3-گیرنده آدرنرژیک روی لنفوسیت‌های نفوذکننده تومور، بیان PD-L1 وابسته به IFN را حفظ می‌کند و ایمنی ضد تومور را در نوروبلاستوما مختل می‌کند.

نوروبلاستوما (NB) یک تومور هتروژن خارج جمجمه ای است که در دوران کودکی ایجاد می شود. ویژگی متمایز تومورهای NB، توانایی نورواندوکرین آنها برای ترشح کاتکول آمین ها است، که به نوبه خود، از طریق بستن گیرنده های آدرنرژیک، ممکن است مسیرهای سیگنالینگ مختلف در ریزمحیط تومور (TME) را تحت تاثیر قرار دهد. قبلاً نشان داده شده بود که تضاد خاص گیرنده آدرنرژیک (3- AR) روی سلول‌های تومور NB بر رشد و پیشرفت تومور تأثیر می‌گذارد. در اینجا، در یک مدل هم‌زایی موش از NB، هدف ما بررسی این بود که آیا مدولاسیون 3-AR بر پاسخ سیستم ایمنی میزبان در برابر تومور تأثیر می‌گذارد یا خیر. نتایج نشان داد که 3-تضاد AR منجر به فعال شدن مجدد پاسخ ایمنی می‌شود که تا حدی به درگیری محور سیگنالینگ PD-1/PD-L1 بستگی دارد. در واقع، 3- محاصره AR بر روی لنفوسیت‌های نفوذکننده تومور (TILs) توانایی آن‌ها برای ترشح IFN- را کاهش داد، که به نوبه خود بیان PD-L1 ناشی از نفوذ TILs را در سلول‌های تومور NB کاهش داد. بررسی‌های بیشتر، از طریق تجزیه و تحلیل ژنومی روی بیماران NB، نشان داد که بیان ژن ADRB3 بالا با نتایج بالینی بدتر در مقایسه با گروه کم بیان مرتبط است و بیان ژن ADRB3 بر مسیرهای مختلف مرتبط با ایمنی تأثیر می‌گذارد. به طور کلی، نتایج نشان می‌دهد که 3-AR در NB TME می‌تواند تعامل بین تومور و سیستم ایمنی میزبان را تعدیل کند و آنتاگونیسم آن به چندین مسیر سیگنال‌دهی طرفدار تومور برخورد می‌کند.

چکیده گرافیکی

معرفی

نوروبلاستوما (NB) یک بیماری پیچیده و ناهمگن و شایع ترین نوع سرطان است که در سال اول زندگی تشخیص داده می شود. NB یک تومور عصبی غدد درون ریز است که از سلول های پیش ساز متعهد تاج عصبی در طول توسعه سیستم عصبی سمپاتیک (SNS) ایجاد می شود. این منشاء متمایز محل تومور را تعیین می کند، که معمولاً در غده فوق کلیوی و/یا گانگلیون های سمپاتیک رخ می دهد [1]. رفتار بالینی NB بسیار متغیر است، از تومورهایی که به طور خود به خود پسرفت می کنند، تا موارد دیگری که نسبت به همه درمان های موجود از جمله شیمی درمانی فشرده، جراحی، رادیوتراپی، پیوند سلول های بنیادی اتولوگ، و تجویز رتینوئیدها مقاوم شده اند (13-سیس رتینوییک). اسید) [2]. بنابراین اهداف درمانی جایگزین برای این تومورهای بی پاسخ مورد نیاز است. ایمونوتراپی مبتنی بر مهارکننده های ایمن ایست ایست بازرسی (ICIs) امیدبخش ترین استراتژی را برای چندین تومور جامد نشان می دهد [3]. از جمله، محور سیگنال‌دهی لیگاند مرگ برنامه‌ریزی‌شده-1/مرگ برنامه‌ریزی‌شده-1 (PD-L1/PD-1) ایمنی سلول‌های T مؤثر را مختل می‌کند و تحمل ایمنی سلول‌های تومور را افزایش می‌دهد، که نقشی اساسی دارد. نقش در کاهش پاسخ های ضد تومور در سرطان موش و انسان [4، 5]. با این حال، در حالی که مطالعات متعدد قبلاً مکانیسم‌های زیربنایی سیگنال‌دهی PD-1/PD-L1 را در سرطان بزرگسالان بررسی کرده‌اند، در تومورهای کودکان اطلاعات کمی وجود دارد. یک گفتگوی متقابل پیچیده بین SNS و سیستم ایمنی، از طریق آزادسازی کاتکول آمین و فعال شدن سیگنال گیرنده های آدرنرژیک، قادر به تعیین سرنوشت پیشرفت تومور در بسیاری از تومورها است [6]. این می تواند به ویژه در بیماران NB صادق باشد که در آنها، در واقع، سطوح بالای کاتکول آمین ها نشان دهنده شدت بدخیمی است [7]. زیرگروه گیرنده آدرنرژیک ({21}}AR) اخیراً به عنوان یک تنظیم کننده حیاتی سرطان شناسایی شده است [8-10]. به طور خاص، بیان و فعال‌سازی آن، هم بر روی سلول‌های تومور و هم بر روی سلول‌های استرومایی ریزمحیط تومور (TME)، باعث ایجاد مسیرهای سیگنال‌دهی پیش‌تومورال مسئول پیشرفت تومور در مدل‌های مختلف پیش بالینی می‌شود [11-14]. در اینجا، در یک مدل موش سیژنیک از NB، نشان دادیم که 3-AR بر روی لنفوسیت‌های نفوذکننده تومور (TILs) یک تنظیم مثبت PD-L1 وابسته به IFN- - در سلول‌های تومور را حفظ می‌کند، که به نوبه خود منجر به TME سرکوب کننده سیستم ایمنی مسئول فرار تومور است. علاوه بر این، 3-تضاد AR قادر به افزایش تعداد CDهای واکنش‌دهنده ایمنی، کشنده طبیعی (NK) و سلول‌های دندریتیک (DCs) و کاهش تعداد تنظیم‌کننده‌های سرکوب‌کننده ایمنی بود. سلول های T (Treg) و سلول های سرکوبگر مشتق از میلوئید (MDSC) در TME. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل Kaplan-Meier نشان داد که بیان ژن ADRB3 بالا با بقای ضعیف بیماران NB مرتبط است، و تجزیه و تحلیل مجموعه داده‌های عمومی مختلف بیان NB ارتباط معنی‌داری بین سطح بیان ژن ADRB3 و ژن‌های دخیل در مسیرهای سیگنالینگ مرتبط با تعامل سیستم ایمنی/تومور

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

مواد و روش ها

کشت سلولی

سلول‌های سرطانی NB موش عصبی از ATCC (CCL{1}}) به دست آمد و در DMEM حاوی 10 درصد FBS، 2 میلی‌مولار ال-گلوتامین، 100 U·ml-1 پنی سیلین و 100 رشد داده شد. ug·ml-1 استرپتومایسین در دمای 37 درجه در اتمسفر اشباع از آب، 5٪ CO2. سلول‌های عصبی-2آ به طور معمول برای آلودگی مایکوپلاسما مورد آزمایش قرار گرفتند.

مدل موش سنژنیک تومور

موش های ماده NCI A/JCr 4 هفته از آزمایشگاه چارلز ریور (فردریک) خریداری شدند. سلول‌های عصبی a (N2A) با تزریق 1 × 1{35}}6 سلول در 100 میکرولیتر PBS در سمت راست به صورت زیر جلدی در موش‌های گیرنده A/J کاشته شدند. هنگامی که سلول های N2A یک تومور قابل لمس را تشکیل دادند (حدود 8 روز)، درمان شروع شد. درمان ها دو بار در روز برای SR59230A (Tocris Bioscience) و وسیله نقلیه (محلول فیزیولوژیکی)، و در روز 8 و 12 برای آنتی بادی PD-L1 (InVivoMAb ضد موش PD-L1 (B{16}}xhH1) #BE0101 انجام شد. ، Bio X Cell) و کنترل ایزوتیپ (InVivoMAb rat IgG2b کنترل ایزوتیپ # BE0090، Bio X Cell). تجویز کنترل ایزوتیپ IgG2b نتایج یکسانی را برای وسایل نقلیه ایجاد کرد، بنابراین فقط وضعیت خودرو در شکل‌ها نشان داده شده است. SR59230A در 10 میلی گرم / کیلوگرم در محلول فیزیولوژیکی از طریق داخل صفاقی (IP) تحویل داده شد. 250 میکروگرم PD-L1 به صورت داخل صفاقی در 100 میکرولیتر از بافر رقت 6.5 InVivoPure™ با pH 6.5 (#IP0065) تحویل داده شد. 250 میکروگرم از موش کنترل ایزوتیپ IgG2b به صورت داخل صفاقی در 100 میکرولیتر از بافر رقت InVivoPure™ با pH 7.0 (#IP0070) تحویل داده شد. درمان با FTY720 (#6176، Tocris Biotechne) از روز 6 با دوز mg/kg در هر OS (po) انجام شد. سرعت رشد تومور با اندازه‌گیری توده تومور با کالیبر ارزیابی شد و حجم توده تومور به صورت حجم {{ 41}} [(طول × عرض) 2/2]. موش ها پس از 8 روز درمان قربانی شدند.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

سلول ها جمع آوری و در بافر RIPA حاوی کوکتل بازدارنده پروتئاز لیز شدند. پس از تعیین مقدار، 20 میکروگرم از پروتئین کل برای انجام آنالیز SDS-PAGE و WB استفاده شد. غشاهای PVDF یک شبه با آنتی بادی های اولیه anti-PD-L1 (ab238697، Abcam)، فسفو-CREB (ab32096، Abcam)، CREB (ab32515، Abcam)، p-PKA / / (sc{10}}، Santa انکوبه شدند. بیوتکنولوژی کروز)، -اکتین (sc-1615، بیوتکنولوژی سانتا کروز)، 3-AR (ab94506، Abcam) در 4 درجه و سپس با آنتی‌بادی‌های ثانویه خاص به مدت 1 ساعت در دمای اتاق. اتصال آنتی بادی ها با پروتئین های خاص با استفاده از زیرلایه Clarity Western ECL (Bio-Rad) شناسایی شده است و تصاویر از طریق سیستم تصویربرداری Chemidoc (Biorad®) به دست آمد. برای انجام آنالیزهای کمی از نرم افزار ImageJ استفاده شد و شدت سیگنال باندها به صورت افزایش برابری نسبت به مقادیر کنترل بیان شد.

