حذف پنج آمینو اسید در NKCC2 موش C57BL/6 بر تجزیه و تحلیل فسفوریلاسیون NKCC2 تأثیر می گذارد اما بر عملکرد کلیه تأثیر نمی گذارد

edmund.chen@wecistanche.com

مقدمه

اندام بالارونده ضخیم (TAL) پستاندارانکلیهبرای کنترل حجم مایع خارج سلولی، غلظت ادراری، کلسیم (Ca 2 به علاوه) و منیزیم (Mg 2 به علاوه) هموستاز، و همچنین تعادل pH بسیار مهم است. مسیر اصلی انتقال Na به علاوه در TAL ناقل Na + K + - 2Cl- (NKCC2) است که به طور خاص توسط لوپ-دیورتیک ها مهار می شود. انتقال همزمان یون‌های Na +، K + و 2Cl- از طریق NKCC2 الکتروخنثی است اما به ترشح الکتروژنی K به علاوه از طریق آپیکال بستگی دارد. کلیهکانال بیرونی K plus کانال ROMK. اثر متقابل NKCC2 با ROMK یک گرادیان الکتروشیمیایی مثبت لومن ایجاد می‌کند که بازجذب سدیم به علاوه را افزایش می‌دهد و حمل‌ونقل پاراسلولی Ca2+ و Mg2+ را هدایت می‌کند. 3 اهمیت NKCC2 برای TAL وعملکرد کلیهنشانگان بارتر نوع I، یک اختلال ژنتیکی ناشی از جهش‌های از دست دادن عملکرد در NKCC2 است که با شدید تظاهر می‌کند.کلیههدر رفتن نمک و مایعات، آلکالوز متابولیک هیپوکالمیک و هیپرکلسیوری. 3

NKCC2 عضوی از خانواده حامل املاح 12 (Slc12) از پروتئین‌های انتقال غشایی است که همچنین شامل NKCC1 بیان شده در همه جا و توبول پیچیده دیستال (DCT) اختصاصی Na plus - Cl- cotransporter (NCC) است. فعالیت NKCC2 به طور مثبت با فسفوریلاسیون هم‌ترانسپورتر در چندین باقیمانده سرین و ترئونین در دم انتهایی N سیتوپلاسمی ارتباط دارد. 4 توالی اسیدهای آمینه اطراف این مکان های فسفوریلاسیون به شدت حفظ شده اند و درجه بالایی از شباهت را بین NKCC2، NKCC1 و NCC نشان می دهند. 2 فسفوریلاسیون NKCC2 توسط چندین مسیر هورمونی و غیر هورمونی تحریک می شود. هورمون هایی مانند آرژنین وازوپرسین (AVP) و آنژیوتانسین II (ANGII) NKCC2 را از طریق افزایش تولید cAMP و فعال شدن پروتئین کیناز A (PKA) تحریک می کنند. تصور می‌شود که PKA مستقیماً NKCC2 را در Ser126 فسفریله می‌کند، که اگزوسیتوز وزیکول‌های حاوی NKCC2 و در نتیجه فراوانی ناقل در غشای پلاسمایی آپیکال را افزایش می‌دهد. 6 به همین ترتیب، تغییرات در غلظت کلرید داخل سلولی فسفوریلاسیون NKCC2 را تنظیم می کند. کاهش غلظت کلرتر سلولی، کینازهای با نولیزین (K) WNK1 و WNK4 را تحریک می کند تا فسفریله شوند و کینازهای پایین دستی Ste{27}} مرتبط با پرولین آلانین غنی کیناز (SPAK) یا کیناز 1 پاسخگو به استرس اکسیداتیو (OXSR1) را فعال کنند. ). {30}} پس از اتصال به یک موتیف "RFxV" در NKCC2، این کینازها سپس NKCC2 را در دو باقیمانده ترئونین (T96 و T101) فسفریله می کنند. 2 دفسفوریلاسیون این باقیمانده ها توسط کلسینئورین فسفاتاز انجام می شود و تأکید می کند که NKCC2 هدفی برای چندین مسیر سیگنالینگ است. 10

