پروتئین غیر ساختاری ویروس زیکا 4B با DHCR7 برای تسهیل عفونت ویروسی در تعامل است

خلاصه

ویروس زیکا (ZIKV) پروتئین های غیر ساختاری را برای فرار از پاسخ ایمنی و تضمین تکثیر کارآمد در سلول های میزبان تکامل می دهد. اخیراً گزارش شده است که آنزیم متابولیک کلسترول 7-دهیدرکلسترول ردوکتاز (DHCR7) بر پاسخ‌های ایمنی ذاتی در عفونت ZIKV تأثیر می‌گذارد. با این حال، پروتئین غیرساختاری حیاتی و مکانیسم های دخیل در فرار ویروسی با واسطه DHCR به خوبی مشخص نشده است. در این مطالعه، ما نشان دادیم که عفونت ZIKV بیان DHCR7 را تسهیل می‌کند. قابل ذکر است که DHCR7 تنظیم شده به نوبه خود عفونت ZIKV را تسهیل می کند و مسدود کردن DHCR7 عفونت ZIKV را سرکوب می کند. از نظر مکانیکی، پروتئین غیر ساختاری ZIKV 4B (NS4B) با DHCR7 برای القای بیان DHCR7 تعامل کرد. علاوه بر این، DHCR7 فسفوریلاسیون کیناز 1 (TBK1) و فاکتور تنظیم‌کننده اینترفرون 3 (IRF3) را مهار کرد که منجر به کاهش تولید اینترفرون بتا (IFN-) و ژن‌های تحریک‌شده با اینترفرون (ISGs) شد. بنابراین، ما پیشنهاد می‌کنیم که ZIKV NS4B به DHCR7 متصل شود تا فعال‌سازی TBK1 و IRF3 را سرکوب کند، که به نوبه خود IFN- و ISGs را مهار می‌کند و در نتیجه فرار از ZIKV را تسهیل می‌کند. این مطالعه بینش‌ها را در مورد اینکه چگونه پروتئین‌های غیرساختاری ویروسی با ایمنی ذاتی مقابله می‌کنند تا عفونت ویروسی را از طریق آنزیم‌های متابولیک کلسترول و واسطه‌ها تسهیل کنند، گسترش می‌دهد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

1. معرفی

ویروس زیکا (ZIKV) به عنوان یک فلاوی ویروس منتقله از پشه، ابتدا در سال 1947 از ماکاک رزوس در اوگاندا شناسایی شد. اپیدمی ZIKV به دلیل گسترش انفجاری از طریق مسیرهای پشه‌ها و سفرهای سراسر جهان، با شیوع چندین بیماری در سراسر جهان، به یک تهدید سلامت جهانی تبدیل شده است. انتقال دهنده های بدون علامت و انتقال جنسی بیشتر عفونت‌های ZIKV در اپیدمی‌های گذشته بدون علامت یا خفیف بودند (وانگ و همکاران، 2016)، با این حال، در چندین اپیدمی اخیر، عفونت ZIKV منجر به بیماری‌های ویرانگر از جمله عواقب عصبی در دوران بارداری (میکروسفالی و مرگ جنین) و اختلالات عصبی شده است. (سندرم Guillain-Barre) در بزرگسالان (Cao-Lormeau et al., 2016؛ Pierson and Diamond, 2020؛ Rasmussen et al., 2016). سیستم ایمنی ذاتی اولین و حیاتی خط دفاع ایمنی میزبان در برابر عفونت ویروسی است. پس از عفونت ZIKV، RNA ویروسی توسط ژن القایی با رتینوئیک اسید درون سلولی I (RIG-I) شناسایی شد (Chazal et al., 2018; Hertzog et al., 2018; Kato et al., 2006) که باعث شروع ایمنی ذاتی پایین دست شد. پاسخ‌ها، از جمله فعال‌سازی کیناز 1 (TBK1)، فسفوریلاسیون فاکتور تنظیم‌کننده اینترفرون 3 (IRF3) و سپس تولید اینترفرون‌های نوع I (IFN-I) (Fitzgerald et al., 2003; Grant et al., 2016). Xia و همکاران، 2018) و بیان ده ها ژن تحریک شده با اینترفرون (ISGs) با اثرات ضد ویروسی مختلف (Savidis et al., 2016؛ Schneider et al., 2014). سیستم ایمنی میزبان IFN و ISG را برای محدود کردن عفونت ویروسی تولید می‌کند، با این حال، ZIKV خود مکانیسم‌های فرار مختلفی را برای اطمینان از بقا و تکثیر موفقیت‌آمیز در سلول میزبان، مانند کدگذاری پروتئین‌های غیر ساختاری خاص (NS) تکامل داده است. RNA ژنومی ZIKV هفت پروتئین غیر ساختاری از جمله NS1، NS2A، NS2B، NS3، NS4A، NS4B و NS5 تولید می کند (Berthoux, 2020). ZIKV NS1 میزبان deubiquitinase USP8 را برای تثبیت کاسپاز{36}} جذب می‌کند و سیگنال‌دهی IFN نوع I را برای سود بردن از عفونت ZIKV کاهش می‌دهد (Zheng et al., 2018). گزارش شده است که یک جهش یافته NS1 به TBK1 متصل می شود و فسفوریلاسیون TBK1 را کاهش می دهد که منجر به کاهش تولید IFN می شود (Xia et al., 2018). ZIKV NS3 به پروتئین‌های داربست انسانی متصل می‌شود و آن‌ها را جدا می‌کند (14-3-3ε و 14-3-3η) (Riedl et al., 2019)، در حالی که NS4A با MAVS تعامل می‌کند تا RIG-I- و MDA را تضعیف کند{50} }واکنش های ایمنی ذاتی واسطه (Ma et al., 2018). قابل‌توجه، ZIKV NS5 مبدل سیگنال و فعال‌کننده رونویسی 2 (STAT2) را به منظور کاهش سیگنال‌دهی IFN نوع اول متصل و تخریب می‌کند (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). علاوه بر این، ثابت شده است که NS5 با RIG-I تعامل می کند و پلی یوبی کوئیتیناسیون مرتبط با K را سرکوب می کند و در نتیجه تولید IFN را سرکوب می کند (Li et al., 2020). علاوه بر این، ZIKV NS2A، NS2B، NS4A و NS4B نیز نشان داده شده است که با هدف قرار دادن عناصر گسسته در مسیر RIG-I بر تولید IFN- غلبه دارند (Xia et al., 2018). برای دستیابی به تکثیر کارآمد در سلول‌های پستانداران، ZIKV همچنین به اجزای متابولیک لیپید سلولی میزبان برای تشکیل یک پوشش و مجموعه کامل ذرات ویروسی متکی است (چن و همکاران، 2020؛ لیر و همکاران، 2020). کلسترول یکی از اجزای لیپیدی غشای سلولی است و در عملکردهای بیولوژیکی متعددی شرکت می کند (Ikonen, 2008). هموستاز کلسترول سلولی با سنتز کلسترول، از جمله جذب ذرات لیپوپروتئین و رهاسازی به گیرنده های خارج سلولی، به شدت تعدیل می شود. تقریباً تمام سلول‌های پستانداران به متابولیسم کلسترول وابسته هستند (Luo et al., 2020). شواهد انباشته نشان داده است که متابولیسم کلسترول در پاسخ ایمنی ذاتی در برابر عفونت ویروسی شرکت می کند (بلانک و همکاران، 2013؛ پترسن و همکاران، 2014؛ یورک و همکاران، 2015). پس از عفونت ویروسی، سنتز کلسترول به طور قابل توجهی تغییر کرد و با افزایش بیان IFN-I و ISGs در ماکروفاژها همراه شد (لی و همکاران، 2017؛ لیو و همکاران، 2008؛ یورک و همکاران، 2015). به عنوان آنزیم کلیدی در متابولیسم کلسترول، کلسترول{81}هیدروکسیلاز (CH25H) کلسترول را به {{83}هیدروکسی کلسترول (25HC) تبدیل می‌کند، که به عنوان محصول بیولوژیکی شناخته شده است که به یک پاسخ ایمنی ذاتی در برابر اکثریت بزرگ کمک می‌کند. ویروس‌ها، از جمله ویروس نقص ایمنی انسانی 1 (HIV-1)، ویروس استوماتیت تاولی (VSV)، ویروس هرپس سیمپلکس 1 (HSV{88}})، ویروس ابولا (EBOV)، ZIKV، ویروس هرپس گاما موشی ( MHV68)، ویروس تب دره ریفت (RVFV)، و ویروس آنسفالیت بهار و تابستان روسی (RSSEV) (Blanc و همکاران، 2013؛ لی و همکاران، 2017؛ لیو و همکاران، 2013). مطالعات کنونی در بررسی اینکه چگونه محصولات متابولیک کلسترول (مانند 25HC) می توانند انتقال سیگنال را دستکاری کنند و در ایمنی ذاتی شرکت کنند، محدود است. تا به امروز، آنزیم ها یا واسطه های بالادست بیوسنتز کلسترول هنوز به خوبی مشخص نشده اند. As the vital cholesterol metabolic anzyme, {95}}dehydrocholesterol reductase (DHCR7) می تواند پیوند دوگانه C (7-8) را در حلقه B استرول ها پاک کند و کلسترول را از دهیدروکلسترول ({100}) کاتالیز کند. }DHC) (Luu و همکاران، 2015). 7-DHC همچنین پیشرو ویتامین D است و جهش‌های DHCR7 با ویتامین D بالاتر مرتبط هستند، که نشان می‌دهد DHCR7 اثرات بیولوژیکی پیچیده‌ای را در تبدیل کلسترول و ویتامین D نشان می‌دهد (Kuan et al., 2013; Prabhu et al. ، 2016a). یک مطالعه به خوبی ارائه شده نشان داده است که سکوت DHCR7 می تواند مسیر PI3K-AKT3 را فعال کند، که منجر به فسفوریلاسیون IRF3 Ser385 و ترویج تولید IFN برای مهار عفونت های ویروسی متعدد در شرایط in vitro و in vivo می شود (Xiao et al., 2020). با این حال، درک متابولیسم کلسترول با واسطه DHCR{116} در فرار ایمنی با واسطه پروتئین ZIKV NS به خوبی تعریف نشده است. در اینجا، ما مکانیسم مشخصی را توضیح می‌دهیم که ZIKV NS4B روی DHCR7، یک آنزیم کلیدی در سنتز کلسترول، برای تضعیف پاسخ IFN-I و تسهیل عفونت ZIKV، هدف قرار می‌دهد. ما دریافتیم که عفونت ZIKV بیان DHCR7 را افزایش داد. جالب توجه است که DHCR7 افزایش یافته عفونت ZIKV را ترویج می کند، در حالی که از بین بردن یا هدف قرار دادن DHCR7 با مهارکننده ها می تواند عفونت ZIKV را سرکوب کند. علاوه بر این، ZIKV NS4B می‌تواند به DHCR7 متصل شود و در نتیجه بیان DHCR7 را القا کند، که فعال‌سازی TBK1 و IRF3 را مهار کرد و منجر به کاهش تولید IFN و ISG شد. بنابراین، ما پیشنهاد می‌کنیم که اتصال ZIKV NS4B به DHCR7 فعال‌سازی IRF3 را کاهش می‌دهد، که به نوبه خود IFN- و ISGs را برای تسهیل فرار از ZIKV مهار می‌کند. این مطالعه بینش های جدیدی را در مورد اینکه چگونه پروتئین غیر ساختاری ZIKV ایمنی ذاتی را برای تسهیل عفونت ویروسی از طریق تعامل با آنزیم های متابولیک کلسترول از بین می برد، گسترش می دهد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. مواد و روش ها

