اثر کاهش اسید اوریک و مکانیسم آکتوزید و اکیناکووزید استخراج شده از Cistanche Tubulosa

چکیده:هدف از کشف اثرات کاهش اسید اوریک و مکانیسم های آکتوزید (AS) و اکیناکووزید (ECH) استخراج شده ازتوبولوزا.

روشمدل موش Hyperuricemia (HUA) با استفاده از پتاسیم اگزونات (1.5 گرم · کیلوگرم -1 · d {3}}) با آدنین (100 میلی گرم · کیلوگرم {5}}} · D {-1) ایجاد شد. موش های مدل Hua به طور تصادفی به یک گروه کنترل مدل ، یک گروه آلوپورینول (30 میلی گرم · کیلوگرم {8}} · D {9}}) تقسیم شدند ، به عنوان کم و زیاد (50 ، 100 میلی گرم · کیلوگرم {12}} · d {{{{13 {13}}) گروه های DOSE (50 mg · kg -1 · d -1) گروه های دوز. قبلاً یک گروه کنترل عادی تأسیس شده بود. پس از چهار هفته تجویز ، از آنالایزر بیوشیمی خون برای تشخیص سطح Sua Urea ، Crea ، Adenosine Deaminase (ADA) و اسید اوریک (UUA) در ادرار استفاده شد. از روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم برای تشخیص سطح زانتین اکسیداز (XOD) در سرم استفاده شد. بافت کلیه جمع آوری شد و ضریب کلیه وزن و محاسبه شد. از رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین (HE) برای مشاهده تغییرات پاتولوژیک کلیه استفاده شد. ایمونوهیستوشیمی (IHC) و PCR در زمان واقعی برای تشخیص پروتئین و سطح بیان mRNA حمل و نقل اورات 1 (URAT1) ، حمل و نقل گلوکز 9 (GLUT9) ، انتقال دهنده آنیون آلی 1 (OAT1) و حمل و نقل آنیون آلی 3 (OAT3) در بافت کلیه استفاده شد. نتایج AS و ECH می تواند عملکرد کلیه در موش های مدل HUA را بهبود بخشد ، میزان اسید اوریک خون را کاهش دهد ، باعث دفع اسید اوریک ، تنظیم سطح سرمی ADA و XOD شود و پروتئین و بیان mRNA URAT1 و GLUT9 را در بافت کلیه تنظیم کند ، در حالی که تنظیم پروتئین و بیان mRNA OAT1 و OAT3 در بافت کلیه.

نتیجه گیری گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید AS و ECH از Cistanche Tubulosa ممکن است با بهبود عملکرد کلیه در موش های مدل HUA ، کاهش سطح ADA و XOD ، اثرات کاهش اسید اوریک را اعمال کند و بیان URAT1 ، GLUT9 ، OAT1 و OAT3 را تنظیم کند.

کلمات کلیدی: Cistanche Tubulosa; عیار؛ اکیناکوزید ؛ هایپریسمی ؛ کاهش اسید اوریک ؛ مکانیزم

 

 

 

عصاره Cistanche Tubulosa با 16 ٪ آکتوزید

اکنون با ما تماس بگیرید

 

 

 

هایپریوریسمی (HUA) یک بیماری متابولیک است که در اثر متابولیسم پورین بی نظم در بدن انسان ایجاد می شود و منجر به افزایش سطح اسید اوریک خون می شود [1]. به طور معمول هنگامی تشخیص داده می شود که میزان اسید اوریک خون بیش از 7 باشد. 0 mg · dl⁻⁻ (416. {4}} μMOL·L⁻⁻) در مردان و 6. 0 mg · dl⁻ (357. توسعه هایپریوریسمی در درجه اول با عواملی مانند رژیم های غذایی پر رنگ ، مصرف مزمن الکل ، مصرف دارو و کم کاری تیروئید مرتبط است. این امر نه تنها خطر ابتلا به بیماری های قلبی عروقی ، دیابت و فشار خون بالا را افزایش می دهد [11 {{{}] بلکه به میزان قابل توجهی بر سلامت بیماران نیز تأثیر می گذارد.

