توالی یابی کل ژنوم برای تشخیص اختلالات انبساط مکرر عصبی در انگلستان: دقت تشخیصی گذشته نگر و مطالعه اعتبار سنجی بالینی آینده نگر

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

خلاصه

زمینه

اختلالات انبساط مکرر حدود 1 نفر از هر 3000 نفر را تحت تاثیر قرار می دهد و از نظر بالینی بیماری های ناهمگونی هستند که در اثر گسترش تکرارهای کوتاه DNA پشت سر هم ایجاد می شوند. آزمایش‌های ژنتیکی اغلب به مکان اختصاصی انجام می‌شود و منجر به تشخیص نادرست افرادی می‌شود که تظاهرات بالینی غیر معمول دارند، به‌ویژه در بیماران اطفال بدون سابقه خانوادگی مثبت قبلی. توالی یابی کل ژنوم به طور فزاینده ای به عنوان یک آزمایش خط اول برای سایر اختلالات ژنتیکی نادر مورد استفاده قرار می گیرد و هدف ما ارزیابی عملکرد آن در تشخیص بیماران مبتلا بهعصبیتکرار اختلالات گسترش

مواد و روش ها

ما به صورت گذشته نگر دقت تشخیصی توالی یابی کل ژنوم را ارزیابی کردیم تا شایع ترین مکان های گسترش تکرار مرتبط باعصبینتایج (AR، ATN1، ATXN1، ATXN2، ATXN3، ATXN7، C9orf72، CACNA1A، DMPK، FMR1، FXN، HTT، و TBP) با استفاده از نمونه‌های به‌دست‌آمده در سرویس بهداشت ملی انگلستان از بیماران مشکوک به داشتنعصبیاختلالات؛ نتایج آزمایش PCR قبلی به عنوان استاندارد مرجع استفاده شد. دقت بالینی توالی‌یابی کل ژنوم برای تشخیص انبساط‌های مکرر در بیمارانی که قبلاً از نظر ژنتیکی آزمایش شده بودند و تشخیص داده نشده بودند که در سال‌های 2013 تا 2017 در پروژه ژنوم 100 000 در بریتانیا استخدام شده بودند و مشکوک به داشتن یک ژنتیکی بودند مورد بررسی قرار گرفت.عصبیاختلال (اشکال خانوادگی یا زودرس آتاکسی، نوروپاتی، پاراپلژی اسپاستیک، زوال عقل، بیماری نورون حرکتی،پارکینسونیجنبشاختلالات، ناتوانی ذهنی، یا اختلالات عصبی عضلانی). اگر با استفاده از توالی یابی کل ژنوم یک فراخوانی مجدد گسترش داده شود، برای تایید نتیجه از PCR استفاده می شود.

یافته ها

دقت تشخیصی توالی یابی کل ژنوم برای تشخیص انبساط مکرر در برابر 793 آزمایش PCR که قبلاً در NHS از 4 بیمار انجام شده بود، ارزیابی شد. توالی یابی کل ژنوم به درستی 215 از 221 آلل گسترش یافته و 1316 از 1321 الل غیر منبسط شده را طبقه بندی کرد که حساسیت 97·3 درصد (95 درصد CI 94·2-99·0) و 99·6 درصد ویژگی (99·1-99) را نشان داد. ·9) در 13 جایگاه مرتبط با بیماری در مقایسه با نتایج آزمایش PCR. در نمونه‌هایی از 11 631 بیمار در پروژه 100 000 ژنوم، توالی‌یابی کل ژنوم 81 بسط تکراری را شناسایی کرد که با PCR نیز آزمایش شدند: 68 مورد به‌عنوان گسترش تکرار در محدوده کامل بیماری‌زا تأیید شد، 11 مورد غیر از بین بودند. گسترش یا جایگشت میانی بیماری زا، و دو مورد تکرار غیر منبسط شده بودند (16 درصد نرخ کشف نادرست).

تفسیر

در مطالعه ما، توالی یابی کل ژنوم برای تشخیص انبساط تکراری حساسیت و ویژگی بالایی نشان داد و منجر به شناساییعصبیتکرار اختلالات گسترش در بیمارانی که قبلاً تشخیص داده نشده بودند. این یافته‌ها از اجرای توالی‌یابی کل ژنوم در آزمایشگاه‌های بالینی برای تشخیص بیمارانی حمایت می‌کندعصبیارائه سازگار با اختلال گسترش تکرار.

منابع مالی

شورای تحقیقات پزشکی، دپارتمان بهداشت و مراقبت های اجتماعی، خدمات بهداشت ملی انگلستان، موسسه ملی تحقیقات سلامت، و ایلومینا.

مقدمه

با وجود پیشرفت های اخیر در درک ما از اساس ژنتیکی نادرعصبیاختلالات، تا 70 درصد از بیماران مبتلا به چنین اختلالاتی از نظر ژنتیکی تشخیص داده نمی شوند. تخمین زده می‌شود که چنین انبساط‌هایی حدود 1 نفر از هر 3000 نفر را تحت تأثیر قرار دهد (پیوست p 1) و علت اصلی بیش از 40 اختلال نوروژنتیکی است، از جمله بیماری هانتینگتون و سندرم X شکننده. اختلالات انبساط مکرر از نظر بالینی و ژنتیکی ناهمگن هستند و تکرار گسترش می تواند با بیماری های مختلفی همراه باشد. برای مثال، انبساط در C9orf72 می‌تواند به صورت اسکلروز جانبی آمیوتروفیک یا دمانس فرونتوتمپورال ظاهر شود. 5 گسترش مکرر در جایگاه‌های مختلف نیز می‌تواند ویژگی‌های فنوتیپی مشابهی را به همراه داشته باشد، که تشخیص بالینی آنها را دشوار می‌کند: تکرار گسترش در حداقل ده ژن آتاکسی نخاعی که اغلب در بزرگسالان وجود دارد. آتاکسی شروع، 6 و آنهایی که در C9orf72 و AR هستند، هر دو می توانند باعث بیماری نورون حرکتی شوند.

