سویه های پروبیوتیک زنده و کشته شده توسط گرما با افزایش غلظت IgA در مخاط دهان، ایمنی دهان را بهبود می بخشند.

خلاصه

ایمنی مخاطی دهان و بینی نقش مهمی در محافظت از بدن در برابر تهاجم باکتری ها و ویروس ها ایفا می کند. محصولات پروبیوتیک ایمن برای تقویت ایمنی انسان و سلامت دهان و دندان استفاده شده است. در این مطالعه، ما اثرات مفید قرص‌های پروبیوتیک زنده مختلط، متشکل از لاکتوباسیلوس سالیواریوس را بررسی کردیم. salicinius AP-32، Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 و Lactobacillus paracasei ET-66 و قرص‌های پروبیوتیکی که با گرما کشته می‌شوند، متشکل از L. salivarius subsp. salicinius AP-32 و L. paracasei ET-66، بر ایمنی دهان در بین ۴۵ شرکت‌کننده سالم. شرکت‌کنندگان به‌طور تصادفی به گروه‌های پروبیوتیک زنده، پروبیوتیک کشته‌شده با گرما و دارونما تقسیم شدند. تجویز درمان به مدت 4 هفته به طول انجامید. نمونه های بزاق در هفته های 0، 2، 4 و 6 جمع آوری شد و جمعیت لاکتوباسیلوس، بیفیدوباکتریوم و استرپتوکوک موتانس و غلظت IgA اندازه گیری شد. غلظت IgA و سطوح TGF-بتا و IL{15}} در سلول‌های PBMC با روش الایزا اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد که سطوح IgA بزاق به طور معنی‌داری با تجویز هر دو گروه زنده افزایش یافت (63/12±30/119 درصد، ***P<0.001) and heat-killed (116.78±12.28%, ***P<0.001) probiotics for 4 weeks. Among three probiotic strains, AP-32 would effectively increase the levels of TGF-beta and IL-10 in PBMCs. The oral pathogen Streptococcus mutans was significantly reduced on viable probiotic tablet administration (49.60±31.01%, ***P<0.001). The in vitro antibacterial test confirmed that viable probiotics effectively limited the survival rate of oral pathogens. Thus, this clinical pilot study demonstrated that oral probiotic tablets both in viable form or heat-killed form could exert beneficial effects on oral immunity via IL-10, TGB-beta mediated IgA secretion. The effective dosage of viable probiotic content in the oral tablet was 109 CFUs/g and the heat-killed oral tablet was 1× 1010 cells/g.

مزایای مکمل سیستانچ - افزایش ایمنی

معرفی

مخاط دهان و بینی، دروازه تماس با آنتی ژن های استنشاقی، دفاع خط مقدم سیستم ایمنی انسان است [1، 2]. معمولاً ویروس‌ها یا باکتری‌های بیماری‌زا از طریق مبارزه با سیستم ایمنی موضعی و میکروبیوتای سالم به سطوح مخاطی حفره دهان و بینی حمله می‌کنند [3]. التهاب و علائم، از جمله سرفه، گلودرد، آبریزش بینی و تب، به دلیل پاسخ های ایمنی در برابر ویروس ها و باکتری های بیماری زا مهاجم ایجاد می شود [4]. علاوه بر این، ایمونوگلوبولین A (IgA) عامل ایمنی اصلی در بزاق است و هموستاز میکروبیوتای دهان را تنظیم می کند [5]. چندین مطالعه توانایی IgA ترشحی را برای محافظت از بدن در برابر عفونت توسط پاتوژن های ویروسی، از جمله ویروس سنسیشیال تنفسی [6]، روتاویروس [7] و ویروس آنفلوانزا [7] گزارش کرده اند. IgA ترشحی برای محافظت از اپیتلیوم مخاطی عمل می کند. نیکلاس میلت و همکاران کشف کرد که IgA مخاطی می تواند از دیس بیوز کاندیدا آلبیکنس در حفره دهان جلوگیری کند [8]. همچنین از تجمع پاتوژن دهانی استرپتوکوک موتانس که باعث ایجاد پلاک دندانی می شود، جلوگیری می کند [9].

علاوه بر این، محققان کشف کردند که میکروبیوتای دهان و متابولیت های آن ممکن است به صورت موضعی بر ایمنی در سد دهانی تأثیر بگذارند [10]. مطالعات قبلی اثربخشی پروبیوتیک ها را در افزایش غلظت IgA در مخاط دهان نشان دادند [11]. اریکسون و همکاران نشان داد که آدامس های حاوی لاکتوباسیلوس رویتری با افزایش سطح IgA بزاقی در پاسخ ایمنی تطبیقی ​​افراد سالم شرکت می کند [12]. در انسان، سیتوکین های ایمنی TGF-beta و IL{4}} با تولید IgA مرتبط هستند [13].