در حال حاضر ، درمانهای بالینی برای هیپریوریکمی عمدتاً شامل داروهایی است که تولید اسید اوریک را مهار می کنند و دفع اسید اوریک را ترویج می کنند. با این حال ، این درمانها برای بیماران مبتلا به اختلال در کبد یا کلیه محدودیت های خاصی دارند [5-6]. بنابراین ، کاوش در داروهای مؤثر با عوارض جانبی کم برای پیشگیری و درمان هایپریوریسمی از اهمیت بالایی برخوردار است.

Cistanche Tubulosa (Schenk) R. Wight، معمولاً در طب سنتی چینی به عنوان گیاهی با رنگ کلیه مورد استفاده قرار می گیرد ، برای درمان شرایطی مانند ناتوانی جنسی ، ناباروری ، کمبود ذات و خون ، ضعف در قسمت تحتانی کمر و زانوها ، ضعف عضلات و یبوست به دلیل خشکی روده استفاده می شود [7]. مطالعات نشان داده است کهتوبولوزادارای محافظت کننده عصبی [8] ، ضد التهاب [9] ، تنظیم متابولیسم استخوان [10] و اثرات تقویت کننده اثر بخشی در شیمی درمانی برای بیماران سرطانی است [11]. در میان مؤلفه های مختلف فعال آن ، گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید فراوان ترین هستند.

Acteoside (AS) و اکیناکووزید (ECH) ، دو گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید با محتوای زیاد درتوبولوزا، فعالیت بیولوژیکی قوی را نشان می دهد و پتانسیل قابل توجهی برای توسعه و کاربرد دارد. در نتیجه ، گروه تحقیقاتی ما برای مطالعه بیشتر به عنوان و ECH انتخاب شده است. از طریق پیش بینی های فارماکولوژی شبکه و از قبل در موش ها ، ما کشف کردیم که عصاره های گلیکوزید فنیل اتانوئید ازتوبولوزاممکن است یک اثر کاهش اسید اوریک خاص داشته باشد. با این حال ، مسیرها و مکانیسم های این اثرات نامشخص است.

بنابراین ، با استفاده از مکانیسم های تولید اسید اوریک و مسیرهای اصلی دفع آن به عنوان تمرکز تحقیق ، ما اثرات کاهش دهنده اسید اوریک عصاره های گلیکوزید فنیل اتانوئید را بررسی کردیم. این مطالعه با هدف روشن کردن مسیرها و مکانیسم هایی که از طریق آن و ECH اثرات کاهش اسید اوریک خود را اعمال می کنند.

1 ماده

1.1 حیوانات آزمایشی

هفتاد موش نر SPF-درجه Sprague-Dawley (SD) ، وزن 150-180 گرم ، از مرکز حیوانات آزمایشی دانشگاه پزشکی سین کیانگ خریداری شد. شماره مجوز تولید حیوانات: SCXK (xin) {4}. این آزمایش توسط کمیته اخلاق حیوانات در انستیتوی تحقیقاتی پزشکی اویجور منطقه خود ، با شماره تأیید اخلاق حیوانات تأیید شد: IACUC- (ژون) {6}.

1.2 دارو و معرف

عصاره گلیکوزید فنیل اتانوئید (as و ech)ازتوبولوزا (purity >98 ٪ ، تأیید شده توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا) توسط آزمایشگاه کلیدی علوم فرمولاسیون Uygur ، منطقه خودمختار منطقه مستقل Uygur ، استخراج ، خالص و تهیه شدند. شماره های دسته ای: 20220617 (AS) و 20220526 (ECH).

قرص های آلوپورینول، شماره دسته ای: 62208726 ، تولید شده توسط شرکت گروه دارویی بیوشیمیایی Jiangsu Wanbang ، Ltd.

اگزونات پتاسیموتآدنین، شماره های دسته ای: I2130050 و C2202255 ، خریداری شده از شرکت فناوری بیوشیمیایی شانگهای علاءالدین ، ​​آموزشی ویبولیتین.

کیت های سنجش CREA (کراتینین) ، UA (اسید اوریک) ، اوره و ADA (آدنوزین دامیناز)، شماره های دسته ای: 141123010 ، 141223004 ، 141323008 و 043624005 ، خریداری شده از شرکت الکترونیک Bio-Medray Shenzhen Mindray ، Ltd.

کیت سنجش فعالیت XOD (Xanthine Oxidase)، شماره دسته ای: Y10001219 ، خریداری شده از شرکت فناوری بیوشیمیایی شانگهای Macklin ، Ltd.

