اختلال در تنظیم RNA عنصر قابل انتقال در کروی های سه بعدی سرطان ریه KRAS (G12C) جهش یافته

خلاصه

KRAS جهش‌یافته RNA عنصر قابل انتقال (TE) و بیان ژن تحریک‌شده با اینترفرون (ISG) را تنظیم می‌کند، اما مشخص نیست که آیا جهش‌های متنوع در KRAS بر RNA‌های مختلف TE در سراسر ژنوم تأثیر می‌گذارند یا خیر. ما رونوشت‌های کروی‌های سه بعدی سرطان ریه انسان را که دارای جهش‌های KRAS (G12C) هستند، برای تعیین چشم‌انداز RNA‌های TE که توسط جهش‌یافته KRAS (G12C) تنظیم می‌شوند، تجزیه و تحلیل کردیم. ما دریافتیم که سیگنال‌دهی KRAS(G12C) برای بیان TE RNAهای مشتق از LINE و LTR که متمایز از TE RNAهایی هستند که قبلاً نشان داده شده بود توسط KRAS (G12D) یا KRAS (G12V) جهش یافته تنظیم می‌شوند، مورد نیاز است. علاوه بر این، مهار KRAS (G12C) به طور خاص RNA های TE مشتق شده از SINE را از جوانترین زیرخانواده Alu Alu تنظیم مثبت می کند. نتایج ما نشان می‌دهد که اختلال در تنظیم TE RNA در سلول‌های سرطان ریه مبتنی بر KRAS وابسته به جهش است، در حالی که زیرمجموعه‌ای از TE RNA‌های جوان مشتق از Alu را برجسته می‌کند که به طور هماهنگ با ژن‌های ایمنی ذاتی بر روی مهار KRAS (G12C) فعال می‌شوند.

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

معرفی

RNA های عنصر قابل انتقال (TE) به طور مکرر در زمینه سرطان تنظیم نمی شوند. عناصر LTR 2،3. علاوه بر RNA های TE، RNA های طولانی غیرکدکننده (lncRNAs) نیز به طور هماهنگ با ژن های سیگنال دهنده RAS 4 تنظیم می شوند و الگوهای بیان آنها به طور مشابه در بسیاری از سرطان ها تغییر می کند 5-8. برای TE RNA ها، تنظیم مثبت آنها در سرطان حالتی از تقلید ویروسی را القا می کند که منجر به فعال شدن ذاتی ژن های ایمنی ذاتی مانند ژن های تحریک شده با اینترفرون (ISGs) 3،9،10 می شود. به طور خاص، خانواده Alu از SINE ها منبع غالب TE RNA های ایمنی 11 هستند که توسط تغییرات اپی ژنتیکی ناشی از مهارکننده های DNA متیل ترانسفراز (DNMTi) یا مهار KZNF با واسطه KRAS جهش یافته 3،9،10 القا می شوند.

برای بررسی اینکه چگونه یک جهش رایج در KRAS بر چشم انداز TE RNA در سلول های سرطان ریه تأثیر می گذارد، رونوشت های کروی های سه بعدی سرطان ریه را که دارای جهش های KRAS (G12C) در حضور یا عدم حضور مهارکننده جهش یافته KRAS (G12C) 12 هستند، مشخص کردیم. سیگنال دهی KRAS(G12C) برای بیان TE RNA های مشتق از LINE و LTR مورد نیاز است، در حالی که مهار KRAS(G12C) به طور خاص هر دو TE RNA مشتق شده از SINE و زیر مجموعه ای از ژن های مرتبط با اینترفرون (IFN) را تنظیم می کند. یافته‌های ما تأثیر متقابل پیچیده بین سیگنال‌دهی KRAS جهش یافته و اختلال در تنظیم TE در سلول‌های سرطان ریه را نشان می‌دهد، جایی که مجموعه‌ای از عناصر جوان AluY به شیوه‌ای وابسته به جهش تنظیم می‌شوند.