با این حال، اینکه آیا میکروبیوتای دهان سطوح IgA ترشحی را از طریق سیتوکین‌های TGF-beta و IL-10 افزایش می‌دهد هنوز مشخص نیست. علاوه بر این، پاتوژن های دهانی شامل S. mutans، P. gingivalis و F. nucleatum subsp. پلی مورفیسم و ​​A. actinomycetemcomitans همبستگی بالایی با بیماری پریودنتال و بوی بد دهان نشان دادند [14]. محصولات پروبیوتیکی می توانند با مهار پاتوژن های دهانی Fusobacterium nucleatum یک درمان جایگزین بالقوه برای پریودنتیت باشند، اما Porphyromonas gingivalis و Aggregatibacter actinomycetemcomitans کاهش قابل توجهی نشان ندادند [15]. مکمل پروبیوتیک همچنین می تواند از عفونت های بیماری زا جلوگیری کند [16]. گزارش شده است که گونه های کلیدی میکروبیوتا رشد استرپتوکوک پنومونی بیماری زا را محدود می کنند [17]. بنابراین، حفظ یک اکوسیستم میکروبی متعادل از طریق جذب سویه‌های پروبیوتیک ممکن است راهی جایگزین برای تنظیم ایمنی دهان و افزایش سلامت دهان باشد. یافته‌های قبلی در مورد مهار پاتوژن‌های دهان توسط سویه‌های پروبیوتیک نشان داده است که لاکتوباسیلوس سالیواریوس subsp. salicinius AP-32، Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 و Lactobacillus paracasei ET-66 اثرات ضد باکتریایی عالی در شرایط آزمایشگاهی دارند. با این حال، نه با مکانیسم افزایش سطح H2O2 [18]. استراتژی‌های اصلی برای سویه‌های پروبیوتیک برای محدود کردن رشد بیماری‌زای دهان، تجمع پاتوژن‌ها به صورت خوراکی، تولید بیوسورفکتانت‌ها، تغییر محیط دهان و تولید مواد ضد میکروبی بود [19]. علاوه بر این، یک مطالعه آزمایشگاهی نشان داد که L. salicinius AP{14}} باعث بیان سیتوکین التهابی [اینترلوکین (IL){15}}، IL-10] در سلول‌های اپیتلیال انسان می‌شود [20]. بنابراین، در این مطالعه، ما بررسی کردیم که آیا قرص‌های پروبیوتیکی زنده، متشکل از L. salivarius subsp. salicinius AP{18}}، B. animalis subsp. lactis CP{19}} و L. paracasei ET-66 و قرص‌های پروبیوتیکی که با گرما کشته می‌شوند، متشکل از L. salivarius subsp. سالیسینیوس AP-32 و L. paracasei ET{23}}، عملکرد ایمنی را از طریق TGF-beta، IL{25}} بهبود بخشیدند یا سطح غلظت IgA بزاقی را افزایش دادند. عملکرد ضد باکتریایی جذب محصول پروبیوتیک در حفره دهان مورد آزمایش قرار گرفت.

مزایای مکمل سیستانچ-چگونه سیستم ایمنی بدن را تقویت کنیم

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

مواد و روش ها

شركت كنندگان

در مجموع، 45 شرکت‌کننده سالم 20-40 ساله انتخاب شدند و به‌طور تصادفی به سه زیر گروه تقسیم شدند: قرص خوراکی پروبیوتیک زنده، قرص خوراکی پروبیوتیک گرما کشنده، و گروه دارونما. هر گروه شامل 15 شرکت کننده بود. شرکت‌کنندگانی که عادت‌های غذایی مصرف سیگار و فوفل داشتند از مطالعه حذف شدند. قرص های خوراکی کورکورانه به شرکت کنندگان اختصاص داده شد. همه شرکت کنندگان قرص های خوراکی را سه بار در روز (صبح، ظهر و عصر) به مدت 4 هفته مصرف کردند. نمونه‌های بزاق (2 میلی‌لیتر) برای اندازه‌گیری غلظت IgA و جمعیت میکروارگانیسم‌ها در هفته‌های 0، 2، 4 و 6 جمع‌آوری شد. رضایت آگاهانه از همه شرکت‌کنندگان در این مطالعه اخذ شد. این پروتکل توسط هیئت بررسی نهادی دانشگاه پزشکی چانگ شان، تایوان (CS19052) تأیید شد.

قرص خوراکی پروبیوتیک زنده

قرص خوراکی پروبیوتیک زنده (1 گرم) حاوی سه سویه پروبیوتیک زنده، L. salivarius subsp. salicinius AP-32، B. animalis subsp. lactis CP-9 و L. paracasei ET-66. ما 0 را مخلوط کردیم.01 گرم از 1011 واحد تشکیل کلنی (CFUs) تک پروبیوتیک در قرص خوراکی. هر سویه تک پروبیوتیک حدود 0.33 * 109 CFUs/g اندازه گیری شد. کل محتوای پروبیوتیک در قرص خوراکی 109 کلنی CFUs/g بود. دوز فعال قرص خوراکی پروبیوتیک به دنبال آثار منتشر شده قبلی بود [18]. تمام سویه های پروبیوتیک از آزمایشگاه Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan، تایوان) به دست آمد. L. salivarius subsp. salicinius AP{12}} از روده انسان سالم جدا شد و در موسسه تحقیقات و توسعه صنایع غذایی، تایوان (ID: BCRC 910437) و در دانشگاه ووهان، چین (ID: CCTCC-M2011127) سپرده شد. B. animalis subsp. CP لاکتیک{16}} از شیر مادر سالم جدا شد و در موسسه تحقیقات و توسعه صنایع غذایی، تایوان (ID: BCRC 910645) و در دانشگاه ووهان (ID: CCTCC-M2014588) سپرده شد. L. paracasei ET{20}} از شیر مادر سالم جدا شد و در موسسه تحقیقات و توسعه صنایع غذایی، تایوان (ID: BCRC 910753) و در مرکز جمع‌آوری فرهنگ میکروبیولوژیکی عمومی چین، پکن، چین (شناسه: CGMCC {22}}). لاکتوباسیلوس. salivarius subsp. salicinius AP{23}} و L. paracasei ET-66 روی صفحات آگار de Man، Rogosa و Sharpe (MRS) (110660، Merck، دارمشتات، آلمان) کشت و تحت شرایط بی هوازی اختیاری در دمای 37 درجه انکوبه شدند. به مدت 48 ساعت B. animalis subsp. Lactis CP{29}} روی آگار MRS حاوی سیستئین 05/0 درصد کشت داده شد و در دمای 37 درجه به مدت 48 ساعت به صورت بی هوازی انکوبه شد. شمارش کلنی ها برای تعیین کمیت CFU باکتریایی پس از کشت سویه های پروبیوتیک انجام شد [18].

