امروزه پیری سلولی به عنوان واکنش رایج تقریباً همه انواع سلول های در حال تکثیر در نظر گرفته می شود.

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصهحذف هدفمند سلول های پیر، تجزیه و تحلیل، یکی از روندهای اصلی در درمان ضد پیری است. اخیراً ثابت شده است که گلیکوزیدهای قلبی سنولیتیک با طیف وسیع هستند. در اینجا ما خواص سنولیتیک گلیکوزیدهای قلبی را نسبت به سلول های بنیادی مزانشیمی انسان (hMSCs) آزمایش کردیم. گلیکوزیدهای قلبی هیچ توانایی سنولیتیکی نسبت به hMSCهای پیر با منشاء مختلف نداشتند. با استفاده از رویکردهای بیولوژیکی و بیوانفورماتیک، ما رشد پیری را در سلول‌های بنیادی مزانشیمی حساس به گلیکوزیدهای قلبی A549 و hMSCهای غیر حساس مقایسه می‌کنیم. مشخص شد که فقدان آنالیز به واسطه واردات موثر پتاسیم و افزایش مقاومت آپوپتوز در سلول های بنیادی مزانشیمی پیری است. تضعیف "دفاع ضد اپوپتوز" hMSCs را مستعد تجزیه و تحلیل می کند. ما نشان دادیم که مقاومت آپوپتوز، که قبلا به عنوان یک ویژگی مشترک پیری شناخته شده بود، در واقع یک ویژگی کلی سلول های پیر نیست. علاوه بر این، تنها سلول‌های پیر آپوپتوز-پرولین به تجزیه و تحلیل ناشی از گلیکوزید قلبی حساس هستند. بنابراین، ما می‌توانیم حدس بزنیم که اثربخشی تجزیه و تحلیل ممکن است به این بستگی دارد که آیا سلول‌های پیر واقعاً در مقایسه با همتایان در حال تکثیر خود مقاوم به آپوپتوز می‌شوند یا خیر.

کلید واژه هاسلولهای بنیادی. سنولیز · پیری · آپوپتوز · مقاومت در برابر استرس

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

مقدمه

امروزه پیری سلولی واکنش رایج تقریباً همه انواع سلول‌های در حال تکثیر، از جمله سرطان و سلول‌های بنیادی، و همچنین برخی از سلول‌های پس از میتوزی به انواع محرک‌های استرس‌زا [1-3] در نظر گرفته می‌شود. انواع پیری سلولی زیر را می توان بر اساس منشاء عامل القا کننده تشخیص داد: همانندسازی (به دلیل آسیب DNA در انتهای تلومر کوتاه شده)، ناشی از انکوژن (در پاسخ به فعال سازی نابهنجار سیگنال دهی انکوژن)، ناشی از استرس ( با واسطه آسیب DNA ناشی از استرس اکسیداتیو، شوک حرارتی، اشعه ماوراء بنفش و y و غیره) و ناشی از شیمی درمانی (فعال شده در سلول های سرطانی در پاسخ به داروهای شیمی درمانی)[4-7]. بسته به نوع سلول و توهین مورد استفاده برای القای پیری، در مارکرهایی که توسط سلول های پیر بیان می شوند، ناهمگنی وجود دارد. با این حال، چندین ویژگی مشترک برای اکثر انواع سلول های پیر وجود دارد. ویژگی اساسی پیری برای هر نوع سلول در حال تقسیم، از دست دادن تکثیر غیرقابل برگشت است [8].عصاره cistanche tubulosaبرگشت ناپذیری توقف چرخه سلولی توسط مهارکننده‌های کیناز وابسته به سیکلین (CDK) pl6 و p21 کنترل می‌شود و اغلب توسط پروتئین p53 سرکوب‌کننده تومور تنظیم می‌شود [8،9]. دیگر ویژگی های مهم سلول های پیر، فعال شدن پاسخ آسیب دائمی به DNA است. هیپرتروفی سلولی، که اغلب در نتیجه اختلال در بیوژنز ریبوزومی و سنتز پروتئین ایجاد می شود. اختلال در تخریب لیزوزومی و اختلال در عملکرد سایر سیستم های تخریب. افزایش فعالیت آنزیم لیزوزومی خاص مرتبط با پیری- -گالاکتوزیداز. تغییرات مختلف میتوکندری؛ کسب فنوتیپ ترشحی مرتبط با پیری (SASP)، متشکل از عوامل پیش التهابی، آنزیم های تخریب کننده ماتریکس، گونه های فعال اکسیژن و غیره. تغییرات چشم‌انداز اپی ژنتیک و کروماتین، از جمله تشکیل کانون‌های هتروکروماتیک مرتبط با پیری و انبساط مرتبط با پیری ماهواره‌ها [8-10]. به عبارت دیگر، سلول‌های پیر فعالیت متابولیک و سرزندگی را حفظ می‌کنند، اما عملکرد آنها به طور قابل‌توجهی در مقایسه با سلول های مبدا