برای مطالعه عملکرد NKCC2، چندین گروه از جمله گروه ما آنتی بادی های اختصاصی فسفوفرم را علیه Thr96 و/یا Thr101 تولید کردند. 11- 17 آنتی‌بادی‌ها برای ارزیابی فسفوریلاسیون NKCC2 در سیستم‌های بیان هترولوگ 7،11،17،18،19،20 و مدل‌های حیوانی شامل موش‌های 10،21،22،23،24،25 و موش‌ها استفاده شد. 14،15،16،17،19،26،27 با این حال، هنگام استفاده از آنتی بادی pT96/101 NKCC2، نتایج متناقضی در مدل های مختلف موش به دست آوردیم. در حالی که سیگنال‌های قوی pNKCC2 را در کلیه‌ها از موش‌ها در پس‌زمینه ژنتیکی 129Sv شناسایی کردیم، سیگنال‌های pNKCC2 قابل اعتمادی را در کلیه‌ها از موش‌های C57BL/6 دریافت نکردیم، اما واکنش متقابل آنتی‌بادی‌های pNKCC2 را با pNCC مشاهده کردیم. آزمایشگاه‌های دیگر، از جمله آزمایشگاه‌های JA McCormick و AA McDonough (ارتباط شخصی) مشاهدات مشابهی انجام دادند. 18،28،29 علاوه بر این، تفاوت‌های سویه‌ای چشمگیر در موش‌ها برایکلیهتابع 30 شامل کاهش قابل توجهی Ca2 ادرار به علاوه دفع در C57BL/6 در مقایسه با موش 129Sv. بنابراین، ما فرض کردیم که موش‌های C57BL/6 یک نوع ژنتیکی از NKCC2 را بیان می‌کنند که بر فسفوریلاسیون NKCC2 و احتمالاً تأثیر می‌گذارد.عملکرد کلیهکه تفاوت های کرنش مشاهده شده را توضیح می دهد. مطالعه زیر برای آزمون سیستماتیک این فرضیه طراحی شده است.

کلید واژه ها:هموستاز یون، کلیه، NKCC2، فسفوریلاسیون، تفاوت سویه

نتایج

2.1|موش های C57BL/6 دارای حذف پنج آمینو اسید در NKCC2 هستند که با تشخیص NKCC2 فسفریله تداخل می کند.ابتدا، توالی‌های اسیدهای آمینه N-ترمینال منتشر شده (شناسه‌های رونویسی در جدول S1) NKCC2 و NCC (به ترتیب شکل 1A,B) را برای چندین گونه که با اپی توپ‌های شناسایی شده توسط آنتی‌بادی‌های anti-pNCC و anti-pNKCC مطابقت دارند، تراز کردیم. (شکل 1C). هم ترازی درجه بالای حفاظت از محل های فسفوریلاسیون NKCC2 و NCC 7 را تایید کرد که احتمالاً واکنش متقابل آنتی بادی های pNKCC2 و pNCC مشاهده شده توسط ما و دیگران را توضیح می دهد. 18،28،29 جالب و مطابق با فرضیه ما، هم ترازی حذف پنج آمینو اسید تا کنون در توالی NKCC2 از موش‌های C57BL/6 (ΔF{18}} T101) را نشان داد (شکل 1A) . توالی یابی DNA از دو کلنی مختلف موش C57BL/6 نگهداری شده در آزمایشگاه جکسون در ایالات متحده یا آزمایشگاه Janvier در فرانسه، حذف نوکلئوتیدی را در اگزون 2 C57BL/6 NKCC2 تأیید کرد که مربوط به حذف اسیدهای آمینه ذکر شده در بالا است (شکل S1). ، جدول S2).

برای مشخص کردن تأثیر حذف پنج آمینو اسید در تشخیص ایمنی NKCC2 کل و فسفریله، ما به طور سیستماتیک کلیه موش‌های C57BL/6 و 129Sv را با روش ایمونوهیستوشیمی و بلات‌گیری مورد مطالعه قرار دادیم. ایمونوفلورسانس با یک آنتی بادی علیه NKCC2 کل یک سیگنال فلورسنت قوی در غشای پلاسمایی آپیکال TALهای موش 129Sv و C57BL/6 نشان داد. با این حال، آنتی بادی pT96/T101 NKCC2 که قبلاً توسعه داده شده بود، برچسب اپیکالی قوی TALها را فقط در موش‌های 129Sv نشان داد، در حالی که TAL‌های موش‌های C57BL/6 رنگ‌آمیزی بسیار ضعیفی داشتند (شکل 1D). مطابق با این، تجزیه و تحلیل وسترن بلات یک نوار قوی برای کل NKCC2 در هر دو سویه موش نشان داد، در حالی که آنتی بادی pT96/T101 NKCC2 یک نوار قوی را در اندازه مورد انتظار (170 کیلو دالتون) تنها در موش های 129Sv تشخیص داد (شکل 1E). در عوض، کلیه‌های موش‌های C57BL/6 نواری را در 130 کیلو دالتون نشان دادند که با اندازه مورد انتظار NCC مطابقت دارد (شکل 1E). نتایج مشابهی با سایر آنتی بادی هایی که قبلاً برای مطالعه فسفوریلاسیون NKCC2 استفاده شده بودند به دست آمد (شکل S2). آنتی بادی pT212/T217 NKCC1 R5 11 علاوه بر سیگنال pNCC یک سیگنال ضعیف را در اندازه مورد انتظار برای pNKCC2 نشان داد (شکل S2). باند واکنش‌پذیری برای pNKCC2 وقتی تازه بود شدیدتر شدکلیهلیزات استفاده شد. استفاده از بافر لیز با مواد شوینده (بافر RIPA) بهبود نیافت اما شدت سیگنال را کاهش داد (شکل S3).