کشت مشترک برای سنجش سیتوفلوریمتری PD-L1

سلول‌های توموری روی MW24 (45،000 سلول/چاه) کاشته شدند و پس از 24 ساعت با لنفوسیت‌های به‌دست‌آمده از TDLN موش‌هایی که به مدت 2 روز با Vehicle یا SR59230A (T2) از قبل تیمار شده بودند، کشت داده شدند. نسبت بذر 1:10 (تومور/لنفوسیت). در پایان دوره کمون کامل (48 ساعت)، لنفوسیت ها همراه با محیط کشت با پیپتینگ ملایم خارج شدند و سپس سلول های تومور با تریپسینیزاسیون جدا شدند و با آنتی بادی ضد PD-L1 مشخص شدند (آنتی بادی CD274 { {17}}، eBioscience™) برای تعیین کمیت سیتوفلوریمتری. سلول های رنگ آمیزی شده بر روی یک فلوسایتومتر MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec، Gladbach، آلمان) به دست آمد و داده ها با استفاده از نرم افزار Flowlogic (Miltenyi Biotec، Gladbach، آلمان) پردازش شدند.

کشت مشترک برای ایمونوفلورسانس PD-L1 و کمی سازی IFN

سلول‌های تومور بر روی لام‌های میکروسکوپی (20،000 سلول/چاه) در اسلاید 4 محفظه Nunc Lab-Tek کاشته شدند و پس از 24 ساعت با لنفوسیت‌های به‌دست‌آمده از TDLN موش‌هایی که به مدت 2 روز با Vehicle تحت درمان قرار گرفتند، کشت شدند. یا SR59230A (T2)، در نسبت بذر 1:10 (تومور/لنفوسیت). پس از 48 ساعت، لنفوسیت ها در محیط کشت با پیپتینگ ملایم جمع آوری و سپس از طریق سانتریفیوژ دور انداخته شدند. از مایع رویی برای تعیین کمیت IFN-از طریق فناوری Luminex xMAP طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. به طور خلاصه، کمی سازی IFN- در محیط کشت همزمان با استفاده از Bio-Plex Pro Mouse Cytokine IFN-Set (#171G5017M، Bio-Rad) انجام شد و داده ها در سیستم MAGPIX (Luminex، تگزاس، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. تجزیه و تحلیل با استفاده از نرم افزار Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. سلول های تومور روی اسلایدهای میکروسکوپ به جای آن برای انجام سنجش ایمونوفلورسانس PDL1 به شرح زیر استفاده شدند. برای آنالیز ایمونوفلورسانس، سلول ها در پارافورمالدئید 3 درصد در PBS به مدت 20 دقیقه تثبیت شدند. نفوذپذیری با افزودن محلول حاوی Tween{25}}.5% در PBS به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق به دست آمد. سپس سلول ها در BSA 3% به مدت 1 ساعت مسدود شدند و با آنتی بادی اولیه anti-PD-L1 (ab238697، Abcam) به مدت 2 ساعت انکوبه شدند. متعاقبا، پس از شستشو در PBS، اسلایدها با آنتی بادی ثانویه Alexa-fluor 488 به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. تصاویر با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (DMi{38}} میکروسیستم لایکا) به دست آمد.

گیاه چینی سیستانچ - ضد تومور

الکتروپوراسیون siRNA لنفوسیت ها برای خاموش کردن 1- 2- و 3-AR

لنفوسیت‌های به‌دست‌آمده از TDLN‌ها با siRNA‌ها برای 1- (SASI_Mm01_00090154، توالی: GUGAUCGUGGCCAUCGCCA، Merck)، 2- (SASI_Mm{4}) انتخابی ترانسفکت شدند. {5}}، دنباله: CCAAGUUCGAGCGACUACA، Merck) و 3-AR (SASI_Mm01_00145466، دنباله: CAGUGGACGUGCUCUGUGU، Merck) خاموش کردن. به طور خلاصه، لنفوسیت ها با siRNA ها (100 نانومولار) با استفاده از واحد 4D-Nucleofector X (Lonza) و کیت P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X (V4XP{16}}، Lonza) الکتروپوره شدند. برنامه DN{17}}، مخصوص الکتروپوراسیون سلول T موش، انجام شد. پس از الکتروپوراسیون، لنفوسیت ها در محیط TexMACS ({18}}، Miltenyi Biotec) به مدت 24 ساعت کشت داده شدند و سپس با سلول های تومور N2A به مدت 48 ساعت، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، برای تعیین کمیت PD-L1 کشت داده شدند. کارایی خاموش کردن ARs در لنفوسیت ها از طریق قطره دیجیتال PCR به شرح زیر ارزیابی شد.

قطره دیجیتال PCR برای تعیین کمیت mRNA -ARs

RNA با استفاده از کیت سنتز cDNA پیشرفته iScript (Bio-Rad) رونویسی معکوس شد. ddPCR با استفاده از ddPCR Supermix for Probes (بدون dUTP) (Bio-Rad)، طبق دستورالعمل های ساخت، بر روی یک سیستم QX200 (Bio-Rad) و یک سیکلر حرارتی لمسی C1000 (Bio-Rad) انجام شد. سنجش‌های مورد استفاده عبارت بودند از: Adrb3-FAM (dMmuCPE5088688)، Adrb2-FAM (dMmuCPE5089938)، Adrb{10}}FAM (dMmuCPE5100184)، Rps{12}}HEX (dMmuCPE519). داده های ddPCR با استفاده از نرم افزار QuantaSoft™ (نسخه 1.7.4، Bio-Rad) تجزیه و تحلیل شد.

توالی یابی RNA

تومورهای بریده شده در بافر RLT (Qiagen) قرار داده شدند و به صورت مکانیکی با gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec، Glad bach، آلمان) با استفاده از لوله های M gentleMACS (Miltenyi Biotec، Gladbach، آلمان) همگن شدند. استخراج RNA کل با کیت RNeasy Plus Mini (Qiagen) و طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. کمی سازی RNA با استفاده از هر دو طیف سنج NanoDrop 2000/2000c (ThermoFisher) و Qubit RNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher) انجام شد. یکپارچگی RNA با استفاده از کیت Agilent RNA 6000 Pico بر روی یک Bioanalyzer Agilent ارزیابی شد و تمام نمونه‌های با عدد یکپارچگی RNA (RIN) کمتر از 6.00 حذف شدند. آماده سازی کتابخانه با استفاده از کیت طلای آماده سازی کتابخانه RNA TruSeq Stranded Total RNA (Illumina) طبق دستورالعمل سازنده، با ورودی اولیه 500 نانوگرم RNA کل انجام شد. کیفیت کتابخانه با استفاده از کیت Agilent DNA 7500 بر روی Agilent Bioanalyzer و به دنبال آن کمی سازی کتابخانه با استفاده از 1X dsDNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher) ارزیابی شد. کتابخانه ها بر روی یک سیستم توالی یابی NextSeq 550 (Illumina) با استفاده از NextSeq 500/550 v2.5 (150 چرخه) کیت های با خروجی بالا (Illumina) توالی یابی شدند. اجراها با پیکربندی 2 × 76 جفت باز انجام شد.

کمی سازی mRNA و تجزیه و تحلیل ترانس کریپتومیکس

ماهی قزل آلا (v. 1.5.1) در حالت مبتنی بر نقشه برداری برای انجام کمی سازی رونوشت ها و رونوشت مرجع mus musculus GRCm38.98 استفاده شد. فایل‌های qf به‌دست‌آمده با زبان آماری R آنالیز شدند. بسته tximport برای وارد کردن داده‌ها در R استفاده شد، و رونوشت‌ها توسط بسته AnnotationDbi و پایگاه داده org.Mm.eg.db روی ژن‌ها جمع شدند. در نهایت، تجزیه و تحلیل های آماری را با DESeq2 انجام دادیم. ما با استفاده از بسته ClusterProfiler برای پرس و جو از پایگاه داده GO: BP، با تجزیه و تحلیل های آماری حاصل، برای شناسایی مسیرهای سلولی تغییر یافته، یک تجزیه و تحلیل بیش از غنی سازی (ORA) انجام دادیم. برای انتخاب ژن‌ها برای تجزیه و تحلیل غنی‌سازی، آستانه log2FC را روی 0.5 (| log2FC|⋝ 0.5) و مقدار p تنظیم‌شده را روی 0 تنظیم کردیم.{ {17}}5. پس از فیلتر کردن نتایج با مقدار p 0.05، ما 45 فرآیند آماری غیرقانونی از بین 15158 مورد آزمایش شده در برابر پایگاه داده GO: BP را بازیابی کردیم.

تعیین کمیت سیتوکین های لومینکس

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

موش ها پس از 2 روز درمان (T2) با Vehicle، SR59230A، PD-L1، و SR59230A + PD-L1 قربانی شدند و توده تومور با قیچی جدا شد و با استفاده از کیت لیز سلولی Bio-Plex (BIO-RAD، کالیفرنیا) همگن شد. ، ایالات متحده آمریکا) و gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec، آلمان). سپس لیزهای تومور برای غلظت سیتوکین هایشان با سنجش Bio-Plex Pro™ (BIO-RAD، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) بر اساس فناوری Luminex xMAP مورد آزمایش قرار گرفتند. سطوح IFN-، TNF-، IL-2، IL{16}}، IL-10، GM-CSF، IL-1 و IL{20}} (pg/ml ) طبق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد. داده ها بر روی سیستم MAGPIX (Luminex، تگزاس، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد و تجزیه و تحلیل با استفاده از نرم افزار Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) انجام شد.