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

نتایج

مهار KRAS (G12C) رونوشت کد کننده و غیر کد کننده را تغییر می دهد

برای تعیین اینکه چگونه سیگنال‌دهی انکوژنی KRAS (G12C) رونوشت کدکننده و غیرکدکننده را تنظیم می‌کند، ما توالی‌یابی RNA (RNA-seq) را روی کروی‌های سرطان ریه جهش یافته KRAS (G12C) سه بعدی انجام دادیم. برای RNA-seq، ما از یک پروتکل تمام طول با شناسه‌های مولکولی منحصر به فرد (UMIs) 5 برای فعال کردن شمارش دقیق RNA و در عین حال کاهش سوگیری‌های تقویت PCR 13 استفاده کردیم (شکل 1A). ما رونوشت‌های اسفروئیدهای سرطان ریه H358 تحت درمان با مهارکننده KRAS(G12C) ARS{11}} (ARS) را با کروی‌های کنترل شده (درمان‌شده با DMSO) (شکل S1A) مقایسه کردیم و دیدیم که درمان ARS به‌طور قابل‌توجهی سطوح ERK فسفریله شده را کاهش داد. (p-ERK) (شکل S1B)، نشان می دهد که درمان ARS سیگنال دهی پایین دستی KRAS (G12C) را مهار می کند. سرکوب سیگنال دهی KRAS (G12C) توسط درمان ARS نیز با کاهش اندازه کروی و زنده ماندن سلول مشهود شد (شکل S1C و S1D).

در سطح RNA، ما فراوانی نسبی بیوتیپ‌های مختلف و ابرخانواده‌های TE را در کروی‌های سه بعدی سرطان ریه تحت درمان با ARS یا DMSO ارزیابی کردیم که تغییرات دینامیکی را در ترکیب TE RNA بر مهار KRAS (G12C) نشان داد (شکل 1B). در حالی که ما فقط 32٪ از ژن های کد کننده پروتئین مشروح GENCODE و 15٪ از ژن های lncRNA را شناسایی کردیم، 92-96٪ از ابرخانواده های TE (92٪ LTR، 95٪ SINE، 96٪ LINE) در برچسب UMI ما نشان داده شدند. داده‌های RNA-seq، نشان‌دهنده اختلال در تنظیم گسترده RNA‌های TE در رونوشت مبتنی بر KRAS(G12C). بیش از یک چهارم تمام مولکول های RNA شناسایی شده در کروی های سرطان ریه تحت درمان با ARS از TE ها مشتق شده اند، که نشان می دهد TE RNA ها بخش قابل توجهی از خروجی رونویسی سلول های سرطانی ریه KRAS (G12C) جهش یافته را نشان می دهد.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

در مرحله بعد، ژن‌های بیان‌شده به‌طور قابل‌توجهی را بین کروییدهای سه بعدی سرطان ریه تحت درمان با ARS و DMSO تعیین کردیم تا فرآیندهای بیولوژیکی را که با سیگنال‌دهی KRAS (G12C) انکوژن تنظیم می‌شوند، شناسایی کنیم. کروی های سرطان ریه با سیگنال دهی دست نخورده KRAS (G12C) به طور قابل توجهی برای ژن های دخیل در ایست بازرسی G2M، اهداف E2F، اهداف MYC و دوک میتوزی غنی شدند (شکل 1C). با این حال، پس از مهار KRAS (G12C)، کروی های سرطان ریه به طور قابل توجهی سطوح بالاتری از ژن های دخیل در فسفوریلاسیون اکسیداسیون، مکمل و پاسخ های آلفا و گاما IFN را بیان کردند (شکل 1C)، که شواهد حمایتی بیشتری را برای دخالت سیگنالینگ KRAS در تنظیم ارائه می کند. ژن های مرتبط با IFN 2،3.

مهار KRAS (G12C) به طور هماهنگ ISG و عناصر AluY جوان را القا می کند.

برای توضیح بیشتر دخول ذاتی ISG ها بر مهار KRAS (G12C)، ما شناسایی کردیم که کدام ژن ها و TE ها به ترتیب در هر مجموعه ژن و ابرخانواده TE به طور قابل توجهی متفاوت بیان می شوند. در هر دو ژن پاسخ گاما IFN و IFN، قوی‌ترین ژنی که بر مهار KRAS(G12C) در کروی‌های سرطان ریه القا می‌شود، RTP4 (شکل 2A)، یک پروتئین ناقل گیرنده است که سیگنال‌دهی TBK1 را به طور منفی تنظیم می‌کند. علاوه بر این، کمپلکس کلاس I MHC ژن بتا{6}میکروگلوبولین (B2M)، که به طور مکرر در سرطان ریه 15 غیرفعال می شود، همچنین در هر دو مجموعه ژن مرتبط با IFN در اسفروئیدهای سرطان ریه تحت درمان با ARS به طور قابل توجهی تنظیم مثبت شد (شکل 2A).