شکل 1 آنتی بادی pT96/T101 NKCC2 سیگنال pNKCC2 قابل مشاهده را در موش های C57BL/6 تشخیص نمی دهد. الف، آمینواسیدهای NKCC2 هم ترازی توالی گونه های مختلف و دو سویه موش 129Sv و C57BL/6. شناسه های توالی NKCC2 برای گونه های مختلف در جدول S1 فهرست شده است. منطقه بسیار حفاظت شده مربوط به Thr96 موشی به Thr101 موش با خاکستری مشخص شده است. ب، هم ترازی توالی اسیدهای آمینه NCC در گونه های مختلف. شناسه های دنباله NCC برای گونه های مختلف در جدول S1 فهرست شده است. ج، فهرستی از اپی توپ‌های آنتی‌بادی‌های رایج و منتشر شده که pT53 یا pT58NCC را شناسایی می‌کنند، و همچنین pNKCC2 در مکان حفاظت‌شده در اطراف Thr96 تا Thr101. D، ایمونوهیستوشیمی کل و pT96/T101 NKCC2 در مقاطع انجمادی متوالی موش با پس زمینه 129Sv و C57BL/6. نوار مقیاس=50 میکرومتر. E، ایمونوبلات کل و pT96/T101 NKCC2 موش با پس زمینه 129Sv و C57BL/6. مقادیر میانگین ± SEM، n=5 موش در هر گروه هستند، فلش‌های سبز به باندهای خاص اشاره می‌کنند در حالی که سر فلش‌های قرمز به باندهای غیر خاص اشاره می‌کنند. نشانگرهای وزن مولکولی گنجانده شده است. باند توتال و pT96/T101 NKCC2 در 170 کیلو دالتون انتظار می رود. F، ایمونوبلات برای کل و pT96/T101 NKCC2، کل و pT53 و pT58 NCC در موش های NCC WT و NCC ناک اوت (KO) با زمینه های مختلف. فلش های سبز به نوارهای خاص اشاره می کنند در حالی که فلش های قرمز به نوارهای غیر خاص اشاره می کنند. نشانگرهای وزن مولکولی گنجانده شده است. باندهای NCC Total و pT58 و pT53 در 130 کیلو دالتون و باندهای کل و pT96/T101 NKCC2 در 170 کیلو دالتون انتظار می‌رود.

برای آزمایش اینکه آیا آنتی بادی pT96/T101 NKCC2 ما واقعاً با NCC فسفریله در موش‌های C57BL/6 واکنش متقابل نشان می‌دهد، ما بررسی کردیم.کلیهلیزات از موش های نوع وحشی 129Sv و C57BL/6 و موش های حذفی C57BL/6 NCC با آنتی بادی علیه NKCC2 تام، pT96/T101 NKCC2، NCC کل، و NCC فسفریله (pT53 و pT58 NCC) (شکل 1F). آنتی‌بادی pT96/T101 NKCC2 و آنتی‌بادی‌ها علیه کل NCC و pNCC باندهایی را در 130- 170 کیلو دالتون در موش‌های حذفی C57BL/6 NCC شناسایی نکردند (شکل 1F). جالب توجه است که ایمونوبلات و همچنین آزمایش‌های ایمونوهیستوشیمی اضافی (شکل S4) نشان می‌دهد که نه تنها آنتی‌بادی‌های pNKCC2 با NCC در موش‌های C57BL/6 واکنش متقابل نشان می‌دهند، بلکه آنتی‌بادی‌های pNCC ما (pT53 NCC و pT58 NCC) با NKCC2 در 129 واکنش متقابل نشان می‌دهند. موش ها در غلظت های مورد استفاده

دفع کلسیم و منیزیم ادراری بین موش‌های 129Sv و C57BL/6 متفاوت است.