آنالیز فلوسایتومتری

آنالیز فلوسیتومتری بر روی سلول‌های تومور و زیرجمعیت‌های سلولی ایمنی ریزمحیط تومور به شرح زیر انجام شد. به طور خلاصه، تومورها با موش کیت تفکیک تومور (#{0}}، Miltenyi Biotec) همگن شدند و لنفوسیت‌های نفوذگر تومور از سوسپانسیون کل سلول‌ها با استفاده از موش میکروبیدز CD45 (TIL) جدا شدند (#130-110- 618، ماوس Miltenyi Biotec) یا CD8 (TIL) MicroBeads (#130-116-478، Miltenyi Biotec) از طریق جداکننده خودکار Pro (Miltenyi Biotec) طبق دستورالعمل سازنده. سپس سلول ها انکوبه شدند و با ترکیبات مختلف رقیق شده از آنتی بادی های مختلف کونژوگه با فلوروکروم رنگ آمیزی شدند (جدول تکمیلی 1). سلول های رنگ آمیزی شده با استفاده از یک فلوسایتومتر MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec®)، و داده ها با استفاده از نرم افزار Flowlogic (Miltenyi Biotec®) پردازش شدند.

ایمونوفلورسانس سلول ها و بافت ها

آنالیز ایمونوفلورسانس توده تومور موش به شرح زیر انجام شد. نمونه‌ها به سرعت جدا شدند، در فرمالدئید بافر 4 درصد به مدت 24 ساعت ثابت شدند و در پارافین جاسازی شدند. بخش‌های بافت‌شناسی به ضخامت 5 میکرومتر از نمونه‌ها بریده شد، پارافین زدایی شد و به مدت 1{7}} دقیقه در بافر سیترات سدیم (10 میلی‌مولار، pH 6.0؛ Bio-Optica) برای بازیابی آنتی‌ژن جوشانده شد و یک شبه در دمای 4 درجه با اولیه ایمونوارنگ‌آمیزی شد. آنتی بادی ها (anti-PD-L1، ab238697، Abcam؛ anti- 3-AR، ab94506، Abcam، anti-CD4، 14-9766-82، eBioscience، anti-CD8، 14-0808-82، eBioscience، DBH، ab209487، Abcam). واکنش ایمنی در انکوباسیون بخش‌هایی با آنتی‌بادی‌های ثانویه الکسا فلور 488- IgG کونژوگه یا الکسا فلور 594-IgG کونژوگه (1:350؛ آزمایشگاه جکسون) آشکار شد. پس از رنگ آمیزی متقابل با 4،{28}}دیامیدینو-2- فنیلندول (DAPI)، تصاویر معرف توسط میکروسکوپ Olympus BX63 همراه با نرم افزار تصویربرداری ابعادی CellSens نسخه 1.6 (Olympus) به دست آمد. رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس از طریق نرم افزار ImageJ (NIH، ایالات متحده آمریکا) ارزیابی شد زیرا شدت فلورسانس پروتئین مورد نظر به مقادیر DAPI نرمال شد.

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

کاپلان مایر و تجزیه و تحلیل همبستگی ژن در بیماران مبتلا به NB

همبستگی ژن ADRB3 با ژن های ایمن ایمونی CD80، CTLA4، CD276، CD226، CD40LG، 4-1BBL و همبستگی بین احتمال بقای کلی (OS) و بدون رویداد (EFS) بیماران مبتلا به NB و سطوح ARDB3 بیان mRNA با استفاده از پروفایل بیان ژن 649 نمونه NB تولید شده با استفاده از ریزآرایه های الیگونوکلئوتیدی 44 K انجام شد. نمایه‌ها و داده‌های بالینی از R2 بازیابی شدند: تجزیه و تحلیل ژنومی و پلت فرم تجسم (http://r2.amc.nl)، (Kocak، ag44kcwolf سفارشی، n=649 مورد). آخرین چارک توزیع به عنوان مقدار برش بیان برای بیان ژن ADRB3 بالا در مقابل کم در تجزیه و تحلیل Kaplan-Meier استفاده شد.

آمار

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA) با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه یا دو طرفه (ANOVA) و به دنبال آن آزمون تعقیبی Bonferroni یا آزمون t-paired student انجام شد. برای آزمایش‌های in vivo، طبق مطالعات قبلی روی همان مدل حیوانی [12]، حداقل 6 موش در هر گروه برای تضمین قدرت 80٪ مورد نیاز بود. مقادیر به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند. وقتی P بود اهمیت در نظر گرفته شد<0.05 and described in each figure legend. Allocation concealment was performed using a randomization procedure (http:// www.randomizer.org/).

نتایج

3-تضاد AR بیان PD-L1 را در سلول های توموری موش های A/J حامل NB کاهش می دهد.

مطالعات اخیر نشان داد که سیگنال دهی PD{0}}/PD-L1 در NB یک مکانیسم حیاتی برای محدود کردن نظارت ایمنی است و بیان PD-L1 با سطوح بالای نشانگرهای تومور مرتبط است [15، 16]. با در نظر گرفتن این داده‌ها و داده‌های قبلی ما که توانایی 3-محاصره AR برای برانگیختن TME مناسب ایمنی در موش‌های حامل ملانوم [13] را نشان می‌دهد، ما نمی‌دانیم که آیا در تومور NB، 3-AR تضاد می تواند منجر به فعال شدن پاسخ ایمنی وابسته به درگیری سیگنالینگ PD-L1 شود. تجویز 3-آنتاگونیست AR، SR59230A، در یک مدل هم‌زایی موشی NB، رشد تومور را به میزان بیشتری نسبت به درمان mAb آنتی‌بادی ضد PD-L1 (PD-L1) کاهش داد، اما هیچ اثر هم افزایی مشاهده نشد. هنگامی که موش ها با هر دو دارو تحت درمان قرار گرفتند (شکل 1A, B). برای بررسی اینکه آیا اثر ضد توموری ارائه شده توسط تجویز SR59230A تا حدی به مدولاسیون بیان PD-L1 متکی است، ما سطح بیان PD-L1 را در TME موش‌های حامل NB مورد سنجش قرار دادیم. جالب توجه است، ایمونوفلورسانس (شکل 1C) و تجزیه و تحلیل وسترن بلات (شکل 1D) روی توده تومور موش نشان داد که بیان PD-L1 در TME موش‌های تحت درمان با آنتاگونیست 3-AR در مقایسه با شرایط وسیله نقلیه کاهش یافته است. همانطور که داده های ادبیات گسترده نشان داد که در TME، علاوه بر سلول های سرطانی، سلول های استرومایی مانند سلول های ارائه دهنده آنتی ژن (APCs) MDSC، DCs و ماکروفاژها، منابع اصلی PD-L1 هستند [17-20]، بررسی شد که در TME، سطح بیان PD-L1 به دنبال مسدود کردن 3-AR تحت تأثیر قرار گرفت. سنجش سیتوفلورومتری نشان داد که 3-آنتاگونیسم AR بیان PD-L1 را در سلول‌های تومور کاهش می‌دهد (شکل 1E) در حالی که سطح بیان آن را در DCها و ماکروفاژها افزایش می‌دهد (شکل 1F، G). هیچ تغییری در جمعیت MDSC مشاهده نشد (شکل 1H). این نتایج اولیه نشان می‌دهد که 3-محاصره AR یک فعالیت ضد توموری قابل‌توجهی در مدل هم‌زایی موش‌های حامل NB اعمال می‌کند و اینکه تجویز همزمان آنتی‌بادی PDL1 اثر هم افزایی ضد توموری را القا نمی‌کند. جالب توجه است، 3-تضاد دارویی AR سطح بیان PDL1 را در TME تعدیل می‌کند، که نشان دهنده دخالت سیگنال‌دهی PD-L1 در عملکرد ضد تومور است که توسط محاصره 3-AR ایجاد می‌شود.

شکل 1 اثر درمان های SR59230A و PD-L1 بر رشد تومور و بیان PD-L1 در موش های حامل تومور NB

3-تضاد AR و تجویز PD-L1 یک TME واکنشی ایمنی را در NB تحریک می کند

به منظور بررسی اینکه آیا کاهش بیان PD-L1، مشاهده شده در سلول های تومور NB به دنبال تضاد 3-AR، منجر به فعال شدن مجدد سیستم ایمنی در TME شده است، ابتدا تعداد پرفورین را با PD{3}CD{3} ارزیابی کردیم. سلول‌های {4}} در توده توموری SR59230A-، PD-L1- یا SR59203A + PD-L{12}}در مقایسه با وسیله نقلیه (شکل 4A، B). علاوه بر این، یک روش رنگ‌آمیزی Ki67 روندی را نشان داد که نشان‌دهنده افزایش تکثیر سلول‌های CD{15}} در تومورهای NB موش‌های تحت درمان با آنتاگونیست 3-AR یا آنتی‌بادی PD-L1 بود، حتی اگر نتواند به میزان قابل توجهی برسد. تفاوت ها (شکل 4C). در نهایت، اندازه‌گیری سیتوکین‌ها در موش‌های تحت درمان با PDL، سطح افزایش یافته‌ای از سیتوکین‌های شناخته شده برای اعمال ضد تومور مانند TNF-، IFN-، و IL{24}} و همزمان را نشان داد. کاهش سیتوکین سرکوب کننده ایمنی IL{26}}. با کمال تعجب، در موش‌های حامل NB که با 3-آنتاگونیست AR درمان شده‌اند، شاهد افزایش TNF- و IL{30}} و کاهش سطح IL{31}} بر اساس سیستم ایمنی بودیم. وضعیت واکنش نشان داده شده توسط ویژگی های سلول های T، اما کاهش سطح IFN- (شکل 4D). تفاوت معنی داری در سایر سیتوکین های مورد سنجش (GMCSF، IL{35}}، IL{36}} و IL{37}} مشاهده نشد. این داده‌ها با هم نشان می‌دهند که 3-آنتاگونیسم AR پاسخ ایمنی میزبان را در TME موش‌های حامل NB تحریک می‌کند، و همان اثرات مشاهده‌شده پس از تجویز آنتی‌بادی PD-L1 را بازیابی می‌کند. به طور خاص، عملکرد سیتوتوکسیک CD{42}} توسط SR59230A و PD-L1 تقویت شد. هنگامی که آنتاگونیست AR همزمان با آنتی بادی PD-L1 تجویز شد، هیچ اثر هم افزایی مشاهده نشد، که تأیید می کند که فعال سازی مجدد ایمنی ناشی از محاصره AR، حداقل تا حدی، به سیگنال دهی PD-L1 وابسته است. درگیری مسیر

شکل 2 SR59230A و PD-L1 یک TME واکنشی ایمنی را در NB تحریک می کنند

شکل 3 بیان نقاط بازرسی ایمنی روی لنفوسیت ها در TME و TDLN به دنبال 3-تضاد AR و تجویز PD-L1

شکل 4 3-محاصره AR عملکردهای CD8 را تحریک می‌کند و ترشح سیتوکین‌های ایمنی را در TME تنظیم می‌کند.