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

اکنون واضح است که سلول‌های پیر می‌توانند ریزمحیط اطراف را تغییر دهند که هم سلول‌های همسایه و هم حفره‌های سلولی را تحت تأثیر قرار می‌دهد، که ممکن است منجر به عملکرد نادرست بافت شود و بنابراین ممکن است با پیشرفت پیری و بیماری‌های مرتبط با افزایش سن مرتبط باشد [11،12]. با در نظر گرفتن این موضوع، امروزه توجه بیشتری بر روی استراتژی‌های "کشتن" هدفمند سلول‌های پیر متمرکز شده است[13-15]. برای این منظور، دسته جدیدی از داروها به نام senolytics به طور فعال در حال توسعه است. Senolytics مسیرهای سیگنالینگ را هدف قرار می دهد که به مقاومت سلول های پیر در برابر آپوپتوز کمک می کند، بنابراین ترجیحاً آپوپتوز را در سلول های پیر القا می کند [16]. لیست senolytics به طور مداوم با عوامل جدید پر می شود. شناخته شده ترین ترکیبات با فعالیت سنولیتیک بیان شده ناویتوکلاکس (بازدارنده خانواده Bcl{5}})، ترکیبی از داساتینیب (بازدارنده تیروزین کینازهای متعدد) و کورستین (یک فلاونول طبیعی)، مهارکننده‌های Hsp90، مهارکننده‌های MDM2، FOXO هستند. {8}}پپتید مداخله‌گر p53، تجزیه‌کننده پروتئین خانواده BET، CAR-T خاص uPAR، ناویتوکلاکس کونژوگه با galacto و ترکیبات طبیعی سنولیتیک مختلف[16-24]. اخیراً، با استفاده از غربالگری دارویی با توان بالا، دو گروه تحقیقاتی مستقل، گلیکوزیدهای قلبی، به ویژه اوابین، دیگوکسین و بوفالین را به عنوان سنولیتیک‌های طیف وسیع شناسایی کردند [25،26].بررسی cistanche tubulosaشایان ذکر است که تقریباً تمامی سنولیتیک های اعلام شده دارای محدودیت هایی از جمله عوارض جانبی نامطلوب یا بی اثر بودن نسبت به انواع سلولی هستند. سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs) که تقریباً در تمام اندام‌ها/بافت‌های پس از زایمان یافت می‌شوند، با ظرفیت خود تجدید (تقسیمات متقارن) و تمایز مشخص می‌شوند، بنابراین به حفظ و بازسازی بافت باقی‌مانده کمک می‌کنند [27]. با توجه به این خواص منحصر به فرد، همراه با عملکردهای قوی ضد التهابی و سرکوب کننده سیستم ایمنی، سلول های بنیادی مزانشیمی به طور گسترده در درمان جایگزینی سلولی برای درمان بیماری های مختلف از جمله دیابت، مولتیپل اسکلروزیس، انفارکتوس میوکارد و غیره استفاده می شوند [28]. با این حال، سلول‌های بنیادی مزانشیمی، مشابه نتاج تمایز یافته‌شان و سایر سلول‌های تک‌توان، می‌توانند در پاسخ به فعال‌سازی انکوژن‌ها و محرک‌های استرس‌زا، به صورت تکثیر شونده یا زودرس پیر شوند [29،30]. از مجموعه سلول های بنیادی، کاهش نگهداری و بازسازی بافت، اختلال در ظرفیت تمایز، گسترش پیری با واسطه SASP، کاهش خواص رگ زایی، اصلاح جایگاه سلول های بنیادی [29،{8}}]. با در نظر گرفتن اهمیت بیولوژیکی عملکرد مناسب سلول های بنیادی مزانشیمی، سلول های بنیادی مزانشیمی پیر ممکن است به عنوان هدف حیاتی برای تجزیه و تحلیل در نظر گرفته شوند. در راستای این پیشنهاد، تعدادی از بررسی‌ها که نتایج مفید احتمالی حذف سلول‌های بنیادی مزانشیمی پیر را برجسته می‌کنند، در سال گذشته منتشر شده است [29، 31،34،35]. با این وجود، تنها چند داده تجربی در مورد این موضوع وجود دارد [36-40].

در مطالعه حاضر، ما برای اولین بار نشان می‌دهیم که گلیکوزیدهای قلبی، یعنی اواباین و بوفالین، فعالیت همولیتیک را نسبت به سلول‌های بنیادی مزانشیمی انسانی (hMSCs) مشتق شده از آندومتر (END-MSCs)، بافت چربی (AD-MSCs) نشان نمی‌دهند. پالپ دندان (DP-MSCs) و ژله وارتون (WJ-MSCs). علاوه بر این، ما تأیید می‌کنیم که هر دو گلیکوزید قلبی قادر به القای آپوپتوز ترجیحاً در A549 و SK-HEP{7}} هستند که قبلاً توضیح داده شد. در مطالعات آزمایشی [25،26]. با ارزیابی تغییرات در هموستاز یونی ناشی از انسداد Nat/K به علاوه -ATPase و سطوح بیان ژن‌های مرتبط، نشان می‌دهیم که فقدان آنالیز ناشی از ouabain ممکن است توسط افزایش اثربخشی واردات جبرانی K به علاوه در پایان پیری واسطه شود. MSCها در مقایسه با A549 پیر. علاوه بر این، با استفاده از بیوانفورماتیک پیشرفته نشان می‌دهیم که پیری سلول‌های بنیادی مزانشیمی END-MSC، مقاوم به تجزیه و تحلیل ناشی از اواباین، با کسب فنوتیپ مقاوم به آپوپتوز همراه است، در حالی که پیری A549 حساس به اواباین نیست. مهمتر از همه، مسدود کردن فعالیت پروتئین ضد آپوپتوز MCL{19}} قبل از درمان گلیکوزید قلبی منجر به تجزیه و تحلیل سلول‌های بنیادی مزانشیمی END-MSC مقاوم به آپوپتوز شد. بنابراین، ما شواهد روشنی ارائه می دهیم که مقاومت در برابر آپوپتوز یک ویژگی کلی سلول های پیر نیست. بر اساس داده‌های به‌دست‌آمده، نتیجه می‌گیریم که اثربخشی رویکردهای تحلیلی ممکن است به این بستگی دارد که آیا سلول‌ها واقعاً در طول رشد پیری به آپوپتوز مقاوم شده‌اند یا خیر.