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

قرص های خوراکی پروبیوتیک گرما کشنده

قرص‌های خوراکی پروبیوتیک (1 گرم) که با گرما کشته می‌شدند شامل L. salivarius subsp. salicinius AP-32 و L. paracasei ET-66. سویه های زنده، همانطور که قبلا توضیح داده شد، کشت و انکوبه شدند. سپس AP{4}} و ET-66 با انکوبه کردن سویه‌های زنده در محیط MRS در دمای 100 درجه به مدت 1 ساعت غیرفعال شدند. محتوای پروبیوتیک در قرص خوراکی 1010×1 سلول در گرم بود. دوز فعال قرص‌های خوراکی پروبیوتیک که با گرما کشته می‌شوند به دنبال آزمایش‌های آزمایشگاهی قبلی منتشر شده بود [11]. تمام مراحل آزمایشی در آزمایشگاه Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan، تایوان) انجام شد.

اندازه گیری جمعیت لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم در نمونه های بزاق

نمونه‌های بزاق (2 میلی‌لیتر) از هر شرکت‌کننده در هفته‌های 0، 2، 4 و 6 جمع‌آوری شد. نمونه‌های بزاق (100 میکرولیتر) به‌طور متوالی رقیق شدند و به MRS اضافه شدند. بشقاب ها برای اندازه گیری جمعیت لاکتوباسیلوس، لاکتوباسیلوس کشت داده شد و بر روی صفحات آگار MRS تحت شرایط بی هوازی اختیاری در دمای 37 درجه به مدت 48 ساعت انکوبه شد. برای اندازه‌گیری جمعیت بیفدوباکتریوم، بیفدوباکتریوم به‌صورت بی‌هوازی در آگار MRS حاوی 0.05% سیستئین در دمای 37 درجه به مدت 48 ساعت انکوبه شد. پس از کشت سویه های پروبیوتیک، شمارش کلنی ها برای تعیین کمیت CFU باکتریایی انجام شد. نرخ جمعیت لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم به تعداد جمعیت پروبیوتیک در هفته 0 نرمال شد. نرخ جمعیت لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم جمع آوری شده در هفته 0 100 درصد در نظر گرفته شد. روش تجربی از آثار منتشر شده قبلی پیروی می کند [18].

اندازه گیری غلظت IgA در مخاط دهان

نمونه های بزاق (2 میلی لیتر) از هر شرکت کننده در هفته های 0، 2، 4 و 6 جمع آوری شد و در درجه 20 نگهداری شد. کیت ELISA بدون پوشش انسانی IgA (کاتالوگ # 88-50600-88؛ Invitrogen، Thermo Fisher Scientific، San Jose، CA، USA) برای تجزیه و تحلیل غلظت IgA استفاده شد. ابتدا، آنتی بادی های ضد IgA انسانی را روی یک صفحه چاه 96- پوشاندیم. IgA بزاقی موجود در نمونه یا استاندارد به میکرووله اضافه شد و سپس آنتی بادی ضد IgA انسانی کنژوگه با HRP در دمای اتاق به مدت 1 ساعت اضافه شد. زیرلایه TMB را به مدت 30 دقیقه به هر چاهک لوله کنید. در نهایت، هماهنگی IgA بر روی یک اسپکتروفتومتر در 450 نانومتر اندازه‌گیری شد. تمام مراحل آزمایشی طبق دستورالعمل سازنده در سه تکرار انجام شد. میزان غلظت IgA جمع آوری شده در هفته صفر 100 درصد در نظر گرفته شد. روش تجربی از آثار منتشر شده قبلی پیروی می کند [18].

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

اندازه گیری غلظت TGF-بتا و IL-10 در PBMC

آزمایش افزایش سطح TGF-بتا و IL{2}} ناشی از پروبیوتیک به دنبال مطالعه قبلی [20]. سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMCs) از نمونه های خون اهداکنندگان سالم (مرکز خون تاینان، بنیاد خدمات خون تایوان) به دست آمد. سانتریفیوژ کردن خون کامل از طریق گرادیان Ficoll-Hypaque (Pharmacia، سوئد)، و کسر چگالی نور از رابط 42.5٪-50٪ شسته شد. کاشت سلول های PBMC 4 * 105 سلولی استخراج شده در 100 میکرولیتر RPMI{12}} با 1% FBS (شرکت شیمیایی سیگما، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) به هر چاهک از صفحات 96 چاهی. سپس با افزودن 5 * 105 cfu/20 میکرولیتر تیمار پروبیوتیک به هر PBMCs seeded well (cells: probiotic strains{18}}:10). گروه کنترل مثبت 10 میکروگرم بر میلی لیتر فیتوهاماگلوتینین (PHA) (Sigma-Aldrich، مونیخ، آلمان) را به چاه های بذر PBMCs برای تولید TGF-، IL{23}} به ترتیب اضافه کردند [21]. کشت همزمان پروبیوتیک ها با PBMC ها به مدت 48 ساعت. اندازه گیری مایع رویی حاوی سیتوکین های IL-10 و TGF- با استفاده از روش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) (Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA). تمام آزمایش‌ها حداقل در سه تکرار اندازه‌گیری و از پروتکل تجاری پیروی کردند.

ارزیابی عملکرد آنتی باکتریال در حفره دهان

استرپتوکوک موتانس یک تهدید رایج برای سلامت دهان است که با تشکیل طاعون یا بیوفیلم باعث پوسیدگی دندان می شود [22]. نمونه‌های استرپتوکوکوس موتانس از سواب‌ها جمع‌آوری شد و به وسیله آن استافیلوکوکوس موتانس را در قسمت فوق لثه، لثه و مخاط دهان در هفته‌های 0، 2، 4 و 6 جمع‌آوری کردیم. S. mutans در تریپتیک نگهداری شد. براث سویا (TSB، 5 میلی لیتر) همراه با 50٪ گلیسرول. محیط S. mutans به صورت سریال رقیق شد و به صفحه Mitis Salivarius-Bacitracin Agar (MSBA, 0.2 U/mL) اضافه شد که در دمای 37 درجه به مدت 2 روز انکوبه شد. در نهایت، تعداد کلنی های S. mutans در هر نمونه شرکت کننده برای محاسبه میزان بقای بیماری زا شمارش شد. میزان بقای S. mutans جمع آوری شده در هفته 0 100٪ در نظر گرفته شد. روش تجربی از آثار منتشر شده قبلی پیروی می کند [18].