3-AR در لنفوسیت‌های نفوذکننده تومور، ترشح IFN را تعدیل می‌کند و بر بیان PD-L1 روی سلول‌های تومور NB تأثیر می‌گذارد.

بیان PD-L1 بر روی سلول های تومور را می توان توسط عوامل متعددی برانگیخت، اما در میان دیگران، TNF- و IFN- نشان دهنده سایتوکاین های اصلی هستند که قادر به افزایش سطح PD-L1 در تومورهای مختلف هستند [23]. برای روشن کردن بیشتر سیگنال‌دهی زیربنای گفتگوی متقابل 3-AR/PD-L1 در مدل توموری NB، ابتدا بیان PD-L1 را در سلول‌های تومور N2A پس از درمان TNF و IFN- در شرایط آزمایشگاهی مورد سنجش قرار دادیم. نتایج نشان داد که بیان PD-L1 در سلول‌های NB که به مدت 48 ساعت با IFN- تیمار شده بودند تنظیم مثبت شد، اما نه با TNF-. علاوه بر این، پیش‌درمان سلول‌های تومور N2A با 3-آنتاگونیست AR SR59230A قادر به لغو افزایش بیان PDL1 ناشی از درمان با IFN نبود (شکل 5A). با توجه به اینکه داده های ادبیات، TIL ها را به عنوان منبع سلولی اصلی IFN- در طی پاسخ ایمنی تطبیقی ​​تشخیص دادند [24] و نتایج ما نشان داد که 3-مدولاسیون AR در سلول های تومور N2A بر PD وابسته به IFN{31} تأثیر نمی گذارد. بیان -L1، ما تعجب کردیم که آیا یک مدولاسیون 3-AR در TILها مسئول ترشح IFN- تغییر یافته است، که به نوبه خود بیان PD-L1 را در سلول های تومور تحت تأثیر قرار می دهد. برای اثبات فرضیه ما، لنفوسیت‌های به‌دست‌آمده از TDLN‌های موش‌های حامل NB که با وسیله نقلیه یا SR59230A تحت درمان قرار گرفتند، جدا شدند و در شرایط آزمایشگاهی با سلول‌های تومور کشت شدند. آنالیز ایمونوفلورسانس و فلوسیتومتری تأیید کرد که لنفوسیت‌های جمع‌آوری‌شده از موش‌های حاوی NB تحت درمان با آنتاگونیست AR، توانایی آن‌ها را برای تحریک بیان PD-L1 روی سلول‌های N2A در مقایسه با لنفوسیت‌های درمان‌نشده کاهش می‌دهد (شکل 5B، D). علاوه بر این، اندازه‌گیری سطح IFN در محیط‌های کشت مشترک تأیید کرد که لنفوسیت‌های جمع‌آوری‌شده از موش‌های تحت درمان با SR50230A، زمانی که با سلول‌های تومور NB کشت می‌شوند تا حدی توانایی خود را برای ترشح IFN- از دست دادند (شکل 5C). قبلاً نشان داده شده است که 3-AR ممکن است با پروتئین Gs در چندین بافت جفت شود و فعال شدن آن منجر به فعال شدن مسیر سیگنالینگ cAMP/PKA می شود [25]. در همان زمان، مطالعات نقش حیاتی اتصال عنصر پاسخگو AMP حلقوی (CREB) را به عنوان یک تنظیم کننده رونویسی مثبت IFN- در سلول های T ثابت کردند [25-27]. با شروع از این مشاهدات، ما بررسی کردیم که آیا مسیر سیگنالینگ cAMP/PKA/CREB در ترشح IFN وابسته به 3-AR در TILها دخالت دارد یا خیر. نتایج نشان داد که 3-تضاد AR CD{62}} TILها فسفوریلاسیون زیرواحدهای PKA /PKA و CREB را کاهش داد، که منجر به کاهش بیان IFN در CD{64}} TILها شد (شکل تکمیلی 1A ، ب). این نتایج تأیید کرد که 3-AR می‌تواند رونویسی IFN- را در TILهای NB با راه‌اندازی مسیر سیگنالینگ cAMP/PKA/CREB حفظ کند. از سوی دیگر، سیتوکین سرکوبگر ایمنی IL-10 در Treg موش‌های تحت درمان با SR59230A در مقایسه با وسیله نقلیه کاهش یافت (شکل تکمیلی 1C)، که واکنش‌پذیری ایمنی NB TME را پس از درمان با آنتاگونیست AR تأیید می‌کند. موش های حامل NB برای تأیید اثر انتخابی آنتاگونیسم SR59230A روی زیرگروه 3-AR، ما یک سنجش هم‌کشتی با لنفوسیت‌های خاموش شده با siRNA‌ها برای 1-، 2- و 3-AR انجام دادیم. زیر انواع نتایج نشان داد که لنفوسیت‌های خاموش شده برای 3-AR، در میان زیرگروه‌های -AR، تا حدی توانایی خود را برای القای بیان PD-L1 در سلول‌های تومور N2A در مقایسه با شرایط کنترل از دست دادند (شکل 5E و شکل تکمیلی 1D). علاوه بر این، بیان پروتئین 3-AR در لنفوسیت‌های موش موش‌های حامل NB با تجزیه و تحلیل وسترن بلات لنفوسیت‌های به‌دست‌آمده از TDLNs (شکل تکمیلی 2A) و ایمونوفلورسانس CD{89}} و CD{{{ 90}} سلول‌های T رنگ‌آمیزی برای 3-AR در بخش‌های توده تومور (شکل تکمیلی 2B). ما قبلاً نشان دادیم که تضاد خاص 3- AR بر روی سلول‌های تومور N2A توسط SR59230A، رشد NB و پیشرفت تومور را با تغییر از ساقه به ویژگی‌های تمایز سلول‌های تومور مهار می‌کند [12]. در اینجا، نتایج ما نشان داد که اثر ضد توموری تجویز آنتاگونیست AR بر 3-مدولاسیون سیگنالینگ AR در TILها نیز متکی است، که به نوبه خود منجر به تقویت پاسخ‌های ایمنی علیه تومورها شد. بنابراین، برای تأیید تز خود در داخل بدن، FTY720 را برای مهار سلول‌های T در TDLNs و کاهش نفوذ آنها در توده تومور تجویز کردیم. FTY720 آنالوگ اسفنگوزین 1-فسفات (S1P) است و تجویز آن باعث درونی شدن و تخریب گیرنده S1P می‌شود، بنابراین از خروج لنفوسیت‌ها از غدد لنفاوی جلوگیری می‌کند [28]. همانطور که فرض شد، قبل از درمان FTY720 اثر ضد تومور ناشی از تجویز آنتاگونیست AR (شکل 5F-H) را کاهش داد. برای تأیید اثربخشی FTY720 برای مهار سلول‌های T در TDLNs، ما تعداد سلول‌های T را در TDLN‌ها پس از هشت روز (T8) درمان اندازه‌گیری کردیم. نتایج نشان داد که سلول‌های CD{113}} و CD{114}} در TDLN موش‌هایی که از قبل با FTY720 تیمار شده بودند در مقایسه با موش‌های درمان نشده (وسیله نقلیه) افزایش یافتند (شکل تکمیلی 2C). با توجه به نتایج قبلی ما و سایر نتایج نشان می دهد که سیگنال دهی S1P برای بقای سلول های تومور NB بسیار مهم است [12، 29]، درمان با FTY720 به تنهایی نیز قادر به کاهش قابل توجه رشد تومور بود (شکل 5F-H). تجزیه و تحلیل توالی RNA بر روی توده‌های تومور NB جدا شده از موش‌های تحت درمان با وسیله نقلیه و SR59230A، 5607 ژن را شناسایی کرد که در میان آنها 267 ژن با بیان متفاوت (DEGs)، 127 ژن با تنظیم مثبت و 140 ژن در تومورهای تحت درمان با SR59230A کاهش یافتند (شکل 6A). به طور خاص، چندین ژن که از نظر آماری به طور متفاوت بیان شدند، به مسیرهای مرتبط با ایمنی بر اساس پایگاه داده GO: BP تعلق داشتند (شکل 6B). علاوه بر این، کاهش mRNA ژن PD-L1 (ژن CD274) در تومور درمان‌شده با SR59230A در مقایسه با وضعیت وسیله نقلیه و تنظیم مثبت ژن‌های مختلف دیگر درگیر در فرآیندهای مرتبط با ایمنی (شکل 6C) همبستگی بین 3-AR و نقطه بازرسی ایمنی PD-L1 در سطح پروتئین مشاهده شد. در نهایت، تجزیه و تحلیل بیان ژن دیفرانسیل بر روی یک مجموعه داده عمومی (GSE14880 از آرشیو GEO) متشکل از 34 بیمار مبتلا به NBs، تأیید کرد که توده‌های تومور NB با بیان کم ADRB3 تنظیم مثبت پاسخ‌های ایمنی، فعال‌سازی سلول‌های T و عامل ایمنی را نشان می‌دهند. مسیرها در مقایسه با توده تومور با سطوح بالای ADRB3 (شکل 6D). توجه داشته باشید، در حالی که در سرطان های مختلف، کاتکول آمین ها از طریق نورون های مرتبط با سرطان آزاد می شوند یا به سادگی از طریق گردش خون به تومور می رسند، در NB سطوح بیش از حد کاتکول آمین ها و متابولیت های آنها (HVA، VMA، دوپامین) که یکی از ویژگی های منحصر به فرد این بدخیمی است، منشا می گیرد. از منبعی متفاوت در واقع، به دلیل منشاء خاص سلول های NB (از سلول های تمایز عصبی سمپاتیک معیوب تاج عصبی)، این تومورها معمولاً قادر به ترشح کاتکول آمین ها به خودی خود هستند. در واقع، در مدل موش NB ما، ایمونوفلورسانس روی توده‌های تومور نشان داد که سلول‌های تومور NB برای دوپامین -هیدروکسیلاز (DBH) (تکمیلی شکل 3A)، آنزیمی که مسئول سنتز نوراپی نفرین است، بدون در نظر گرفتن {153} مثبت بودند. بیان AR روی تومور یا آنتاگونیسم آن. روی هم رفته، این داده‌ها نقش حیاتی سیگنال‌دهی آدرنرژیک را در تنظیم فرآیندهای مختلف بیولوژیکی درگیر در تعامل بین سیستم ایمنی میزبان و ریزمحیط تومور در تومورهای NB برجسته می‌کنند. اثرات ضد تومور مشاهده شده پس از تجویز 3-آنتاگونیست AR در مدل سیژنیک موش ما، حداقل تا حدی به مدولاسیون 3-AR بیان شده در لنفوسیت‌های نفوذکننده به تومور متکی است. به طور خاص، ما نشان دادیم که محاصره انتخابی 3-AR در TILها باعث کاهش ترشح IFN- می‌شود که به نوبه خود بیان PD-L1 را در سلول‌های تومور NB کاهش می‌دهد که TME واکنش‌دهنده ایمنی را ترویج می‌کنند.