2.1. خطوط سلولی

سلول های U251 از مرکز چین برای مجموعه فرهنگ نوع (CCTCC) (ووهان، چین) خریداری شد. سلول های کلیه Cercopithecus aethiops (Vero)، سلول های کلیه جنینی انسان (HEK 293T) و سلول های آدنوکارسینوم ریه انسان (A549) از مجموعه کشت بافت آمریکایی (ATCC) خریداری شدند. سلول ها در محیط Eagle Modified Dulbecco (DMEM) (Gibco) همراه با 10٪ سرم جنین گاوی (FBS) (Gibco)، پنی سیلین (100 U/mL) و استرپتومایسین سولفات (100 ug/mL) در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 نگهداری شدند. % CO2 سلول های Aedes albopictus (C6/36) در محیط حداقل ضروری (MEM) حاوی 10% FBS، پنی سیلین (100 واحد بر میلی لیتر) و استرپتومایسین سولفات (100 میکروگرم در میلی لیتر) در دمای 28 درجه سانتی گراد با 5% CO2 کشت داده شدند.

2.2. تقویت، تیتراسیون و عفونت ZIKV

جدایه ZIKV z16006 (شماره دسترسی GenBank، KU955589.1) در سلول‌های C6/36 کشت شد، و ZIKV در ویال‌های انجمادی تقسیم شد و در دمای 80 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. تیتر ZIKV با استفاده از روش پلاک اندازه‌گیری شد. سلول‌ها به مدت 2 ساعت با ZIKV در تعدد آلودگی مشخص شده (MOI) آلوده شدند، سپس با بافر فسفات سالین (PBS) شستشو داده شدند و سپس کشت، برداشت و بررسی شدند.

2.3. پلاسمیدها و معرف ها

پلاسمید بیانی pcDNA3.1(þ)-3 پرچم برای شبیه سازی ژن های فردی ZIKV از قطعات مربوطه از cDNA ZIKV استفاده شد. برای ساختن pGEX6p-1-NS4B، ZIKV NS4B با استفاده از کیت کلونینگ یک مرحله ای ClonExpress II (Vazyme Biotech، نانجینگ، چین) در وکتور pGEX6p{9}} کلون شد. cDNAهایی که DHCR7، RIG-I، TBK1 و IRF3 انسانی را کد می‌کنند در وکتور pCAGGS-HA یا وکتور pcDNA3.1 (þ){17}} کلون شده با روش شبیه‌سازی مولکولی استاندارد ساخته شدند. جهش نادرست G410S در DHCR7 با استفاده از روش جهش‌زایی سایت-directed site ساخته شد. پاکت ضد ZIKV خرگوش مونوکلونال (GTX133314) از GeneTex (Irvine, CA, USA) خریداری شد. خرگوش پلی کلونال ضد DHCR7 (A8049)، خرگوش مونوکلونال ضد ISG15 (A2416)، مونوکلونال خرگوش ضد TBK1 (A3458)، مونوکلونال خرگوش ضد P-TBK1 در Ser172 (AP1026)، خرگوش پلی کلونال ضد IRF113 (A1) IgG خرگوش (ac005) و IgG ضد موش (ac011) از ABclonal Technology (ووهان، چین) خریداری شد. آنتی بادی های ثانویه ضد موش FITC و ضد خرگوش Cy3 از Abkine (ووهان، چین) خریداری شدند. خرگوش مونوکلونال anti-P-IRF3 در Ser396 (29047S) و خرگوش مونوکلونال anti-ISG56 (14769S) از Cell Signaling Technology (CST، بوستون، MA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. ضد پرچم مونوکلونال موش (F3165)، مونوکلونال ضد HA خرگوش (H6908)، و مونوکلونال ضد GAPDH موش (G9295) از سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. آنتی ژن-آنتی بادی مونوکلونال گروه آنتی فلاوی ویروس موش (MAB10216) از Millipore (ماس، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. Lipofectamine 2000 (11668-027) و Trizol (15596018) از Invitrogen Corporation (Carlsbad، CA، USA) خریداری شدند. Poly (I: C) از InvivoGen (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد.

2.4. سنجش پلاک

مایع رویی حاوی ZIKV با DMEM بدون سرم رقیق شد و سلول‌های Vero را در یک صفحه چاهک آلوده به مدت 2 ساعت رقیق کردند و سپس با 1 میلی‌لیتر PBS دو بار شست‌وشو دادند. DMEM حاوی 2٪ FBS و 2٪ آگارز با نقطه ذوب پایین به خوبی با توجه به نسبت حجمی 1:1 مخلوط شد و 1 میلی لیتر مخلوط به هر چاه اضافه شد. سلول های آلوده در دمای 37 درجه سانتی گراد با 5 درصد CO2 به مدت 5-7 روز کشت داده شدند. سلول ها با 4% پارافورمالدئید به مدت 1 ساعت تثبیت شدند و با 0.5% کریستال ویولت به مدت 30 دقیقه رنگرزی شدند. صفحه چاه 12-با آب شسته شد و پلاک‌ها محاسبه شد.