مواد و روش ها

سلول ها

END-MSCs، WJ-MSCs، DP-MSCs، AD-MSCs، A549، و SK-Help از مجموعه روسی کشت های سلولی (موسسه سیتولوژی، سنت پترزبورگ، روسیه) به دست آمد. خطوط A549 و SK-Help با آزمایشات کاریولوژی، تومورزایی، ایزوآنزیم (LDH و G6PD) و آنالیز STR تأیید شدند. سلول ها در محیط کامل DMEM F12 (Gibco BRL) همراه با 10 درصد FBS (HyClone)، 1 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین (Gibco BRL) و 1 درصد گلوتامیک (Gibco BRL) کشت داده شدند. همه سلول ها به طور معمول برای آلودگی مایکوپلاسما مورد آزمایش قرار گرفتند.

شرایط پیری و استرس زا

برای پیری ناشی از استرس اکسیداتیو، سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC/WJ-MSCs با 200 میکرومولار / 100 میکرومولار HO (سیگما) به مدت 1 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. برای پیری ناشی از دوکسوروبیسین، DP-MSCs/A549 با 1 میکرومولار دوکسوروبیسین (Veropharm) به مدت 3 روز تحت درمان قرار گرفتند. در هر مورد، سلول‌ها زودتر از 14 روز پس از درمان پیر در نظر گرفته شدند. برای پیری همانندسازی، سلول های بنیادی مزانشیمی AD-MSC زودتر از پاساژ 4 به عنوان سلول های کنترل و دیرتر از 10 به عنوان سلول های پیر شناسایی شدند. برای پیری ناشی از اتوپوزید، A549/END-MSCs/SK-Help با 2 uM/5 uM/3 uM etoposide (Veropharm) به مدت 3 روز تحت درمان قرار گرفت و زودتر از 7 روز پس از القای پیری آنالیز شد. در این مورد، طرح درمان به طور کامل با مواردی که در مطالعه توضیح داده شده است، مطابقت دارد که داده‌های RNA-seq از آن منشاء گرفته‌اند (وانگ و همکاران، 2017). ما دو گلیکوزید قلبی را به عنوان ترکیبات سنولیتیک به کار بردیم - Ouabain (Sigma) و Bufalin (Calbiochem).

به منظور مقایسه مقاومت استرس بین سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC یا A549 کهنسال هستند، سلول ها با 4{6}}0/800 میکرومولار H O2 (سیگما) به مدت 1 ساعت یا با 0.3/1 میکرومولار استائوروسپورین (سیگما) تیمار شدند. زنده ماندن سلولی 48 ساعت پس از القای استرس مورد بررسی قرار گرفت.

برای مسدود کردن فعالیت MCL{0}}، سلول‌های بنیادی مزانشیمی END-MSC با 10 میکرومولار A-1210477(سیگما) به مدت 3 روز پیش درمان شدند.

آنالیز فلوسیتومتری

اندازه گیری زنده ماندن سلولی، تکثیر، اندازه سلول، فلورسانس خودکار، نرخ آپوپتوز، برش کاسپاز 3/7، پتانسیل غشای میتوکندری و دپلاریزاسیون غشاء توسط فلوسیتومتری انجام شد. فلوسیتومتری با استفاده از CytoFLEX (Beckman Coulter) انجام شد و داده‌های به‌دست‌آمده با استفاده از نرم‌افزار CytExpert نسخه 2 تجزیه و تحلیل شد.{4}}. سلول های چسبنده دو بار با PBS شستشو و با تریپسینیزاسیون برداشت شدند. سلول های جدا شده ادغام شده و در محیط تازه معلق شدند و سپس شمارش و برای اتوفلورسانس آنالیز شدند. به منظور دسترسی به زنده ماندن سلول، 50 میکروگرم در میلی لیتر پروپیدیوم یدید (فناوری های حیات) درست قبل از تجزیه و تحلیل به هر نمونه اضافه شد. اندازه سلول با پراکندگی نور رو به جلو سیتومتری سلول‌های PI منفی ارزیابی شد. القای آپوپتوز با استفاده از رنگ‌آمیزی Annexin-V-APC (Invitrogen) و DAPI (Sigma) زیر دستورالعمل‌های سازنده تأیید شد. فعالیت کاسپاز با استفاده از کیت سنجش جریان سیتومتری جریان سبز (Invitrogen) CellEventTM Caspase-3/7 به دنبال پروتکل سازنده ارزیابی شد. از دست دادن پتانسیل غشای میتوکندری با استفاده از رنگ نسبت سنجی JC{13}} (Invitrogen) ارزیابی شد. روش رنگ آمیزی مطابق با پروتکل سازنده انجام شد. برای دپلاریزاسیون غشا، از پروب فلورسنت DiBAC4(3) (Invitrogen) استفاده کردیم.