فعالیت ضد باکتریایی قرص های خوراکی در شرایط آزمایشگاهی

Oral tablets (1 g) that contained viable (AP-32, CP-9, and ET-66; > 109 CFUs) and heat-killed (AP-32 and ET-66,>1010 سویه پروبیوتیک CFU به ترتیب در TSB و محیط تزریق قلب مغز حل شد تا غلظت نهایی 0.1 گرم در میلی لیتر به دست آید. فقط از محیط برای گروه خالی استفاده شد، در حالی که قرص (1 گرم) بدون هیچ گونه جزء پروبیوتیکی در محیط مربوطه برای گروه دارونما حل شد. سپس، پاتوژن های خوراکی (106 CFUs) به محلول های قرص وارد شدند و در دمای 37 درجه برای 2 (S. mutans) یا 3 (Porphyromonas gingivalis، Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum و Aggregatibacter actinomy cetemcomitans) انکوبه شدند. پاتوژن ها از BCRC به دست آمد. نرخ مهار پاتوژن خوراکی (٪) به شرح زیر محاسبه شد: (کنترل CFUblank-گروه تجربی CFU) / کنترل CFUblank. روش آزمایشی از آزمایش های منتشر شده قبلی پیروی می کند [11].

تحلیل آماری

برای تجزیه و تحلیل آماری نتایج آزمون t دو طرفه از نرم افزار GraphPad Prism استفاده شد. داده ها به عنوان میانگین انحراف معیار (SD) یا میانگین نتایج دو یا سه آزمایش مستقل ارائه شد. تفاوت های آماری در مقدار P معنی دار در نظر گرفته شد<0.05.

نتایج

قرص های پروبیوتیک جمعیت بیفیدوباکتریوم را در حفره دهان افزایش دادند

پس از تجویز قرص پروبیوتیک، جمعیت بیفیدوباکتریوم به طور پایدار در حفره دهان افزایش یافت. جمعیت باکتریایی بعد از درمان توسط جمعیت باکتری قبل از درمان نرمال شد (نرخ جمعیت %=CFU بعد از درمان/CFU قبل از درمان). در گروه پروبیوتیک زنده، نرخ جمعیت به طور قابل توجهی به 164.96±244.14٪ در هفته 2 افزایش یافت (**P<0.01, Fig. 1a) and 438.41±308.58 at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population rate remained high at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 550.16±448.19%, ***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (**P<0.01). In the heat-killed probiotic group, the Bifidobacterium population was increased at Weeks 2 (149.92±60.47%, **P<0.01) and 4 (199.87±148.64%, *P<0.05), but was decreased at Week 6 after administration of the heat-killed probiotic tablets was stopped for 2 weeks (182.98±163.73%, Fig. 1a).

قرص های پروبیوتیک باعث افزایش جمعیت لاکتوباسیلوس در حفره دهان می شوند

تغییر در جمعیت لاکتوباسیلوس خوراکی ناشی از تجویز قرص پروبیوتیک، الگویی مشابه با تغییر در جمعیت بیفیدوباکتریوم خوراکی را نشان داد. جمعیت باکتریایی بعد از تیمارها توسط جمعیت باکتریایی قبل از درمان نرمال شد. در گروه پروبیوتیک زنده، میزان جمعیت لاکتوباسیلوس به طور قابل توجهی به 447.74±337.89٪ در هفته 2 افزایش یافت (**P<0.01, Fig. 1b) and 982.27±726.66% at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Lactobacillus population rate was higher at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 727.57±539.76%, ***P<0.001) than at Week 0. The Lactobacillus population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (***P<0.001). In the heat-killed probiotic group, the Lactobacillus population was increased at Weeks 2 (256.66±183.78%, **P<0.01) and 4 (312.85 ± 279.71%, *P < 0.05). Additionally, the Lactobacillus number remained but showed no significant difference at Week 6 after the administration of heat-killed probiotics was stopped for 2 weeks (208.00±199.50%, Fig. 1b).

شکل 1 اندازه گیری جمعیت بیفیدوباکتریوم در سطوح مخاطی دهان. قرص پروبیوتیک زنده V; قرص های پروبیوتیک غیرفعال گرما کشته شده H; قرص پلاسبو C (شاهد)؛ و باکتری های اسید لاکتیک LAB. جمع‌آوری و آنالیز نمونه‌های بزاق در هفته‌های 0، 2، 4 و 6 انجام شد. داده ها به عنوان میانگین انحراف معیار (SD) ارائه شد. برای تجزیه و تحلیل تفاوت های آماری از آزمون t دو طرفه استفاده شد. معنی‌داری آماری با *P مشخص شد<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. b Measurement of Lactobacillus populations on the oral mucosal surfaces. V viable probiotic tablets; H heat-killed inactivated probiotic tablets; C placebo tablets (control); and LAB lactic acid bacteria. Collection and analysis of salivary samples at Weeks 0, 2, 4, and 6 were performed. Data were presented as the mean standard deviation (SD). A two-tailed t-test was used to analyze statistical differences. Statistical significances were marked with *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

قرص های پروبیوتیک حاوی AP-32، ET-66، و CP-9 به طور قابل توجهی غلظت IgA را در مخاط دهان افزایش دادند.

از آنجایی که ثابت شده است که مصرف قرص پروبیوتیک (بادوام یا کشته شده در اثر حرارت) باعث افزایش سطح بیفیدوباکتریوم و لاکتوباسیلوس در حفره دهان می شود، ما تغییرات غلظت IgA بزاقی را که به دلیل جذب محصولات پروبیوتیک رخ می دهد، بیشتر تجزیه و تحلیل کردیم. سطح IgA بعد از درمان توسط سطوح IgA قبل از درمان نرمال شد. در گروه پروبیوتیک زنده، غلظت IgA بزاقی اندکی به 1{19}} 8.10 ± 3.24 درصد در هفته 2 (شکل 2) و 104.81 ± 13.26 در هفته 4 افزایش یافت، اما تفاوت آماری معنی داری نداشت. با این حال، غلظت IgA بزاقی در گروه پروبیوتیک زنده، در مقایسه با گروه دارونما، به طور قابل توجهی به 12.63 ± 119.30 درصد در هفته 6 (عدم تجویز قرص های پروبیوتیک زنده به مدت 2 هفته پس از هفته 4)، در مقایسه با هفته 0 ( ***پ<0.001). Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the salivary IgA concentration was slightly increased at Weeks 2 (102.51± 7.20%) and 4 (104.35 ± 10.27%). The saliva IgA concentration was increased at Week 6 (116.78 ± 12.28%, ***P < 0.001, Fig. 2), compared to Week 0.