شکل 5 3-AR در TIL ها بیان PD-L1 وابسته به IFN- - را در سلول های تومور NB حفظ می کند. آ

بیان ژن ADRB3 با پیش آگهی ضعیف در بیماران NB ارتباط دارد

برخی از مطالعات نشان می‌دهند که {{0}}AR mRNA و/یا پروتئین بیش از حد بیان می‌شوند و در برخی موارد با تکثیر و تبدیل نئوپلاستیک در سرطان‌های مختلف انسانی مرتبط هستند [10، 30-32]. بر این اساس، نتایج بالینی ما به‌دست‌آمده در یک مدل موش سیژنیک NB، نشان داد که سیگنال‌دهی 3- AR می‌تواند فرآیندهای مختلف پیش‌تومورال را حفظ کند که به نفع رشد تومور است. بنابراین، برای آزمایش اینکه آیا بیان ژن ADRB3 با بقای بیماران NB همبستگی دارد، ما یک تجزیه و تحلیل Kaplan-Meier را از طریق پلت فرم R2: تجزیه و تحلیل ژنومیک و تجسم (http://r2.amc.nl)، با استفاده از پایگاه داده Kocak که شامل اطلاعات کامل در مورد داده های بالینی 649 بیمار NB. نتایج نشان داد که بیان ژن ADRB3 با نتایج ضعیف در بیماران مبتلا به NB همراه بود. بیان بالای ژن ADRB3، در واقع، به طور قابل توجهی با کاهش بدون رویداد (p=3.2e-05) (شکل 7A) و بقای کلی (p=8}.4e-0.5) مرتبط بود ( شکل 7B) بیماران NB. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل همبستگی ژن در برخی گروه‌ها همبستگی مثبتی را بین ADRB3 و ژن‌های نقاط بازرسی ایمنی بازدارنده، مانند CD80، CTLA4، و CD276، و یک همبستگی منفی با ژن‌های نقاط بازرسی ایمنی فعال کننده سیستم ایمنی، مانند CD266، نشان داد. لیگاند CD40 (CD40LG) و {29}}لیگاند BB (4-1BBL) (شکل 7C). به طور کلی، داده‌های به‌دست‌آمده، همبستگی منفی بیان ژن ADRB3 را با نتیجه بیماران NB نشان می‌دهند و نقش 3-AR را به‌عنوان یک بازیکن مولکولی که قادر به کاهش پاسخ‌های ایمنی ضد توموری با تأثیرگذاری بر چندین ایست بازرسی ایمنی است، تأیید و تقویت می‌کند. مسیرهای سیگنالینگ

بحث

از آنجایی که منشاء عصبی عجیب و غریب آن است، سطوح بالای متابولیت های کاتکول آمین شرایط تومور NB را مشخص می کند [7، 33]. در کار قبلی، ما حدس زدیم که انتشار کاتکول آمین در TME ممکن است سلول‌های سرطانی را از طریق فعال‌سازی -ARs مورد هدف قرار دهد و باعث ایجاد یک حلقه پیش‌خور رشد و بدخیمی در سرطان NB شود. در واقع، داده‌های تجربی نشان داد که 3-AR بر روی رده‌های سلولی مختلف تومور NB و بیوپسی‌های بیماران بیان می‌شود و مدولاسیون آن به طور قابل‌توجهی بر رشد تومور در یک مدل موش هم‌زاد NB تأثیر می‌گذارد [12]. علاوه بر بیان -ARs در سلول‌های تومور، به طور گسترده شناخته شده است که -ARs روی سطح اکثر سلول‌ها در TME، از جمله سلول‌های ایمنی قرار دارند، و بستن کاتکول آمین‌ها به -ARs در سلول‌های ایمنی، ایمنی ذاتی و تطبیقی ​​را تنظیم می‌کند. [34]. توجه داشته باشید، در حالی که تحت شرایط فیزیولوژیکی، مدولاسیون سیستم ایمنی توسط سیگنال دهی آدرنرژیک باعث ارتقای پاسخ ایمنی طبیعی می شود، در فرآیندهای تغییر یافته، تحریک طولانی مدت SNS/کاتکولامین ها/-ARs ممکن است اثرات مضری بر سلول های مختلف ایمنی از جمله لنفوسیت ها داشته باشد [35، 36]. ]. در این شرایط تغییر یافته، تحریک مداوم سیگنال‌های آدرنرژیک، فرآیندهای پاتولوژیک و از جمله پیشرفت سرطان را ارتقا می‌دهد [37]. با شروع از مشاهدات فوق الذکر، مطالعه ما قصد دارد بررسی کند که آیا اثرات ضد توموری ناشی از تضاد AR در تومورهای NB تا حدی می تواند به تقویت مجدد ایمنی ضد تومور متکی باشد و اینکه آیا این می تواند شامل شود یا خیر. مدولاسیون مسیرهای سیگنال دهی نقاط بازرسی ایمنی مطالعات پیش بالینی نشان می دهد که بیان PD-L1 در NB متاستاتیک یک مکانیسم حیاتی برای محدود کردن نظارت ایمنی [15] نشان می دهد، و ایمونوتراپی ترکیبی با آنتی بادی های ضد PD-L1/PD{24}} و ضد CD4، NB منتشر شده سیژنیک را درمان می کند. 38]. اخیراً، بیان PD-L1 در چندین تومور اطفال مورد ارزیابی قرار گرفت و بالاتر از همه، رنگ آمیزی PD-L1 با بقای پایین در بیماران مبتلا به NB مرتبط بود [16، 39]. علاوه بر این، نشان داده شد که تومورهای مثبت PD-L در غده فوق کلیوی بیشتر از تومورهای منفی PD-L قرار دارند و متابولیت‌های کاتکولامین (NSE، VMA، و HVA) تمایل دارند در گروه PD-L{39}مثبت بیشتر از گروه PD-L{41}}منفی [16] است.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