2.5. تولید لنتی ویروس و عفونت

توالی های هدف گیری shRNA ها برای DHCR7 انسانی به شرح زیر بود: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30، sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. وکتور pLKO.1 حامل یک shRNA درهم برای کنترل منفی (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) یا توالی هدف خاص به همراه psPAX2 و pMD2.G با لیپوفکتامین 2 به سلول های HEK293T ترانسفکت شد{19} }00. ذرات ویروسی حاوی سوپرناتانت در 36 ساعت پس از ترانسفکشن برداشت و سپس در 210 گرم به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. فاز رویی بدون سلول از طریق یک فیلتر 0.45 میکرومتر برای حذف بقایای سلولی فیلتر شد. سلول‌های U251 با ذرات لنتی ویروسی در حضور 8 ug/mL پلی‌برن آلوده شدند. پس از 48 ساعت کشت، سلول های U251 با پورومایسین (2 میکروگرم در میلی لیتر، سیگما) انتخاب شدند. راندمان کوبیدن به sh-DHCR7 توسط RT-PCR و تجزیه و تحلیل وسترن بلات تعیین شد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

2.6. وسترن بلات

سلول ها توسط بافر RIPA تکمیل شده با مهارکننده های پروتئاز و مهارکننده های فسفاتاز روی یخ به مدت 1 ساعت لیز شدند، سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد، 13، {3}} گرم به مدت 1{{1{12}}}} دقیقه سانتریفیوژ شدند تا سلول جمع آوری شود. لیز. غلظت پروتئین در لیزات سلولی با روش پروتئین بیسینکونیک اسید (BCA) اندازه گیری شد. پروتئین توسط SDS-PAGE جدا شد و سپس روی غشای پلی وینیل دی فلوراید (PVDF) منتقل شد. غشای PVDF با بافر مسدودکننده ایمونوبلات TBST (10 میلی مول در لیتر Tris-HCl، pH 7.4، 0.15 مول در لیتر NaCl، و 0.05 درصد توئین{14}}) حاوی 5 درصد BSA به مدت 1 ساعت مسدود شد. پس از شستشو با TBST، غشاء با آنتی‌بادی‌های اولیه و آنتی‌بادی‌های دوم انکوبه شد و متعاقباً با استفاده از سیستم تصویربرداری Chemiluminescence (Bio-Rad) شناسایی شد.

2.7. سنجش کلسترول تام

کلسترول تام در سلول ها با استفاده از کیت سنجش کلسترول تام بافت از Applygen Technologies Inc. (پکن، چین) شناسایی شد. استاندارد کلسترول 5 mmol/L تحت یک رقت سریال با اتانول بی آب برای رسم منحنی استاندارد قرار گرفت و مقادیر کلسترول تام سلولی طبق منحنی های استاندارد محاسبه شد. این آزمایش طبق روش ارائه شده توسط سازنده انجام شد.

2.8. سنجش هم‌رسوبی ایمنی

سلول های HEK293T با پلاسمیدهای نشان داده شده ترانسفکت شدند. سلول ها برداشت و با بافر لیز RIPA تکمیل شده با مهارکننده های پروتئاز لیز شدند. پس از سانتریفیوژ در 18، 000 گرم به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، لیزهای سلولی جمع آوری و توسط Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) به مدت 4 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد رسوب ایمنی شدند. با 2 بافر بارگذاری شسته شده و با ایمونوبلات آنالیز شدند.

2.9. Real-time PCR

RNA های کل با استفاده از معرف TRIZol (Invitrogen Life Technologies) از سلول ها استخراج شد و cDNA با کیت ترانس کریپتاز معکوس M-MLV (Promega، Madison، WI، USA) تولید شد. RT-PCR با استفاده از کیت های SYBR RT-PCR (DBI Bio-science) روی Roche LC480 انجام شد. mRNA ژن گلیسرآلدئید{5}فسفات دهیدروژناز (GAPDH) به عنوان مرجع درون زا برای عادی سازی mRNA ها تنظیم شد و سطوح بیان ژن با استفاده از روش 2 ΔΔCT محاسبه شد. توالی پرایمرهای RT-PCR در جدول تکمیلی S1 نشان داده شده است. 2.10. میکروسکوپ کانفوکال

سلول های U251 با پلاسمید ترانسفکت شده و به مدت 3{4} ساعت کشت داده شدند، سپس سه بار با PBS شسته شدند. سلول ها با پارافورمالدئید 4 درصد به مدت 15 دقیقه تثبیت شدند و به مدت 5 دقیقه با PBS حاوی 1/0 درصد TritonX{6}} نفوذ کردند. پس از شستشو با PBS، سلول ها با PBS حاوی 5% BSA به مدت 30 دقیقه مهر و موم شدند. سلول ها سه بار با PBS شسته و با آنتی HA، آنتی FLAG و آنتی فلاوی ویروس انکوبه شدند، سپس با آنتی بادی های ثانویه ضد ماوس FITC و ضد خرگوش Cy3 انکوبه شدند. سلول ها با 40،{17}}دیامیدین-2-فنیلندول دی هیدروکلراید (DAPI) رنگ آمیزی شدند و با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال Olympus انجام شدند.

2.11. سنجش های کشویی GST

پلاسمید pGEX6p-1-NS4B به سویه BL21 اشریشیا کلی (E. coli) ترانسفکت شد. GST و GST-NS4B توسط IPTG با غلظت نهایی 0.5 mmol/L القا شدند و کشت‌ها به مدت 8-6 ساعت دیگر در دمای 37 درجه سانتیگراد رشد کردند. سپس پروتئین GST و GST- پروتئین NS4B از باکتری E. coli خالص سازی شد. پروتئین GST یا GST-NS4B با دانه های گلوتاتیون Sepharose (Novagen) انکوبه شد و سه بار با PBS شسته شد. پروتئین GST و GST-NS4B با پروتئین فیوژن یوکاریوتی HA-DHCR7، که از پلاسمیدهای کد کننده HA-DHCR نشات می‌گیرد، انکوبه شدند{20}} لیز سلولی HEK293T را به مدت 4 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد بیان می‌کردند. 2 بافر بارگذاری SDS، و توسط وسترن بلات با آنتی بادی های ضد GST و ضد HA شناسایی شد.

2.12. جهش زایی HA-DHCR7 به سمت سایت

جفت پرایمرهای جهش زا (جدول تکمیلی S1) سنتز شد و برای تولید ساختار جهش یافته توسط PCR استفاده شد. HA-DHCR7 به عنوان الگوی PrimeSTAR® HS Premix (Takara) استفاده شد. پس از PCR، پلاسمید نوع وحشی باقی مانده در محصول PCR به طور انتخابی توسط DpnI (نیوانگلند بیولابز) هضم شد. محصول PCR هضم شده به باکتری E. coli سویه DH5 ترانسفکت شد. جهش مورد نظر با آنالیز توالی سانگر تایید شد.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

2.13. تحلیل آماری

تمام آزمایش ها حداقل سه بار با نتایج مشابه تکرار شدند. داده ها به صورت میانگین انحراف استاندارد (SD) بیان می شوند. معنی‌داری متغیرها با استفاده از آزمون t غیر زوجی دو طرفه Student برای آنالیز واریانس دو گروهی یا یک‌طرفه با آزمون مقایسه‌های چندگانه Dunnett یا آزمون ANOVA دو طرفه با مقایسه چندگانه Sidak برای مقایسه‌های چند گروهی با استفاده از نرم‌افزار GraphPad Prism تعیین شد. (نسخه 8.{6}}.1). مقدار P < 0.{{10}}5 از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شد و P > 0.05 به‌عنوان آماری غیرمعنی‌دار شناخته شد. برای همه داده‌ها، معنی‌داری به صورت *P <0.05، **P <0.01 و ***P <0.001 ارائه شد.

3. نتایج

3.1. عفونت ZIKV باعث بیان DHCR7 می شود

شواهد انباشته نشان داده‌اند که متابولیسم کلسترول بر پاسخ‌های ایمنی ذاتی میزبان در برابر عفونت فلاوی ویروس مانند ZIKV و ویروس دنگی (DENV) تأثیر می‌گذارد (Leier et al., 2020; Randall, 2018). DHCR7 آنزیمی را رمزگذاری می کند که 7-DHC را به کلسترول تبدیل می کند، آخرین مرحله در بیوسنتز کلسترول (Moebius et al., 1998). ما برای اولین بار بیان DHCR7 را پس از عفونت ZIKV شناسایی کردیم. آستروسیت U251 انسانی با ZIKV آلوده شد که به طور وابسته به دوز بیان DHCR7 را در mRNA و پروتئین افزایش داد (شکل 1A-C). برای تأیید این پدیده، بعداً بیان DHCR7 را در سلول‌های Vero بررسی کردیم و دریافتیم که عفونت ZIKV به طور قابل‌توجهی بیان DHCR7 را القا می‌کند (شکل 1D-F)، که با نتایج در سلول‌های U251 سازگار بود.