اختلالات انبساط مکرر به دلیل افزایش تعداد توالی های DNA پشت سر هم کوتاه تکراری ایجاد می شود و آستانه بیماری زایی برای هر اختلال مختص مکان است. اندازه انبساط از کمتر از 30 تکرار (مثلاً در CACNA1A) تا چندین هزار واحد تکرار متفاوت است (مثلاً در FMR1، DMPK، C9orf72، و FXN، که می تواند تا 5 کیلوبایت اندازه گسترش یابد). انبساط مکرر ناپایداری مولکولی را نشان می‌دهد که می‌تواند منجر به تغییر در اندازه تکرار (به طور کلی افزایش طول) در بین نسل‌ها و بافت‌ها شود.4 در این شرایط، افزایش تعداد تکرارها اغلب منجر به شروع زودتر و بیماری شدیدتر در پیاپی می‌شود. نسل‌ها. 4 شروع تکرار اختلالات انبساط در کودکان می‌تواند به صورت سندرم‌های چند سیستمی بدون علائم فنوتیپی خاص تظاهر کند، و کودکان مبتلا به این اختلالات به احتمال زیاد در مواردی که سابقه خانوادگی تکرار اختلال گسترش وجود ندارد، کمتر تشخیص داده می‌شوند. 12

ارزیابی آزمایشگاهی انبساط های مکرر معمولاً محدود به ارزیابی مولکولی هدفمند یک مکان جداگانه است که توسط تشخیص بالینی مشکوک با استفاده از روش های مبتنی بر PCR یا ساترن بلات هدایت می شود، که می تواند پرهزینه و زمان بر باشد. علاوه بر این، به دلیل ویژگی‌های فنوتیپی متنوع و همپوشانی این اختلالات، مکان‌های گسترش مکرر مرتبط با بیماری می‌توانند آزمایش نشده باقی بمانند.

توالی یابی کل ژنوم به عنوان یک ابزار تشخیصی خط اول در بیماران مبتلا به بیماری نادر در حال ظهور است، اما تا همین اواخر، تصور می شد که توانایی محدودی برای ارزیابی جایگاه های حاوی انبساط های تکراری داشته باشد. در اینجا، ما در مورد ارزیابی تشخیصی یک رویکرد توالی یابی کل ژنوم برای تشخیص تکرار بسط با استفاده از داده های PCR گذشته نگر، و اعتبار بالینی آن در بیمارانی که در پروژه 100000 ژنوم هستند، گزارش می کنیم. یک اختلال عصبی مشکوک بود که با آزمایشات ژنتیکی قبلی تشخیص داده نشده بود.

مواد و روش ها

طراحی مطالعه و شرکت کنندگان

این ارزیابی از توالی‌یابی کل ژنوم برای تشخیص بسط‌های تکراری، هم دقت تشخیصی و هم ارزیابی‌های دقت بالینی را شامل می‌شود. دقت تشخیصی با استفاده از داده‌های بیمارانی که قبلاً توسط PCR برای گسترش مکرر شناخته شده برای ایجاد بیماری‌های عصبی آزمایش شده بودند، ارزیابی شد. کمبریج، انگلستان). برای هر دو گروه از بیماران، آزمایش PCR بر روی نمونه‌های بیمار توسط آزمایشگاه‌های خدمات بهداشت ملی (NHS) به عنوان بخشی از ارزیابی بالینی معمول انجام شده بود: برای نمونه‌های پروژه 100000 ژنوم، آزمایش‌های PCR قبل از استخدام در پروژه توسط سازمان انجام شد. آزمایشگاه نوروژنتیک بیمارستان دانشگاه کالج لندن (لندن، انگلستان)؛ نمونه هایی با انبساط تکرار تایید شده با PCR از بیماران آزمایش شده توسط آزمایشگاه ژنومیک مستقر در کمبریج به دست آمد. بیماران با نتایج آزمایش PCR مثبت و منفی برای تکرار اختلالات گسترش برای گنجاندن در مطالعه ما از طریق سیستم های ثبت آزمایشگاهی شناسایی شدند. همه بیماران برای استفاده از نمونه خود برای تضمین کیفیت و اهداف تحقیق و آموزش، به عنوان بخشی از بهینه سازی و اعتبار سنجی خدمات بالینی، رضایت آگاهانه کتبی داده بودند.

توالی یابی کل ژنوم هر نمونه در یکی از دو آزمایشگاه انجام شد: Genomics England (Hinxton، UK) برای نمونه های پروژه 100000 ژنوم (n=254) و آزمایشگاه خدمات بالینی Illumina (ICSL؛ San Diego, CA, ایالات متحده آمریکا) برای نمونه های به دست آمده توسط آزمایشگاه ژنومیک مستقر در کمبریج (n=150). به طور کلی، این مجموعه داده برای بخش دقت تشخیصی مطالعه مورد استفاده قرار گرفت و شامل داده‌های PCR و توالی‌یابی کل ژنوم از 404 بیمار بود که 13 جایگاه را پوشش می‌داد که نشان دهنده شایع‌ترین اختلالات تکرار عصبی هستند: 11 جایگاه مرتبط با آتاکسی و دیررس. شروع اختلالات نورودژنراتیو (HTT، AR، ATN1، ATXN1، ATXN2، ATXN3، ATXN7، CACNA1A، TBP، C9orf72، و FXN)، یک مکان مرتبط با ناتوانی ذهنی (FMR1)، و یک مکان مرتبط با دیستروفی میوتونیک (DMPK). برای هر مکان، داده های آزمون PCR برای حداقل یک آلل منبسط شده در دسترس بود (پیوست ص 24).

دقت بالینی با بررسی تطابق گسترش‌های مکرر، همانطور که با توالی‌یابی کل ژنوم تشخیص داده شد، با تشخیص بالینی مشکوک پس از تایید PCR در بیماران مشکوک به اختلالات عصبی ژنتیکی (اشکال اولیه یا خانوادگی آتاکسی، نوروپاتی، پاراپلژی اسپاستیک، زوال عقل) ارزیابی شد. بیماری نورون حرکتی،پارکینسونیاختلالات حرکتی، ناتوانی ذهنی، یا اختلالات عصبی عضلانی) که در پروژه 100000 ژنوم در سال‌های 2013-2017 استخدام شدند. پروژه 100000 ژنوم یک برنامه بریتانیایی برای ارزیابی ارزش توالی یابی کل ژنوم در بیماران با نیازهای تشخیصی برآورده نشده در بیماری های نادر و سرطان است. پس از تایید اخلاقی پروژه 100000 ژنوم توسط کمیته اخلاق تحقیقات کمبریج جنوب شرقی انگلستان (مرجع 14/EE/1112)، از جمله برای تجزیه و تحلیل داده ها و بازگشت یافته های تشخیصی به بیماران، این بیماران توسط متخصصان مراقبت های بهداشتی و محققان از 13 مرکز پزشکی ژنومیک در انگلستان و در صورتی که آنها یا سرپرست آنها رضایت کتبی برای استفاده از نمونه‌ها و داده‌هایشان در تحقیقات، از جمله این مطالعه، ارائه می‌کردند، در پروژه ثبت نام می‌شدند. پروباندها و، در صورت امکان، سایر اعضای خانواده، بر اساس معیارهای واجد شرایط بودن تعیین شده برای شرایط خاص بیماری نادر ثبت نام شدند (پیوست صفحات 5-11). طبق معیارهای واجد شرایط بودن، بیماران پس از آزمایش استاندارد ژنتیکی مراقبتی در NHS، به پروژه 100000 ژنوم جذب شدند. داده‌های بالینی پایه استاندارد شده با استفاده از هستی‌شناسی فنوتیپ انسانی (HPO)23 در برابر مدل‌های داده‌های خاص بیماری ثبت شد. وضعیت بیماری اعضای خانواده، نسبت به اندیکاسیون بالینی پروباند برای آزمایش، نیز جمع‌آوری شد.