با توجه به نقش مستقیم سیگنال‌دهی KRAS انکوژن در مقررات TE RNA 3، ما بررسی کردیم که کدام زیرخانواده‌های TE RNA به KRAS جهش یافته (G12C) وابسته هستند. در کروی های سرطان ریه با سیگنال دهی دست نخورده KRAS (G12C)، ما دریافتیم که زیرخانواده های LINE L1M6B و L1PA12 به شدت بیان شده و به KRAS (G12C) وابسته بودند، همانطور که با کاهش آنها در اسفروئیدهای سرطان ریه تحت درمان با ARS مشهود است (شکل 2B). علاوه بر این، در حالی که تنها یک زیرخانواده DNA منفرد MER44D به سیگنال‌دهی KRAS (G12C) وابسته بود، بیش از دوازده زیرخانواده LTR توسط KRAS (G12C) جهش‌یافته، از جمله MLT1A0-int، LTR51، MER5{17}}B تنظیم شدند. و LTR1B0 (شکل 2B). در مقابل، زیرخانواده های SINE همگی به طور قابل توجهی با مهار KRAS (G12C) تنظیم مثبت شدند و به طور هماهنگ با ژن های خاص ISG (شکل 2A) در اسفروئیدهای سرطان ریه القا شدند. این RNA های SINE TE همگی از زیرخانواده AluY مشتق شده اند (شکل 2B)، که نشان می دهد مهار KRAS(G12C) زیرمجموعه خاصی از عناصر جوان AluY را تنظیم نمی کند.

مهار KRAS (G12C) RNA های طولانی غیر کد کننده را کاهش می دهد

برای روشن کردن بیشتر اثرات مهار KRAS (G12C) بر روی رونوشت، ما همه lncRNAهای متفاوت بیان شده را در اسفروئیدهای سرطان ریه تحت درمان با کنترل ARS یا DMSO بررسی کردیم. ما دریافتیم که تعداد زیادی از lncRNA ها برای بیان خود به سیگنال دهی KRAS(G12C) وابسته بودند، زیرا بسیاری از این lncRNA ها به طور قابل توجهی با مهار KRAS(G12C) کاهش یافتند (شکل 3A). سه مورد از این lncRNAهای تنظیم‌شده، AC114546.3، NCMAP-DT، و AC073575.2، هیچ عملکرد شناخته‌شده‌ای ندارند، اما به ترتیب در جهت‌گیری آنتی‌سنس با ژن‌های کدکننده ZNF770، RCAN3 و ERP29 همپوشانی دارند. به عنوان یک کلاس از RNA غیرکدکننده، ما کاهش گسترده lncRNA ها را در درمان ARS در کروی های سرطان ریه مشاهده کردیم (شکل 3B)، که نشان می دهد بسیاری از lncRNA ها برای بیان خود به سیگنال دهی KRAS(G12C) وابسته هستند.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

بحث

در اینجا نشان می‌دهیم که سیگنال‌دهی انکوژنی KRAS (G12C) برای بیان ابرخانواده‌های خاص TE، یعنی عناصر LINE و LTR، و همچنین زیرمجموعه‌ای از lncRNAها مورد نیاز است، و بیشتر نشان می‌دهد که چگونه سیگنال‌دهی RAS رونوشت‌های غیرکدکننده 2-4 را تنظیم می‌کند. ما همچنین از یک مدل کروی سه بعدی سرطان ریه برای آزمایش‌های بازدارنده KRAS (G12C) خود استفاده کردیم، زیرا نشان داده شده است که مدل‌های سه‌بعدی در مقایسه با مدل‌های کشت دوبعدی 16، پاسخ دارویی in vivo را به طور صادقانه‌تری خلاصه می‌کنند. تکنیک RNA-seq-length 13 به ما این امکان را داد که با حذف موارد تکراری PCR در داده‌های RNA-seq خود، ترکیب و پویایی TE RNA را در اسفروئیدهای سرطان ریه خود با دقت بیشتری ثبت کنیم.