سویه های زنده سطوح IL-10 و TGF-بتا را در PBMC ها افزایش دادند

کنترل مثبت 10 میکروگرم در میلی لیتر فیتوهاماگلوتینین (PHA) با موفقیت سطوح IL-10 (7.9 ± 58.2 pg/ml، ***P <0.001، شکل 3a) و TGF- را افزایش داد. (8±53.4 pg/ml، ***P<0.001, Fig. 3b) in PBMCs by comparing to the negative control (PBMCs treated with medium only). Viable strains of CP-9, AP-32 and ET-66 signifcantly increased the levels of IL-10 in PBMCs to 84.2±9 pg/ml (***P<0.001, ##P<0.01), 303.1±170.9 pg/ml (*P<0.05, ##P<0.01) and 98.2±17.5 pg/ml (***P<0.01, ##P<0.01), respectively. Symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated a significant difference by comparing to the PHA control (Fig. 3a). Besides, viable strains of CP-9, AP-32, and ET-66 significantly increased the levels of TGF-beta in PBMCs to 23.2 ± 4.7 pg/ml (***P < 0.001), 130.9 ± 16 pg/ ml (***P < 0.001, ###P < 0.001) and 31.4 ± 5.5 pg/ml (***P<0.01), respectively (Fig. 3b).

شکل 2 غلظت ایمونوگلوبولین A (IgA) در نمونه های بزاق. قرص پروبیوتیک زنده V; قرص های پروبیوتیک غیرفعال گرما کشته شده H; قرص پلاسبو C (شاهد)؛ و باکتری های اسید لاکتیک LAB. جمع‌آوری و آنالیز نمونه‌های بزاق در هفته‌های 0، 2، 4 و 6 انجام شد. داده ها به عنوان میانگین انحراف معیار (SD) ارائه شد. برای تجزیه و تحلیل تفاوت های آماری از آزمون t دو طرفه استفاده شد. آماری

قرص های پروبیوتیک حاوی AP-32، ET-66، و CP-9 جمعیت S. mutans را در بزاق ممنوع کردند

افزایش جمعیت بیفیدوباکتریوم و لاکتوباسیلوس و افزایش غلظت IgA بزاقی ممکن است به مبارزه با میکروارگانیسم‌های بیماری‌زای دهان کمک کند. در آزمایش بعدی، ما تغییر را در جمعیت پاتوژن دهانی S. mutans به دلیل مداخله پروبیوتیک آزمایش کردیم. جمعیت باکتریایی بعد از تیمارها توسط جمعیت باکتریایی قبل از درمان نرمال شد. در گروه پروبیوتیک زنده، جمعیت S. mutans به طور قابل توجهی در هفته 2 کاهش یافت (53.55±31.60٪)، ***P<0.001), 4 (49.60±31.01%, ***P<0.001), and 6 (55.19±42.72%, **P<0.01, Fig. 4). At week 6, S. mutans was significantly inhibited in the viable probiotic group (55.19±42.72%, ***P<0.001), compared to in the placebo group. Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the S. mutans population was slightly decreased at Week 2 (85.81±49.87%) and significantly reduced at Week 4 (58.35 ± 33.17%, ***P<0.001). The S. mutans population level in the heat-killed probiotic group (202.81±167.99%) reverted to that in the placebo group (225.05±127.01%) at Week 6 (no administration of heat-killed probiotic tablets for 2 weeks from Week 4) (Fig. 4).

شکل 3 سویه های زنده سطوح IL-10 و TGF-بتا را در PBMC ها افزایش دادند. سطح IL{3}} و b TGF-بتا در PBMCs با درمان سویه‌های پروبیوتیک مورد آزمایش قرار گرفت. افزودن 5 * 105 cfu/20 میکرولیتر سویه های زنده CP-9، AP-32 و ET{10}} به PMBCs 10 میکروگرم بر میلی لیتر. فیتوهماگلوتینین (PHA) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. کنترل منفی، PBMCهایی بود که فقط با محیط RMPI{12}} تیمار شده بودند. آزمایشات سه تکراری انجام شد. داده ها به عنوان میانگین انحراف معیار (SD) ارائه شد. برای تجزیه و تحلیل تفاوت های آماری از آزمون t دو طرفه استفاده شد. معنی داری آماری با P مشخص شد<0.05, P<0.01, P<0.001. The symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated significant difference by comparing to the PHA control

شکل 4 اندازه گیری جمعیت استرپتوکوک موتانس بیماری زا در سطوح مخاطی دهان. قرص پروبیوتیک زنده V; قرص های پروبیوتیک غیرفعال گرما کشته شده H; قرص پلاسبو C (شاهد)؛ و باکتری های اسید لاکتیک LAB. جمع‌آوری و آنالیز نمونه‌های بزاق در هفته‌های 0، 2، 4 و 6 انجام شد. داده ها به عنوان میانگین انحراف معیار (SD) ارائه شد. برای تجزیه و تحلیل تفاوت های آماری از آزمون t دو طرفه استفاده شد. معنی داری آماری با *P مشخص شد<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