برای تعیین اینکه آیا حذف (F{0}} T101) در NKCC2 ممکن است با تفاوت‌های فیزیولوژیکی بین موش‌های 129Sv و C57BL/6 مرتبط باشد، مصرف آب، سطوح یون پلاسما، و مایع ادرار و دفع یون را بین دو سویه موش مقایسه کردیم. همانطور که در جدول 1 خلاصه شده است، اکثر پارامترهای ارزیابی شده بین سویه ها تفاوتی نداشتند. با این حال، موش‌های C57BL/6 نسبت به موش‌های 129Sv نسبت به موش‌های 129Sv، کلسیم ادراری پایین‌تر و منیزیم ادراری بالاتری را نشان دادند. سطوح پلاسمایی Ca 2 پلاس و Mg 2 + پلاسما برای هر دو گروه مشابه بود، که نشان می دهد موش ها در حالت ثابتی بودند که در آن تعادل هموستاتیک بازجذب روده ای، حرکت بافتی (به عنوان مثال از استخوان)، وکلیهدفع یون های Ca 2 به علاوه و Mg 2 به علاوه به دست آمد. برای آزمایش اینکه آیا میزان دفع Ca 2 به علاوه و Mg 2 به علاوه ادرار ناشی از تفاوت در جذب روده ای این یون ها است یا خیر، ما مصرف روزانه غذا، خروجی مدفوع و دفع Ca 2 پلاس و منیزیم به علاوه مدفوع را برای این دو مورد مقایسه کردیم. سویه های موش همانطور که در شکل S5 نشان داده شده است، دریافت غذا و دفع کلسیم مدفوع به علاوه دفع مدفوعی مشابه بود، اما دفع روزانه منیزیم مدفوع به علاوه در موش‌های C57BL/6 کمتر از موش‌های 129Sv بود که نشان می‌دهد موش‌های C57BL/6 دارای Mg2 روده به‌علاوه بازجذب بالاتری هستند. نسبت به موش های 129Sv. مطابق با این فرض، موش‌های C57BL/6 بیان کولونی قوی‌تری از کانال منیزیم TRPM6 داشتند (شکل S6)، و همچنین تمایل به سطوح بالاتر منیزیم پلاسما پلاسما در مقایسه با موش‌های 129Sv داشتند، اگرچه تفاوت‌ها به معنی‌دار آماری نبود. برای ارزیابی سهم احتمالی استخوان، تراکم مواد معدنی استخوان در هر دو سویه را با میکرو CT آنالیز کردیم. مشابه گزارش‌های قبلی، 32 موش C57BL/6 دارای تراکم استخوان نسبتاً پایینی بودند (شکل S7)، که ممکن است توضیح دهد که چرا این موش‌ها تمایل به حفظ یون‌های Ca2 بعلاوه از طریق کاهش یافتن دارند.کلیهCa 2 به علاوه دفع. کلیه‌های موش‌های C57BL/6 مطابق با افزایش سرعت Ca2 لوله‌ای به‌علاوه بازجذب

در مقایسه با کلیه‌های موش‌های 129Sv، کانال TRPV5 Ca2 plus بیشتری را در سطوح پروتئین بیان کرد (شکل 2). موش های C57BL/6 همچنین بیان mRNA و پروتئین NCC به طور قابل توجهی نسبت به موش های 129Sv داشتند (شکل 2A). به همین ترتیب، فراوانی پروتئین کل NKCC2، کل و NCC فسفریله و کل - ENaC در C57BL/6 نسبت به موش های 129Sv بیشتر بود (شکل 2B,C). فراوانی شکل های پروتئولیتیکی شکافته شده و از این رو فعال - و - ENaC متفاوت نبود و این نشان می دهد کهکلیهفعالیت ENaC برای هر دو سویه مشابه بود (شکل 2B,C).

هیچ مدرکی برای تغییر عملکرد اندام صعودی ضخیم در موش‌های C57BL/6 در مقایسه با موش‌های 129Sv وجود ندارد.

فراوانی بیشتر NKCC2 کل، NCC کل و NCC فسفریله در کلیه موش‌های C57BL/6 ممکن است یک پاسخ جبرانی برای کاهش فسفوریلاسیون NKCC2 باشد. برای آزمایش اینکه آیا فعالیت NKCC2 و NCC بین سویه‌های موش متفاوت است، ما به ترتیب آزمایش بومتانید و تیازید را انجام دادیم. یک تزریق منفرد بومتانید یا هیدروکلروتیازید باعث ایجاد ناتریورز قوی شد که برای بومتانید بیشتر از هیدروکلروتیازید بود. با این حال، پاسخ‌های دیورتیک در هر دو سویه کاملاً مشابه بود که نشان می‌دهد فعالیت‌های عملکردی NKCC2 و NCC بین موش‌های C57BL/6 و 129Sv تفاوتی نداشت (شکل 3A-D). ظاهراً فراوانی پروتئین و سطوح فسفوریلاسیون لزوماً با فعالیت های عملکردی مطابقت ندارد.کلیهپروتئین های انتقال یون همانطور که اخیرا توسط هانتر و همکارانش نیز اشاره شده است. برای ارزیابی بیشتر عملکرد TAL، ما یک آزمایش محدودیت آب انجام دادیم که در آن موش ها به مدت 24 ساعت به غذای خیس شده دسترسی داشتند، اما به آب لوله کشی دسترسی نداشتند. تحت این شرایط، هر دو سویه موش اسمولاریته ادرار را به مقادیر مشابه افزایش دادند (جدول 1). علاوه بر این، موش‌های C57BL/6 و موش‌های 129Sv دفع ادراری یکسانی از uromodulin (پروتئین Tamm-Horsfall) را نشان دادند (جدول 1)، که بسته به فعالیت عملکردی سلول‌های TAL تولید و در ادرار دفع می‌شود. 3

تلاقی موش های 129Sv و C57BL/6 نشان می دهد که حذف پنج آمینو اسید در NKCC2 فنوتیپ خاصی را جدا نمی کند.