آنتی بادی ها (URAT1 ، GLUT9 ، OAT1 ، OAT3)، شماره های دسته ای: 3I5723 {5}} ، 92F0296/4 ، 0F33081/2I44618 ، خریداری شده از Abtinity Bioscience.

IgG ضد خرگوش بز HRP، شماره دسته ای: 245440113 ، خریداری شده از ZSGB-Bio.

محلول رنگ آمیزی هماتوکسیلین، شماره دسته ای: 24135741H ، خریداری شده از شرکت فناوری پکن لانجیک ، آموزشی ویبولیتین.

کیت معرف کروموژنیک DAB، شماره دسته ای: 240010512 ، خریداری شده از ZSGB-Bio.

DEPC (دی اتیل پیروکربنات)، شماره کاتالوگ: D {{0} ml ، خریداری شده از Amresco (ایالات متحده).

M5 Hiclear DL2000 DNA نشانگر، شماره کاتالوگ: MF025 ، خریداری شده از شرکت بیوتکنولوژی ژنومیک پکن ، آموزشی ویبولیتین.

معرف TRIZOL، شماره کاتالوگ: 15596026 ، خریداری شده از ترمو فیشر علمی (ایالات متحده).

5x all-in-one mastermixوتEvagreen Express 2 × qPCR Mastermix-Low ROX، شماره کاتالوگ: G492 و G891 ، هر دو از شرکت Applied Biological Material (ABM) خریداری شده اند.

2 روش

2.1 تأسیس و گروه بندی مدل

هفتاد موش Sprague-Dawley (SD) به دو گروه تقسیم شدند و به دو گروه تقسیم شدند: یک گروه کنترل طبیعی (موش 3 {3 {}}) و یک گروه کنترل مدل (60 موش). گروه کنترل طبیعی 0.5 ٪ CMC-NA از طریق Gavage اجرا شد. گروه کنترل مدل پتاسیم اگزونات (1.5 گرم · kg⁻⁻) همراه با آدنین (100 میلی گرم · kg⁻⁻) با دوز 10 میلی لیتر · kg⁻ ، یک بار در روز به مدت 14 روز متوالی انجام شد. این مدل با موفقیت در نظر گرفته شد که سطح اوره ، کرای و SUA به طور قابل توجهی افزایش یافت ، همانطور که توسط یک آنالایزر بیوشیمیایی اندازه گیری شد.

The hyperuricemia model rats were further divided into the following groups based on SUA, UREA, and CREA levels: model control group, allopurinol group (30 mg·kg⁻¹), low-dose AS group (50 mg·kg⁻¹), high-dose AS group (100 mg·kg⁻¹), low-dose ECH group (50 mg·kg⁻¹), and high-dose ECH group (100 میلی گرم · kg⁻⁻) ، با 10 موش در هر گروه. برای حفظ هیپریوریسمی پایدار ، همه گروه ها به جز گروه کنترل طبیعی پتاسیم اگزونات (500 میلی گرم · kg⁻⁻) همراه با آدنین (100 میلی گرم · kg⁻⁻) از طریق گاواژ در صبح تجویز شدند و پس از آن تجویز داروهای مربوطه در هر گروه درمانی در بعد از ظهر انجام شد. گروه کنترل طبیعی صبح امروز 0.5 ٪ CMC-NA را در صبح و آب آشامیدنی بعد از ظهر با دوز 10 میلی لیتر · kg⁻⁻ ، یک بار در روز به مدت 14 روز متوالی دریافت کرد. پس از آن ، تجویز عوامل مدل سازی متوقف شد و داروهای مربوطه روزانه به مدت 14 روز دیگر به طور مداوم تجویز می شدند.

 

2.2 مجموعه نمونه

پس از دوز نهایی ، موش ها یک شبه روزه گرفتند (آب محدود نشده بود). ادرار از هر گروه برای آزمایش اسید اوریک جمع آوری شد. وزن بدن پس از روزه گرفتن اندازه گیری شد و نمونه خون تحت بیهوشی جمع آوری شد. سرم با سانتریفیوژ از هم جدا شد و برای استفاده در آینده ذخیره شد. بافتهای کلیه جمع آوری و وزن شد. یک کلیه در محلول پارفرمالدئید 4 ٪ ثابت شد ، در حالی که دیگری برای تجزیه و تحلیل بیشتر در نیتروژن مایع در نیتروژن مایع یخ زده بود.