برای شناسایی انبساط های مکرر مسبب در بیماران مبتلا به بیماری ژنتیکی تشخیص داده نشده، ما بیمارانی را که مشکوک به اختلالات ژنتیکی مطابق با یک بیماری گسترش مکرر بودند آزمایش کردیم. بیماران بر اساس تطابق بیماری و شرایط HPO با تکرار اختلالات مرتبط با گسترش انتخاب شدند. داده‌های توالی‌یابی کل ژنوم بیماران برای جستجوی بسط‌ها در مجموعه‌های خاصی از تکرارها با استفاده از چهار پانل گسترش تکرار مختلف با توجه به ویژگی‌های بالینی آنها مورد بازجویی قرار گرفت (پیوست ص 5). انبساط های تکراری انتخاب شده برای گنجاندن بر روی این پانل ها شایع ترین مکان های گسترش تکرار بیماری عصبی هستند. بیماران با ویژگی‌های بالینی که به طور بالقوه با بیش از یک اختلال انبساط مکرر سازگار هستند، در پانل‌های متعدد مورد آزمایش قرار گرفتند. اگر با استفاده از توالی یابی کل ژنوم یک فراخوان گسترش مجدد انجام شد، آزمایش تاییدی توسط PCR انجام شد.

برای هر بیمار با گسترش تکرار تایید شده، پزشک محلی از نتیجه تشخیصی بالقوه مطلع شد و سهم گسترش تکرار در ویژگی‌های بالینی بیمار ارزیابی شد. برای انبساط های مکرر که به طور کامل یا جزئی ویژگی های بالینی بیمار را توضیح می داد، یک گزارش تشخیصی طبق رویه های استاندارد محلی صادر شد.

رویه ها

برای نمونه های تاریخی NHS مورد استفاده در بخش دقت تشخیصی مطالعه ما، بسط های تکراری قبلاً با استفاده از تقویت PCR و تجزیه و تحلیل قطعه آزمایش شده بود. ساترن بلات برای گسترش بزرگ C9orf72 انجام شد. در بخش دقت بالینی مطالعه ما، تکرار بسط های شناسایی شده توسط توالی یابی کل ژنوم در بیماران از پروژه ژنوم 100 000 توسط PCR در نمونه های ذخیره شده در آزمایشگاه های ژنتیک NHS مورد آزمایش قرار گرفت. جزئیات بیشتر، از جمله توالی پرایمر، در پیوست ارائه شده است (ص 2-3، 25-26).

DNA برای توالی یابی کل ژنوم با استفاده از آماده سازی کتابخانه TruSeq DNA PCR-Free تهیه شد و توالی یابی جفت انتها 150 جفت باز یا 125 جفت باز بر روی پلت فرم های HiSeq 2000 یا HiSeq X در مرکز ژنوم با توان بالا برای Genomics انگلستان و در ICSL انجام شد. . ژنوم ها تا عمق متوسط ​​35× (31× تا 37×؛ پیوست p 27) توالی یابی شدند. ژنوتیپ با تکرار پشت سر هم کوتاه با استفاده از بسته نرم افزاری ExpansionHunter نسخه 3.1.2.25،26، به طور خلاصه، ExpansionHunter توالی خوانی را مجدداً در یک مجموعه از پیش تعریف شده از تکرارهای پشت سر هم قرار می دهد تا اندازه هر دو آلل را از یک فرد تخمین بزند (پیوست ص 3).

خروجی ExpansionHunter شامل تخمینی از تعداد عناصر تکرار، اندازه کلی و حد اطمینان برای هر منبع ارزیابی شده است. دستورالعمل‌های انجمن آسیب‌شناسی پزشکی و کالج آسیب‌شناسان آمریکایی، بازرسی بصری تماس‌های مختلف را در طول ارزیابی معمول انواع توالی‌یابی با توان عملیاتی بالا توصیه می‌کنند.

با این حال، انواع تکرار پشت سر هم کوتاه نمی‌توانند به‌اندازه کافی توسط ابزارهای تجسم رایج مانند Integrative Genomics Viewer تجسم شوند.28 برای بررسی داده‌های توالی ژنوم کل زیر هر فراخوانی ژنوتیپ، از ابزار تجسم نمودار استفاده شد که تجسم مستقیم هاپلوتیپ‌ها و انباشته خواندن متناظر را امکان‌پذیر می‌سازد. ژنوتیپ های ExpansionHunter (پیوست صفحات 3، 15). بازرسی بصری نمودار انباشته بر روی همه تماس‌های تکراری کوتاه پشت سر هم توالی‌یابی کل ژنوم انجام شد تا تأیید شود که پیش‌بینی ExpansionHunter برای آلل‌ها به طور کامل در هر خواندن وجود دارد (یعنی توالی تکرار کوچک‌تر از طول خواندن توالی بود). برای تأیید وجود انبساط تک آللی یا دو آللی؛ برای تشخیص تماس های احتمالی مثبت کاذب؛ و برای تشخیص آلل های منفی کاذب در بسط های تکرار دو آللی، مانند FXN (پیوست صفحات 4، 16).