داده های ارائه شده نشان می دهد که تفاوت سویه در دفع یون ادرار وکلیهفراوانی پروتئین مربوط به حذف پنج آمینو اسید در C57BL/6 NKCC2 نیست، اما مربوط به سایر تفاوت های ژنتیکی بین دو سویه موش است. برای آزمایش بیشتر، ما موش‌های 129Sv و C57BL/6 را به نسل F2 تلاقی کردیم که در آن تفاوت‌های سویه‌های ژنتیکی (از جمله موارد در NKCC2) باید به‌طور تصادفی باشد.

بین موش ها توزیع شد. سپس موش‌های F2 را که هموزیگوت بودند برای NKCC2 تمام طول (f/f)، هموزیگوت برای حذف NKCC2 (Δ/Δ) یا هتروزیگوت برای حذف NKCC2 (f/Δ) مقایسه کردیم. به استثنای الگوهای مختلف اتصال مورد انتظار آنتی بادی های اختصاصی فسفوفرم علیه NKCC2 و NCC (و تفاوت نامشخص بیان ROMK در mRNA، اما نه سطح پروتئین)، هیچ یک از تفاوت های شناسایی شده قبلی بین دو سویه در موش های f/f، Δ/Δ، یا f/Δ از نسل F2 (شکل 4 و جدول 2). به طور خاص، هیچ تفاوتی در دفع Ca 2 پلاس یا Mg 2 به اضافه ادرار و همچنین هیچ تفاوتی در سطوح Ca 2 پلاس یا Mg 2 پلاسما وجود نداشت، که نشان می دهد تفاوت سویه بین موش های 129Sv و C57BL/6 مستقل از حذف پنج آمینو اسید در NKCC2.

یک آنتی بادی جدید pT96 NKCC2 pNKCC2 را در هر دو سویه تشخیص می دهد

از آنجایی که حذف پنج آمینو اسید در NKCC2 مانع از تشخیص قابل اعتماد فسفوریلاسیون NKCC2 در موش‌های C57BL/6 در هنگام استفاده از آنتی‌بادی‌های موجود می‌شود، ما یک آنتی‌بادی جدید علیه فسفو سایت T96 در موش‌های C57BL/6 تولید کردیم. خرگوش ها با یک فسفوپپتید که مطابق با توالی اسید آمینه C57BL/6 NKCC2 اطراف T96 (YYLQ(p)TMDA) بود، ایمن شدند. آنتی سرم ها با میل ترکیبی خالص شدند و با ایمونوبلات و ایمونوهیستوشیمی مشخص شدند (شکل 5). آنتی بادی یک باند را در اندازه مورد انتظار 170 کیلو دالتون در کلیه های 129Sv، C57BL/6 نوع وحشی و C57BL/6 NCC شناسایی کرد.

موش ها (شکل 5 الف). باند به وضوح با نوار تشخیص داده شده برای NCC در 130 کیلو دالتون متفاوت بود. دفسفوریلاسیون 129Svکلیهنمونه‌های با آلکالین فسفاتاز روده گوساله (CIAP) سیگنال به‌دست‌آمده با آنتی‌بادی جدید pT96 NKCC2 را کاملاً از بین بردند، در حالی که سیگنال با آنتی‌بادی NKCC2 غیر فسفوفرم خاص در نمونه‌های شاهد و دفسفریله‌شده قابل مشاهده بود (شکل 5B). جالب توجه است، فسفوریلاسیون NKCC2 نیز تا حد زیادی زمانی که حذف شدکلیهلیزات در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت بدون CIAP انکوبه شدند (احتمالاً به دلیل فعالیت آلکالین فسفاتاز درون زا از لوله های پروگزیمال). آزمایش‌های دفسفوریلاسیون با استفاده از لامبدا فسفاتاز بر روی بخش‌های متوالی پارافین کلیه موش‌های C57BL/6 تأیید کرد که آنتی‌بادی جدید فقط NKCC2 فسفریله شده را تشخیص می‌دهد (شکل 5C). علاوه بر این، فلورسانس ایمنی روی برودت‌های متوالی نشان داد که آنتی‌بادی جدید فقط غشای پلاسمایی آپیکال TAL‌های مثبت NKCC{7}} را رنگ می‌کند، اما نه DCT‌های NCC- مثبت را در موش‌های 129Sv و C57BL/6 (شکل 5D)، نشان می‌دهد که جدید آنتی بادی pNKCC2 با pNCC واکنش متقابل ندارد. این نتیجه گیری همچنین با استفاده از لیزات سلولی از سلول های MDCKI که NKCC2 انسانی (hNKCC2) و NCC انسانی (hNCC) را بیان می کنند تأیید شد. ایمونوبلات رسوب‌های ایمنی (IP) و لیزات سلولی کامل نشان داد که آنتی‌بادی جدید pT96 NKCC2 NKCC2 انسانی را تشخیص می‌دهد اما NCC انسانی را تشخیص نمی‌دهد (شکل S8A). جالب توجه است، اگرچه آنتی بادی جدید علیه pNKCC2 موش های C57BL/6 ایجاد شد، آنتی بادی جدید فسفوریلاسیون NKCC2 را به طور معادل در کلیه های هر دو سویه موش توسط ایمونوهیستوشیمی (شکل 6A) و ایمونوبلات (شکل 6B) شناسایی کرد.