رنگ آمیزی گالاکتوزیداز مرتبط با پیری

رنگ آمیزی گالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA{2}}Gal) با استفاده از کیت رنگ آمیزی پیری گالاکتوزیداز (تکنولوژی سیگنال سلولی) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. تجزیه و تحلیل کمی تصاویر با استفاده از بسته MatLab، طبق الگوریتمی که قبلا توضیح داده شد، تولید شد[41]. برای هر نقطه آزمایشی، حداقل 50 سلول به طور تصادفی انتخاب شدند.

وسترن بلاتینگ

وسترن بلات همانطور که قبلا توضیح داده شد [41] انجام شد. الکتروفورز SDS-PAGE، انتقال به غشای نیتروسلولزی و ایمونوبلات با تشخیص ECL (Thermo Scientific) طبق پروتکل‌های استاندارد سازنده (آزمایشگاه‌های Bio-Rad) انجام شد. آنتی بادی‌ها علیه پروتئین‌های زیر استفاده شد: گلیسرآلدئید{3}}فسفات دهیدروژناز (GAPDH) (کلون 14C10)، فسفو-p53 (Ser15)، p21 (کلون 12D1)، فسفو-Rb (Ser807/811) ، HMGB1 (کلون D3E5)، و همچنین IgG ضد خرگوش بز کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی. نرخ رقت برای همه آنتی بادی های اولیه 1:1000 و برای آنتی بادی های ثانویه 1:7000 بود. تمام آنتی بادی ها از Cell Signaling خریداری شدند. Scion Image 4.0 (Scion Corporation) برای انتخاب و تعیین چگالی باندهای تفریق شده پس زمینه در همه ژل ها و لکه ها استفاده شد.

تجزیه و تحلیل رونوشت

نمونه‌هایی از سه مجموعه داده ژنی Omnibus (GEO)RNA-seq زیر در تجزیه و تحلیل استفاده شد: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 و GSM{4}}GSM2742122forcontrol and senescentA549cells، بر این اساس). GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 و GSM{10}}GSM3454502 بر این اساس برای سلول‌های کنترل و پیری IMR-90). و مجموعه داده ما GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 و GSM4877907-GSM4877910 به ترتیب برای END-MSCهای کنترل و پیری). داده‌های تمامی مجموعه‌های داده به روشی مشابه پردازش شدند.

داده‌های خواندن خام با استفاده از گزینه‌های پیش‌فرض، از طریق اسکریپت‌های FilterByTile و BBDuk از بسته BBtools (نسخه 38.75) با کیفیت فیلتر و آداپتور اصلاح شدند. خوانده‌های باقی‌مانده به‌علاوه فیلتر و با استفاده از یک اسکریپت سه‌ماهه از بسته‌بندی FastqPuri (نسخه 1.{4}}.7) حذف شدند.cistanche انگلستانعملیات برش برای هر دو انتهای قرائت ها در صورتی که دارای N هستند یا کیفیت آنها زیر آستانه کیفیت تعیین شده روی 27 بود، اعمال می شد، همه خواندن های کوتاه تر از 25 پایه دور ریخته می شدند. کنترل کیفیت پیرایش با نرم افزار FastQC (نسخه 0.11.7) و اسکریپت های FastqPuri انجام شد. قرائت ها، پس از گذراندن تمام عملیات، کمتر از 90 درصد از داده های اولیه را تشکیل می دهند.

فراوانی رونوشت با استفاده از نقشه برداری سبک وزن سالمون (نسخه 1.1.0) که در حالت تراز انتخابی اجرا می شود، برآورد شد. فهرست طعمه‌ها بر اساس ژنوم مرجع ژنوم انسانی Gencode GRCh38.p13 (نسخه 33) تولید شد و بیشتر برای ساختن ایندکس بر روی فایل‌های مرجع رونویسی و ژنوم ژنوم پیوسته (نسخه 33) با استفاده از اندازه کیلومتر 21 استفاده شد. عملیات نقشه‌برداری اجرا شد. با پرچم‌های اضافی——numBootstraps 30——sequins——gcBias——نقشه‌ها را تأیید می‌کند. نرخ نقشه برداری حاصل حدود 70 درصد بود.

پردازش اطلاعات بیشتر با استفاده از نسخه R 3.6.3 با مجموعه بسته‌های Tidyverse (نسخه 1.3.{5}}) انجام شد. تعداد تخمینی ژن، فراداده، و محدوده رونوشت در R بارگذاری شد و با استفاده از tximeta (نسخه 1.4.5) در سطح ژن خلاصه شد. ماتریس شمارش به‌دست‌آمده فیلتر شد تا حاوی ردیف‌هایی باشد که حداقل 5 شمارش تخمینی در تمام نمونه‌ها داشتند، ماتریس حاصل حاوی 20400 ژن بود.