ExpansionHunter اندازه تکرار را از داده های توالی یابی کل ژنوم با تجزیه و تحلیل توالی خوانی هایی که به طور کامل یا جزئی حاوی یک تکرار پشت سر هم کوتاه هستند، تخمین می زند. اگر یک آلل تکرار پشت سر هم کوتاه‌تر از طول خوانده شده باشد، ExpansionHunter اندازه دقیق را پیش‌بینی می‌کند. اگر یک آلل تکرار پشت سر هم کوتاه بیشتر از طول خوانده شده باشد، ExpansionHunter اندازه تکرار را در یک CI، بسته به ترکیب توالی مکان، عمق توالی یابی و کیفیت توالی تخمین می زند.

تحلیل آماری

اگر اندازه پیش‌بینی‌شده توسط ExpansionHunter بالاتر از برش پیش‌جهش بود، تکرارها را به‌عنوان گسترش‌یافته توسط توالی‌یابی کل ژنوم طبقه‌بندی کردیم، یا اگر اندازه پیش‌بینی‌شده کمتر از حد بود (ضمیمه p 28) بود.

حساسیت و CI برای تشخیص گسترش تکرار توالی‌یابی کل ژنوم به عنوان نسبت آلل‌های با تکرارهای منبسط شده در بین آلل‌های قبلاً تأیید شده با PCR با تکرارهای گسترش‌یافته محاسبه شد. ویژگی به عنوان نسبت آلل های منبسط نشده در بین تکرارهای غیر منبسط شده قبلی توسط PCR تخمین زده شد. شرح کامل فرمول های آماری در پیوست (ص 1) ارائه شده است.

برای مقایسه اندازه‌های تکرار توسط PCR با تخمین اندازه تکرار توسط توالی‌یابی کل ژنوم، آلل‌های کمی‌سازی‌شده با PCR با اندازه‌های تکرار پیش‌بینی‌شده توسط ExpansionHunter برای آلل‌های کوتاه‌تر از طول خوانده شده در تمام 13 جایگاه تکرار پشت سر هم مقایسه شدند. تطابق با درصد اندازه‌های تکرار پیش‌بینی‌شده توسط ExpansionHunter که با اندازه اندازه‌گیری شده با PCR مطابقت داشتند، با در نظر گرفتن خطای PCR به اضافه یا منهای یک تکرار محاسبه شد. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار آماری R نسخه 3.6.3 انجام شد.

نقش منبع تامین مالی

طراحی مطالعه، ثبت نام بیمار، جمع آوری داده ها و توالی یابی توسط کارمندان ژنومیکس انگلستان و محققان دانشگاهی انجام شد. کارکنان Illumina توالی یابی 150 نمونه بیمار را به عنوان یک جزء برنامه ریزی شده از کل مطالعه توالی یابی تشخیصی ژنوم انجام دادند و ExpansionHunter را توسعه دادند. کارمندان ژنومیکس انگلستان، محققان دانشگاهی و نویسندگان همکار RTH، ED، و MAE تجزیه و تحلیل و تفسیر بسط تکراری را در بیماران استخدام شده در پروژه ژنوم 100 000 انجام دادند. منابع مالی هیچ نقشی در تفسیر داده ها یا نوشتن گزارش نداشتند.

نتایج

دقت تشخیصی توالی یابی کل ژنوم برای تشخیص انبساط های مکرر در برابر 793 آزمایش PCR که قبلاً در NHS از 4 04 بیمار انجام شده بود (64 بیمار برای بیش از یک تکرار آزمایش شدند؛ شکل 1) ارزیابی شد. از این آزمایش‌ها، 183 مورد به‌عنوان دارای تکرار گسترش‌یافته و 610 مورد به‌عنوان فاقد انبساط مکرر توسط PCR طبقه‌بندی شدند که در مجموع 221 آلل منبسط شده و 1321 آلل منبسط شده را در 13 مکان بیماری ایجاد کردند (پیوست صفحات 24، 28). توالی یابی کل ژنوم به درستی 215 از 221 آلل گسترش یافته و 1316 از 1321 آلل غیر منبسط شده را در مقایسه با نتایج آزمایش PCR (پیوست صفحات 27، 29) طبقه بندی کرد که حساسیت اولیه 97.3 درصد (95 درصد فاصله اطمینان (CI 94·2-99) را نشان می دهد. · 0) و ویژگی 99 · 6 درصد (99 · 1-99 · 9؛ جدول 1). به دنبال تصحیح بصری همه تماس‌ها بر اساس کیفیت خواندن، حساسیت به 99·1 درصد (96·8-99·9) و ویژگی به 100 درصد (99·7-100؛ شکل 2A، جدول 1) افزایش یافت. تجسم آلل‌های گسترش‌یافته، تشخیص نتایج مثبت کاذب و طبقه‌بندی مجدد همه آلل‌های منفی کاذب در FXN را امکان‌پذیر کرد، که تنها یک آلل به‌درستی به‌عنوان منبسط شده در نمونه‌های دارای انبساط دو آللی طبقه‌بندی شد (پیوست صفحات 17، 18).

طول تکرار با استفاده از PCR در 509 آزمایش PCR که 945 آلل را در 13 مکان انبساط تکراری بررسی می‌کرد، اندازه‌گیری شد. همبستگی بین ExpansionHunter و PCR برای اندازه های تکرار کوتاهتر و بزرگتر از طول خواندن توالی (یعنی 150 جفت باز) در پیوست نشان داده شده است (پیوست p 19). تطابق بالایی برای تکرارهای کوتاهتر از طول خواندن مشاهده شد، با 92.7 درصد (836 از 902) توافق بین PCR و ExpansionHunter. تنوع مکان مشاهده شد، با تطابق زیاد بین ExpansionHunter و PCR برای ATXN2، ATXN7، CACNA1A، و HTT، و تطابق کم برای DMPK یا TBP (پیوست ص 30). طول آلل های بزرگتر از طول خوانده شده توسط ExpansionHunter دست کم گرفته شد، که بر دقت فراخوانی در DMPK، FMR1، و FXN تأثیر گذاشت (شکل 2B، پیوست ص 19، 31).

اگرچه ExpansionHunter توانست به درستی آلل های منبسط شده بزرگ را در FMR1، DMPK، C9orf72، و FXN شناسایی کند (پیوست ص 29)، تخمین اندازه پیش بینی شده کمتر از آنهایی است که توسط PCR به دست می آید، زیرا اندازه تکرار در محدوده بیماری زایی افزایش می یابد، که بر روی توانایی تمایز بین گسترش‌های بزرگ و کوچک در DMPK، C9orf72، و FXN، یا بین بسط‌ها و جایگشت‌های کامل در FMR1 (پیوست ص 31). برای مثال، جایگاه‌هایی با طول تکرار ارزیابی‌شده با PCR بزرگتر از 200 تکرار در FMR1 و طبقه‌بندی شده به عنوان یک جهش کامل، میانگین اندازه تکرار برآورد شده توسط ExpansionHunter 92·6 (SD 17·8؛ پیوست ص 31) داشتند.