آنتی بادی جدید pT96 NKCC2 امکان تجزیه و تحلیل فسفوریلاسیون تنظیم شده NKCC2 را فراهم می کند.

فسفوریلاسیون و در نتیجه فعالیت NKCC2 و NCC توسط غلظت یون خارج سلولی تنظیم می شود. مقدار کم [Cl-] ex فسفوریلاسیون NKCC2 را در Thr96 و Thr101 و NCC را در Thr53 و Thr58 از طریق فعال سازی مسیر WNK/SPAK/OSR1 افزایش می دهد. 7،8،18،29،35 به همین ترتیب، [K+] بالا به سرعت فسفوریلاسیون NCC را کاهش می دهد، اما تصور می شود که تأثیر کمی بر فسفوریلاسیون NKCC2 داشته باشد یا هیچ اثری نداشته باشد. 12،36،37،38 برای آزمایش اینکه آیا آنتی بادی جدید pT96 NKCC2 قادر به تشخیص این نوع تنظیم افتراقی فسفوریلاسیون NKCC2 است یا خیر،کلیهبرش‌هایی از موش‌های C57BL/6 به ترتیب در شرایط خارج از بدن به 110 یا 5 میلی‌مولار [Cl-] سابق و به 3 یا 10 میلی‌مولار [K+] سابق قرار گرفتند. همانطور که انتظار می رفت، ex پایین [Cl-] به شدت فسفوریلاسیون NCC و NKCC2 را افزایش داد (شکل 7A,B)، در حالی که [K+] ex زیاد فقط فسفوریلاسیون NCC را کاهش داد اما فسفوریلاسیون NKCC2 را تغییر نداد (شکل 7C,D). به همین ترتیب، آنتی بادی جدید به همان اندازه به خوبی تغییر یافته است

شکل 4 هیچ تغییر قابل توجهی در بیان mRNA و پروتئین ماژور وجود نداردکلیهناقل‌ها و کانال‌های یون در نسل F2 دورگه. A، نمودار نوار سطوح بیان mRNA نسبی در سه گروه موش. تمام مقادیر به موش f/f نرمال شد. مقادیر میانگین ± SEM هستند. ب، فراوانی پروتئین در موشکلیهلیزات از حیوانات نسل F2. این سه گروه با NKCC2 تمام طول (f/f)، NKCC2 هموزیگوت برای حذف (Δ/Δ) یا NKCC2 هتروزیگوت برای حذف (f/Δ/) مطابقت دارند. نشانگرهای وزن مولکولی گنجانده شده است. NKCC2 و pNKCC2 در 170 کیلو دالتون، NCC و pNCC در 130 کیلو دالتون، TRPM6 در 260 کیلو دالتون، - ENaC در 95 کیلو دالتون و 34 کیلو دالتون (شکاف)، - ENaC در 100 کیلو دالتون، - ENaC در 100 کیلو دالتون، - ENaC در 100 کیلو دالتون ، ROMK در 55 کیلو دالتون (گلیکوزیله بالغ)، 43 کیلو دالتون (هسته گلیکوزیله) و 34 کیلو دالتون (غیر گلیکوزیله). فلش های سبز به نوارهای خاص اشاره می کنند در حالی که فلش های قرمز به نوارهای غیر خاص اشاره می کنند. C، تجزیه و تحلیل تراکم سنجی فراوانی پروتئین با مقایسه موش های f/f و Δ/Δ. شدت باند از موش Δ/Δ به موش‌های f/f نرمال می‌شود. (مقادیر عبارتند از میانگین ± SEM؛ n=5 موش/گروه؛ *P <.05، †="" p=""><.01، ‡="" p=""><>

فسفوریلاسیون NKCC2 که در سلول‌های MDCKI که NKCC2 انسانی (hNKCC2) یا NKCC2 موش (mNKCC2(C57BL/6)) را با شرایط کم کلرید خارج سلولی هیپوتونیک بیان می‌کنند تحریک شد (شکل S8B). که درکلیهبرش‌های انکوبه‌شده در 5 میلی‌مولار [Cl-] سابق، همچنین آنتی‌بادی‌های pT96/T101 NKCC{4}} و ضد انسان pT212/T217 NKCC1 R5 11 که قبلاً توضیح داده شد، سیگنال‌های ضعیف را برای NKCC2 و NCC تشخیص می‌دهند. زمانی که پروتئین‌های بیشتری بارگیری می‌شوند و لکه‌های ایمنی در تنظیمات بهبودیافته تصویربرداری می‌شوند، آشکارتر می‌شوند (شکل S9).