برای نمایش PCA و نقشه حرارتی، تعداد خوانده شده با استفاده از تبدیل گزارش از بسته DESeq2 (نسخه 1.26.{3}}) عادی شد.cistanche wirkungنقشه های حرارتی با استفاده از بسته های فیلتر ژن (نسخه 1.38.{2}}) و نقشه حرارتی (نسخه 1.0.12)R ساخته شد. اعتبارسنجی تقسیم‌بندی نمونه‌ها بر اساس متغیر پیری از طریق زیرمجموعه کردن شمارش خواندن نرمال‌شده توسط ژن‌های مرتبط با عبارت هستی‌شناسی ژنی «سلول‌های سلولی» (GO 0090398) انجام شد. تجزیه و تحلیل بیان دیفرانسیل و برآورد تغییرات log fold با استفاده از DESeq2 برای آخرین متغیر در فرمول طراحی برای وضعیت پیری سلولی، واکنش درمان اوابین و تعامل عوامل نشان‌داده‌شده محاسبه شد. برای تقویت تست بیان دیفرانسیل، تصحیح تغییر log fold با استفاده از ترکیبی از برآوردگر انقباض تطبیقی ​​از بسته palm (نسخه 1.8.{28}}) و تعیین آستانه تغییر لگ فولد اضافی برابر با 0.667 اعمال شد. تخمین‌های منقبض‌شده به‌دست‌آمده برای رتبه‌بندی ژن و اجرای تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن با استفاده از مشخصات خوشه‌ای (نسخه 3.14.3) و بسته‌های فیوز (نسخه 1.12.0) R با مقادیر p که برای مقایسه‌های چندگانه مطابق با روش بنجامین-هوچبرگ تنظیم شده‌اند، استفاده شد. نمونه‌های ریزآرایه Affymetrix برای کنترل و سلول‌های بنیادی مزانشیمی AD-MSC کهنه شده از پایگاه داده GEO (GSE66236) به‌دست آمدند و با برنامه وب Phantasus با نرمال‌سازی log2 و تعداد کمی پردازش شدند. تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه ژن با استفاده از یک بسته فیوز (نسخه 1.12.0)R انجام شد.

استخراج RNA، رونویسی معکوس، و زمان واقعی PCR

استخراج RNA، رونویسی معکوس و PCR بلادرنگ همانطور که در مطالعه قبلی ما توضیح داده شد انجام شد [32]. معرف های استخراج RNA (معرف ExtractRNA)، رونویسی معکوس (کیت MMLV RT)، و زمان واقعی PCR (کیت HS SYBR) از Evrogen به دست آمد. سطوح بیان ژن با استفاده از تقویت‌کننده Real-time PCR BioRad CFX (BioRad) با برنامه در حال اجرا زیر برای همه ژن‌های مورد بررسی ارزیابی شد: 40 چرخه ذوب برای 10 ثانیه در 95 درجه، بازپخت به مدت 15 ثانیه در 57.5 درجه و سنتز به مدت 15 ثانیه در دمای 72 درجه. تجزیه و تحلیل منحنی های ذوب برای کنترل ویژگی واکنش ها استفاده شد. تجزیه و تحلیل زیر از داده های به دست آمده با استفاده از نرم افزار Bio-Rad CFX Manager (BioRad) با روش کمی سازی استاندارد 2deltaCt با استفاده از بیان GAPDH به عنوان مرجع انجام شد. توالی پرایمر در جدول 1 فهرست شده است.

تحلیل آماری

برای معناداری تفاوت بین دو گروه از آزمون t استیودنت یا ولش استفاده شد. برای مقایسه‌های چندگانه بین گروه‌ها، ANOVA با HSD Tukey استفاده شد. مگر اینکه غیر از این نشان داده شود، تمام داده های کمی به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده می شوند و ستاره ها تفاوت های معنی داری را به شرح زیر نشان می دهند: ns، معنی دار نیست، *p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

نتایج

سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC تحت درمان با H2O2- وارد پیری زودرس می شوند

در مطالعه حاضر، ما از سلول‌های بنیادی مزانشیمی انسانی جدا شده از آندومتر لایه‌برداری شده (END-MSCs) استفاده کردیم که حداقل معیارهای پیشنهادی ISCT برای تعریف hMSCs را برآورده می‌کند [41]. پیش از این، ما یک مدل تجربی قابل اعتماد برای مطالعه جنبه‌های مختلف پیری زودرس END-MSCs توسعه داده‌ایم [30]. به عنوان مثال، ما نشان داده‌ایم که سلول‌های بنیادی مزانشیمی END-MSC تحت استرس اکسیداتیو کشنده به تدریج تمام ویژگی‌های معمول سلول‌های پیر، از جمله کانون‌های آسیب DNA پایدار و پاسخ آسیب فعال DNA، توقف غیرقابل برگشت چرخه سلولی با واسطه p53/p21/Rb کلاسیک را به دست آوردند. مسیر، از دست دادن تکثیر، هیپرتروفی سلولی، ظهور SA{8}}رنگ‌آمیزی گال و ایجاد فنوتیپ ترشحی مرتبط با پیری [30، 32، 42]. در اینجا ما مدل طراحی شده را برای مطالعه اثر سنولیتیک اوابائین و همچنین آشکارسازی تغییرات درون سلولی زمینه‌ای در هموستاز یونی به کار بردیم. در ابتدا، با تخمین رایج ترین پارامترها، تأیید کردیم که درمان تک دوز (1 ساعت، 200 میکرومولار) HO برای القای پیری در سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC کافی است. نکته مهم این است که سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC دو هفته پس از استرس اکسیداتیو پیر در نظر گرفته شدند. بنابراین، همه نشانگرهای پیری نه زودتر از 14 روز پس از درمان H-Oz ارزیابی شدند. در واقع، درمان H-Oz از سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC منجر به بلوک تکثیر، هیپرتروفی سلولی که با افزایش اندازه سلول نشان داده می شود، تجمع لیپوفوسسین شناسایی شده با افزایش اتوفلورسانس، ظهور SA{22}}گال، فعال شدن مسیر p21/Rb و از دست دادن HMGB1 با هم از استقرار پیری در شرایط تجربی انتخاب شده حمایت می‌کنند (شکل ac,e,f).