یافته‌های ما با مطالعات قبلی مهار KRAS (G12C) مطابقت دارد، که در آن ژن‌های پاسخ IFN آلفا و گاما در سلول‌های سرطان ریه H358 تحت درمان با ARS تنظیم مثبت شدند. دخیل خاص عناصر AluY جوان بر مهار KRAS (G12C) حداقل تا حدی مسئول دخول قوی ISGs در اسفروئیدهای سرطان ریه تحت درمان با ARS است. قابل‌توجه، غنی‌سازی قابل‌توجه ژن‌های مرتبط با IFN در پاسخ به درمان با مهارکننده KRAS (G12C) شامل تنظیم مثبت بیشتر ISG‌های حسگر RNA مانند MDA{10}}، RIG-I، یا PKR نمی‌شود، که در ابتدا در تنظیم مثبت می‌شوند. سلول های ریه در پاسخ به سیگنالینگ KRAS انکوژن 2،3.

ما قبلاً نشان داده‌ایم که سیگنال‌دهی KRAS جهش‌یافته به تنهایی برای القای دخول TE RNA در سلول‌های ریه انسان که در شرایط آزمایشگاهی 2،3 تبدیل شده‌اند کافی است، و نتایج ما که در اینجا توضیح داده شده‌اند این مشاهدات را به سلول‌های سرطان ریه با یک جهش فعال‌کننده KRAS متفاوت گسترش می‌دهند. جهش‌های KRAS (G12D) یا KRAS (G12V) هر دو موجب افزایش قابل توجه زیرخانواده LTR12C در سلول‌های ریه تبدیل‌شده 3 می‌شوند، اما ما غنی‌سازی قابل‌توجهی از TE RNAهای مشتق از LTR12C در کروی‌های سرطان ریه KRAS (G12C) خود را مشاهده نکردیم. درعوض، شاهد دگرگونی LTR51، LTR1B{11}}، LTR14B، و LTR28B بودیم که نشان می‌دهد جهش‌های مختلف افزایش عملکرد در KRAS جنبه‌های مختلف رونوشت TE RNA را تنظیم می‌کنند.

کار ما ارزیابی جامعی از نحوه پاسخ پویا رونوشت RNA غیرکدکننده/TE RNA به مهار KRAS (G12C) ارائه می‌کند. مطالعات آینده ممکن است بینش جدیدی در مورد نقش بالقوه RNA های غیر کد کننده/TE در مکانیسم های مقاومت در برابر مهارکننده KRAS (G12C) ارائه دهد. علاوه بر این، RNA های TE که از سلول های سرطانی در اثر مهار KRAS ترشح می شوند، ممکن است به عنوان نشانگرهای زیستی RNA خارج سلولی 2،3،5،18،19 پاسخ و/یا مقاومت به درمان های مهارکننده KRAS عمل کنند.

مواد و روش ها

خطوط سلولی

رده های سلولی سرطان ریه H358 حاوی جهش KRAS(G12C) در محیط کشت RPMI 1640 (Invitrogen) همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی (سیگما) در دمای 37 درجه، CO2 5 درصد در انکوباتور مرطوب شده کشت داده شدند. همه رده های سلولی برای مایکوپلاسما منفی شدند. خطوط سلولی از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (ATCC) خریداری شد.

سنجش بقای سلولی

برای سنجش زنده ماندن کروی، 10،000 سلول/چاه در پلیت‌های چاهک پایین گرد با چسبندگی کم کاشته شدند و در دمای 37 درجه، 5 درصد CO2 به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. سپس ARS{7}} یا DMSO رقیق شده به صورت سریال به سلول ها اضافه شد و پلیت ها در شرایط کشت استاندارد به مدت 72 ساعت انکوبه شدند و محیط های ARS و DMSO تازه روزانه جایگزین شدند. بقای سلول با استفاده از کیت سنجش زنده ماندن سلولی Luminescent Cell Titer-Glo® (Promega) طبق پروتکل سازنده اندازه گیری شد. سیگنال لومینسانس نمونه های تیمار شده با ARS به کنترل DMSO نرمال شد. لومینسانس بر روی دستگاه مولکولی SpectraMax iD3 اندازه گیری شد.

جداسازی RNA

RNA توده کل از حدود 100 کروی H358 (در هر شرایط) با استفاده از کیت Quick-RNA Mini-Prep (Zymogen) طبق پروتکل سازنده جدا شد. RNA از طریق اسپکتروفتومتر NanoDrop اندازه‌گیری شد.

