مجموع گلیکوزیدهای گیاه سیستانش دسرتیکولا با القای بازسازی عصبی عروقی از طریق مسیر Nrf- 2/Keap{1}} در موش‌های صحرایی MCAO/R باعث بهبود عملکرد عصبی می‌شوند-Ⅰ

معرفی

سکته مغزی یکی از علل اصلی مرگ و میر و ناتوانی در جهان محسوب می شود. تقریباً 87 درصد از تمام موارد سکته مغزی توسط سکته مغزی ایسکمیک ایجاد می شود. در حال حاضر، موثرترین عامل و تنها داروی مورد تایید FDA استدرمان سکته مغزی ایسکمیکفعال کننده پلاسمینوژن بافت نوترکیب است. با این حال، تعداد زیادی از بیماران سکته مغزی به دلیل بازه زمانی محدود درمانی آن و خطر جدی عوارض خونریزی دهنده، به این دارو پاسخ نمی دهند. چالش اصلی درمان ترومبولیتیک، آسیب ایسکمی/ریپرفیوژن مجدد (I/R) است که علت اصلی آسیب مغزی و تخریب عملکرد در نظر گرفته می‌شود. خونرسانی مجدد پس از ایسکمی مغزی خطر خونریزی مغزی را افزایش می دهد در حالی که منجر به آسیب عصبی عروقی و تولید گونه های اکسیژن فعال بیش از حد (ROS) می شود که به سد خونی مغزی آسیب می رساند. چندین مطالعه تایید کرده اند که اختلال در BBB یکی از دلایل اصلی پاتوژنز سکته مغزی ایسکمیک است.

سیستانچ توبولوزای طبیعی برای درمان سکته مغزی ایسکمیک PHGS75% ECH 30% ACT 12%

BBB عمدتاً از سلول های اندوتلیال، پری سیت ها، آستروسیت ها، نورون ها و غشای پایه تشکیل شده است. اجزای اصلی BBB سلول های اندوتلیال ریز عروقی مغز هستند که توسط اتصالات محکم به هم متصل می شوند، بنابراین مولکول های برون زا را به مغز محدود می کنند. تغییرات پاتولوژیک اتصالات محکم - به ویژه اکلودین، کلودین-5، و زونولا انسداد-1 (ZO-1) - به طور قابل توجهی بر عملکرد BBB در طول سکته مغزی ایسکمیک، به ویژه نفوذپذیری سد تأثیر می‌گذارد. در طول دوره های I/R، ROS بیش از حد یکی از عوامل اصلی است که منجر به آسیب مستقیم نورون های مغز می شود. تولید بیش از حد ROS منجر به تخریب اتصالات خاص و اختلال در BBB می شود که منجر به ورود مولکول های اگزوژن به مغز از طریق BBB می شود که منجر به تشدید آسیب مغزی می شود. بنابراین، محافظت از BBB توسط آنتی اکسیدان ها به عنوان یک راه بالقوه برای جلوگیری از آسیب خونرسانی مجدد در نظر گرفته شده است.

علاوه بر تجزیه BBB، I/R می تواند منجر به آسیب عصبی عروقی و مرگ نورون ها شود. در طول سکته مغزی، افزایش مرگ سلول های عصبی ممکن است ناشی از استرس اکسیداتیو باشد و مطالعات متعدد نشان داده اند که ROS شدت سکته و آسیب عصبی را تشدید می کند. اگرچه کارآزمایی‌های بالینی نتایج رضایت‌بخشی به دست نیاورده‌اند، محافظت عصبی هنوز یک استراتژی امیدوارکننده برای درمان سکته مغزی ایسکمیک حاد است. بنابراین، یافتن داروهای محافظت کننده عصبی موثر برای درمان سکته مغزی برای بیماران سکته مغزی مفید است.