این شواهد توانایی محور سیگنالینگ PD-1/PD-L1 را برای کنترل فرار ایمنی تومور در NB اولیه و متاستاتیک نشان می‌دهد، اما مکانیسم‌های دقیق زیربنای PD-1/PD- را بررسی نکردند. تنظیم سیگنالینگ L1 برای بررسی اینکه آیا مدولاسیون 3-AR می‌تواند بر بیان PD-L1 در NB، و متعاقب آن واکنش ایمنی در TME تأثیر بگذارد، ما موش‌های A/J تلقیح شده با سلول‌های N2A NB را با 3- درمان کردیم. آنتاگونیست AR SR59230A، یک آنتی بادی مونوکلونال PD-L1 (PD-L1)، یا ترکیبی از آنها. اول، ما مشاهده کردیم که 3-تضاد AR قادر به کاهش رشد تومور NB و به طور همزمان بیان PD-L1 در TME موش‌های حامل NB بود. فلوسایتومتری نشان داد که میزان کاهش PD-L1 مشاهده شده در توده تومور موش های تحت درمان با SR59230A عمدتاً بیانگر کاهش بیان سلول های تومور است. در مقابل، بیان PD-L1 در DCها و ماکروفاژها تنظیم مثبت شد. چندین شواهد علمی به PD-L1 اختصاص داده شده است که هم روی سلول های تومور و هم بر روی APCها قرار دارد و ظرفیت آن را کاهش می دهد که فعال سازی سلول های T را کاهش می دهد و تا حدی مانع از واکنش ایمنی موثر علیه تومور می شود [40]. با این حال، مطالعات اخیر نشان داده است که در طول جذب آنتی ژن و ارائه متقابل آنتی ژن‌های تومور به سلول‌های T، یک گام مهم در ایمنی تطبیقی، DCs و ماکروفاژها PD-L1 را تنظیم می‌کنند و بنابراین فعال‌سازی بیش از حد سلول‌های T را محدود می‌کنند و از آنها در برابر فعالیت‌های سیتوتوکسیک محافظت می‌کنند. سلول های T [41، 42]. بنابراین، ما فرض کردیم که کاهش بیان PD-L1 روی سلول‌های تومور و افزایش همزمان آن بر روی APCها در توده تومور تحت درمان با SR59230A احتمالاً منعکس‌کننده تقویت مجدد سیستم ایمنی در TME است. نتایج افزایش تعداد سلول‌های واکنش‌دهنده ایمنی (NK، DCs و CD{40}}) و کاهش سلول‌های سرکوب‌کننده ایمنی نفوذگر تومور (Treg و MDSC) را تأیید کرد. تجزیه و تحلیل بیان نقطه بازرسی ایمنی PD-1 در TILها افزایش قابل توجهی تعداد سلولهای PD-1+CD4+ و PD{{46}CD8+ T در TDLNها را نشان داد. مرحله اولیه توسعه تومور (T2)، و PD-1+CD8+ در تومور پس از 8 روز (T8) SR59230A، PD-L1، یا درمان ترکیبی آنها در مقایسه با شاهد. همچنین روند افزایشی در تعداد سلول‌های CD{56}} T رنگ‌آمیزی شده برای TIM3 یا LAG3 در تومورهای SR59230A، درمان‌های PD-L1 و ترکیب آنها مشاهده شد، اما آنها نتوانستند به معنی‌داری آماری برسند. برای سلول‌های CD{62}} T رنگ‌آمیزی شده برای TIM3 یا LAG3، در عوض تنوع زیادی مشاهده کردیم. در حالی که برخی از داده‌های ادبیات نشان می‌دهند که سلول‌های T بیان‌کننده PD-1، LAG-3 و TIM{67}} خسته و ناکارآمد هستند [43-45]، دیگران نشان دادند که این نقاط بازرسی ایمنی، به‌ویژه PD {70}}، همچنین به دنبال فعال‌سازی و تمایز سلول‌های T موثر تنظیم می‌شوند [46-48]، و بنابراین بیان به خودی خود نشان دهنده وضعیت خسته نیست، بلکه این نشانگرها مجموعه اتولوگ واکنش‌دهنده تومور را شناسایی می‌کنند که به تومورهای مختلف نفوذ می‌کند [46- 49]. در توافق، تحقیقات عمیق تر در مدل تومور ما تأیید کرد که 3-آنتاگونیسم AR، به عنوان درمان با ضد PD-L1 mAb، عملکرد سیتوتوکسیک CD را تحریک می کند{80}}، همانطور که با افزایش تعداد PD نشان داده شده است. سلول‌های 1+CD8+ رنگ‌آمیزی شده برای پرفورین یا گرانزیم B، تأیید می‌کند که PD1+ TIL‌های موجود در توده تومور از نظر عملکردی فعال هستند. نشان داده شده است که انفیلتراسیون بالای سلول‌های T سیتوتوکسیک CD{84} در تومور با پیش آگهی مثبت در بیماران مبتلا به سرطان‌های مختلف از جمله ملانوم، سر و گردن، پستان، کولورکتال، تخمدان، پروستات و سایر سرطان‌ها ارتباط دارد [50]. در NB، یک مطالعه اخیر نشان داد که تومورهای غنی شده در سلول های T نفوذ کننده تومور، نتایج بالینی بهتری دارند، مستقل از سایر شاخص های فعلی که برای مرحله بندی تومور اتخاذ شده اند [51]. علاوه بر این، یافته‌های اخیر نشان داد که حضور سلول‌های DC و NK در توده تومور با نفوذ سلول‌های T و پیامد بالینی مثبت بیماران NB همبستگی مثبت دارد [52]. همه این شواهد بالینی با نتایج بالینی ما مطابقت دارند، که در آن یک TME غنی شده از سلول‌های T NK، DC، و CD{89}}، مشاهده شده به دنبال تضاد AR یا تجویز PD-L1، از نظر عملکردی قادر به انجام کنترل رشد تومور NB یکی از جنبه های اساسی چالش سیستم ایمنی میزبان در برابر تومورها، آزادسازی سیتوکین های مختلف در TME است که می تواند فعالیت های ضد تومور را حفظ یا محو کند. اندازه‌گیری سیتوکین‌ها در تومور، در موش‌های تحت درمان با SR59230A و PD-L تأیید شد، وضعیتی که به سمت TME واکنش‌دهنده ایمنی تغییر کرد. با این حال، در حالی که در بین سایتوکاین‌های ضد تومور، سطوح TNF- و IL{101}} هر دو افزایش یافتند، سطح IFN- در توده تومور موش‌های تحت درمان با آنتاگونیست AR کاهش یافت. با شروع از این مشاهدات، ما فرض کردیم که مدولاسیون 3-سیگنال AR در سلول‌های T نفوذکننده تومور، به ویژه در CD{107}} و CD{108}}، می‌تواند مسئول تغییر IFN باشد. ترشح، که به نوبه خود بر بیان PD-L1 در سلول های تومور تأثیر می گذارد. نتایج فرضیه ما را تایید کرد. تضاد انتخابی 3-AR در TILها، در واقع، این سلول‌ها را در القای بیان PD-L1 در سلول‌های تومور NB به دلیل ترشح تغییر یافته IFN- ناکارآمد نشان می‌دهد و عملاً از ایجاد یک مقاومت ایمنی تطبیقی ​​جلوگیری می‌کند. در TME، IFN- پاسخ‌های ایمنی ضد تومور و ضد تومور را تنظیم می‌کند و به عنوان یک سیتوکین سیتوتوکسیک همراه با گرانزیم B و پرفورین برای ضربه زدن به سلول‌های تومور عمل می‌کند، اما همچنین باعث سنتز نقاط بازرسی ایمنی مهاری می‌شود و در نتیجه مکانیسم‌های سرکوب‌کننده ایمنی را تحریک می‌کند [53]. این نقش دووجهی IFN- در ایجاد اثرات متضاد وابسته به مکانیسم های پیچیده ای است که هنوز به طور کامل شناخته نشده اند، با این حال، به نظر می رسد مقدار IFN- ترشح شده در تعریف اعمال این سیتوکین تعیین کننده باشد [54]. بر این اساس، ما فرض می‌کنیم که در مدل ما، میزان کاهش IFN که توسط 3- تضاد AR بر روی TILها ایجاد می‌شود، در مقایسه با شرایط کنترل، که در آن قرار گرفتن در معرض مزمن با IFN مکانیسم‌های سرکوب‌کننده‌ی سیستم ایمنی بیشتری ایجاد می‌کند، به نفع پاسخ‌های ایمنی است. در میان زیرگروه‌های -AR، 2-به‌نظر می‌رسد AR بیش از همه در سطح انواع سلول‌های ایمنی بیان می‌شود. با این حال، باید توجه داشت که 3-AR، آخرین عضو شناسایی شده از -ARs، کمترین مطالعه را تا به امروز انجام داده است. بنابراین، برای تأیید اینکه تجویز SR59230A اثرات خود را عمدتاً زیرگروه 3-AR را مسدود می‌کند، ابتدا بیان پروتئین 3-AR را روی لنفوسیت‌های TDLN و سلول‌های T نفوذگر تومور بررسی و تأیید کردیم. ما بیان 3-پروتئین AR را در CD{136}} و CD{137}} نفوذکننده تومور، و سپس از طریق انتخابی 1-، 2- و {{ نشان دادیم. 140}}خاموش کردن ARها، ما نقش برجسته 3-زیرگروه AR را که روی لنفوسیت‌ها قرار دارد، در کنترل بیان وابسته به IFN{142}}در سلول‌های تومور NB تأیید کردیم. توجه داشته باشید، داده‌های گسترده روی بافت‌ها و مدل‌های سلولی مختلف نشان داده‌اند که در حالی که 1- و 2-ARs هر دو بیشتر مستعد پدیده حساسیت‌زدایی همولوگ به دنبال قرار گرفتن طولانی‌مدت در معرض کاتکول آمین‌های درون زا هستند، {{147} نشان داده شد که زیرگروه AR نیست، و زمانی که، با این وجود، در برخی سلول‌ها، حساسیت زدایی ARها اتفاق افتاد، در مقایسه با 1- و 2-ARs [ 55]. سپس حدس می‌زنیم که در تومور NB، وضعیتی که با قرار گرفتن در معرض مزمن با کاتکول آمین‌ها مشخص می‌شود، زیرگروه AR در TILها، که بیشتر از نظر فیزیولوژیکی بیان می‌شود، ممکن است پس از حساسیت‌زدایی تحت تنظیم کاهشی قرار گیرد، و برعکس، 3-AR به دست می‌آورد. نقش اساسی در میانجی‌گری اثرات پیش‌توموری ناشی از کاتکولامین برای بررسی تمایلات پروتومورال بیان 3- AR در انسان، ما در نهایت تجزیه و تحلیل ژنتیکی را روی 649 بیمار NB با استفاده از دسترسی آزاد R2 انجام دادیم: پلتفرم تجزیه و تحلیل ژنومیک و تجسم. بیان ژن ADRB3 بالا با بدترین نتیجه بالینی (بقای کلی و بدون رویداد) بیماران NB در مقایسه با بیان کمتر مرتبط است. علاوه بر این، همبستگی مثبت ژن ADRB3 با نقاط بازرسی مختلف سرکوب کننده سیستم ایمنی مانند CD80، CTLA4، و B{165}}H3 (CD276)، و همبستگی منفی با نقاط بازرسی فعال کننده سیستم ایمنی مانند CD266، CD40LG و {{171} BBL نقش منفی 3-AR را در تنظیم پیچیده واکنش ایمنی در NB تأیید کرد. به طور خاص، همبستگی مثبت بیان ژن ADRB3 با نقاط بازرسی سرکوب کننده سیستم ایمنی، مانند CD276، یک مولکول مرتبط با NB که در گونه های NB بدون پاسخ یافت می شود، که نقش محافظتی از لیز با واسطه سلول های NK را اعمال می کند [56، 57]. یا با CTLA4، که نشان داده شد مهار آن در افزایش کشتن سلول‌های T ضد توموری در NB [58] غیر زائد است، توانایی سیگنال‌دهی 3-AR را برای حفظ مکانیسم‌های مختلف که به نفع فرار ایمنی تومور است، برجسته کرد. ما می‌توانیم حدس بزنیم که همبستگی بین بیان ژن ADRB3 بالا و افزایش بیان نقاط بازرسی ایمنی مختلف می‌تواند بر توانایی 3-AR برای حفظ مکانیسم‌هایی تکیه کند که فعال‌سازی بیش از حد آنها شروع مقاومت به تومور را افزایش می‌دهد، مانند قرار گرفتن در معرض مزمن با برخی افراد حرفه‌ای. -سیتوکین های التهابی مطالعات اولیه بازداری ایست بازرسی در NB همیشه موفقیت آمیز نبوده است. به طور خاص، هم در مدل‌های مطالعه پیش بالینی و هم در انسان، پاسخ‌های بهتری که در استراتژی‌های درمانی با اتخاذ چندین ICI به دست می‌آید، نشان می‌دهد که هدف قرار دادن نقاط بازرسی ایمنی مختلف، یک رویکرد ضد تومور موثر غیر اضافی در NB را نشان می‌دهد [58، 59]. سپس، هدف قرار دادن مسیرهای مختلف سرکوب کننده ایمنی می تواند بهترین گزینه درمانی برای جلوگیری از مقاومت تومور در درمان تک هدفمند باشد. با این حال، تجویز چندین دارو به دلیل عوارض جانبی و سمیت زیاد، همیشه مشکل ساز است و همیشه به نتایج مطلوبی منجر نشده است. بنابراین، دانش عمیق تر از مکانیسم های مولکولی درگیر در تنظیم شبکه پیچیده همتای ایمنی TME برای توسعه رویکردهای جدید ایمنی-انکولوژی مورد نیاز است. در این زمینه، نتایج ارائه‌شده نشان می‌دهد که هدف قرار دادن 3-AR در NB TME می‌تواند نشان‌دهنده یک رویکرد احتمالی برای ضربه زدن به مسیرهای سیگنالینگ غیر زائد پروتومورال باشد. به طور خاص، با تأثیر گذاشتن بر سیستم ایمنی میزبان، از طریق حذف سد ناشی از همکاری نقاط بازرسی ایمنی، و مسیرهای حامی بقای سلول های تومور، تضاد 3-AR ممکن است یک استراتژی امیدوارکننده با، امیدواریم، درمانی باشد. پتانسیل برای بیماران مبتلا به بدخیمی های NB. هنوز مطالعات بیشتری برای تعمیق مکانیسم‌های زیربنای تعامل پیچیده بین سیستم ایمنی میزبان و همتای تومور در NB مورد نیاز است. با این وجود، با توجه به آنچه مشاهده کردیم، مطالعه سیگنال دهی آدرنرژیک در TME تومورهای NB باید مورد توجه قرار گیرد.