برای آزمایش توانایی تشخیص تکرار گسترش توسط توالی یابی کل ژنوم برای حل تشخیص بیمارانی که قبلاً آزمایش شده بودند و از نظر ژنتیکی تشخیص داده نشده بودند، 11 631 بیمار مشکوک به اختلال عصبی ژنتیکی را که در پروژه 100000 ژنوم استخدام شده بودند آزمایش کردیم (شکل 1). داده‌های توالی‌یابی کل ژنوم با استفاده از چهار پانل گسترش تکرار مختلف با توجه به ویژگی‌های بالینی بیمار مورد ارزیابی قرار گرفت. تعداد بیماران آزمایش شده با هر یک از چهار پانل در جدول 2 نشان داده شده است.

به طور کلی، ما تکرار بسط‌ها را در نمونه‌های 105 بیمار شناسایی و به صورت بصری تأیید کردیم (جدول 2، پیوست صفحه 20، 33). از این تعداد، 81 نمونه برای آزمایش تاییدی توسط PCR در دسترس بود، و 68 نمونه به عنوان تکرار انبساط تایید شد (0·6 درصد بازده): 45 (1·2 درصد ) از 3692 در پانل A، هشت ({ {18}}·3 درصد ) از 2743 در پانل B، پنج (0·6 درصد ) از 860 در پانل C، و ده (0·1 درصد ) از 6731 در پانل D. سیزده مورد از 81 تماس توسعه به عنوان انبساط تکرار بیماری زا تایید نشد (16 درصد نرخ کشف نادرست). از این تعداد، دو آلل غیر منبسط شده در ATXN1 و ATXN2، چهار آلل با اندازه متوسط ​​FMR1 (پیوست p 21) و هفت مورد جایگشت FMR1 بودند.

جزئیات بالینی 68 بیمار با انبساط مکرر تایید شده توسط PCR، از جمله تظاهرات بالینی آنها، تکرار گسترش شناسایی شده، و سهم تکرار گسترش در ویژگی های بالینی بیمار در جدول 3 ارائه شده است. شرایط HPO، اندازه تکرار تخمین زده شده توسط ExpansionHunter، و اینکه آیا یک گزارش تشخیصی صادر شده است در پیوست ذکر شده است (ص 33).

گسترش در بیمارانی مشاهده شد که با طیف وسیعی از تظاهرات بالینی همپوشانی آزمایش شده با پانل A (جدول 3، پیوست ص 22)، از جمله گسترش مجدد ATXN2 در بیمار مبتلا به بیماری پارکینسون زودرس پاسخگو به لوودوپا و سابقه آتاکسی پیشرونده مخچه مشاهده شد. و گسترش AR در چهار بیمار با تشخیص بالینی بیماری شارکو ماری توث، از جمله یکی با نوروپاتی دمیلینه کننده ژنتیکی تایید شده (به عنوان مثال، بیماری شارکوت ماری توث نوع 1، بیمار 42؛ ضمیمه ص 33). طیف وسیعی از تشخیص‌های بالینی قبلی در بیماران مبتلا به گسترش مجدد بیماری‌زا مشاهده شد.

به عنوان مثال، در هفت بیمار مبتلا به اسکلروز جانبی آمیوتروفیک یا سایر بیماری‌های نورون حرکتی، انبساط در AR (n=4) و C9orf72 (n=3) شناسایی شد. در بیماران مشکوک به آتاکسی ارثی، ما انبساط جایگاه‌هایی را شناسایی کردیم که به عنوان بخشی از کارهای تشخیصی معمول در NHS در زمان استخدام ارزیابی نشده بودند، از جمله ATN1، ATXN2، ATXN3، ATXN7، CACNA1A، FXN، TBP، و HTT. جدول 3). ما همچنین گسترش مکرر را در بیمارانی با ویژگی‌های بالینی مطابق با اختلالات تکراری جایگزین شناسایی کردیم، از جمله گسترش C9orf72 در بیماری پارکینسون اولیه و خانوادگی (بیمار 24، جدول 3) و تکرار گسترش در محدوده نفوذ کاهش یافته در HTT (38 تکرار) در دو خواهر مبتلا به اختلال حرکتی، زوال عقل، افسردگی و مشکلات گفتاری (بیماران 44 و 45)، که بر چالش تشخیصی ارائه شده توسط این اختلالات گسترش تکراری تاکید دارد.

هشت کودکی که با پانل B مورد آزمایش قرار گرفتند، دارای انبساط مجدد CAG بزرگ بودند (شکل 3)، که هفت نفر از آنها به طور کامل ویژگی های بالینی بیمار را توضیح می دادند. شش بیمار سابقه خانوادگی آموزنده ای نداشتند و به عنوان بخشی از ارزیابی بالینی آنها در زمان استخدام، آزمایش گسترش مجدد پیشنهاد نشده بود (بیماران 48-53؛ جدول 3، پیوست ص 33). دو نفر از این کودکان دارای انبساط HTT بزرگ (90-100 تکرار CAG) بودند. شایان ذکر است، یک کودک این تکرار را از والدینی سالم و بدون سابقه خانوادگی بیماری هانتینگتون به ارث برده بود. آزمایش خانوادگی در حال انجام است، اما یک آلل نفوذی کاهش یافته در خانواده گسترده شناسایی شده است، که نشان می دهد تکرار بیش از 60 واحد تکرار در یک نسل منفرد افزایش یافته است (بیمار 52). در زمان نگارش این مقاله، هیچ یک از اعضای خانواده هیچ نشانه ای از بیماری هانتینگتون را نشان ندادند و مشاوره و آزمایش ژنتیک برای والدین ادامه دارد. دو کودک کمتر از 5 سال در ATXN7 انبساط‌های تکراری زیادی داشتند و با بیماری پیچیده چند سیستمی مواجه شدند. برای یکی از این کودکان (بیمار 50 ساله)، والدین آنها 2 سال پس از ثبت نام در پروژه 100000 ژنوم مشکلات راه رفتن نشان دادند. به طور مشابه، یک دختر 10 ساله با ناتوانی ذهنی دارای 99-بسط مکرر در ATXN2 بود، علی‌رغم این واقعیت که هر دو والدین به‌عنوان بی‌تأثیر تعیین شده بودند، و دختری 18 ساله مبتلا به زوال عقل دارای {99- {19}}تکرار گسترش در ATN1 (پیوست ص 33).