طب سنتی چینی (TCM) اقداماتی را برای مداخله در برابر عدم تعادل داخلی بدن انجام می دهد. با توجه به پاتوژنز پیچیده سکته های مغزی ایسکمیک، اثر چند عاملی TCM و ترکیبات فعال آن نقش مهمی در درمان سکته ها ایفا می کند.سیستانچdeserticola YC Ma که در مناطق خشک یا نیمه خشک در سراسر مغولستان و شمال غربی چین گسترده شده است، بیش از 1،000 سال است که در چین به طور گسترده ای از گیاهان دارویی TCM برای درمان بیماری های مختلف مانند فراموشی و افسردگی استفاده می شود. مطالعات فارماکولوژیک مدرن نشان داد که عصاره خام C. deserticola فعالیت های دارویی متعددی از جملهتقویت عملکرد یادگیری و حافظه، محافظت عصبی، ایمنی، اثرات آنتی اکسیدانی، ضد پیری و ضد خستگی. تجزیه شیمیایی C. deserticola نشان داد که ترکیبات اصلی آن شاملگلیکوزیدهای فنیل اتانوئید، گلیکوزیدهای ایریدوئید، پلی ساکاریدها و الیگوساکاریدها. با این حال، اجزای فعال C. deserticola برای محافظت از مغز خیلی واضح نیستند.

خاصیت محافظت عصبی C. deserticola به پتانسیل درمانی آن در بیماری های مرتبط با شناختی مانند سکته مغزی و افسردگی و همچنین بیماری آلزایمر اشاره دارد. با این حال، تحقیقات در مورد تأثیر C. deserticola بر سکته مغزی، از جمله اجزای فعال و مکانیسم‌های عمل آن، بسیار محدود است. در کار فعلی، ما اثر محافظتی سه عصاره از C. deserticola، گلیکوزیدهای کل (TGs، گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی، و سایر گلیکوزیدها)، پلی ساکاریدها (PSs)، و الیگوساکاریدها (OSs) را بر آسیب‌های I/R مغزی بررسی کردیم. یافته‌های ما ممکن است به کاربرد بالینی دقیق C. deserticola کمک کند و یک عامل کاندید برای آن فراهم کنددرمان سکته مغزی ایسکمیک.

مواد و روش ها

مواد شیمیایی و معرف ها

ساقه Cistanche deserticola از آلاشان، مغولستان داخلی خریداری شد و توسط یکی از نویسندگان (P.-F. Tu) شناسایی شد. TGs، PSs، و OSs طبق روش گزارش شده قبلی ما آماده شدند. تجزیه و تحلیل کمی TGs توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) همانطور که قبلا توضیح داده شد انجام شد و کروماتوگرام آن در شکل 1 نشان داده شده است. محتوای آنها به ترتیب 163.05 mg/g، 4.125 mg/g، 41.66 mg/g، 22.655 mg/g و 12.045 mg/g است. محتویات PSs و OSs به ترتیب 69.42٪ و 65.24٪ است که به ترتیب توسط HPLC و تجزیه و تحلیل فنل-سولفوریک اسید تعیین می شود.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای درمان سکته مغزی ایسکمیک PHGS75% ECH 30% ACT 12%

مراجع استاندارد اکیناکوزید (A0282)، توبولوزید A (A0942)، آکتئوزید (A0280)، ایزواکتئوزید (A0281)، و 2'- استیللاکتئوزید (A0943) از Chengdu Must Biotechnology خریداری شد. خلوص تمام استانداردها بیش از 98٪ است. کیت Nissl Stain H&E از Boster خریداری شد. Edaravone (T{8}}) ​​از Target Mol (شانگهای، چین) خریداری شد. خرگوش ضد موش MAP{10}} (ab32454)، Nrf-2 (ab31163)، PDGFRb (ab32570)، Keap{15}} (ab66620) و CD31 ضد موش موش (ab24590) خریداری شد از Abcam Inc. Rabbit anti-rat Claudin5 (BS1069)، ZO{23}} (BS9802M) و Occludin (BS72035) از Bioworld Technology خریداری شد. Cell Signaling Technology Inc. (بوستون، MA، ایالات متحده آمریکا) منبع سیناپسین ضد موش خرگوش بود-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) از Proteintech Group, Inc خریداری شد. آنتی‌بادی‌های ثانویه توسط Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (پکن، چین) عرضه شد. Hoechst 33258 از Beyotime به دست آمد.

حیوانات

موش های Sprague-Dawley (نر، با وزن 250-300 گرم) از فناوری حیوانات آزمایشگاهی Vital River به دست آمدند و در اتاقی با تهویه مطبوع قرار گرفتند که در چرخه نور/تاریکی 12 ساعت نگهداری می شد. تمام آزمایش‌های حیوانی با دستورالعمل‌های ARRIVE تحقیقات حیوانی انجام شد و توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی مرکز علوم بهداشت دانشگاه پکن تأیید شد.