فواید سیستانچ - تقویت سیستم ایمنی

3.2. هدف قرار دادن DHCR7 باعث ایجاد یک فعالیت حیاتی ضد ZIKV می شود

برای ارزیابی اثرات DHCR7 در برابر عفونت ZIKV، سلول‌های U251 و A549 با پلاسمید کدکننده HA-DHCR7 ترانسفکت شدند و سپس با ZIKV (MOI ¼ 1) آلوده شدند. نتایج نشان داد که بیان بیش از حد DHCR7 به طور قابل توجهی بیان mRNA ژن ZIKV را افزایش داد (شکل 2A و B). قابل توجه، با تجمع پروتئین DHCR7، بیان پروتئین ساختاری E ZIKV نیز افزایش یافت (شکل 2C و D). بعلاوه، ما یک سنجش پلاک را با استفاده از مایع رویی شکل 2C انجام دادیم و دریافتیم که بیان بیش از حد DHCR7 به طور قابل توجهی واحدهای تشکیل دهنده پلاک را در مقایسه با گروه کنترل (شکل 2E و F) افزایش داد. گزارش شده است که جهش نادرست G410S در DHCR7 فعالیت آنزیم را از بین می برد (Fitzky et al., 1998; Shim et al., 2004; Witsch-Baumgartner et al., 2000). برای تعیین بیشتر اثرات DHCR7 بر عفونت ZIKV، در مرحله بعد یک جهش غیر فعال از DHCR7 (G410S) ساختیم. در مقایسه با نوع وحشی DHCR7، جهش G410S می تواند به طور قابل توجهی عفونت ZIKV را مهار کند (شکل 2G). ما همچنین یک سنجش میکروسکوپ کانفوکال را برای تایید مشاهدات انجام دادیم. همانطور که در شکل 2H نشان داده شده است، بیان بیش از حد DHCR7 باعث افزایش عفونت ZIKV شد. برای تعیین اینکه آیا فعالیت آنزیم DHCR7 درون زا برای عفونت ZIKV حیاتی است یا خیر، ما دو RNA سنجاق سر کوتاه (shDHCR{30}} و sh-DHCR7-2) طراحی کردیم که به طور خاص DHCR7 را هدف قرار می‌دهند و DHCR7-سلول U251 خاموش شده تولید می‌کنند. خطوط با سیستم shRNA (شکل 3A). در نهایت، ما یک sh-DHCR{38}} را برای بازده خاموش‌کننده بالاتر آن انتخاب کردیم. در مقایسه با shRNA کنترل ترانسدود شده از خط سلول، این سلول‌های نابودکننده DHCR7 حساسیت کمتری نسبت به عفونت ZIKV نشان دادند (شکل 3B و C). ما در مرحله بعد از بازدارنده انتخابی DHCR7 AY9944 استفاده کردیم که از مکالمه DHC با کلسترول جلوگیری می کند (Xu و همکاران، 2011)، که نشان داده شده است که فعالیت آنزیمی DHCR7 را مهار می کند (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998). در مقایسه با کنترل، تجویز AY9944 به طور وابسته به دوز، عفونت ZIKV را در سلول‌های U251 مهار کرد (شکل 3D-F). سنجش پلاک نیز در سلول‌های Vero برای ارزیابی بیشتر اثرات DHCR7 انجام شد و نشان داد که AY9944 می‌تواند عفونت ZIKV را به طور قابل‌توجهی سرکوب کند (شکل 3G و H). قابل ذکر است، میکروسکوپ کانفوکال نشان داد که پروتئین ZIKV E در حضور AY9944 بطور قابل ملاحظه ای کاهش می یابد (شکل 3I). این یافته ها نشان داد که هدف قرار دادن DHCR7 می تواند عفونت ZIKV را مهار کند.

شکل 1. عفونت ZIKV بیان DHCR7 را القا می کند. سلول های A-F U251 و Vero به مدت 24 ساعت با ZIKV (MOI ¼ 0، 1 و 2) آلوده شدند و سطوح RNA داخل سلولی ZIKV (A, D) و DHCR7 (B, E) توسط RT-PCR با GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی. سطح پروتئین نسبی پاکت‌های DHCR7 و ZIKV توسط وسترن بلات (C، F) شناسایی شد. داده ها از حداقل سه آزمایش مستقل (میانگین SD) یا داده های نماینده (C, F) هستند. معنی‌داری آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه با آزمون مقایسه‌های چندگانه دانت (A, B, D, E) محاسبه شد. **P < 0.01، ***P <0.001. SD، انحراف استاندارد.

3.3. DHCR7 فعال سازی TBK1 و IRF3 را برای کاهش تولید IFN و ISGs مهار می کند.

از آنجایی که DHCR7 آنزیم حیاتی برای تبدیل 7-DHC به کلسترول است (Moebius et al., 1998) و عفونت ZIKV می تواند بیان DHCR7 را افزایش دهد، بنابراین سطح کلسترول را پس از عفونت ZIKV اندازه گیری کردیم. ما نشان دادیم که عفونت ZIKV تأثیر کمی بر سنتز کلسترول در سلول‌های U251 و Vero دارد (شکل 4A و B)، اگرچه DHCR7 افزایش یافته بود (شکل 1A-D). با توجه به افزایش DHCR7 بر عفونت ZIKV و نقش کلیدی IFN ها در مقابله با عفونت ZIKV، ما بعداً اثر DHCR7 را بر مسیر سیگنالینگ IFN-I تعیین کردیم. سلول‌های U251 کنترل و خاموش‌کننده DHCR با ZIKV آلوده شدند یا با پلی (I: C) ترانسفکت شدند و بیان IFN مورد بررسی قرار گرفت. در مقایسه با گروه کنترل، عفونت ZIKV یا درمان پلی (I: C) به طور قابل توجهی بیان IFN را در سلول‌های DHCR{15} خاموش‌کننده U251 افزایش داد (شکل 4C و D). ISG ها عوامل موثر بر اعمال اینترفرون هستند و نقش مهمی در دفاع ایمنی ذاتی در برابر عفونت ZIKV دارند. ما همچنین نشان دادیم که مسدود کردن DHCR7 می تواند به طور قابل توجهی بیان ISG15 و ISG56 را در هر دو سطح mRNA و پروتئین تقویت کند (شکل 4E-J). به طور مداوم، درمان AY9944 با مهارکننده DHCR7 می‌تواند بیان IFN-، ISG15 و ISG56 را القا کند (شکل 4K، L). نکته مهم این است که جهش یافته غیرفعال G410S می تواند تا حدی اثرات بازدارنده DHCR7 بر بیان IFN- و ISG را معکوس کند (شکل 4M، N). فعال‌سازی TBK1 و IRF3 برای القای IFNs-ISG ضروری است، بنابراین، در ادامه اثر DHCR7 را بر بیان و فعال‌سازی TBK1 و IRF3 بررسی کردیم. ما نشان دادیم که DHCR7 نه تنها به طور وابسته به دوز سطح پروتئین را مهار می کند، بلکه سطح فسفوریلاسیون TBK1 و IRF3 را نیز سرکوب می کند (شکل 5A-C). علاوه بر این، جهش یافته غیرفعال G410S به طور ناقص اثرات بازدارندگی DHCR7 بر فسفوریلاسیون IRF3 و TBK1 را معکوس کرد (شکل 5D). برخلاف یافته‌های بیان بیش از حد DHCR7، درمان AY9944 می‌تواند باعث فعال‌سازی IRF3 و TBK1 در سلول U251 شود (شکل 5E).

3.4. ZIKV NS4B برای مهار فسفوریلاسیون TBK1 و IRF3 با DHCR7 تعامل دارد.

شواهد فزاینده نشان داده است که ZIKV پروتئین‌های NS خاص را برای تسهیل تکثیر کارآمد در سلول‌های میزبان با فرار مستقیم از ایمنی ذاتی و سازگار میزبان از طریق مکانیسم‌های مجزا ایجاد کرده است. ما برای غربالگری پروتئین ZIKV NS که می‌تواند با DHCR7 تعامل داشته باشد، یک سنجش هم‌آی‌پی انجام دادیم. سلول‌های HEK293T با pCMV-DHCR{5}}HA و پلاسمید بیان‌کننده پروتئین NS منفرد با Flag-tag ترانسفکت شدند. همانطور که در شکل 6A نشان داده شده است، DHCR7 فقط به NS4B متصل می شود اما در تعامل با سایر پروتئین های NS شکست می خورد. سنجش های متقابل co-IP بیشتر انجام شد و نشان داد که پروتئین NS4B با DHCR7 در سلول های HEK293T تعامل دارد (شکل 6B و C). برای تایید برهمکنش NS4B و DHCR7، ما در مرحله بعد یک میکروسکوپ کانفوکال را انجام دادیم و دریافتیم که پروتئین NS4B و پروتئین DHCR7 در سیتوپلاسم کلوکالیزه شده اند (شکل 6D). سنجش کاهشی GST بیشتر برهمکنش NS4B و DHCR7 را نشان داد (شکل 6E). علاوه بر این، ترانسفکشن گذرا NS4B در سلول های U251 می تواند به طور چشمگیری بیان DHCR7 را القا کند (شکل 6F). نکته مهم این است که NS4B می تواند به طور وابسته به دوز فسفوریلاسیون هر دو TBK1 و IRF3 را مسدود کند، که با افزایش فعال شدن TBK1 و IRF3 در پاسخ به DHCR7 همبستگی مثبت داشت (شکل 6G و H). با این حال، بیان بیش از حد NS4B در سلول های HEK293T به طور قابل توجهی سطح پروتئین TBK1 را کاهش داد، اما تأثیر کمی بر پروتئین IRF3 داشت (شکل 6G و H). برای تأیید بیشتر این مشاهدات، NS4B به سلول‌های U251 شکست‌دهنده DHCR7 ترانسفکت شد و اثرات مهاری بر پروتئین درون‌زا و سطوح فسفوریلاسیون TBK1 و IRF3 نشان داد (شکل 6I). در مجموع، این نتایج نشان داد که ZIKV NS4B با DHCR7 تعامل دارد و بیان DHCR7 را افزایش می‌دهد تا فعال‌سازی TBK1 و IRF3 را مسدود کند و سپس عفونت ZIKV را تسهیل کند.