اعتقاد بر این است که مضرترین اثرات سلولهای پیر در سطح بافت و ارگانیسم نتیجه حیات طولانی مدت آنهاست. در راستای این نکته، سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC تحت درمان با HO زنده ماندن بالایی داشتند، حتی در مراحل پایانی رشد پیری (قابلیت زنده ماندن سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC کهنسال 17 روز (14 روز تا 3 روز) پس از استرس اکسیداتیو اولیه ارزیابی شد) (شکل 1d) ). به طور خلاصه، درمان HO{9}}کشنده END-MSCs مدل مناسبی برای پیری زودرس است و برای بررسی اثرات ترکیبات سنولیتیک بر END-MSCها مرتبط است.

گلیکوزید قلبی اوابائین هیچ گونه فعالیت سنولیتیکی نسبت به سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC در محدوده غلظت وسیع ندارد.

شواهد اخیر نشان می دهد که گلیکوزیدهای قلبی، از جمله اواباین، دیگوکسین و بوفالین، نشان دهنده خانواده ای از ترکیبات با فعالیت همولیتیک هستند [25،26]. اگرچه امروزه گلیکوزیدهای قلبی به عنوان سنولیتیک‌های طیف وسیع در نظر گرفته می‌شوند، اما اطلاعاتی در مورد اثرات آنها بر سلول‌های بنیادی مزانشیمی پیری وجود ندارد. بنابراین، در اینجا ما آزمایش کردیم که آیا اواباین پتانسیل القای مرگ انتخابی در END-MSCهای پیر را دارد یا خیر. برای انجام این کار، ما زنده ماندن سلول‌های بنیادی مزانشیمی END-MSC را پس از درمان با اواباین در محدوده غلظت وسیع (از 10- تا 10~ M) ارزیابی کردیم. جالب توجه است که هیچ یک از غلظت‌های اعمال‌شده منجر به کاهش قابل‌توجه در زنده‌مانی سلول‌های کنترل و پیری در روز اول پس از کاربرد اوابین نشد (شکل 2 و شکل مکمل S1).

با این حال، در روز سوم پس از درمان با اوابین، کاهش قابل توجهی وابسته به دوز را در زنده ماندن سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC نشان دادیم (شکل 2a و شکل مکمل S1). به طور غیرمنتظره ای، سلول های پیر در هر غلظت آزمایش شده در برابر اوابائین مقاوم تر بودند. مطابق با این نتیجه، 10-M ouabain منجر به مرگ آپوپتوز مستعدتر در سلول های کنترل شد (20.75 درصد به علاوه /PI-و 36.47 درصد به علاوه /PI plus) در مقایسه با سلول های پیر (15.01 درصد An-/PI). -و 12.15 درصد به علاوه /PI پلاس ) (شکل 2b). نتایج به‌دست‌آمده به‌وضوح نشان می‌دهد که در زمینه سلول‌های بنیادی مزانشیمی END-MSC کهنسال، اوابائین هیچ فعالیت سنولیتیکی ندارد.

برای حذف اثرات احتمالی مرتبط با تغییرپذیری محرک‌های القای پیری بر عملکرد سنولیتیک اواباین، مجموعه‌ای از آزمایش‌ها را انجام دادیم. یعنی، ما سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC را به جای استرس اکسیداتیو با اتوپوزید درمان کردیم تا پیری زودرس را القا کنیم.بیوفلاونوئیدهای مرکباتسلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC تحت درمان با اتوپوزید تمام ویژگی های معمول سلول های پیر را نشان می دهند (شکل 3a-e).

نکته مهم این است که اوابائین هیچ اثر همولیتیکی نسبت به سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC که با اتوپوزید درمان شده اند، نداشت (شکل 3f و شکل مکمل ذهنی S2). این داده‌ها تأیید بیشتری را برای نتایج فوق و شواهدی ارائه می‌کنند که فقدان آنالیز ناشی از ouabain نتیجه‌ی محرک پیری بتن مورد استفاده برای القای پیری نیست.

شکل 1 اعتبار سنجی مدل پیری زودرس END-MSCهای ناشی از استرس اکسیداتیو. سلول‌های بنیادی مزانشیمی END-MSC کهنسال تکثیر شل می‌شوند، b تحت هیپرتروفی قرار می‌گیرند، c خودفلورسانس بالا را به دست می‌آورند، زنده ماندن سلولی بالا را حفظ می‌کنند و فعالیت SA{4}}Gal را در مقایسه با نمونه‌های شاهد نشان می‌دهند. سطوح فسفوریلاسیون p53 و Rb و سطوح بیان پروتئین‌های p21 و HMGBI در کنترل و پیری END-Ouabain هیچ اثر همولیتیکی نسبت به سلول‌های بنیادی مزانشیمی انسانی با منشاء مختلف ندارد. ما اثرات اوابین را روی hMSCهای جدا شده از منابع دیگر از جمله بافت چربی، پالپ دندان و ژله وارتون تجزیه و تحلیل کردیم. برای تقویت بیشتر داده‌هایمان، مدل‌های مختلفی از پیری را به کار بردیم - پیری تکراری برای سلول‌های بنیادی مزانشیمی AD-MSC، پیری ناشی از دوکسوروبیسین برای سلول‌های بنیادی مزانشیمی DP-MSC، و پیری ناشی از استرس اکسیداتیو برای سلول‌های بنیادی مزانشیمی WJ-F (شکل 4a-f).

همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، انواع مختلفی از سلول های بنیادی مزانشیمی در زنده ماندن پس از درمان با اوابین متفاوت بودند، برای مثال، هر دو سلول های بنیادی مزانشیمی DP-MSC کنترل و پیر نسبت به WJ-MSCها نسبت به عملکرد اواباین بسیار مقاوم تر بودند (شکل 4 g و شکل مکمل S3b، ج). با این وجود، ouabain قادر به القای سنولیز در هیچ یک از انواع hMSCهای پیر نبود (شکل 4g و شکل تکمیلی S3). با هم، داده‌های به‌دست‌آمده نشان می‌دهند که عدم وجود آنالیز ناشی از ouabain یک ویژگی مشترک برای انواع مختلف hMSCs است. MSCs مقادیر ارائه شده میانگین ± انحراف معیار هستند. برای مقایسه چند گروهی در a و d، ANOVA یک طرفه اعمال شد، n=3، ns معنی دار نیست، ***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH به عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد

گلیکوزید بوفالین قلبی نمی تواند END-MSCS پیر را از بین ببرد

برای تأیید عدم وجود اثر سنولیتیک گلیکوزیدهای قلبی نسبت به hMSCها، ما از بوفالین، ترکیب دیگری با فعالیت سنولیتیک اعلام شده متعلق به خانواده گلیکوزیدهای قلبی استفاده کردیم [25]. بوفالین تقریباً هیچ تأثیری بر زنده ماندن کنترل نداشت و سلول‌های بنیادی مزانشیمی سلول‌های بنیادی مزانشیمی کهنسال را با H2O در محدوده غلظتی وسیع (از 10-7 تا 10-5 M) درمان کرد (شکل 5a و مکمل شکل S4a).

مشابه آنچه که ما برای درمان اوابین مشاهده کردیم، عدم تجزیه و تحلیل بر روی بوفالین مستقل از محرک های القا کننده پیری بود، زیرا قابلیت زنده ماندن سلول های بنیادی مزانشیمی که در پاسخ به استرس اکسیداتیو یا به اتوپوزید پیر شده بودند، تحت تاثیر قرار نگرفت (شکل 5a، b، شکل تکمیلی). S4a، b). نتایج توصیف شده در بالا تأیید می کند که گلیکوزیدهای قلبی برای القای مرگ هدفمند در سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC ناکارآمد هستند. MSCs مقادیر ارائه شده میانگین ± انحراف معیار هستند. برای مقایسه چند گروهی در a و d، ANOVA یک طرفه اعمال شد، n=3، ns معنی دار نیست،***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

گلیکوزید بوفالین قلبی نمی تواند END-MSCS پیر را از بین ببرد

برای تأیید عدم وجود اثر سنولیتیک گلیکوزیدهای قلبی نسبت به hMSCها، ما از بوفالین، ترکیب دیگری با فعالیت سنولیتیک اعلام شده متعلق به خانواده گلیکوزیدهای قلبی استفاده کردیم [25]. بوفالین تقریباً هیچ تأثیری بر زنده ماندن کنترل نداشت و سلول‌های بنیادی مزانشیمی سلول‌های بنیادی مزانشیمی کهنسال را با H2O در محدوده غلظتی وسیع (از 10-7 تا 10-5 M) درمان کرد (شکل 5a و مکمل شکل S4a).

مشابه آنچه که ما برای درمان اوابین مشاهده کردیم، عدم تجزیه و تحلیل بر روی بوفالین مستقل از محرک های القا کننده پیری بود، زیرا قابلیت زنده ماندن سلول های بنیادی مزانشیمی که در پاسخ به استرس اکسیداتیو یا به اتوپوزید پیر شده بودند، تحت تاثیر قرار نگرفت (شکل 5a، b، شکل تکمیلی). S4a، b). نتایج توصیف شده در بالا تأیید می کند که گلیکوزیدهای قلبی برای القای مرگ هدفمند در سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC ناکارآمد هستند.

شکل 2 Ouabain هیچ فعالیت همولیتیکی نسبت به سلول های بنیادی مزانشیمی END-سنت درمان شده با HO در محدوده غلظت وسیعی ندارد. زنده ماندن نسبی سلولی (درصد) سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC در 3 روز پس از درمان با 1077,10~6,10-5 M ouabain. b القای آپوپتوز در سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC بر روی 10-6 M ouabain که با رنگ آمیزی دوگانه Annexin V/DAPI ارزیابی شد. n=3 آزمایش مستقل. همه داده ها با میانگین ± انحراف معیار مطابقت دارند. معنی‌داری آماری با استفاده از آزمون t ولچ ارزیابی شد: ns معنی‌دار نیست<>

هر دو گلیکوزید قلبی اواباین و بوفالین قادر به القای مرگ سلولی انتخابی در سلول‌های پیر A549 و SK-Hep1 هستند.