آماده سازی کتابخانه RNA-seq

یک پروتکل اقتباس شده Smart-seq3 13 برای تولید کتابخانه های RNA-seq از RNA کل برای شمارش و ارزیابی مولکول های RNA تمام قد استفاده شد. به طور خلاصه، 10 نانوگرم از RNA کل با استفاده از یک پرایمر بارکد oligoDT (125 نانومتر) و سپس تعویض الگو با سوئیچ الگوی بارکد الیگو (125 نانومتر) معکوس شد. این توالی های اولیگو به عنوان آغازگر برای تقویت PCR خدمت کردند. کیت Nextera HT (Illumina) برای تبدیل کتابخانه‌های cDNA به کتابخانه‌های توالی‌یابی با افزودن پرایمر مخصوص UMI برای تقویت انتهای cDNA حاوی بارکدهای مولکولی همانطور که در پروتکل Smart-seq3 توضیح داده شده است، استفاده شد. cDNA و کیفیت کتابخانه با استفاده از یک تراشه با حساسیت بالا DNA bioanalyzer Agilent ارزیابی شد و با استفاده از سنجش DNA با حساسیت بالا در Qubit 3.0 کمی سازی شد.

وسترن بلات

تقریباً 100 اسفروئید H358 (در هر شرایط) به دنبال درمان ARS یا DMSO جدا شد. سپس اسفروئیدها در بافر RIPA همراه با مهارکننده پروتئاز به مدت 15 دقیقه روی یخ انکوبه شدند. سپس لیزات در 10،{4}} RCF به مدت 10 دقیقه چرخانده شدند. سپس مایع رویی به یک لوله جدید برای آماده سازی نمونه SDS-PAGE بعدی در بافر Laemmli، به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد برای غلظت نهایی 1 میلی گرم بر میلی لیتر جوشانده شد. SDS PAGE برای جداسازی پروتئین بر اساس اندازه و سپس انتقال بعدی به غشای PVDF انجام شد. غشاها با آنتی‌بادی‌های اولیه p-ERK (CST) و HSP90 (CST) یک شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. سپس آنتی‌بادی‌های ثانویه (Abcam) روی غشاهای 3 بار شسته شده با TBST در بافر مسدودکننده برای تصویربرداری بعدی انکوبه شدند.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

حذف مجدد UMI

قرائت‌های جفت illumina انتهایی با استفاده از FastP 21 با تنظیمات پیش‌فرض، آداپتور کوتاه شده است. UMI ها از خوانده شده استخراج شدند و با استفاده از umi{1}}ابزارها_عصاره umi از بسته UMI-tools 22 با الگوی بارکد روی "NNNNNNNN" به نام خوانده شده منتقل شدند. خواندن های حذف شده UMI با استفاده از هم تراز STAR با مجموعه حاشیه نویسی GENCODE v38 با HG38 تراز شدند. خواندن های تراز شده با استفاده از "UMI-tools dedup" با تنظیمات پیش فرض حذف شد.

تجزیه و تحلیل RNA-seq

همه فایل‌های fastq با Trimmomatic 2 (0.38) 23 برش داده شدند و فایل‌های برش‌شده حاصل با FastQC 24 ارزیابی شدند و سپس با خط لوله تحلیلی زیر پردازش شدند: Salmon (1.3.0): شبه هم‌ترازی RNA خواندن seq با Salmon 25 با استفاده از آرگومان های زیر انجام شد: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 با استفاده از یک نمایه ایجاد شده از GENCODE نسخه 35 فایل رونویسی fasta با استفاده از توالی های فریب برای فعال کردن تراز انتخابی. یک شاخص TE-aware اضافی به روشی مشابه ایجاد شد، اما با توالی های تولید شده از مسیر UCSC Repeat Masker تکمیل شد. DESeq2 (1.32.0): خروجی ماهی قزل آلا با استفاده از tximport 26 به یک شی DESeq وارد شد و تجزیه و تحلیل بیان دیفرانسیل با آرگومان های استاندارد 27 انجام شد. همه نتایج برای داشتن padj < 0.05 فیلتر شدند. در جایی که داده‌های شمارش استفاده شد، با استفاده از DESeq در بین نمونه‌ها نرمال شد.

تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه ژن

ژن‌های بیان‌شده متفاوت با مقادیر log2FoldChange کوچک‌شده تولید شده توسط DESeq2 رتبه‌بندی شدند. مجموعه‌های ژنی با استفاده از بسته R msigdbr (7.4.1) به‌دست آمدند و فیلتر شدند تا فقط شامل مجموعه‌های ژنی با وضعیت «Hallmark» باشند. بسته R fgsea (1.18.{7}}) برای تولید تخمین‌های غنی‌سازی مجموعه ژن‌ها استفاده شد که برای نتایج با pvalueهای تنظیم‌شده <0.05 فیلتر شدند.

منابع

1. Burns, KH (2017). عناصر قابل انتقال در سرطان Nat Rev Cancer 17، 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.

2. رجیاردو، RE، مارولی، اس وی، هالاس، اچ، اوزن، ام.، کاریلو، دی.، لامونتاگن، ای.، وایتهد، ال.، کیم، ای.، مالیک، اس.، فرناندز، جی.، و همکاران (2020). برنامه ریزی مجدد اپی ژنومیک RNA های تکراری غیر کدکننده و ژن های تحریک شده با IFN توسط KRAS جهش یافته. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.

3. Reggiardo، RE، Maroli، SV، Halasz، H.، Ozen، M.، Hrabeta-Robinson، E.، Behera، A.، Peddu، V.، Carrillo، D.، LaMontagne، E.، Whitehead، L. .، و همکاران (2022). KRAS جهش یافته RNA عنصر قابل انتقال و ایمنی ذاتی را از طریق ژن های انگشت روی KRAB تنظیم می کند. Cell Reports 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.

4. کیم، دی اچ، مارینوف، جی کی، پپکه، اس.، سینگر، ZS، هی، پی، ویلیامز، بی.، شروت، جی پی، الوویتز، ام بی، و وولد، بی جی (2015). تجزیه و تحلیل رونوشت تک سلولی تغییرات پویا در بیان lncRNA را در طول برنامه ریزی مجدد نشان می دهد. سلول بنیادی سلولی 16، 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.

5. Reggiardo، RE، Maroli، SV، و Kim، DH (2022). نشانگرهای زیستی LncRNA التهاب و سرطان. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.

6. اشمیت، AM، و چانگ، HY (2016). RNA های طولانی غیر کد کننده در مسیرهای سرطانی سلول سرطانی 29، 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.

7. Rinn, JL, and Chang, HY (2020). RNA های غیر کد کننده طولانی: روش های مولکولی برای عملکردهای موجودات زنده. Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.

8. Slack، FJ، و Chinnaiyan، AM (2019). نقش RNA های غیر کد کننده در انکولوژی سلول 179، 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.

9. Chiappinelli، Katherine B.، Strissel، Pamela L.، Desrichard، A.، Li، H.، Henke، C.، Akman، B.، Hein، A.، Rote، Neal S.، Cope، Leslie M. اسنایدر، ا.، و همکاران. (2015). مهار متیلاسیون DNA باعث پاسخ اینترفرون در سرطان از طریق dsRNA از جمله رتروویروس های درون زا می شود. سلول 162، 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.

10. Roulois، D.، Loo Yau، H.، Singhania، R.، Wang، Y.، Danesh، A.، Shen، Shu Y.، Han، H.، Liang، G.، Jones، Peter A.، Pugh، Trevor J.، و همکاران. (2015). عوامل دی متیل کننده DNA با القای تقلید ویروسی توسط رونوشت های درون زا، سلول های سرطانی کولورکتال را هدف قرار می دهند. سلول 162، 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.

11. مهدی پور، پی، مارهون، س.، اطایبی، آی، چاکروارثی، ع.، حسینی، ع.، وانگ، ی.، د کاسترو، فا، لو یاو، اچ، ایشاک، سی، آبلسون، اس. .، و همکاران (2020). درمان اپی ژنتیک باعث رونویسی SINE های معکوس و وابستگی به ADAR1 می شود. طبیعت 588، 169-173. 10.1038/s41586-020-2844-1.

12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA, and Shokat, KM (2013). مهارکننده‌های K-Ras (G12C) به‌صورت آلوستریک میل GTP و برهمکنش‌های مؤثر را کنترل می‌کنند. طبیعت 503، 548- 551. 10.1038/nature12796.