 

2.3 اندازه گیری اسید اوریک در ادرار موش

نمونه های ادرار از هر گروه سانتریفیوژ شدند (3 ، 1 {1} R · min⁻⁻ ، 10 دقیقه ، شعاع سانتریفیوژ 14 سانتی متر) و مایع رویی جمع آوری شد. نمونه ادرار 1: 9 با نمک رقیق شد و برای میزان اسید اوریک با استفاده از آنالایزر بیوشیمیایی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

2.4 اندازه گیری ADA ، اوره ، Crea و SUA در سرم موش

نمونه خون از هر گروه سانتریفیوژ شد (3 ، {1}} R · min⁻⁻ ، 10 دقیقه ، شعاع سانتریفیوژ 14 سانتی متر) و سرم جمع آوری شد. سطح ADA ، اوره ، CREA و SUA در سرم با استفاده از آنالایزر بیوشیمیایی اندازه گیری شد.

 

2.5 اندازه گیری XOD در سرم موش

تغییرات در سطح XOD در سرم موش با استفاده از یک روش آنزیمی طبق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد. میزان جذب اولیه (A₁) و جذب نهایی (A₂) در 290 نانومتر ثبت شد و ΔA (ΔA {1}} A₂ - A₁) محاسبه شد. ΔA در فرمول جایگزین شد:
XOD (nmol⁻ · min⁻⁻ · ml⁻⁻)=[ΔA × سیستم واکنش حجم کل ÷ (ضریب انقراض مولر اسید اوریک × طول مسیر نوری) × 10⁹] ÷ حجم نمونه ÷ 2 {2}}} ΔAA,
برای محاسبه میزان اسید اوریک کاتالیز شده در هر دقیقه در میلی لیتر سرم.

 

2.6 اندازه گیری ضریب کلیه

بافتهای کلیه جمع آوری شده ، با شور شسته شده و آب اضافی برداشته شد. وزن اندام به طور دقیق اندازه گیری شد و ضریب کلیه به شرح زیر محاسبه شد:
ضریب کلیه=وزن کلیه (میلی گرم) / وزن بدن (G).

 

2.7 مشاهده بافت شناسی بافت کلیه توسط رنگ آمیزی او

بافتهای کلیه ثابت در محلول پارفورمالدئید 4 ٪ با غلظت اتانول درجه بندی شده ، با زایلن پاک شدند ، در پارافین تعبیه شده و در برش های {1}}} μM قرار گرفتند. بخش ها با زایلن ، هیدراته شده با اتانول درجه بندی شده ، رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین و ائوزین (HE) و با آدامس خنثی آب بندی شدند. تغییرات مورفولوژیکی در بافت کلیه در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شد و تصاویر در بزرگنمایی 400 incaced ضبط شدند.

 

2.8 تشخیص پروتئین URAT1 ، GLUT9 ، OAT1 و OAT3 در بافت کلیه توسط IHC

بافتهای کلیه ثابت شده در محلول پارفورمالدئید 4 ٪ با غلظت اتانول درجه بندی شده ، پاکسازی با زایلن ، تعبیه شده در پارافین و بخش. بازیابی آنتی ژن و مسدود شدن سرم بز انجام شد. آنتی بادی های اولیه (URAT1 ، GLUT9 ، OAT1 ، OAT3) در رقیق 1: 200 اضافه شدند و یک شبه در 4 درجه انکوبه شدند. روز بعد ، بخش ها با PBS ، هوا خشک شده و با IgG ضد خرگوش بز بیوتین در 37 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. این بخش ها با PBS شسته شدند و به مدت 10 دقیقه با معرف کروموژنیک DAB انکوبه شدند و به دنبال آن شستشوی PBS ، رنگ آمیزی هماتوکسیلین به مدت 3 دقیقه ، تمایز با محلول اتانول اسید هیدروکلریک ، آبی کربنات لیتیوم با اتانول شیب ، پاکسازی با زایلن و مهر و موم با آدامس خنثی.

برای هر موش ، دو قسمت 4 {4}}} 0 × زمینه های بخش کلیه انتخاب شدند. رنگ آمیزی مثبت (قهوه ای-زرد) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و چگالی نوری یکپارچه (IOD) هر زمینه با استفاده از Image-Pro Plus 6.0 برای تجزیه و تحلیل آماری اندازه گیری شد.