تایید توانایی قرص های پروبیوتیک در مهار رشد پاتوژن های دهان با آزمایش آزمایشگاهی

مطالعه آزمایشگاهی نشان داد که قرص های پروبیوتیک زنده به طور قابل توجهی نرخ بقای پاتوژن های دهانی را مهار می کنند (شکل 5a). جمعیت باکتریایی بعد از تیمارها توسط جمعیت باکتریایی قبل از درمان نرمال شد. میزان بقای S. mutans، P. gingivalis، F. nucleatum و A. actinomy cetemcomitans در گروه پروبیوتیک زنده، در مقایسه با گروه دارونما، به 4.23% کاهش یافت (***P < 0} .001، دارونما=91%)، 8.64% (***P <0.001، دارونما{10}}%)، 5.77% (**P<0.01, placebo=98%), and 6.23% (**P<0.01, placebo=87%), respectively. However, the heat-killed probiotic tablet exerted weaker antibacterial effects than the viable probiotic tablet (Fig. 5b). The survival rate of S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, and A. antinomy cetemcomitans in the heat-killed probiotic group, compared to in the placebo group, was slightly decreased without statistical significance (82%, placebo=91%), significantly reduced to 53% (*P<0.05, placebo=89%), not inhibited (96.88%, placebo=98%), and significantly reduced to 80% (**P<0.01, placebo=87%), respectively.

بحث

در مقایسه با گروه دارونما، جمعیت خوراکی لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم با تغذیه قرص های پروبیوتیک زنده یا قرص های پروبیوتیک گرما کشنده به مدت 4 هفته به طور قابل توجهی افزایش می یابد. علاوه بر این، تعداد لاکتوباسیلوس ها و بیفیدوباکتریوم ها به مدت 2 هفته پس از تعلیق مصرف پروبیوتیک های زنده در سطوح بالایی باقی ماندند (شکل 1a و b). به طور مشابه، Camila Casuccio Almeida و همکاران. نشان داد که تجویز چهار هفته‌ای یک درمان پروبیوتیک می‌تواند علائم را در بیماران مبتلا به عدم تحمل لاکتوز به مدت حداقل 3 ماه پس از قطع مصرف پروبیوتیک بهبود بخشد [23]. با این حال، اثر پایدار پروبیوتیک ها در درمان طولانی مدت باید در آینده ارزیابی شود. علاوه بر این، غلظت IgA بزاق به طور قابل توجهی در تجویز قرص‌های پروبیوتیک زنده و گرما افزایش یافت. هر دو گروه پروبیوتیک زنده و گرما با تجویز قرص های خوراکی به مدت 4 هفته، IgA بزاق را افزایش دادند، اما بدون نشان دادن تفاوت آماری با دارونما. غلظت IgA در گروه‌های پروبیوتیک زنده و گرما افزایش قابل توجهی را در هفته 6 نشان داد. با این حال، مکانیسم افزایش IgA پس از توقف تجویز پروبیوتیک به مدت 2 هفته باید بیشتر مورد بررسی قرار گیرد (شکل 2) Braathen و همکاران. نتایج مشابهی را در مورد نقش تعدیل کننده ایمنی سویه های پروبیوتیک در حفره دهان گزارش کرد [24]. علاوه بر این، سویه های پروبیوتیکی گزارش شده است که غلظت IgA مدفوع را به طور قابل توجهی در خروس و خوک افزایش می دهد [25]. با این حال، مطالعات در مورد علائم کاهش دهنده IgA در عفونت های راه هوایی فوقانی کافی نیست. مکانیسم مولکولی دقیق مهار و پیشگیری از عفونت های راه هوایی فوقانی توسط سویه های پروبیوتیک CP{18}}، AP{19}} و ET-66 را می توان در مطالعات آینده بررسی کرد. در مطالعه حاضر، سویه‌های زنده CP-9، AP{22}} و ET-66 سطح IL-10 و TFG-بتا را در سلول‌های PBMC افزایش می‌دهند. AP{26}} توانایی مؤثری در افزایش IL-10 و TFG-بتا در PBMCs با مقایسه آنها با کنترل PHA مثبت نشان داد (شکل 3a و b). فرض بر این بود که سویه‌های زنده CP-9، AP{31}}، و ET{32}} ممکن است IL-10 و TFG-بتا را برای افزایش سطح IgA بزاقی ترشح کنند. با این حال، ارتباط بین IL{36}}، TFG-بتا، و IgA بزاق باید بیشتر مورد آزمایش قرار گیرد [26]. علاوه بر این، هنوز مشخص نیست که آیا پروبیوتیک‌های کشته شده با گرما IgA را از طریق القای IL{40}} و TFG-بتا افزایش می‌دهند. یک آزمایش آزمایشگاهی نشان داد که AP{43}} که با گرما کشته می‌شود، ترشح اینترفرون و IL{45}}p70 را افزایش می‌دهد و سطوح IL{47}} را کاهش می‌دهد [27]. بنابراین، در این مطالعه بالینی، توانایی سویه‌های پروبیوتیک CP-9، AP{50}}، و ET{51}} و AP{53}} و ET{54}} که در اثر حرارت کشته می‌شوند، بررسی شد. سویه هایی برای مهار باکتری های بیماری زا در حفره دهان بیشتر تایید شد (شکل 4). پاستیل های پروبیوتیک زنده توانایی ضد بیماری زایی بهتری نسبت به پاستیل های کشته شده در اثر حرارت از طریق ترشح اسیدهای آلی، پپتیدهای ضد میکروبی [28]، اگزوپلی ساکاریدها (EPSs) [29] باکتریوسین ها [30] نشان دادند (شکل 5a و b). اجزای ضد میکروبی عملکردی تولید شده توسط سویه های پروبیوتیک زنده باید توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و کروماتوگرافی مایع (LC) - طیف سنجی جرمی در آینده شناسایی شوند [31]. گزارش شده است که پروبیوتیک های کشته شده با گرما دارای مزایای کلیدی پروبیوتیک های زنده هستند، اما بدون نگرانی های ایمنی خاصی از سویه های پروبیوتیک زنده [32]. با این حال، اجزای ضد میکروبی پروبیوتیک های گرما کشنده باید بیشتر تأیید شود.