13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR, and Sandberg, R. (2020). شمارش RNA تک سلولی در وضوح آلل و ایزوفرم با استفاده از Smart-seq3. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10.1038/s{10}}.

14. He, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK, et al. (2020). RTP4 پاسخ IFN-I را مهار می کند و مالاریا مغزی تجربی و آسیب شناسی عصبی را افزایش می دهد. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.

15. Pereira، C.، Gimenez-Xavier، P.، Pros، E.، Pajares، MJ، Moro، M.، Gomez، A.، Navarro، A.، کاندوم، E.، Moran، S.، Gomez- لوپز، جی، و همکاران. (2017). پروفایل ژنومی زنوگرافت های مشتق شده از بیمار برای سرطان ریه، غیرفعال سازی B2M را شناسایی می کند که باعث اختلال در تشخیص ایمنی می شود. Clin Cancer Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.

16. Sen, C., Freund, D., and Gomperts, BN (2022). مدل های سه بعدی ریه: گذشته، حال و آینده: یک بررسی کوچک. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. موگارزا، ای.، ون مالدگم، اف.، بوملها، جی.، مور، سی، رانا، اس.، لوریان سوپنا، م.، شرق، پی، آمبلر، آر.، آناستازیو، پی، رومرو -کلاویخو، پی، و همکاران. (2022). مهار درمانی KRAS (G12C) باعث ایجاد ایمنی ضد توموری موثر با واسطه اینترفرون در سرطان های ریه ایمنی می شود. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.

18. خوجه، آر.، رجیاردو، RE، اوزن، ام.، مارولی، اس وی، کریلو، دی.، دمیرچی، یو.، و کیم، دی اچ (2022). امضاهای RNA خارج سلولی سلول های آدنوکارسینومای ریه KRAS (G12C) جهش یافته. bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.

19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF, and Demirci, U. (2021). به سوی جداسازی و تشخیص اگزوزوم مبتنی بر میکروفلوئید برای درمان تومور. Nano Today 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.

20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F., and Malek, S. (2021). درمان های هدفمند RAS Nat Rev Drug Discov. 10.1038/s{5}}.

21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., and Gu, J. (2018). fastp: یک پیش پردازشگر فوق سریع همه در یک FASTQ. بیوانفورماتیک 34, i884-i890. 10.1093/bioinformatics/bty560.

22. اسمیت، تی، هگر، ا.، و سادبری، آی. (2017). UMI-tools: مدل سازی خطاهای توالی در شناسه های مولکولی منحصر به فرد برای بهبود دقت کمی. Genome Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116.

23. Bolger، AM، Lohse، M.، و Usadel، B. (2014). Trimmomatic: یک صاف کننده انعطاف پذیر برای داده های توالی Illumina. بیوانفورماتیک 30، 2114-2120. 10.1093/bioinformatics/btu170.

24. براون، جی.، پیرونگ، ام.، و مک کیو، لس آنجلس (2017). داشبورد FQC: نتایج FastQC را در یک ابزار کنترل کیفیت FASTQ مبتنی بر وب، تعاملی و قابل توسعه ادغام می کند. بیوانفورماتیک. 10.1093/bioinformatics/btx373.

25. پاترو، آر.، دوگال، جی.، لاو، MI، آیریزاری، RA، و کینگزفورد، سی (2017). ماهی قزل آلا کمی سازی سریع و آگاهانه از بیان رونوشت را فراهم می کند. Nat Methods 14، 417-419. 10.1038/nmeth.4197.

26. Soneson, C., Love, MI, and Robinson, MD (2015). تجزیه و تحلیل دیفرانسیل برای RNA-seq: برآوردهای سطح رونوشت استنتاج سطح ژن را بهبود می بخشد. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.

27. Love, MI, Huber, W., and Anders, S. (2014). تخمین تعدیل شده تغییر برابر و پراکندگی برای داده های RNA-seq با DESeq2. Genome Biol 15, 550. 10.1186/s13059-014- 0550-8.