شکل 2. بیان بیش از حد DHCR7 تکثیر ZIKV را تقویت می کند. سلول های A-D U251 و A549 با HA-وکتور یا HA-DHCR7 در غلظت های نشان داده شده به مدت 12 ساعت ترانسفکت شدند و سپس برای 36 ساعت دیگر با ZIKV آلوده شدند. سطوح ZIKV RNA توسط RT-PCR با GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی (A، B) و سطوح پروتئین پوشش ZIKV، HA-DHCR7 و GAPDH توسط وسترن بلات (C، D) شناسایی شد. سلول های E، F Vero با مایع رویی حاوی ZIKV از شکل 2C به مدت 48 ساعت برای تعیین کپی های ZIKV با روش پلاک آلوده شدند. سلول های G U251 به مدت 12 ساعت با ناقل HA، HA-DHCR7، یا HA-DHCR7 (G41{42}}S) ترانسفکت شدند و به مدت 36 ساعت با ZIKV آلوده شدند، و سطوح پروتئین پوشش ZIKV، HA-DHCR7 و GAPDH توسط وسترن بلات شناسایی شد. سلول‌های H U251 با ناقل HA یا HA-DHCR7 (1 میکروگرم) به مدت 12 ساعت آلوده به ZIKV به مدت 36 ساعت ترانسفکت شدند و متعاقباً با آنتی‌بادی‌های ضد فلاوی ویروس موش و ضد HA خرگوش، پس از رنگ‌آمیزی با آنتی موش کونژوگه FITC و انکوبه شدند. آنتی بادی های ثانویه ضد خرگوش کونژوگه Cy3-. هسته ها با DAPI رنگ آمیزی شدند. تصاویر با میکروسکوپ کانفوکال مشاهده شدند. نوار مقیاس ¼ 1{44}}0 میکرومتر. داده ها از حداقل سه آزمایش مستقل (میانگین SD) یا داده های نماینده (C، D، E، G، H) هستند. معنی‌داری آماری با استفاده از آزمون t غیر جفت نشده دانشجویی (F) یا ANOVA یک طرفه با آزمون مقایسه‌های چندگانه دانت (A, B) محاسبه شد. *P <0.05، ***P <0.001. SD، انحراف استاندارد.

4. بحث

IFNهای نوع I و ISGهای پایین دست آنها با یک سری بزرگ از پاتوژن ها مقابله می کنند و نقش مهمی در دفاع ایمنی میزبان در برابر ZIKV ایفا می کنند (Lazear et al., 2016). برای فرار از نظارت با واسطه IFN و دستیابی به تکثیر کافی، ZIKV پروتئین های NS را تکامل می دهد که نقاط مختلف مسیر سیگنالینگ IFN را هدف قرار می دهد تا از سیستم ایمنی ذاتی سلولی فرار کند (لی و همکاران، 2021). مطالعات افزایش نشان داده است که ZIKV NS1، NS3، NS4A و NS5 ماژول های مجزای مسیر RIG-I/IFN-I را مهار می کنند و عفونت ویروسی را با استفاده از مکانیسم های مستقل و متنوع تسهیل می کنند (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). ؛ ما و همکاران، 2018؛ ریدل و همکاران، 2019؛ شیا و همکاران، 2018؛ ژنگ و همکاران، 2018). با این حال، مکانیسم خاص ZIKV NS4B برای مقابله با محدودیت ایمنی ضعیف تعریف شده است. ZIKV NS4B یک پروتئین بسیار آبگریز متشکل از 251 اسید آمینه است و در غشای شبکه آندوپلاسمی با ترمینال N قرار دارد (Zou et al., 2014). مهار NS4B از مسیر سیگنالینگ IFN-I در فلاوی ویروس های مختلف شناسایی شده است (Ding et al., 2013; Munoz-Jordan et al., 2003, 2005; Shan et al., 2021; Yi et al., 2016; Zhang; همکاران، 2021). یک مطالعه اخیر گزارش داده است که سویه ZIKV INMI1 جدا شده در برزیل از NS4B برای مقابله با مسیر سیگنالینگ IFN-I با خرد کردن فسفوریلاسیون STAT1 و در نتیجه قطع حمل و نقل هسته ای STAT1 استفاده می کند (Fanunza et al., 2021). در این مطالعه، ما مکانیسم مشخصی را یافتیم که در آن ZIKV NS4B با سرکوب فسفوریلاسیون TBK1 و IRF3، جزء بالادست مسیر سیگنالینگ IFN-I، تولید IFN- را لغو کرد. قابل ذکر است، جایگزینی اسید آمینه (G18R) در ZIKV NS4B کشف شده است که به کاهش تولید IFN و تضعیف بیان ISG کمک می کند و در نتیجه عفونت ویروسی را در موش تسهیل می کند، که نشان دهنده اهمیت NS4B به عنوان یک عامل تعیین کننده پاتوژنز است (Gorman et al. .، 2018). شواهد جدید حاکی از اهمیت حیاتی متابولیسم کلسترول است که در پاسخ ایمنی ذاتی شرکت می کند (آکولا و همکاران، 2016؛ دانگ و همکاران، 2017؛ ربولدی و همکاران، 2014؛ یورک و همکاران، 2015). اگرچه چندین واسطه در متابولیسم کلسترول اثرات ضد ویروسی گسترده ای دارند (بلانک و همکاران، 2013؛ لی و همکاران، 2017؛ لیو و همکاران، 2013؛ شیائو و همکاران، 2020)، مطالعه ما مکانیسم جدیدی را نشان داد. آنزیم متابولیک کلسترول DHCR7 با کاهش فعالسازی TBK1 و IRF3 برای تسهیل عفونت ویروسی در عفونت ZIKV نقش داشته است. به عنوان یک آنزیم کلیدی درگیر در متابولیسم دسموسترول و کلسترول، DHCR7 نشان دهنده تغییر تبدیل 7-DHC به ویتامین D در سلول های پوست در معرض UVB است (پرابهو و همکاران، 2016b). علاوه بر این، DHCR7 نه تنها در دروازه مسیر بلوخ، بلکه در انتهای مسیر Kandutsch-Russell نیز قرار دارد (Prabhu et al., 2016a, 2016b)، که نقشی حیاتی در کنترل سنتز کلسترول دارد. تداخل DHCR7 و تعامل آن با آنزیم های دیگر در چندین مسیر ممکن است عملکردهای متعددی را در انواع یا اندام های مختلف سلول تقویت کند. مطالعه قبلی نشان داده است که مسدود کردن DHCR7 می تواند دسموسترول، پیش ساز فوری بیوسنتز کلسترول را کاهش دهد، در نتیجه محافظت کافی در برابر عفونت HCV ارائه می دهد (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012). نکته مهم، شیائو و همکاران. نشان داده اند که عفونت VSV بیان DHCR7 را کاهش می دهد و منجر به کاهش کلسترول می شود، اما تجمع DHC در ماکروفاژها و کبد بسیار بیشتر است (Xiao et al., 2020). ماکروفاژهای تیمار شده با 7-DHC یک پاسخ ضد ویروسی پیشرفته ارائه کردند. در حالی که افزودن کلسترول محافظت جزئی را نشان داد. مهارکننده‌های DHCR7 و تجویز 7-DHC ممکن است رویکردهای مفیدی برای مبارزه با عفونت‌های ویروسی مانند HIN1، HSV، و VSV باشد. در این مطالعه، ما دریافتیم که مهارکننده DHCR7 AY9944 می‌تواند عفونت ZIKV را سرکوب کند. با این حال، مطالعه ما نشان داد که عفونت ZIKV بیان DHCR7 را القا می‌کند، اما تأثیر کمی بر بیوسنتز کلسترول در سلول‌های گلیال دارد. ما سطح 7-بیان DHC پس از عفونت ZIKV را بررسی نکردیم، با این وجود، ارزش بررسی بیشتر دارد که آیا 7-DHC و AY9944 اثر درمانی سینرژیک برای درمان بیماران مبتلا به ZIKV دارند یا خیر. عفونت در مغز بیان بیش از حد DHCR7 عفونت ZIKV را ترویج کرد، در حالی که درمان با مهارکننده انتخابی DHCR7 (AY9944) به شدت تولید IFN- را در برابر عفونت ZIKV افزایش داد. فعال سازی TBK1 و IRF3 برای پرایمینگ سیگنالینگ IFN-I حیاتی است. تحقیقات قبلی نشان داد که خاموش کردن DHCR7 یا 7-درمان با DHC مسیر PI3K-AKT3 را برای فسفریله کردن IRF3 فعال می‌کند، اما نه TBK1 را در ماکروفاژها (Xiao et al., 2020). با این وجود، یافته‌های ما نشان داد که DHCR7 وابسته به دوز بیان IRF3 و TBK1 و همچنین فسفوریلاسیون IRF3 و TBK1 را کاهش داد. این تحقیقات نشان داد که DHCR7 ممکن است به عفونت ZIKV در مکانیسم مستقل از متابولیسم کلسترول در مغز کمک کند. به خوبی مشخص شده است که ZIKV از پروتئین‌های NS برای تعامل مستقیم با اجزای مختلف مسیر RIG-I/IFN-I برای فرار از پاسخ ایمنی و تسهیل تکثیر ویروسی استفاده می‌کند. ما قبلاً تعامل ZIKV NS5 با RIG-I را برای کاهش تولید IFN گزارش کردیم (Li et al., 2020). دیگران نشان دادند که ZIKV NS1 و NS2B روی TBK1، NS3 روی RIG-I و MDA5 برای کاهش تولید IFN-I و ISGs را هدف قرار دادند (لی و همکاران، 2021؛ ریدل و همکاران، 2019). با این حال، عملکرد پروتئین‌های ZIKV NS که متابولیسم کلسترول را هدف قرار می‌دهند تا حد زیادی مبهم باقی مانده است. در این مطالعه، ما همچنین یک تعامل گزارش نشده بین آنزیم متابولیک کلسترول DHCR7 و پروتئین های ZIKV NS را نشان داده ایم. ما نشان دادیم که DHCR7 به طور خاص به NS4B متصل است، نه به سایر پروتئین‌های NS. ما شواهد مهمی را ارائه کردیم مبنی بر اینکه ZIKV NS4B با DHCR7 برهمکنش دارد و به طور قابل‌توجهی بیان آن را القا می‌کند، که با نتایج سلول‌های U251 پس از عفونت ZIKV مطابقت داشت. نکته مهم، جدا از نشان دادن مستقیم درگیری DHCR7 و ZIKV NS4B، ما همچنین دریافتیم که ZIKV NS4B بیان DHCR7 را برای مهار فسفوریلاسیون TBK1 و IRF3 و تسهیل عفونت ZIKV افزایش می‌دهد. در توافق با نتایج ما، یک مطالعه اخیر نشان داد که کمبود DHCR7 می تواند سیگنالینگ IRF3 و IFN را برای مهار VSV و سایر ویروس ها در ماکروفاژها فعال کند.