پروتکل های آزمایشی حیوانات

همانطور که قبلاً توضیح داده شد، موش‌ها در معرض MCAO/R قرار گرفتند (وانگ و همکاران، 2{5}}18). به طور خلاصه، شریان کاروتید مشترک چپ (CCA)، شریان کاروتید خارجی (ECA) و شریان کاروتید داخلی (ICA) در معرض دید قرار گرفتند و یک نخ نایلونی تک رشته ای 3-0 تا رسیدن به وسط از ECA به داخل ICA قرار داده شد. شریان مغزی (MCA). پس از 1.5 ساعت انسداد MCA، خونرسانی مجدد با برداشتن رشته شبیه سازی شد. در طول عمل جراحی، دمای بدن تمام موش ها در 37.0 درجه حفظ شد. دارو

مدیریت

موش ها با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 22 به طور تصادفی به شش گروه تقسیم شدند. گروه مدل (MOD)؛ گروه edaravone (دارو مثبت، 6 میلی لیتر / کیلوگرم، EDI)؛ گروه TGs (280 mg/kg، TGs)؛ گروه PSs (280 mg/kg، PSs)، و گروه OSs (280 mg/kg، OSs). TGs، PSs و OSs یک بار در روز پس از MCAO/R به مدت 14 روز تجویز شدند. گروه های NOR و MOD با نرمال سالین تحت درمان قرار گرفتند. شماره حیوانات در جدول 1 نشان داده شده است.

اندازه گیری وزن و نمرات اصلاح شده نقص عصبی (mNSS)

وزن بدن در روز چهاردهم با استفاده از مقیاس دیجیتال ADVENTURE™ (OHAUS، نیوجرسی، ایالات متحده آمریکا) کنترل شد. mNSS با توجه به روشی که توسط FJ Wang (وانگ و همکاران، 2018) توصیف شده است، با تجدید نظرهای جزئی ارزیابی شد.

2، 3، 5-رنگ‌آمیزی تری فنیل تترازولیوم کلرید (TTC)

حجم انفارکتوس همانطور که قبلا توضیح داده شد اندازه گیری شد. به طور خلاصه، مغزها به هفت بلوک کرونی با فاصله مساوی (2 میلی متر) تقسیم شدند. این مقاطع با 2% TTC در دمای 37 درجه به مدت 15 دقیقه رنگ آمیزی شدند. حجم انفارکتوس (%)=(حجم نیمکره ایسکمیک همان طرف - حجم نیمکره ایسکمیک طرف مقابل) / حجم نیمکره ایسکمیک طرف مقابل × 100.

رنگ آمیزی Nissl و H&E

موش‌ها عمیقاً بیهوش شدند و سپس کل مغز به‌سرعت از جمجمه خارج شد و با استفاده از پارافورمالدئید 4 درصدی که در موم پارافین جاسازی شده بود، تثبیت شد و به برش‌هایی به ضخامت 7 میکرومتر تقسیم شد. مقاطع با Nissl و H&E رنگ آمیزی شدند. در این مطالعه، شش میدان تصادفی 200×200 میکرومتر در هر نمونه بافت با میکروسکوپ نوری ثبت شد. تعداد بدنه های نیسل با نرم افزار IPP نسخه 6.0 شمارش شد.

سنجش آبی ایوانز

موش ها با 2٪ EB پس از MCAO/R تزریق شدند. دو ساعت بعد، موش‌ها بیهوش شدند و کل مغز به سرعت خارج شد و در استون همگن شد. مواد رویی در طول موج 620 نانومتر توسط یک خواننده جذب 800 TS آنالیز شدند.

اندازه گیری فعالیت های کاتالاز (CAT)، سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، مالون دی آلدئید (MDA) و گلوتاتیون پراکسیداز (GSH-Px)

تمام نمونه‌های سرم با سرعت 4، 000 × دور در دقیقه به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتریفیوژ شدند و سپس برای شناسایی فعالیت‌های MDA، CAT، SOD و GSH-Px طبق دستورالعمل‌های سازنده آنالیز شدند.