پنج گسترش در DMPK (پانل C) شناسایی شد، از جمله در یک کودک و یک مادر با تشخیص بالینی دیستروفی عضلانی، در دو خواهر و برادر مشکوک به میوپاتی دیستال، و در یک نوجوان با میوپاتی مادرزادی (بیماران 54-58). گسترش FMR1 (پانل D) در نه پسر و یک دختر تشخیص داده شد، و تشخیص سندرم X شکننده به طور کامل یا جزئی ویژگی های بالینی ارائه شده را توضیح داد (بیماران 59-68).

بحث

تشخیص اختلالات گسترش مکرر در مراقبت های بهداشتی به دلیل ویژگی های بالینی ناهمگن و همپوشانی و یافته های بالینی غیراختصاصی چالش برانگیز است که می تواند با افزایش سن و در هر نسل بعدی شدت آن افزایش یابد. اختلالات انبساط مکرر یکی از شایع‌ترین علل بیماری‌های عصبی ارثی است. روش‌های آزمایش در حال حاضر تکه تکه شده‌اند و بیماران ممکن است مکان انبساط را تکرار نادرست آزمایش کنند یا به دلیل همپوشانی ویژگی‌های بالینی با سایر اختلالات ژنتیکی عصبی، آزمایش مولکولی برای کلاس متفاوتی از انواع دریافت کنند.

توالی یابی کل ژنوم در تنظیمات متعدد به عنوان یک آزمایش تشخیصی خط اول برای اختلالات عصبی نادر استفاده شده است، اما قبلاً تصور می شد که توانایی کمی در تشخیص انبساط های تکراری دارد. ابزارهای متعددی برای شناسایی انبساط های تکراری از کل ژنوم ایجاد شده است. توالی یابی در محیط تحقیق، 31، اما هیچ یک از این رویکردها برای داده های توالی یابی کل ژنوم جمع آوری شده از تعداد زیادی از بیماران در یک سرویس مراقبت بهداشتی به کار گرفته نشده است. ما شواهدی را ارائه می‌کنیم که نشان می‌دهد الگوریتمی که برای تشخیص تکرار بسط‌ها از توالی‌یابی کل ژنوم طراحی شده است، می‌تواند به طور قابل اعتمادی رایج‌ترین گسترش‌های تکراری ایجادکننده بیماری را ارزیابی کند و مواردی که قبلاً از نظر ژنتیکی تشخیص داده نشده‌اند را در گروه بزرگی از بیماران مبتلا به اختلالات عصبی حل کند. نتایج ما نشان می‌دهد که توالی‌یابی کل ژنوم می‌تواند بین آلل‌های غیر منبسط شده و منبسط شده با حساسیت و ویژگی بالا در 13 مکان انبساط تکراری تمایز قائل شود (که می‌تواند با بازرسی بصری بیشتر بهبود یابد)، می‌تواند اندازه آلل‌های کوچک‌تر از طول خوانده شده را به دقت محاسبه کند. و ممکن است اندازه گسترش‌های بزرگ در FMR1، DMPK، FXN و C9orf72 را دست‌کم بگیرد.

هنگامی که تشخیص تکرار بسط توسط توالی یابی کل ژنوم در برابر نتایج مثبت و منفی که قبلاً در آزمایشگاه های ژنومی تشخیصی بالینی با استفاده از روش های استاندارد طلا به دست آمده بود ارزیابی شد، حداقل حساسیت 97.3 درصد و ویژگی 99.6 درصد یافتیم. علاوه بر این، ما نشان دادیم که هم ویژگی و هم حساسیت را می توان با تنظیم دستی انباشته خوانده شده بهبود بخشید، که امکان تشخیص نتایج مثبت کاذب و طبقه بندی مجدد آلل های منفی کاذب در نمونه هایی با بسط دو آللی را فراهم می کند. از 6731 بیمار آزمایش شده برای FMR1 (پانل D)، 124 تماس پیش بینی شده بود که گسترش یابد. ما توانستیم 97 را از طریق بازرسی بصری به عنوان موارد مثبت کاذب احتمالی حذف کنیم. این نشان می‌دهد که از هر 54 آزمایش توالی‌یابی ژنوم، 1 مورد یک تماس FMR1 دارد که باید به صورت بصری بازرسی شود تا تماس مثبت کاذب بالقوه حذف شود. کار برای بهبود روش ژنوتیپ ExpansionHunter برای کاهش تعداد تماس های مثبت کاذب برای FMR1 ادامه دارد.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 تکرار) باعث بیماری شدیدتر می شود و آتاکسی نخاعی نوع 36 (NOP56) که برای آن انبساط های بزرگتر از 650 تکرار بیماری زا و اندازه های تکرار 15-650 متوسط ​​و انواع با اهمیت نامشخص در نظر گرفته می شوند.

بیش از 40 مکان انبساط تکراری شناسایی شده است. بسیاری از این جایگاه‌ها اخیراً شناسایی شده‌اند و اکنون با شرایط غیرقابل توضیح قبلی، از جمله آتاکسی مخچه همراه با نوروپاتی و سندرم آرفلکسی دهلیزی (RFC1) 32 و صرع میوکلونیک (SAMD12) همراه هستند. برای مطالعه ما بر اساس در دسترس بودن نمونه های کنترل مثبت و منفی انتخاب شدند.

یافته‌های ارائه‌شده در اینجا نشان می‌دهد که ExpansionHunter باید بتواند آلل‌های غیر منبسط و منبسط شده را به دقت در هر مکان انبساط تکراری طبقه‌بندی کند، اگر آلل‌های منبسط نشده کوچکتر از طول خوانده شده (یعنی 150 جفت باز) باشند. اگرچه اکثر جایگاه‌های انبساط مکرر آلل‌هایی دارند که کوچک‌تر از 150 جفت باز هستند، اما برخی از جایگاه‌ها که اندازه آلل انبساط‌نشده نزدیک به 150 جفت باز است (مثلاً NOTCH2NLC)34 ممکن است ژنوتیپ با استفاده از این رویکرد دشوارتر باشد. برای مکان هایی که تکرار منبسط شده به طور قابل توجهی بزرگتر از طول خوانده شده است، توالی یابی کل ژنوم می تواند گسترش های بیماری زا را تشخیص دهد (به عنوان مثال، NOP56,35 RFC120,32). فناوری‌های توالی‌یابی طولانی‌مدت در حال ظهور ممکن است رویکردهای مکملی را هنگام تعیین ژنوتیپ بسط‌های بزرگ ارائه دهند.