شکل 6 آنالیزهای رونویسی توده تومور NB نقش برجسته 3-AR را در تأثیرگذاری بر فرآیندهای مرتبط با ایمنی تأیید می‌کند.

شکل 7 تجزیه و تحلیل بقای Kaplan-Meier و نقاط بازرسی ایمنی همبستگی با بیان ژن ADRB3 در بیماران NB.

منابع

1. Cheung NK، Dyer MA. نوروبلاستوما: بیولوژی رشد، ژنومیک سرطان و ایمونوتراپی. Nat Rev سرطان. 2013؛ 13:397-411.

2. Matthay KK، Maris JM، Gudrun S، Nakagawara A، Mackal CL، Diller L، و همکاران. نوروبلاستوما. Nat Rev Dis Prim. 2016؛ 2:16078.

3. Darvin P، Toor SM، Nair SN، Elkord E. مهارکننده های ایست بازرسی ایمنی: پیشرفت اخیر و نشانگرهای زیستی بالقوه. Exp Mol Med. 2018؛ 50:1–11.

4. عفو DM. محاصره نقاط بازرسی ایمنی در ایمونوتراپی سرطان Nat Rev سرطان. 2012؛ 12:252-64.

5. Zou W، Wolchok JD، Chen L. PD-L1 (B7-H1) و مسدود کردن مسیر PD-1 برای درمان سرطان: مکانیسم‌ها، نشانگرهای زیستی پاسخ، و ترکیبات. Sci Transl Med. 2016؛ 8:328rv4.

6. Cole SW، Sood AK. مسیرهای مولکولی: سیگنالینگ بتا آدرنرژیک در سرطان. Clin Cancer Res. 2012؛ 18:1201-6.

7. Strenger V، Kerlb R، Dornbusch HJ، Ladenstein R، Ambros PF، Ambros IM، و همکاران. تاثیر تشخیصی و پیش آگهی کاتکول آمین های ادراری در بیماران نوروبلاستوما. سرطان خون کودکان. 2007؛ 48:504-9.

8. هوانگ XE، Hamajima N، Saito T، Matsuo K، Mizutani M، Iwata H، و همکاران. ارتباط احتمالی پلی‌مورفیسم‌های ژن گیرنده‌های آدرنرژیک بتا2- و بتا3- با استعداد ابتلا به سرطان پستان. سرطان سینه Res. 2001؛ 3: 264-9.

9. Babol K, Przybylowska K, Lukaszek M, Pertynski T, Blasiak J. ارتباط بین پلی مورفیسم Trp64Arg در ژن گیرنده بتا3-و سرطان آندومتر و چاقی. J Exp Clin Cancer Res. 2004؛ 23:669-74.

10. Perrone MG، Notarnicola M، Caruso MG، Tutino V، Scilimati A. دگرگونی mRNA گیرنده آدرنرژیک بتا در سرطان روده بزرگ انسان: یک مطالعه مقدماتی. انکولوژی. 2008؛ 75:224-9.

11. Magnon C، هال SJ، Lin J، Xue X، Gerber L، Freedland SJ، و همکاران. رشد عصب اتونومیک به پیشرفت سرطان پروستات کمک می کند. علوم پایه. 2013؛ 341:1236361.

12. برونو جی، سنتتی اف، پینی آ، توندو آ، کوزوبو دی، فونتانا اف، و همکاران. بلوک گیرنده آدرنرژیک بتا رشد تومور را کاهش می دهد و تمایز نورونی را در نوروبلاستوما از طریق مدولاسیون SK2/S1P2 افزایش می دهد. انکوژن. 2020؛ 39:368-84.

13. Calvani M، Bruno G، Dal Monte M، Nassini R، Fontana F، Casini A، و همکاران. گیرنده آدرنرژیک بتا به عنوان یک عامل بالقوه سرکوبگر ایمنی در ملانوم. Br J Pharm. 2019؛ 176:2509–24.

14. دال مونته ام، کازینی جی، فیلیپی ال، نیکیا ام جی، اسولتو ام، باگنولی پی. دخالت عملکردی گیرنده‌های بتا{1}}آدرنرژیک در رشد ملانوما و عروق. جی مول مد. 2013؛ 91: 1407-19.

15. Dondero A، Pastorino F، Della Chiesa M، Corrias MV، Morandi F، Pistoia V، و همکاران. بیان PDL1 در نوروبلاستوم متاستاتیک به عنوان یک مکانیسم اضافی برای محدود کردن نظارت ایمنی انکوایمونولوژی. 2016؛ 5: e1064578.

16. Zuo S، Sho M، Sawai T، Kanehiro H، Maeda K، Yoshida M، و همکاران. نقش بالقوه بیان PD-L1 و لنفوسیت های نفوذ کننده تومور در نوروبلاستوما. Pediatr Surg Int. 2020؛ 36:137-43.

17. Keir ME، Butte MJ، Feeman GJ، Sharpe AH. PD-1 و لیگاندهای آن در تحمل و مصونیت. Annu Rev Immunol. 2008؛ 26:677-704.

18. کوریل تی جی، وی اس، دونگ اچ، آلوارز ایکس، چنگ پی، موترام پی، و همکاران. انسداد B7-H1 ایمنی ضد توموری با واسطه سلول دندریتیک میلوئیدی را بهبود می بخشد. نات مد. 2003؛ 9:562-7.

19. وو ک، کریچک آی، چنگ ال، زو دبلیو، ولینگ تی. سرکوب سلول‌های کوپفر سلول‌های CD8+ در کارسینوم سلول‌های کبدی انسان، توسط فعل و انفعالات B7-H1/مرگ برنامه‌ریزی‌شده-1 انجام می‌شود. سرطان Res. 2009؛ 69: 8067-75.

20. Kuang DM، Zhao Q، Peng C، Xu J، Zhang JP، Wu C، و همکاران. مونوسیت‌های فعال در استرومای اطراف تومور کارسینوم کبدی، امتیاز ایمنی و پیشرفت بیماری را از طریق PD-L1 تقویت می‌کنند. J Exp Med. 2009؛ 206: 1327-37.

21. Rotte A, Jin JY, Lemaire V. بررسی اجمالی مکانیکی نقاط بازرسی ایمنی برای حمایت از طراحی منطقی ترکیبات آنها در ایمونوتراپی سرطان. ان اونکول. 2018؛ 29:71-83.

22. Dammeijer F, van Gulijk M, Mulder EE, Lukkes M, Klaase L, van den Bosch T, et al. نقطه بازرسی PD-1/PD-L1 ایمنی سلول های T را در غدد لنفاوی تخلیه کننده تومور مهار می کند. سلول سرطانی 2020؛ 38:685-700. e8.