شکل 3. از بین رفتن DHCR7 عفونت ZIKV را در سلول های U251 کاهش می دهد. سلول‌های U251 با ذرات لنتی ویروسی حاوی shRNA در برابر DHCR7 (shDHCR{5}} و sh-DHCR7-2) یا یک توالی غیرهدف (sh-NTC) و به‌دنبال انتخاب پورومایسین به مدت 14 روز مبدل شدند. کارایی ناک داون توسط RT-PCR تعیین شد. سلول های B، C DHCR{11}}خاموش کننده U251 (sh-DHCR7) و sh-NTC U251 به مدت 36 ساعت آلوده یا آلوده به ZIKV (MOI ¼ 1) بودند. سطح RNA داخل سلولی ZIKV توسط RT-PCR با GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی (B) و سطوح پروتئین پوشش ZIKV، DHCR7 و GAPDH توسط وسترن بلات (C) شناسایی شد. سلول های D، E U251 با مهارکننده DHCR7 AY9944 در غلظت مشخص شده به مدت 2 ساعت، سپس عفونت با ZIKV (MOI ¼ 1) به مدت 48 ساعت تیمار شدند. سلول‌ها برای تشخیص ZIKV RNA (D) تحت RT-PCR قرار گرفتند. سطح پروتئین پوشش ZIKV، DHCR7 و GAPDH توسط وسترن بلات (E) شناسایی شد. سلول های F U251 با مهارکننده DHCR7 AY9944 در غلظت مشخص شده به مدت 36 ساعت تیمار شدند و DHCR7 و GAPDH با وسترن بلات شناسایی شدند. سلول‌های G، H Vero با مایع رویی حاوی ZIKV از شکل 3E به مدت 48 ساعت برای تعیین کپی‌های ZIKV با سنجش پلاک آلوده شدند. سلول های I U251 با AY9944 در غلظت نشان داده شده به مدت 2 ساعت، سپس عفونت با ZIKV در 1¼ MOI به مدت 36 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. تصاویر با میکروسکوپ کانفوکال مشاهده شدند. نوار مقیاس ¼ 100 میکرومتر. داده ها از حداقل سه آزمایش مستقل (میانگین SD) یا داده های نماینده (C، E، F، G، و I) هستند. معنی‌داری آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه با آزمون مقایسه‌های چندگانه دانت (A, D, H) یا آنالیز واریانس دوطرفه با آزمون مقایسه‌های چندگانه سیداک (B) محاسبه می‌شود. ***P <0.001. SD، انحراف استاندارد.

شکل 4. DHCR7 تولید IFN و ISG را مهار می کند. سلول های A، B U251 و Vero به مدت 24 ساعت با ZIKV (MOI ¼ 0، {5}}.5 و 1) آلوده شدند و کلسترول سلولی با کیت سنجش کلسترول تام بافت اندازه گیری شد. سلول های C-H DHCR{9}}خاموش کننده U251 (sh-DHCR7) و sh-NTC U251 با ZIKV (MOI ¼ 1) آلوده شدند یا با Poly (I: C) (1 ug/mL) به مدت 6 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. RNA سلولی کل استخراج شد و برای بیان mRNA با GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی تحت RT-PCR قرار گرفت. عبارات نسبی IFN- و ISGs به نمونه‌های sh-NTC در گروه ساختگی نرمال‌سازی شدند و تغییرات چین‌خوردگی نامتعارف نشان داده شد. IFN- (C، D)، ISG15 (E، F) و ISG56 (G، H). سلول های I، J DHCR{24}}خاموش کننده U251 (sh-DHCR7) و sh-NTC U251 با ZIKV (MOI ¼ 1) آلوده شدند یا با Poly (I: C) (1 ug/mL) به مدت 24 ساعت ترانسفکت شدند. و سطح پروتئین ISG15، ISG56 و GAPDH توسط وسترن بلات شناسایی شد. سلول های K U251 با دوز مشخص شده AY9944 به مدت 2 ساعت تیمار شدند، سپس به مدت 6 ساعت با ZIKV (MOI ¼ 1) آلوده شدند. سطح IFN-RNA توسط RT-PCR با GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی تشخیص داده شد. سلول های L U251 با دوز مشخص شده AY9944 به مدت 2 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و سپس به مدت 24 ساعت با ZIKV (MOI ¼ 1) آلوده شدند. سطح پروتئین ISG15، ISG56 و GAPDH توسط وسترن بلات شناسایی شد. سلول های M U251 به مدت 24 ساعت با ناقل HA، HA-DHCR7، یا HA-DHCR7 (G410}) ترانسفکت شدند و به مدت 6 ساعت با ZIKV (MOI ¼ 1) آلوده شدند. سطوح IFN-RNA توسط RT-PCR با GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی شناسایی شد. سلول‌های N U251 با ناقل HA، HA-DHCR7 یا HA-DHCR7 (G41{77}}S) به مدت 24 ساعت ترانسفکت شدند و سپس به مدت 24 ساعت با ZIKV (MOI ¼ 1) آلوده شدند. سطح پروتئین ISG15، ISG56 و GAPDH توسط وسترن بلات شناسایی شد. داده ها از حداقل سه آزمایش مستقل (میانگین SD) یا داده های نماینده (I، J، L، N) هستند. معنی‌داری آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه با آزمون مقایسه‌های چندگانه دانت (A, B, K, M) یا ANOVA دو طرفه با آزمون مقایسه‌های چندگانه Sidak (C–H) محاسبه می‌شود. ns، P > 0.05، ***P <0.001. SD، انحراف استاندارد.