ارزیابی تکرار بسط با استفاده از توالی یابی کل ژنوم در 11 631 بیمار تشخیص داده نشده که در پروژه ژنوم 100 000 استخدام شده بودند، 68 بیمار را با یافته های توضیحی به دست آورد. بیماران پس از آزمایش استاندارد ژنتیکی در پروژه ژنوم 100 000 استخدام شدند. بنابراین، نسبت گسترش‌های تکراری شناسایی‌شده در این گروه نشان‌دهنده افزایش بازده تشخیصی از آزمایش استاندارد NHS است که شامل آزمایش‌های اختصاصی مکان برای تکرار اختلالات گسترش مانند FXN یا DMPK است. شایان ذکر است، برخی از تشخیص‌ها بر اساس ویژگی‌های بالینی بیمار مشکوک نبودند، از جمله شش بیمار اطفال که هیچ سابقه خانوادگی شناخته شده‌ای از یک اختلال گسترش مجدد نداشتند. میانگین اندازه‌های تکرار تکرار پیش‌بینی‌شده توسط توالی‌یابی کل ژنوم در بیماران اطفال توصیف‌شده در این مطالعه، به‌طور قابل‌توجهی بزرگ‌تر از میانگین در بزرگسالان است، که با این انتظار همخوانی دارد که گسترش‌های بزرگ‌تر با شروع زودتر و شدیدتر، حتی در کودکان مرتبط است. کار بیشتری مورد نیاز است، اما این یافته نشان می‌دهد که ارزیابی بیماری‌زایی وابسته به سن و تکرار وابسته به اندازه ممکن است با کاهش خطر بالقوه شناسایی آلل‌های خطر شروع بزرگسالان، که منجر به آزمایش‌های پیش‌بینی ناخواسته در کودکان می‌شود، از تشخیص کودکان حمایت کند.

یافته های ما امکان ایجاد یک گردش کار تشخیصی بالینی را برای توالی یابی کل ژنوم فراهم می کند (پیوست ص 23). ما پیشنهاد می‌کنیم که بازرسی بصری برای همه فراخوان‌های طبقه‌بندی‌شده به‌عنوان گسترش یافته برای تشخیص مثبت‌های کاذب، و برای بسط‌های دو آللی که تنها یک آلل منبسط شده برای آن‌ها شناسایی شده است (به عنوان مثال، FXN) انجام شود. ما توصیه می‌کنیم که آزمایشگاه‌ها از ExpansionHunter برای ارزیابی وجود انبساط بدون رعایت تخمین اندازه استفاده کنند و آزمایش PCR تأییدی را به‌عنوان جزء استاندارد گردش کار آزمایش انجام دهند.

بیماری‌های ارثی نادر شامل طیف گسترده‌ای از ویژگی‌های بالینی است که باعث می‌شود آزمایش‌های ژنومی اختصاصی لوکوس ناکارآمد، دشوار و پرهزینه باشد. ما شواهدی را ارائه می‌دهیم که نشان می‌دهد توالی‌یابی کل ژنوم با درجه بالینی با پتانسیل تشخیص طیفی از بیماری‌های عصبی نادر که معمولاً با یک نوع پایه، ایندل یا تعداد کپی ارائه می‌شوند، اکنون می‌تواند به گسترش‌های تکراری گسترش یابد. از آنجایی که توالی‌یابی کل ژنوم یک آزمایش واحد را ارائه می‌کند که می‌تواند رایج‌ترین بسط‌های تکراری را شناسایی کند، و همچنین امکان آزمایش جهش‌های نقطه‌ای و تنوع تعداد کپی در ژن‌های مرتبط با این شرایط را به طور همزمان فراهم می‌کند، این فرصت را برای شناسایی بیشتر بیماران مبتلا به این اختلالات ناهمگن فراهم می‌کند. که با استفاده از آزمایشات مکان خاص تشخیص داده نشده اند. در عصر درمان های نوظهور برای این اختلالات، تشخیص زودهنگام ممکن است بسیار مهم باشد.37 این نتایج از اجرای توالی یابی کل ژنوم برای تشخیص گسترش مکرر در آزمایشگاه های تشخیصی بالینی پشتیبانی می کند، رویکردی که قبلاً در NHS National Genomic انگلستان گنجانده شده است. فهرست آزمایشی، 38 برای بررسی بیماری عصبی نادر تشخیص داده نشده.

منابع

1 Ngo KJ، Rexach JE، Lee H، و همکاران. سقف تشخیصی برای توالی اگزوم در آتاکسی مخچه و اختلالات عصبی مرتبط Hum Mutat 2020; 41: 487-501.

2 Lynch DS، Koutsis G، Tucci A، و همکاران. پاراپلژی اسپاستیک ارثی در یونان: توصیف جمعیتی که قبلا کشف نشده با استفاده از توالی یابی نسل بعدی Eur J Hum Genet 2016; 24: 857-63.

3 Graziola F، Garone G، Stregapede F، و همکاران. عملکرد تشخیصی یک پانل ژن توالی‌یابی هدفمند نسل بعدی برای اختلالات حرکتی با شروع کودکان: یک مطالعه کوهورت 3- ساله. Front Genet 2019; 10: 1026.

4 پالسون اچ. بیماری های گسترش را تکرار کنید. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105-23.

5 Gossye H، Engelborghs S، Van Broeckhoven C، Van der Zee J. C9orf72 دمانس فرونتوتمپورال و/یا اسکلروز جانبی آمیوتروفیک. سیاتل، WA: دانشگاه واشنگتن، 2015.

6 Klockgether T، Mariotti C، Paulson HL. آتاکسی نخاعی مخچه ای. Nat Rev Dis Primers 2019; 5: 24.

7 Shakkottai VG، Fogel BL. نوروژنتیک بالینی: آتاکسی مغزی نخاعی اتوزومال غالب. Neurol Clin 2013; 31: 987-1007.

8 La Spada A. آتروفی عضلانی ستون فقرات و پیاز. در: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. سیاتل، WA: دانشگاه واشنگتن، 1999.