با در نظر گرفتن این واقعیت که نتایج ما با شواهد اخیر منتشر شده در مورد عملکرد سنولیتیک طیف وسیع گلیکوزیدهای قلبی مطابقت ندارد، تصمیم گرفتیم این اثر را با استفاده از مدل سلولی شرح داده شده در مطالعات مربوطه بازتولید کنیم [25،26]. بنابراین، ما یک سری آزمایش را با استفاده از سلول های سرطان ریه A549 کنترل و پیر انجام دادیم. پیری در سلول های A549 با درمان اتوپوزید القا شد. پیری سلول‌های A549 ناشی از اتوپوزید، مدلی است که اغلب استفاده می‌شود و بنابراین به خوبی مشخص می‌شود پیری ناشی از درمان [4]. همچنین نشان داده شد که اواباین به طور انتخابی سلول‌های پیر A549 تیمار شده با اتوپوزید را می‌کشد[25]. برای اثبات پیری در A549، نرخ تکثیر، اندازه سلول، تجمع لیپو فینی، رنگ‌آمیزی SA{15}Gal، وضعیت فعال‌سازی را ارزیابی کردیم. مسیر p53/p21/Rb و سطح بیان HMGB1 (شکل 6a-e).

برای تأیید فعالیت همولیتیک ouabain نسبت به سلول های سرطانی پیر، ابتدا زنده ماندن سلولی وابسته به دوز را تخمین زدیم. مطابق با نتایجی که در بالا توضیح داده شد، ما قادر به تشخیص کاهش قابل توجهی در تعداد سلول های کنترل زنده یا پیر A549 در عرض 24 ساعت پس از کاربرد اوابین نبودیم (شکل تکمیلی S5a). با این حال، در 3 روز پس از درمان، ouabain به طور قابل توجهی زنده ماندن سلول های A549 پیر را به صورت وابسته به دوز کاهش داد، در حالی که تعداد سلول های A549 کنترل به میزان بسیار کمتری کاهش یافت (شکل 7a و شکل مکمل S5a). یعنی، تقریباً 90 درصد از سلول‌های کنترل زنده ماندن را در 10- M ouabain در مقایسه با 50 درصد سلول‌های پیر A549 که با همان دوز تیمار شده بودند حفظ کردند (شکل 7a). علاوه بر این، سلول‌های پیر A549 نسبت به همتایان کنترل خود (شکل 7b) بیشتر مستعد مرگ سلولی ناشی از بوفالین بودند (شکل 5b و شکل تکمیلی S5b).

با توجه به داده های منتشر شده، اواباین باعث آپوپتوز وابسته به کاسپاز در سلول های A549 پیر شد [26]. در واقع، ما افزایش قابل توجهی را در کسر مثبت مضاعف و/یا PI در سلول‌های سرطانی پیر تحت درمان با 10-6M ouabain نشان دادیم (شکل 7c). علاوه بر این، با استفاده از روش فلورسنت، ما فعال شدن کاسپاز{6}} را در سلول‌های پیر A549 تیمار شده با اواباین مشاهده کردیم (شکل 7d). در مجموع، این نتایج کاملاً با داده های توصیف شده توسط سایر نویسندگان مطابقت دارد و فعالیت همولیتیک اوابائین را نسبت به A549 تأیید می کند.

همچنین، ما از دوکسوروبیسین به جای اتوپوزید برای ایجاد پیری در A549 استفاده کردیم (شکل 8a-e). همانطور که انتظار می رفت، A549 پیر تیمار شده با دوکسوروبیسین و همچنین تیمار شده با اتوپوزید حساسیت بالاتری نسبت به اواباین و بوفالین در مقایسه با همتایان کنترل خود نشان دادند (شکل 8g و شکل مکمل S6). دومی تایید می کند که اثرات سنولیتیک گلیکوزیدهای قلبی مستقل از محرک های القا کننده پیری هستند. بنابراین، گلیکوزیدهای قلبی در واقع سنولیتیک دارند

شکل 3 Ouabain قادر به القای سنولیز در سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC که با اتوپوزید درمان شده اند نیست. اعتبار سنجی مدل پیری ناشی از اپیزود برای سلول های بنیادی مزانشیمی END-MSC: توانایی تکثیر، اندازه سلول b، سطوح اتوفلورسانس c و فعالیت d SA- -Gal، سطح فسفوریلاسیون Rb و سطوح بیان پروتئین های p21 و HMGBI. f زنده ماندن نسبی سلولی (درصد) سلول های شاهد و پیر پس از درمان با 10-6 ouabain. مقادیر میانگین±SD هستند. برای چند گروه مقایسه در یک آنالیز واریانس یک طرفه اعمال شد، n=3، ns معنی دار نیست، ***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

در نهایت، ما تصمیم گرفتیم آزمایش‌های آنالیز روی سلول‌های سرطانی کبد تحت درمان با اتوپوزید SK-Help، مدل سلولی دیگری با اثرات سنولیتیک اثبات شده گلیکوزیدهای قلبی را طبق گفته Guerrero و همکاران، بازتولید کنیم. مطالعه [25] (شکل 9a-e). SK-Help کهنسال تیمار شده با اتوپوزید حساسیت بالاتری را به هر دو عامل در مقایسه با همتایان کنترل خود نشان داد و عملکرد همولیتیک گلیکوزیدهای قلبی را نسبت به این نوع سلول ثابت کرد (شکل 9f و شکل تکمیلی S7).

این داده ها با هم شواهدی را نشان می دهند که گزینش پذیری همولیز ناشی از گلیکوزیدهای قلبی بیشتر به ماهیت سلولی متکی است تا به محرک پیری بتن.

این مقاله از Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 استخراج شده است https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x