شکل 5. DHCR7 فعال سازی TBK1 و IRF3 را مهار می کند. سلول‌های A، B HEK293T با پلاسمید کدکننده TBK{6}}همراه با پلاسمید بیان‌کننده پلاسمید یا بردار خالی (A) DHCR{7}همراه ترانسفکت شدند. سلول‌های HEK293T با پلاسمید کدکننده IRF، پلاسمید کدکننده RIG-I، همراه با پلاسمید بیان‌کننده پلاسمید یا بردار خالی (B){12}}همراه ترانسفکت شدند. سلول ها در 24 ساعت پس از ترانسفکشن برداشت شدند و تحت وسترن بلات با آنتی بادی های مشخص شده [anti-TBK1، anti-P-TBK1 (S172)، anti-IRF3، anti-PIRF3 (S396)، anti-HA و anti-GAPDH قرار گرفتند. ]. سلول های C U251 با دوز مشخص شده پلاسمید یا وکتور خالی بیان کننده DHCR7 به مدت 24 ساعت ترانسفکت شدند. سپس سلول ها با ZIKV (MOI ¼ 1) که در 6 ساعت پس از عفونت برداشت شد، آلوده شدند و تحت وسترن بلات با آنتی بادی های مشخص شده [anti-TBK1، anti-P-TBK1 (S172)، anti-IRF3، anti-P-IRF3 ( S396)، anti-HA و anti-GAPDH]. سلول های D U251 با HA-وکتور، HA-DHCR7 یا HA-DHCR7 (G410S) به مدت 24 ساعت ترانسفکت شدند. سپس سلول ها با ZIKV (MOI ¼ 1) که در 6 ساعت پس از عفونت برداشت شد، آلوده شدند و تحت وسترن بلات با آنتی بادی های مشخص شده [anti-TBK1، anti-P-TBK1 (S172)، anti-IRF3، anti-PIRF3 (S396) قرار گرفتند. , anti-HA و anti-GAPDH]. سلول های E U251 با دوز مشخص شده AY9944 به مدت 2 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و به مدت 6 ساعت با ZIKV (MOI ¼ 1) آلوده شدند، سپس تحت وسترن بلات با آنتی بادی های مشخص شده [anti-TBK1، anti-P-TBK1 (S172)، ضد قرار گرفتند. -IRF3، anti-P-IRF3 (S396) و anti-GAPDH]. داده ها از حداقل سه آزمایش مستقل هستند و به عنوان داده های نماینده (A-E) نشان داده شده اند.

شکل 6. ZIKV NS4B برای مهار فسفوریلاسیون TBK1 و IRF3 با DHCR7 تعامل دارد. یک سلول HEK293T با پلاسمیدهای کد کننده HA-DHCR7 و پلاسمیدهای کد کننده پروتئین های غیر ساختاری ZIKV (FLAG-NS1، FLAG-NS3، FLAG-NS4A، FLAG-NS4B، و FLAG-NS5) یا پلاسمید کنترل خالی برای 3 ترانسفکت شدند. 0 ساعت لیزات سلولی با آنتی‌بادی‌های ضد پرچم ایمونوپسیته شدند و سپس با ایمونوبلات با آنتی‌بادی‌های مشخص‌شده آنالیز شدند. سلول های B، C HEK293T با پلاسمیدهای کد کننده HA-DHCR7، پلاسمیدهای کد کننده FLAG-NS4B، یا پلاسمید کنترل خالی به مدت 30 ساعت به صورت مشترک ترانسفکت شدند. لیزات سلولی با آنتی بادی ضد HA (B) یا آنتی بادی ضد FLAG (C) رسوب داده شدند و سپس با ایمونوبلات با آنتی بادی های مشخص شده مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. سلول های D U251 با پلاسمید FLAG-NS4B همراه با پلاسمیدهای کد کننده با HA-DHCR7 ترانسفکت شدند. محلی سازی FLAG-NS4B (سبز)، HA-DHCR7 (قرمز)، نشانگر هسته DAPI (آبی)، و ادغام با میکروسکوپ کانفوکال تجزیه و تحلیل شد. نوار مقیاس ¼ 10 میکرومتر. E سلول لیز از سلول های HEK293T ترانسفکت شده با HA-DHCR7 با پروتئین GST یا پروتئین GST-NS4B که با دانه های گلوتاتیون-سفاروز انکوبه شد. مخلوط ها با وسترن بلات با آنتی بادی های ضد HA و ضد GST (بالا) شناسایی شدند. لیزات از سلول های HEK293T ترانسفکت شده و پروتئین های خالص شده توسط وسترن بلات با آنتی بادی های ضد HA و ضد GST (پایین) شناسایی شدند. سلول های F U251 با پلاسمید کد کننده FLAG-NS4B (0، 1، 2 میکروگرم) ترانسفکت شدند. سطح پروتئین نسبی DHCR7، FLAG-NS4B، و GAPDH توسط وسترن بلات شناسایی شد. سلول‌های G، H HEK293T با پلاسمید بیان‌کننده NS4B یا وکتور خالی، همراه با پلاسمید کدکننده TBK (F)، پلاسمید بیان‌کننده IRF و پلاسمیدهایی که RIG-I (G) را کد می‌کنند، ترانسفکت شدند. . سلول ها در 24 ساعت پس از ترانسفکشن برداشت شدند و تحت وسترن بلات با آنتی بادی های مشخص شده [anti-TBK1، anti-P-TBK1 (S172)، anti-IRF3، anti-P-IRF3 (S396)، anti-FLAG و antiGAPDH قرار گرفتند. ]. سلول های I DHCR{83} خاموش کننده U251 (sh-DHCR7) و sh-NTC U251 با پلاسمید بیان کننده NS4B یا وکتور خالی ترانسفکت شدند. سلول ها در 6 ساعت پس از ترانسفکشن برداشت شدند و تحت وسترن بلات با آنتی بادی های مشخص شده [anti-TBK1، anti-P-TBK1 (S172)، anti-IRF3، anti-P-IRF3 (S396)، anti-FLAG و antiGAPDH قرار گرفتند. ]. داده ها نماینده سه آزمایش مستقل از هم هستند.

5. نتیجه گیری ها

به طور خلاصه، یک مطالعه قبلی نشان داد که آنزیم متابولیسم کلسترول DHCR7 در پاسخ ایمنی ذاتی در برابر عفونت‌های ویروسی مختلف نقش دارد. مطالعه ما نشان داده است که ZIKV NS4B با DHCR7 تعامل دارد و بیان DHCR7 را القاء می کند. افزایش DHCR7 تا حد زیادی از فعال سازی TBK1 و IRF3 جلوگیری می کند و منجر به کاهش تولید IFN- و ISG می شود که در نتیجه عفونت ZIKV را در سلول های گلیال تسهیل می کند. این یافته‌ها یک مکانیسم جدید فرار ایمنی ویروسی را کشف کرده‌اند که ZIKV با هدف قرار دادن مستقیم DHCR7 با NS4B بر پاسخ ایمنی غلبه می‌کند.

منابع

Akula، MK، Shi، M.، Jiang، Z.، Foster، CE، Miao، D.، Li، AS، Zhang، X.، Gavin، RM، Forde، SD، Germain، G.، Carpenter، S.، Rosadini، CV، Gritsman، K.، Chae، JJ، Hampton، R.، Silverman، N.، Gravallese، EM، Kagan، JC، Fitzgerald، KA، Kastner، DL، Golenbock، DT، Bergo، MO، Wang، D .، 2016. کنترل پاسخ ایمنی ذاتی توسط مسیر موالونات. نات. ایمونول. 17، 922-929.

Berthoud، L.، 2020. محدودیت فلاوی ویروس ها. ویرول. گناه 35، 363-377.

بلان، ام.، هسیه، وای، رابرتسون، کا، کروپ، کا، فورستر، تی، شوی، جی.، لاکاز، پی، واترسون، اس.، گریفیث، اس جی، اسپان، نیوجرسی، ملجون، ای.، تالبوت، اس.، کریشنان، ک.، کووی، دی اف، ونک، ام آر، کریگون، ام.، روزیکس، زی، هاس، جی.، آنگولو، آ.، گریفیث، و.جی.، گلس، CK، وانگ، ی. ، غزال، ص.، 2013. فاکتور رونویسی STAT{1}} سنتز ماکروفاژی 25-هیدروکسی کلسترول را به پاسخ ضد ویروسی اینترفرون جفت می کند. مصونیت 38، 106-118.

کائو لورمو، وی. Larre، P.، Vial، A.-L.، Decam، C.، Choumet، V.، Halstead، SK، Willison، HJ، Musset، L.، Manuguerra، J.-C.، Despres، P.، Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. شیوع سندرم Guillain-Barre مرتبط با عفونت ویروس زیکا در پلینزی فرانسه: یک مورد -مطالعه کنترلی Lancet 387، 1531-1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I 5' را تشخیص می دهد. منطقه ژنوم ویروس دنگی و زیکا Cell Rep. 24, 320-328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. متابولیک برنامه ریزی مجدد توسط ویروس زیکا باعث ایجاد التهاب در جفت انسان می شود. نات. اشتراک. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. مهار اکسیسترول سنتز کلسترول از فعال شدن التهاب AIM2 جلوگیری می کند. سلول 171، 1057-1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. ویروس هپاتیت C NS4B تعامل STING و TBK1 برای فرار از مصونیت ذاتی میزبان. ج.هپاتول. 59، 52-58.

Fanunza، E.، Grandi، N.، Quartu، M.، Carletti، F.، Ermellino، L.، Milia، J.، Corona، A.، Capobianchi، MR، Ippolito، G.، Tramontano، E.، 2021 INMI1 ویروس زیکا NS4B با سرکوب فسفوریلاسیون STAT1 با سیگنال دهی اینترفرون مخالفت می کند. ویروس 13، 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. IKKε و TBK1 اجزای ضروری سیگنال دهی IRF3 هستند. مسیر نات. ایمونول. 4، 491-496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Mutations in the Δ{{ 3} ژن استرول ردوکتاز در بیماران مبتلا به سندرم اسمیت-لملی-اوپیتز. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 95, 8181–8186.