تحلیل وسترن بلاتینگ

بافت‌های مغز (100 میلی‌گرم) جمع‌آوری‌شده از هر موش صحرایی همگن شده و در بافر لیز RIPA لیز شدند و سپس برای تشخیص غلظت پروتئین با استفاده از کیت BCA آنالیز شدند. پروتئین کل بافت بر روی ژل SDS-PAGE 10% بارگذاری شده و بر روی یک غشای نیتروسلولزی منتقل شد. غشاء با استفاده از شیر بدون چربی 5 درصد مسدود شد، سپس یک شبه با آنتی بادی های اولیه در دمای 4 درجه انکوبه شد. غشاء سپس با یک آنتی بادی ثانویه انکوبه شد. آنالیز وسترن بلات با استفاده از سیستم تصویربرداری دیجیتال کداک مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

آنالیز ایمونوفلورسانس

رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس برای CD31، a-SMA، ZO{2}}، claudin5، ocludin، PDGFRb، SYN، PSD95، MAP{5}}، Nrf-2 و Keap{7}} انجام شد. آنتی بادی های اولیه علیه Nrf-2، CD31، a-SMA، ZO{11}}، claudin5، ocludin، PDGFRb، SYN، PSD95، MAP{14}} و Keap-1 به 1 رقیق شدند. :200 و 1:100، به ترتیب. آنتی بادی های ثانویه الکسا فلور 488 موش ضد خرگوش IgG و رودامین (TRITC) بز ضد خرگوش IgG هر دو به 1:200 رقیق شدند. هسته ها توسط Hoechst 33258 رنگ آمیزی شدند. تصاویر با استفاده از سیستم تصویربرداری کمی آسیب شناسی خودکار Vectra® Polaris (PerkinElmer، USA) گرفته شد. بیان پروتئین با استفاده از نرم افزار IPP نسخه 6.0 تجزیه و تحلیل شد. تحلیل آماری

تمام داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار توصیف شدند. نرم افزار SPSS نسخه 22.{1}} برای تجزیه و تحلیل آماری انجام شد. هنگام مقایسه گروه های مختلف از آنالیز واریانس یک طرفه استفاده شد. P < 0.05 به عنوان تفاوت آماری در نظر گرفته شد.

توبولوزای طبیعی سیستانچی برای بیماری ضد ایسکمیک PHGS75% ECH 30% ACT 12%

نتایج

TG ها باعث افزایش وزن بدن و کاهش آسیب های مغزی در موش های صحرایی MCAO/R می شوند

پس از 14 روز درمان با TGs، PSs، Oss، و EDI، وزن بدن، نقایص عصبی، و حجم انفارکتوس موش I/R بررسی شد. نتایج نشان داد که وزن بدن در گروه MOD بسیار کاهش یافته است، در حالی که وزن کاهش یافته در گروه های TGs، PSs و EDI افزایش یافته است (شکل 2A). نمرات نقص عصبی به طور قابل توجهی توسط EDI و TGs کاهش یافت (شکل 2B). برش های مغز در موش های گروه NOR قرمز تیره بود و انفارکتوس وجود نداشت، در حالی که موش های گروه MOD انفارکتوس مغزی بزرگ همان طرف را نشان دادند. پس از درمان TGs، حجم انفارکتوس به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 2C، D). تیمار PS و OSs هیچ اثر آشکاری بر شاخص های فوق نشان نداد. داده های بالا نشان داد که TG ها می توانند به طور قابل توجهی آسیب مغزی ناشی از I/R را کاهش دهند، اما PS ها و OS ها نمی توانند.

TG ها آسیب هیستوپاتولوژیک را در موش های صحرایی MCAO/R بهبود می بخشد

برای تعیین برخی از اثرات درمان TGs، PSs و OSs بر آسیب هیستوپاتولوژیک، رنگ‌آمیزی H&E برای آشکارسازی آسیب پاتولوژیک انجام شد. ساختارهای هیستومورفولوژیکی مغز در گروه NOR به طور منظم مرتب شد. تغییرات مورفولوژی در گروه های TGs جزئی تر از گروه MOD بود. با این حال، گروه‌های تیمار PS و OSs هیچ بهبود قابل توجهی در تغییرات مورفولوژی نشان ندادند (شکل 3).

TG ها آسیب عصبی را پس از موش های القا شده با I/R کاهش می دهند

رنگ آمیزی Nissl تغییرات هیستوپاتولوژیک نورون ها را در نیم سایه ناحیه ایسکمیک نشان داد. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، نورون های طبیعی دارای یک هسته واضح و ساختار دست نخورده بودند. در گروه MOD، نورون ها فضاهای بین سلولی بزرگ شده داشتند. اجساد نیسل ناپدید شده، منقبض شده و عمیقاً لکه دار شده اند. با این حال، این تغییرات به ندرت در گروه های EDI، TGs و PS مشاهده شد. این نتایج نشان داد که TGs و PS ها می توانند به طور قابل توجهیکاهش آسیب عصبی ناشی از ایسکمی/پرفیوژن مجدد.