بحث

موش‌های C57BL/6 و 129Sv دو مورد از رایج‌ترین سویه‌های موش برای تحقیقات زیست‌پزشکی هستند. ژنوم موش های C57BL/6 اولین ژنومی بود که برای موش 40 توالی یابی شد و از آن زمان به عنوان ژنوم مرجع برای تجزیه و تحلیل تغییرات ژنتیکی و فنوتیپی بین سویه های موش عمل می کرد. 41- 44 برایکلیهتحقیقات، یک تفاوت اساسی بین موش‌های C57BL/6 و 129Sv مربوط به بیان ژن رنین است. مانند انسان، موش‌های C57BL/6 تنها دارای یک ژن رنین هستند، در حالی که موش‌های 129Sv دارای دو نسخه هستند که ممکن است حساسیت بالای این سویه موش را به فشار خون 45،46 و آسیب‌های فشار خون بالا توضیح دهد. 47 با مطالعه حاضر، تفاوت ژنتیکی مهم دیگری را اضافه می کنیم که باید در نظر گرفته شود. ما حذف پنج آمینو اسیدی را که تا به حال قدردانی نشده بود در NKCC2 (ΔF{11}} T101) توصیف می‌کنیم که در C57BL/6 وجود دارد اما در موش‌های 129Sv وجود ندارد، که در تشخیص فسفوریلاسیون NKCC2 با اکثر آنتی‌بادی‌های قبلاً موجود تداخل دارد، اما به‌طور قابل‌توجهی انجام نمی‌شود. تأثیرعملکرد کلیه.

محل‌های فسفوریلاسیون ترمینال NKCC2 موش T96 و T101 در بین گونه‌ها و بین NKCC2، NKCC1 و NCC بسیار محافظت شده‌اند (شکل 1). بنابراین، جای تعجب نیست که آنتی‌بادی‌هایی که علیه این مکان‌های فسفوریلاسیون قرار می‌گیرند، با سایر ناقل‌ها واکنش متقابل دارند. مطالعات قبلی گزارش کرده‌اند که آنتی‌بادی‌ها علیه NCC فسفریله، NKCC{9}}، 18،28،29 فسفریله را نیز شناسایی می‌کنند و آنتی‌بادی pNKCC1 امکان تجزیه و تحلیل سطوح فسفریله NKCC1 و NKCC2 را فراهم می‌کند. مطابق با این، ما واکنش متقابل آنتی بادی های pNCC (pT53 و pT58) خود را با NKCC2 فسفریله و آنتی بادی pT96/pT101 NKCC2 خود با NCC فسفریله مشاهده کردیم. با این حال، واکنش متقابل آنتی بادی‌های pNCC با NKCC2 تنها در کلیه‌های موش‌های 129Sv مشاهده شد، اما در کلیه‌های موش‌های C57BL/6 مشاهده نشد. برعکس، آنتی‌بادی قبلی ما برای NKCC2 pT96/pT101 هیچ یا در بهترین حالت سیگنال بسیار ضعیفی برای pNKCC2 در کلیه موش‌های C57BL/6 نشان نداد و NCC عمدتاً فسفریله شده را در این سویه شناسایی کرد. اکنون، ما این مشاهدات گیج کننده را به حذف پنج اسید آمینه در NKCC2 موش های C57BL6 (ΔF{38}} T101) مرتبط می کنیم. تنظیم فسفوریلاسیون NKCC2 مورد مطالعه قرار گرفته است