سپاسگزاریها

ما از اعضای آزمایشگاه کیم برای بحث های مفید تشکر می کنیم. این کار توسط بودجه دانشکده مهندسی باسکین (به DHK) حمایت شد. DC توسط یک جایزه پیش‌دکتری از برنامه تحقیقاتی بیماری‌های مرتبط با دخانیات (T30DT0997) پشتیبانی شد، RER توسط F99/K{4}} NIDDK KUH جایزه انتقال پیش‌دکتری به پس‌دکتری از مؤسسه ملی بهداشت (1F99DK{) پشتیبانی شد. {7}})، و VP توسط یک جایزه پیش‌دکتری از برنامه تحقیقات بیماری‌های مرتبط با دخانیات (T32DT4904) حمایت شد.

مشارکت های نویسنده

DHK پژوهش را مفهوم‌سازی کرد، DC و DHK تحقیقات طراحی کردند، DC، JL و GM آزمایش‌ها را انجام دادند، RER و VP داده‌ها را تجزیه و تحلیل کردند، و DC و DHK مقاله را با ورودی نویسندگان نوشتند.

ارقام

شکل 1. مهار KRAS(G12C) رونوشت کد کننده و غیرکدکننده A را تغییر می دهد. شماتیک تجربی. ب. توزیع تعداد اختصاص داده شده به کدگذاری GENCODE، lncRNA، و ابرخانواده های TE/repeat در کتابخانه های سرطان ریه کروی RNA-seq تحت درمان با ARS (ars) یا درمان شده با DMSO (dmso)، که در آن هر ستون یک تکرار بیولوژیکی را نشان می دهد. ج. نتایج تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژنی قابل‌توجهی که در اسفروئیدهای سرطان ریه تحت درمان با DMSO (راست، NES مثبت) یا درمان‌شده با ARS (چپ، NES منفی) با استفاده از ژن‌های متفاوت بیان شده رتبه‌بندی شده بر اساس امتیاز غنی‌سازی عادی (NES) مشاهده شد.

شکل 2. مهار KRAS(G12C) بطور هماهنگ ISG و عناصر جوان AluY را القا می کند.

الف. نمودارهای آتشفشانی که بیان تفاوت معنی‌داری را در مجموعه‌های ژنی کلیدی بین اسفروئیدهای سرطان ریه تحت درمان با DMSO (راست، تغییر برابر مثبت) یا درمان‌شده با ARS (چپ، تغییر چین منفی) نشان می‌دهند. B. نمودارهای آتشفشانی که بیان تفاوت معنی‌داری را در ابرخانواده‌های TE بین اسفروئیدهای سرطان ریه تحت درمان با DMSO (راست، تغییر چین مثبت) یا درمان‌شده با ARS (چپ، تغییر چین منفی) نشان می‌دهند.

شکل 3. مهار KRAS(G12C) RNA های طولانی غیر کد کننده را کاهش می دهد.

الف. نمودار آتشفشانی بیان تفاضلی قابل توجه RNAهای کدکننده پروتئین GENCODE و lncRNAها بین اسفروئیدهای سرطان ریه تیمار شده با DMSO (راست، تغییر برابر مثبت) یا درمان شده با ARS (چپ، تغییر چین منفی). B. نمودار باکس بیان تفاضلی معنی‌دار RNAهای کدکننده پروتئین GENCODE و lncRNA بین اسفروئیدهای سرطان ریه تحت درمان با DMSO (بالا، تغییر برابر مثبت) یا درمان‌شده با ARS (پایین، تغییر چین منفی) (Wilcoxon).

شکل تکمیلی

شکل S1.

الف. اسفروئیدهای H{0}D سرطان ریه تحت درمان با ARS یا DMSO. ب. وسترن بلات برای p-ERK و HSP90 با استفاده از اسفروئیدهای H{3}}D سرطان ریه درمان شده با ARS یا DMSO. ج. اندازه‌گیری‌های قطر (بر حسب میکرومتر) (نقشه سمت چپ) و زنده‌مانی سلولی (Cell Titer-Glo® زنده ماندن سلول‌های درخشان در واحدهای فلورسانس نسبی) (نقاط سمت راست) کروی‌های سرطان ریه H{5}D تحت درمان با ARS یا DMSO پس از 3 یا 5 روز درمان (500 نانومولار ARS{9}} یا DMSO). D. اندازه‌گیری قطر (بر حسب میکرومتر) کروی‌های سرطان ریه H{10}D تحت درمان با غلظت‌های مختلف ARS{11}} (nM) به مدت ۷ روز.