9 Gousse G، Natural H، Touraine R، و همکاران. شکل کشنده آتاکسی نخاعی مخچه تیپ 7 با شروع زودرس در دوران کودکی. Arch Pediatr 2018; 25: 42-44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. تجمع آتاکسین و ubiquitination در SCA7 نوزاد با 180 تکرار CAG. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB، Chapieski L، McDonald RO، Fernandez F، Malphrus AD. آتاکسی نخاعی نوع 2 که با رگرسیون شناختی در دوران کودکی تظاهر می کند. J Child Neurol 2008; 23: 999-1001.

12 Mitchell N، LaTouche GA، Nelson B، Figueroa KP، Walker RH، Sobering AK. آتاکسی نخاعی مغزی با شروع دوران کودکی 3: دیستونی زبان به عنوان یک تظاهرات اولیه. Tremor Other Hyperkinetic Mov 2019; 13 سپتامبر به صورت آنلاین منتشر شد.

13 پرنده TD. دیستروفی میوتونیک نوع 1. در: Adam MP، Ardinger HH، Pagon RA، و همکاران، eds. GeneReviews. سیاتل، WA: دانشگاه واشنگتن، 2019.

14 Aydin G، Dekomien G، Hoffman S، Gerding WM، Epplen JT، Arning L. فرکانس SCA8، SCA10، SCA12، SCA36، FXTAS و C9orf72 تکرار گسترش در بیماران SCA برای شایع ترین زیرگروه های SCA منفی است. BMC Neurol 2018; 18: 3.

15 Turro E، Astle WJ، Megy K، و همکاران. توالی یابی کل ژنوم بیماران مبتلا به بیماری های نادر در یک سیستم بهداشت ملی طبیعت 2020; 583: 96-102.

16 اشلی EA. به سمت پزشکی دقیق Nat Rev Genet 2016; 17: 507-22.

17 Liu HY، Zhou L، Zheng MY، و همکاران. کاربرد تشخیصی و بالینی توالی یابی کل ژنوم در گروهی از خانواده های چینی تشخیص داده نشده با بیماری های نادر. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profiles of the genome-wide landscape of tandem repeat expansions. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM، Bennett MF، Degorski P، Delatycki MB، Lockhart PJ، Bahlo M. تشخیص بسط تکرارهای پشت سر هم در گروه هایی که با داده های توالی خوانی کوتاه توالی ترتیب داده شده اند. Am J Hum Genet 2018; 103: 858-73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. شناسایی تکرارهای منبسط شده مبتنی بر بیوانفورماتیک: یک گسترش پنتامر اینترونیک غیر مرجع در RFC1 باعث ایجاد CANVAS می شود. Am J Hum Genet 2019; 105: 151-65.

21 Gross AM، Ajay SS، Rajan V، و همکاران. انواع کپی شماره در توالی ژنوم بالینی: استقرار و تفسیر برای بیماری نادر و تشخیص داده نشده Genet Med 2019; 21: 1121-30.

22 Trost B، Engchuan W، Nguyen CM، و همکاران. تشخیص ژنومی تکرارهای DNA پشت سر هم که در اوتیسم گسترش می یابند. طبیعت 2020; 5{5}}: 80-86.

23 Robinson PN، Kohler S، Bauer S، Seelow D، Horn D، Mundlos S. هستی شناسی فنوتیپ انسانی: ابزاری برای حاشیه نویسی و تجزیه و تحلیل بیماری ارثی انسان. Am J Hum Genet 2008; 83: 610-15.

24 ژنومیکس انگلستان. مدل های داده های بالینی شرایط بیماری نادر 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (دسترسی در ۴ اوت ۲۰۲۱).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. تشخیص انبساط تکراری طولانی از داده‌های توالی کل ژنوم بدون PCR. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: ابزاری مبتنی بر نمودار توالی برای تجزیه و تحلیل تغییرات در مناطق تکرار پشت سر هم کوتاه. بیوانفورماتیک 2019; 35: 4754-56.

27 روی S، Coldren C، Karunamurthy A، و همکاران. استانداردها و دستورالعمل‌ها برای اعتبارسنجی خطوط لوله بیوانفورماتیک توالی‌یابی نسل بعدی: توصیه مشترک انجمن آسیب‌شناسی مولکولی و کالج آسیب‌شناسان آمریکایی. جی مول دیاگن 2018; 20: 4-27.

28 رابینسون JT، Thorvaldsdottir H، Winckler W، و همکاران. نمایشگر ژنومیک یکپارچه. Nat Biotechnol 2011; 29: 24-26.

29 Schneider SA، van de Warrenburg BPC، Hughes TD، و همکاران. همگنی فنوتیپی تظاهرات شبه بیماری هانتینگتون در خانواده SCA17. نورولوژی 2006; 67: 1701-03.

30 اشنایدر SA، بیماری تی. هانتینگتون پرنده، بیماری مشابه هانتینگتون، و کره ارثی خوش خیم: چه چیزی جدید است؟ Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342-54.

31 Bahlo M، Bennett MF، Degorski P، Tankard RM، Delatycki MB، Lockhart PJ. پیشرفت های اخیر در تشخیص بسط های تکراری با توالی خوانی کوتاه نسل بعدی. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. گسترش بی آللی یک تکرار اینترونیک در RFC1 یک علت شایع آتاکسی دیررس است. Nat Genet 2019; 51: 649-58.

33 Ishiura H، Doi K، Mitsui J، و همکاران. گسترش تکرارهای TTTCA و TTTTA اینترونیک در صرع میوکلونیک خانوادگی خوش خیم بزرگسالان. Nat Genet 2018; 50: 581-90.

34 Ishiura H، Shibata S، Yoshimura J، و همکاران. گسترش غیرکدکننده CGG در بیماری انکلوژن داخل هسته ای عصبی، میوپاتی اکولوفارنگودیستال و یک بیماری همپوشانی تکرار می شود. Nat Genet 2019; 51: 1222-32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. تشخیص سریع آتاکسی نخاعی 36 در یک خانواده سه نسلی با استفاده از داده های توالی یابی کل ژنوم کوتاه خوانده شده. Mov Disord 2020; 35: 1675-79.

36 Mantere T، Kersten S، Hoischen A. توالی خوانی طولانی در حال ظهور در ژنتیک پزشکی. Front Genet 2019; 10: 426.

37 الربی ال ام. تکرار اختلالات گسترش: مکانیسم ها و درمان. نوروتراپی 2019; 16: 924-27.

38 سیستم بهداشت ملی. فهرست ملی تست ژنومیک: معیارهای آزمایش برای بیماری های نادر و ارثی. اکتبر، 2021.