شکل 5 تایید توانایی قرص های پروبیوتیک در مهار رشد پاتوژن های دهانی توسط آزمایش آزمایشگاهی. توانایی قرص‌های پروبیوتیک زنده و گرما در مهار میزان بقای پاتوژن‌های دهانی، از جمله استرپتوکوک موتانس، پورفیروموناس ژنژیوالیس، فوزوباکتریوم نوکلئاتوم و آگرگاتی‌باکتر اکتینومایستمکومیتانس تایید شد. گروه خالی، فقط متوسط؛ گروه دارونما، قرص (1 گرم) بدون هیچ گونه اجزای پروبیوتیک. آزمایشات سه تکراری انجام شد. داده ها به عنوان میانگین انحراف معیار (SD) ارائه شد. برای تجزیه و تحلیل تفاوت های آماری از آزمون t دو طرفه استفاده شد. معنی داری آماری با *P مشخص شد<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

نتیجه

قرص های پروبیوتیک زنده مخلوط، متشکل از L. salivarius subsp. salicinius AP-32، B. animalis subsp. لاکتیک CP-9، و L. paracasei ET-66، و پروبیوتیک‌های کشته شده در اثر حرارت، از جمله L. salivarius subsp. salicinius AP-32 و L. paracasei ET-66، عملکردهای مفید خود را با افزایش جمعیت دهانی لاکتوباسیلوس و بیفدوباکتریوم، کاهش S. mutans در حفره دهان و افزایش غلظت IgA بزاقی در شرکت‌کنندگان سالم انجام دادند. نتایج آزمایش آزمایشگاهی تایید کرد که پروبیوتیک‌های زنده به طور موثر پاتوژن‌های دهانی از جمله S. mutans، P. gingivalis و F. nucleatum subsp را مهار می‌کنند. پلی مورفیسم، و A. actinomycetemcomitans. ایمنی مخاطی دهان و بینی دفاع خط مقدم در برابر میکروارگانیسم‌های مهاجم است و این به یک مسئله حیاتی تبدیل شده است. بنابراین، این مطالعه یک استراتژی جایگزین (مکمل پروبیوتیک) برای حفظ ایمنی دهان و سلامت دهان ارائه می دهد.

مزایای مکمل سیستانچ-چگونه سیستم ایمنی بدن را تقویت کنیم

منابع

1. Takaki H، Ichimiya S، Matsumoto M، Seya T (2018) پاسخ ایمنی مخاطی در بافت لنفوئیدی مرتبط با بینی پس از تجویز داخل بینی توسط ادجوانت ها. J Innate Immun 10(5-6):515-521

2. Wu RQ، Zhang DF، Tu E، Chen QM، Chen WJ (2014) سیستم ایمنی مخاطی در حفره دهان - ارکستری از تنوع سلول های T. Int J Oral Sci 6 (3): 125-132

3. Man WH, de Steenhuijsen Piters WAA, Bogaert D (2017) میکروبیوتای دستگاه تنفسی: دروازه بان برای سلامت تنفسی. Nat Rev Microbiol 15 (5): 259-270

4. Wald ER, Guerra N, Byers C (1991) عفونت های دستگاه تنفسی فوقانی در کودکان خردسال: مدت زمان و فراوانی عوارض. اطفال 87 (2): 129-133

5. Marcotte H، Lavoie MC (1998) اکولوژی میکروبی دهان و نقش ایمونوگلوبولین بزاقی A. Microbiol Mol Biol Rev 62(1):71-109

6. Weltzin R, Traina-Dorge V, Soike K, Zhang JY, Mack P, Soman G et al (1996) آنتی بادی IgA مونوکلونال داخل بینی در برابر ویروس سنسیشیال تنفسی از میمون های رزوس در برابر عفونت دستگاه تنفسی فوقانی و تحتانی محافظت می کند. J Infect Dis 174(2):256-261

7. Ruggeri FM, Johansen K, Basile G, Kraehenbuhl JP, Svensson L (1998) آنتی روتاویروس ایمونوگلوبولین A ویروس را در شرایط آزمایشگاهی پس از ترانس سیتوز از طریق سلول های اپیتلیال خنثی می کند و از موش های شیرخوار در برابر اسهال محافظت می کند. J virol 72 (4): 2708-2714

8. ارزن N, Solis NV, Swidergall M (2020) IgA مخاطی از دیسبیوز کاندیدا آلبیکنس رایج در حفره دهان جلوگیری می کند. Front Immunol 11:2448

9. Katz J, Harmon CC, Buckner GP, Richardson GJ, Russell MW, Michalek SM (1993) پاسخ های ایمونوگلوبولین بزاقی محافظ A در برابر عفونت استرپتوکوک موتانس پس از ایمن سازی داخل بینی با آنتی ژن S. mutans I/II همراه با زیر واحد B توکسین توکسین B. . Infect Immun 61(5):1964-1971

10. موتسوپولوس NM، Konkel JE (2018) ایمنی خاص بافت در سد مخاطی دهان. Trends Immunol 39 (4): 276-287

11. Lin CW، Chen YT، Ho HH، Hsieh PS، Kuo YW، Lin JH، Liu CR، Huang YF، Chen CW، Hsu CH، Lin WY، Yang SF (2021) لوزژین ها با سویه های پروبیوتیک، پاسخ ایمنی دهان و سلامت را افزایش می دهند. . Oral Dis. https://doi.org/10.1111/odi.13854

12. Ericson D, Hamberg K, Bratthall G, Sinkiewicz-Enggren G, Ljunggren L (2013) پاسخ IgA بزاقی به باکتری های پروبیوتیک و استرپتوکوک mutans پس از استفاده از آدامس حاوی لاکتوباسیلوس رویتری. Pathog Dis 68 (3): 82-87

13. Defrance T, Vanbervliet B, Briere F, Durand I, Rousset F, Banchereau J (1992) اینترلوکین 10 و فاکتور رشد تبدیل کننده بتا برای القای سلول های B انسان بی تکلف ضد CD{4} برای ترشح ایمونوگلوبولین A همکاری می کنند. J Exp Med 175 (3): 671-682