TG ها اختلال BBB را پس از موش های تحت درمان I/R کاهش می دهند

روش ایوانز آبی روشی کلاسیک برای تحقیق در مورد تغییر نفوذپذیری BBB است. نتایج آزمایش نشان داد که افزایش آبی ایوانز در گروه MOD مشاهده شد، در حالی که آبی ایوانز به طور قابل توجهی در موش های تحت درمان با TG و EDI کاهش یافت. علاوه بر این، بین گروه های درمانی PS و OSs تفاوت معنی داری وجود نداشت (شکل 5). این نتایج نشان داد که TG ها می توانند به طور قابل توجهی اختلال BBB را کاهش دهند.

TG ها رگ زایی را در موش های آسیب دیده I/R ترویج می کنند

مطالعات جدیدتر نشان می دهد که رگ زایی نقش مهمی در بهبود عملکرد عصبی و پیامدهای پیش آگهی پس از سکته مغزی ایسکمیک حاد ایفا می کند (Yuen et al., 2015). برای ارزیابی اثرات TGs، PSs و OSs بر روی رگزایی، CD31 و a-SMA برای تعیین کمیت تعداد مویرگی استفاده شد. رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس نشان داد که گروه MOD باعث کاهش قابل توجه بیان CD31 (شکل 6A, B) و a-SMA (شکل 6C, D) در نیم سایه نواحی ایسکمیک موش های I/R در مقایسه با موش های نرمال شد. . این نتیجه نشان داد که I/R می‌تواند باعث آسیب عروقی در نیم‌کره قشر نیمکره‌های ایسکمیک شود. با این حال، درمان TGs و EDI به طور قابل توجهی باعث افزایش تراکم مویرگی، رگزایی، و شریان زایی شد که با افزایش بیان CD31 و a-SMA نشان داد. این نتایج نشان می دهد که TG ها می توانند رگزایی را در نیم سایه ایسکمیک موش های I/R ترویج کنند، اما PS ها و OS ها نتوانستند.

TG ها بیان پروتئین های اتصال محکم را در موش های آسیب دیده I/R افزایش می دهند

اختلال BBB می تواند محتوای آب مغز و تورم بافت را افزایش دهد و منجر به آسیب مغزی شود. پروتئین های اتصال محکم اجزای ساختاری مهم BBB هستند. برای آزمایش اینکه آیا درمان TGs، PS و OSs بعد از سکته مغزی ممکن است بر یکپارچگی BBB تأثیر بگذارد، بیان ZO-1، claudin-5، و اکلودین با تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس انجام شد. نتایج نشان داد که عبارات کلودین-5، اکلودین و ZO-1 در گروه MOD به طور مشهود کاهش یافته است. با این حال، آنها به طور قابل توجهی پس از 14 روز از تجویز آن افزایش یافته است. گروه های PS و OSs هیچ تغییر قابل توجهی در بیان این پروتئین نشان ندادند (شکل 7). این داده ها نشان داد که TG ها می توانند بیان پروتئین اتصال محکم را تنظیم کنند و احتمالاً یکپارچگی BBB را پس از آسیب I / R حفظ کنند.

TG ها پوشش پری سیتی را در مویرگ ها در موش های آسیب دیده I/R افزایش می دهند

پوشش پری سیتی روی مویرگ ها نقش مهمی در حفظ یکپارچگی BBB ایفا می کند. بنابراین، ما آزمایش کردیم که آیا پوشش پری سیتی را می توان با درمان TGs، PSs و OSs افزایش داد یا خیر. نتایج آنالیز شدت ایمونوفلورسانس نشان داد که هر دو عبارات PDGFRb و CD31 به طور چشمگیری در گروه MOD کاهش یافتند. تجویز TGs به موش های I/R به طور قابل توجهی شدت بیان PDGFRb و CD31 را بهبود داد یا حتی افزایش داد، اما هیچ تفاوتی در گروه های درمان PS و OSs مشاهده نشد (شکل 8). بنابراین، درمان TGs می تواند به طور قابل توجهی پوشش پری سیتی را افزایش دهد. این یافته ها بیشتر تایید کرد که TG ها می توانند یکپارچگی BBB را پس از I/R حفظ کنند.

توبولوزای طبیعی سیستانچی برای پیشگیری از سکته مغزی ایسکمیک PHGS75% ECH 30% ACT 12%