23. Cha JH، Chan LC، Li CW، Hsu JL، Hung MC. مکانیسم های کنترل بیان PD-L1 در سرطان سلول مول. 2019؛ 76:359–70.

24. Burke JD، Young HA. IFN-: یک سیتوکین در زمان مناسب، در مکان مناسب است. سمین ایمونول. 2019؛ 43:101280.

25. Schena G، Caplan MJ. همه چیزهایی که همیشه می خواستید درباره 3-AR* بدانید (* اما از پرسیدن می ترسیدید). سلول ها. 2019؛ 8:357.

26. Liu Y، Guo YL، Zhou SJ، Liu F، Du FJ، Zheng XJ، و همکاران. CREB یک تنظیم کننده رونویسی مثبت گاما اینترفرون در عفونت های سل نهفته اما نه فعال است. کلین و واکسن ایمونول. 2010؛ 17:1377-80.

27. Samten B، Townsend JC، Weis SE، Bhoumik A، Klucar P، Shams H، و همکاران. فاکتورهای رونویسی CREB، ATF و AP{1}} ترشح گاما IFN توسط سلول های T انسانی را در پاسخ به آنتی ژن مایکوباکتریایی تنظیم می کنند. جی ایمونول. 2008؛ 181: 2056-64.

28. Matloubian M، Lo CG، Cinamon G، Lesneski MJ، Xu Y، Brinkmann V، و همکاران. خروج لنفوسیت ها از تیموس و اندام های لنفاوی محیطی وابسته به گیرنده S1P 1 است. طبیعت. 2004؛ 427:355-60.

29. Li MH, Hla T, Ferrer F. FTY720 رشد تومور را مهار می کند و اثر سرکوب کننده تومور توپوتکان در نوروبلاستوما را با تداخل در مسیر سیگنالینگ اسفنگولیپید افزایش می دهد. سرطان خون کودکان. 2013؛ 60: 1418-23.

30. Chisholm KM، Chang KW، Truong MT، Kwok S، West RB، Heerema-McKenney AE. بیان گیرنده بتا آدرنرژیک در تومورهای عروقی Mod Pathol. 2012؛ 25: 1446-51.

31. Montoya A، Amaya CN، Belmont A، Diab N، Trevino R، Villanueva G، و همکاران. استفاده از بتابلوکرهای غیرانتخابی با کاهش شاخص های تکثیر تومور در سرطان پستان در مراحل اولیه همراه است. انکوتارگت. 2017؛ 8:6446-60.

32. Rains SL، Amaya CN، Bryan BA. گیرنده های بتا آدرنرژیک در سرطان های مختلف بیان می شوند. علم سرطان. 2017؛ 4:95-105.

33. Verly IR، van Kuilenburg ABP، Abeling NGGM، Goorden SMI، Fiocco M، Vaz FM، و همکاران. پروفایل های کاتکولامین ها در هنگام تشخیص: افزایش حساسیت تشخیصی و ارتباط با ویژگی های بیولوژیکی و بالینی در بیماران نوروبلاستوما. Eur J سرطان. 2017؛ 72:235-43.

34. Eng JWL، Kokolus KM، Reed CB، Hylander BL، MA WW، Repasky، و همکاران. ریزمحیط تومور عصبی: تأثیر استرس آدرنرژیک بر سلول های سرطانی، سرکوب سیستم ایمنی و پاسخ ایمنی درمانی. سرطان ایمونول ایمونوتر. 2014؛ 63: 1115-28.

35. Dhabhar FS, McEwen BS. استرس حاد افزایش می یابد در حالی که استرس مزمن ایمنی سلولی را در داخل بدن سرکوب می کند: یک نقش بالقوه برای قاچاق لکوسیت. Brain Behav Immun. 1997؛ 11:286-306.

36. ذبهار اف اس. تقویت عملکرد سیستم ایمنی ناشی از استرس - نقش هورمون های استرس، قاچاق لکوسیت ها و سیتوکین ها. Brain Behav Immun. 2002؛ 16:785-98.

37. Qiao G، Chen M، Bucsek MJ، Repasky EA، Hylander BL. سیگنالینگ آدرنرژیک: یک ایست بازرسی قابل هدف که توسعه پاسخ ایمنی ضد تومور را محدود می کند. جلو ایمونول. 2018؛ 9:164.

38. Rigo V، Emionite L، Daga A، Astigiano S، Corrias MV، Quintarelli C، و همکاران. ایمونوتراپی ترکیبی با آنتی‌بادی‌های ضد PDL-1/PD-1 و ضد CD4 نوروبلاستوم منتشر شده سیژنیک را درمان می‌کند. Sci Rep. 2017; 7:14049.

39. Majzner RG، Simon JS، Grosso JF، Martinez D، Pawel BR، Santi M، و همکاران. ارزیابی بیان لیگاند مرگ برنامه ریزی شده 1 و سلول های ایمنی مرتبط با تومور در بافت های سرطانی کودکان سرطان. 2017؛ 123:3807-15.

40. Gibbons Johnson RM, Dong H. بیان عملکردی لیگاند مرگ برنامه ریزی شده 1 (B7-H1) توسط سلول های ایمنی و سلول های تومور. جلو ایمونول. 2017؛ 8:961.

41. Peng Q، Qiu X، Zhang Z، Zhang S، Zhang Y، Liang Y، و همکاران. PD-L1 روی سلول‌های دندریتیک، فعال‌سازی سلول‌های T را کاهش می‌دهد و پاسخ به محاصره ایست بازرسی ایمنی را تنظیم می‌کند. Nat Commun. 2020؛ 11:4835.

42. Singhal S, Stadanlick J, Annunziata MJ, Rao AS, Bhojnagarwala PS, O'Brien S, et al. مونوسیت ها / ماکروفاژهای مرتبط با تومور انسانی و تنظیم پاسخ سلول های T در سرطان ریه در مراحل اولیه Sci Transl Med. 2019؛ 11: eaat1500.

43. Blackburn SD، Shin H، Haining WN، Zou T، Workman CJ، Polley A، و همکاران. همبستگی فرسودگی سلول های CD{1}} توسط گیرنده های بازدارنده متعدد در طول عفونت مزمن ویروسی. نات ایمونول. 2009؛ 10:29-37.

44. Jin HT، Anderson AC، Tan WG، West EE، Ha SJ، Araki K، و همکاران. همکاری Tim-3 و PD-1 در فرسودگی سلول T CD8 در طول عفونت مزمن ویروسی. Proc Natl Acad Sci USA. 2010؛ 107:14733-8.

45. Sakuishi K، Apetoh L، Sullivan JM، Blazar BR، Kuchroo VK، Anderson AC. هدف قرار دادن مسیرهای Tim-3 و PD-1 برای معکوس کردن خستگی سلول T و بازیابی ایمنی ضد تومور. J Exp Med. 2010؛ 207:2187-94.

46. ​​آگاتا Y، کاوازاکی A، نیشیمورا H، Ishida Y، Tsubata T، Yagita H، و همکاران. بیان آنتی ژن PD{1}} روی سطح لنفوسیت های T و B تحریک شده موش. Int Immunol. 1996؛ 8:765-72.

47. Vibhakar R، Juan G، Traganos F، Darzynkiewicz Z، Finger LR. بیان ژن مرگ برنامه‌ریزی‌شده انسانی{2}} ناشی از فعال‌سازی در لنفوسیت‌های T. Exp Cell Res. 1997؛ 232:25-8.

48. Freeman GJ، Long AJ، Iwai Y، Bourque K، Chernova T، Nishimura H، و همکاران. درگیر شدن گیرنده مهارکننده ایمنی PD توسط یکی از اعضای جدید خانواده B7 منجر به تنظیم منفی فعال شدن لنفوسیت می شود. J Exp Med. 2000؛ 192:1027-34.

49. Gros A, Robbins PF, Yao X, Li YF, Turcotte S, Tran E, et al. PD{1}} مجموعه CD8(+) ویژه بیمار را شناسایی می کند که به تومورهای انسانی نفوذ می کند. جی کلین سرمایه گذاری. 2014؛ 124:2246-59.

50. Galon J، Costes A، Sanchez-Cabo F، Kirilovsky A، Mlecnik B، Lagorce-Pagès C، و همکاران. نوع، تراکم و محل سلول های ایمنی در تومورهای کولورکتال انسان، نتایج بالینی را پیش بینی می کند. علوم پایه. 2006؛ 313: 1960-4.

51. Mina M, Boldrini R, Citti A, Romania P, D'Alicandro V, De Ioris M, et al. لنفوسیت های T نفوذ کننده به تومور، نتایج بالینی نوروبلاستوما مقاوم به درمان را بهبود می بخشد. انکوایمونولوژی. 2015؛ 4: e1019981.

52. Melaiu O, Chierici M, Lucarini V, Jurman G, Conti LA, De Vito R, et al. امضای سلولی و ژنی سلول های دندریتیک نفوذ کننده تومور و سلول های کشنده طبیعی پیش آگهی نوروبلاستوما را پیش بینی می کند. Nat Commun. 2020؛ 11:5992.

53. Jorgovanovic D، Song M، Wang L، Zhang Y. نقش IFN-گاما در پیشرفت و رگرسیون تومور: یک بررسی. Biomark Res. 2020؛ 8:49.

54. ژانگ جی. یین و یانگ تداخل IFN-گاما در التهاب و بیماری خودایمنی. جی کلین سرمایه گذاری. 2007؛ 117:871-3.

55. Okeke K، Angers S، Bouvier M، Michel MC. حساسیت زدایی گیرنده های آدرنرژیک بتا3 - ناشی از آگونیست: کجا، چه زمانی و چگونه؟ Br J Pharm. 2019؛ 176: 2539–58.

56. Castriconi R، Dondero A، Augugliaro R، Cantoni C، Carnemolla B، Sementa AR، و همکاران. شناسایی 4Ig-B7-H3 به‌عنوان یک مولکول مرتبط با نوروبلاستوما که نقش محافظتی از لیز با واسطه سلول NK ایفا می‌کند. Proc Natl Acad Sci USA. 2004؛ 101: 12640-5.