14. Papone V, Verolo C, Zafaroni L, Batlle A, Capo C, Bueno L et al (2015) تشخیص و شیوع پاتوژن های پریودنتال در جمعیت اروگوئه ای مبتلا به پریودنتیت مزمن با استفاده از روش شناسی مرسوم و متاژنومیکس. Odontoestomatologia 17 (25): 23-32

15. Butera A, Gallo S, Maiorani C, Molino D, Chiesa A, Preda C, Scribante A (2021) جایگزین پروبیوتیک برای کلرهگزیدین در درمان پریودنتال: ارزیابی پارامترهای بالینی و میکروبیولوژیکی. میکروارگانیسم ها 9(1):69

16. Wang Y, Li X, Ge T, Xiao Y, Liao Y, Cui Y et al (2016) پروبیوتیک‌ها برای پیشگیری و درمان عفونت‌های دستگاه تنفسی در کودکان: مرور سیستماتیک و متاآنالیز کارآزمایی‌های تصادفی‌سازی و کنترل‌شده. پزشکی 95(31):e4509. https://doi.org/10.1097/ MD.0000000000004509

17. Laufer AS، Metlay JP، Gent JF، Fennie KP، Kong Y، Pettigrew MM (2011) جوامع میکروبی دستگاه تنفسی فوقانی و اوتیت مدیا در کودکان. mBio 2(1):e{4}}. https://doi.org/10. 1128/mBio.{7}}

18. Chen YT، Hsieh PS، Ho HH، Hsieh SH، Kuo YW، Yang SF، Lin CW (2020) فعالیت ضد باکتریایی سویه‌های پروبیوتیک زنده و کشته‌شده با حرارت در برابر پاتوژن‌های دهان. Lett Appl Microbiol 70(4):310-317

19. Bonifait L, Chandad F, Grenier D (2009) پروبیوتیک ها برای سلامت دهان: افسانه یا واقعیت؟ J Can Dent Assoc 75(8):585-90

20. Hsieh PS، An Y، Tsai YC، Chen YC، Chuang CJ، Zeng CT، King AE (2013) پتانسیل سویه های پروبیوتیک برای تعدیل پاسخ های التهابی سلول های اپیتلیال و ایمنی در شرایط آزمایشگاهی. New Microbiol 36 (2): 167-179

21. Elrefaei M, Burke CM, Baker CA, Jones NG, Bousheri S, Bangsberg DR, Cao H (2009) تولید TGF- and IL{3}} توسط سلول های T HIVspecifc CD{4}} توسط CTLA تنظیم می شود سیگنال دهی در سلول های CD{6}} T. PloS ONE 4(12):e8194

22. Ranganathan V، Akhila CH (2019) استرپتوکوک موتانس: آیا عامل اصلی تظاهرات دهانی است؟ J Microbiol Exp 7 (4): 207-213

23. Almeida CC, Lorena SLS, Pavan CR, Akasaka HMI, Mesquita MA (2012) اثرات مفید مصرف طولانی مدت ترکیب پروبیوتیکی از Lactobacillus casei Shirota و Bifidobacterium breve Yakult ممکن است پس از تعلیق درمان در بیماران مبتلا به لاکتوز-این تومور باقی بماند. Nutr Clin Pract 27(2):247-251

24. Braathen G، Ingildsen V، Twetman S، Ericson D، Jørgensen MR (2017) وجود لاکتوباسیلوس رویتری در بزاق همزمان با IgA بزاق بالاتر در بزرگسالان جوان پس از مصرف قرص های پروبیوتیک است. Benef Microbes 8 (1): 17-22

25. Scharek L, Guth J, Filter M, Schmidt MFG (2007) تاثیر باکتری پروبیوتیک Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68) و Bacillus cereus var. به شما NCIMB 40112 در مورد توسعه سرمی IgG و IgA مدفوع خروس ها و خوکچه های آنها. Arch Anim Nutr 61 (4): 223-234

26. ابراهیم پور کوجان س، میلاجردی ع، لاریجانی ب، اسماعیل زاده ع (2020) اثرات پروبیوتیک ها بر سیتوکین ها و ایمونوگلوبولین های بزاقی: مروری سیستماتیک و متاآنالیز در کارآزمایی های بالینی. Sci Rep 10 (1): 1-11

27. Ou CC, Lin SL, Tsai JJ, Lin MY (2011) باکتری های اسید لاکتیک کشته شده توسط گرما پتانسیل تعدیل کننده ایمنی را با انحراف پاسخ ایمنی به سمت قطبش Th1 افزایش می دهند. J Food Sci 76(5):M260–M267. https://doi.org/10.1111/j.{14}}.2011. 02161.x

28. Nair MS، Amalaradjou MA، Venkitanarayanan K (2017) خواص ضد ویروسی پروبیوتیک ها در مبارزه با پاتوژنز میکروبی. Adv Appl Microbiol 98:1-29

29. Wu MH، Pan TM، Wu YJ، Chang SJ، Chang MS، Hu CY (2010) فعالیت های اگزوپلی ساکارید از بیفیدوباکتریوم پروبیوتیک: اثرات تعدیل کننده ایمنی (روی ماکروفاژهای J774A. 1) و خواص ضد میکروبی. Int J Food Microbiol 144 (1): 104-110

30. پابرهنه SF، Klaenhammer TR (1983) تشخیص و فعالیت لاکتاسین B، یک باکتریوسین تولید شده توسط لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس. Appl Environ Microbiol 45(6):1808-1815

31. Kim PI، Sohng JK، Sung C، Joo HS، Kim EM، Yamaguchi T، Kim BG (2010) خصوصیات و شناسایی ساختار یک پپتید ضد میکروبی، هومینین، تولید شده توسط Staphylococcus hominis MBBL 2-9. Biochem Biophys Res Commun 399 (2): 133-138

32. Piqué N, Berlanga M, Minana-Galbis D (2019) مزایای سلامتی پروبیوتیک‌های گرما کشته شده (Tyndallized): یک مرور کلی. Int J Mol Sci 20(10):2534