Gorman، MJ، Caine، EA، Zaitsev، K.، Begley، MC، Weger-Lucarelli، J.، Uccellini، MB، Tripathi، S.، Morrison، J.، Yount، BL، Dinnon 3، KH، Ruckert، C .، یانگ، ام سی، ژو، زی، رابرتسون، اس جی، مک نالی، کی ال، یه، جی.، کائو، بی.، میسورکار، آی یو، ایبل، جی دی، باریک، آر اس، بهترین، اس ام، آرتیوموف، ام. ان، گارسیا -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. یک مدل موش دارای قابلیت ایمنی از عفونت ویروس زیکا. سلول میزبان میکروب 23، 672-685.e6.

Grant، A.، Ponia، SS، Tripathi، S.، Balasubramaniam، V.، Miorin، L.، Sourisseau، M.، Schwarz، MC، Sanchez-Seco، MP، Evans، MJ، Best، SM، Garcia-Sastre , A., 2016. ویروس زیکا STAT2 انسان را هدف قرار می دهد تا سیگنال دهی اینترفرون نوع I را مهار کند. سلول میزبان میکروب 19، 882-890.

هرتزوگ، جی.، دیاس جونیور، AG، ریگبی، RE، دونالد، CL، مایر، A.، Sezgin، E.، Song، C.، جین، B.، Hublitz، P.، Eggling، C.، کهل، A., Rehwinkel, J., 2018. عفونت با ایزوله برزیلی ویروس زیکا RNA محرک RIG-I ایجاد می کند و پروتئین NS5 ویروسی القای و سیگنال دهی IFN نوع I را مسدود می کند. یورو J. Immunol. 48، 1120-1136.

Horlick, L., 1966. اثر یک مهارکننده جدید بیوسنتز کلسترول (AY 9944) بر استرول های سرم و بافت در موش صحرایی. J. Lipid Res. 7، 116-121.

Ikonen، E.، 2008. قاچاق کلسترول سلولی و بخش بندی. نات. کشیش مول. سلول بیول. 9، 125-138.

کاتو، اچ.، تاکوچی، او.، ساتو، اس.، یونیاما، ام.، یاماموتو، م.، ماتسوی، ک.، اوماتسو، اس.، یونگ، آ.، کاوای، تی، ایشی، کی جی، یاماگوچی , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. نقشهای متفاوت MDA5 و RIG-I هلیکازها در شناسایی ویروس های RNA طبیعت 441، 101-105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. جهش های DHCR7 مرتبط با وضعیت بالاتر ویتامین D اجازه مهاجرت اولیه انسان به عرض های جغرافیایی شمالی را داد. BMC Evol. Biol. 13، 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. ویروس زیکا تولید اینترفرون نوع I و پایین دست را مهار می کند. سیگنالینگ. EMBO Rep. 17، 1766-1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. مدل موش پاتوژنز ویروس زیکا. سلول میزبان میکروب 19، 720-730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. پنهان و جستجو: تعامل بین ویروس زیکا و پاسخ ایمنی میزبان. جلو. ایمونول. 12, 750365.

Leier، HC، Weinstein، JB، Kyle، JE، Lee، JY، Bramer، LM، Stratton، KG، Kempthorne، D.، Navratil، AR، Tafesse، EG، Hornemann، T.، Messer، WB، Dennis، EA، Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. یک نقشه جهانی لیپید یک شبکه ضروری برای تکثیر ویروس زیکا را تعریف می کند. نات. اشتراک. 11, 3652.

لی، آ.، وانگ، دبلیو.، وانگ، ی.، چن، ک.، شیائو، اف، هو، دی، هوی، ال.، لیو، دبلیو، فنگ، ی.، لی، جی.، Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. سایت محافظه کار NS5 برای ویروس زیکا برای محدود کردن سیگنال دهی RIG-I مورد نیاز است. جلو. ایمونول. 11، 51.

لی، سی.، دنگ، ی کیو، وانگ، اس.، ما، اف.، آلیاری، آر.، هوانگ، XY، ژانگ، NN، واتانابه، ام.، دونگ، HL، لیو، پی، لی، XF، یه، کیو، تیان، ام، هونگ، اس، فن، جی، ژائو، اچ، لی، ال.، ویشلاقی، ن.، بوث، جی، آئو، سی.، لیو، ی.، لو , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. ، 2017. 25- هیدروکسی کلسترول از میزبان در برابر عفونت ویروس زیکا و میکروسفالی مرتبط با آن در مدل موش محافظت می کند. مصونیت 46، 446-456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. یک مهارکننده بیوسنتز کلسترول، حدت استافیلوکوکوس اورئوس را مسدود می کند. . علم 319، 1391–1394.

لیو، سی، آلیاری، آر.، چیکره، ک.، لی، جی.، مارسدن، MD، اسمیت، جی‌کی. Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. کلسترول القایی اینترفرون-25-هیدروکسیلاز به طور گسترده ورود ویروس را با تولید 25- 25-هیدروکسی کلسترول مهار می‌کند. مصونیت 38، 92-105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. مکانیسم ها و تنظیم هموستاز کلسترول. نات. کشیش مول. سلول بیول. 21، 225-245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. آنزیم های پایانی سنتز کلسترول DHCR24 و DHCR7 از نظر فیزیکی و عملکردی برهم کنش دارند. J. Lipid Res. 56، 888-897.

Ma، J.، Ketkar، H.، Geng، T.، Lo، E.، وانگ، L.، Xi، J.، Sun، Q.، Zhu، Z.، Cui، Y.، یانگ، L.، Wang, P., 2018. پروتئین غیر ساختاری ویروس زیکا 4A سیگنالینگ RLR-MAVS را مسدود می کند. جلو. میکروبیول. 9، 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

شبیه سازی مولکولی و بیان دلتا{0}}استرول ردوکتاز انسانی. Proc. Natl. آکادمی علمی ایالات متحده آمریکا 95، 1899-1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. مهار سیگنال دهی اینترفرون آلفا/بتا توسط پروتئین NS4B فلاوی ویروس ها. جی. ویرول. 79، 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. مهار سیگنال دهی اینترفرون توسط ویروس دنگی. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 100, 14333–14338.

پترسن، جی.، دریک، ام جی، بروس، EA، ریبلت، AM، دیدیگو، کالیفرنیا، ویلن، سی بی، مالانی، ن.، نر، اف.، لی، اف.اچ، بوشمن، اف دی، گیلاس، اس.، دامز، RW، Bates، P.، Briley Jr.، K.، 2014. مسیر اصلی تنظیم کننده استرول سلولی برای عفونت ویروس آند مورد نیاز است. PLoS Pathog. 10, e1003911.

پیرسون، تی سی، دیاموند، ام اس، 2020. تهدید مداوم فلاوی ویروس های در حال ظهور. نات. میکروبیول. 5، 796-812. Prabhu، AV، Luu، W.، Li، D.، Sharpe، LJ، Brown، AJ، 2016a. DHCR7: یک سوئیچ آنزیمی حیاتی بین تولید کلسترول و ویتامین D. Prog. Lipid Res. 64، 138-151.

Prabhu، AV، Luu، W.، Sharpe، LJ، Brown، AJ، 2016b. تخریب 7-دهیدرکلسترول ردوکتاز به واسطه کلسترول، تعادل را از کلسترول به سنتز ویتامین D تغییر می‌دهد. جی بیول. شیمی. 291، 8363-8373. Randall، G.، 2018. متابولیسم قطرات چربی در طول عفونت ویروس دنگی. Trends Microbiol. 26، 640-642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. ویروس زیکا و نقایص مادرزادی – بررسی شواهد برای علیت. N. Engl. جی. مد. 374، 1981-1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. التهاب. 25-هیدروکسی کلسترول التهاب ناشی از اینترلوکین را سرکوب می‌کند-1-در پایین دست اینترفرون نوع I. علوم 345، 679-684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. ویروس زیکا NS3 شبیه سازی سلولی { {2}}موتیف پیوندی برای مقابله با RIG-I- و MDA5-ایمنی ذاتی واسطه. سلول میزبان میکروب 26، 493-503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. پروفایل متابولیت لیپید متابولیسم دسموسترول را به عنوان یک هدف ضد ویروسی جدید برای ویروس هپاتیت C شناسایی می کند. مربا. شیمی. Soc. 134، 6896-6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. IFITM ها تکثیر ویروس زیکا را مهار می کنند. Cell Rep. 15، 2323-2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. ژنهای تحریک شده با اینترفرون: شبکه پیچیده ای از دفاع میزبان. آنو. کشیش ایمونول. 32، 513-545.