در محیط‌های تجربی مختلف و برای محرک‌های مختلف از جمله وازوپرسین، 14،21،24،25،49 uromodulin 19،20،50 و مهارکننده‌های کلسینورین. 10،26 در حالی که بیشتر مطالعات در سیستم‌های بیان هترولوگ 10،19،20،25،50 یا در موش‌های 10،24 و موش‌های 19،26 که NKCC2 تمام طول را بیان می‌کردند، انجام شد، برخی مطالعات نیز در موش‌های C57BL/6 انجام شد. 7،18،27،28،29،51 همانطور که در اینجا گزارش می‌دهیم، موش‌های C57BL/6 یک نوع NKCC2 را با حذف پنج اسید آمینه بیان می‌کنند که با تشخیص مناسب فسفوریلاسیون NKCC2 تداخل می‌کند و این خطر را دارد که pT96/T101 NKCC2 استاندارد باشد. آنتی بادی ها و آنتی بادی ضد فسفو-NKCC1 R5 حداقل در شرایطی که در کار ما استفاده می شود با NCC فسفریله شده واکنش متقابل دارند. قضاوت درباره تأثیر این واکنش متقابل بر نتایج تجربی قبلی ممکن نیست، اما طبق مشاهدات ما، داده‌های موش‌های C57BL/6 باید با احتیاط مورد بازبینی و تفسیر قرار گیرند. علیرغم این واقعیت، که حذف پنج اسید آمینه تأثیر قوی بر تشخیص فسفوریلاسیون NKCC2 داشت، ما هیچ مدرکی مبنی بر اینکه حذف به طور قابل توجهی بر فعالیت عملکردی هم انتقال دهنده تأثیر می گذارد، نداریم. موش‌های C57BL/6 نسبت به موش‌های 129Sv نسبت به موش‌های 129Sv نسبت به موش‌های 129Sv دارای Mg2 ادراری بالاتر و دفع کلسیم ادراری کمتری بودند، اما متوجه شدیم که این تفاوت‌ها احتمالاً مربوط به انتقال پاراسلولی تغییر یافته این کاتیون‌ها در طول TAL نیست، بلکه نتیجه افزایش جذب منیزیم به اضافه TRPM{49}} در روده و افزایش بازجذب Ca2 وابسته به TRPV5- در DCT2 و CNT است. دومی باعث تعادل مثبت Ca 2 به علاوه می شود که ممکن است به افزایش تراکم استخوانی پایین موش های C57BL/6 کمک کند. یافته‌ها که موش‌های C57BL/6 و 129Sv همین را نشان می‌دهندکلیهپاسخ به دیورتیک‌های لوپ و تیازیدی و محدودیت آب بیشتر نشان می‌دهد که حذف پنج اسید آمینه در NKCC2 به طور قابل‌توجهی عملکرد TAL را مختل نمی‌کند. مهم‌تر از همه، موش‌های نسل F2 موش‌های C57BL/6 و 129Sv دو رگه‌ای مشابه دارند.کلیهفنوتیپ مستقل از اینکه موش ها طول کامل (f/f) NKCC2 یا NKCC2 را بیان کنند

هموزیگوت (Δ/Δ) برای حذف. این مشاهدات در موش ها با داده های عملکردی قبلی از سیستم های بیان هترولوگ سازگار است. در حالی که جهش باقی مانده های منفرد در NKCC1 (T217 در انسان، T211 در موش) یا NCC (T60 در انسان، T58 در موش) فعالیت این انتقال دهنده های کوترانس را لغو می کند، جهش باقی مانده مربوطه در NKCC2 (T105 در انسان، T101 در موش). ) بر فعالیت پایه و تحریک شده NKCC2 تأثیر کمی دارند یا حتی هیچ تأثیری ندارند. 35،52،53 حتی زمانی که هر دو باقیمانده ترئونین در NKCC2 به آلانین جهش یافته اند، فعالیت عملکردی NKCC2 هنوز به 70 درصد حداکثر فعالیت می رسد، 35 که نشان می دهد فسفوریلاسیون این مکان ها نشان دهنده است اما برای فعالیت NKCC2 ضروری نیست.

محل های فسفوریلاسیون اغلب بین پروتئین ها همولوگ هستند. از این رو، مشکل واکنش متقابل آنتی‌بادی‌های اختصاصی فسفوفرم برای آنتی‌بادی‌های ضد NCC، NKCC2 و NKCC1 فسفریله‌شده منحصر به فرد نیست، بلکه برای سایر پروتئین‌ها مانند کینازهای وابسته به سیکلین 1 و 2 54 و خارج سلولی نیز گزارش شده است. کینازهای 1 و 2 تنظیم شده با سیگنال. این ممکن است شامل (الف) تأیید اینکه آنتی بادی به کار گرفته شده پروتئین را در وزن مولکولی مورد انتظار (ایمونوبلات) و/یا در محلی سازی سلولی و درون سلولی مورد انتظار (ایمونوفلورسانس) تشخیص می دهد، (ب) تأیید اینکه آنتی بادی به طور خاص با اپی توپ فسفریله شده توسط با استفاده از سنجش رقابت با پپتیدهای فسفریله و غیر فسفریله، و (ج) نشان دادن

با مقایسه نمونه های بافت فسفریله و دفسفریله، آنتی بادی خاص فسفوفرم است. این کنترل‌ها ممکن است با کنترل‌های ژنتیکی تکمیل شوند که شامل آزمایش بافت‌های حیوانات حذفی و/یا سلول‌هایی است که پروتئین مورد نظر را به صورت هترولوگ بیان می‌کنند. در مطالعه حاضر، ما از رویکردهای ذکر شده در بالا برای توصیف کامل آنتی بادی جدید pT96 NKCC2 استفاده کردیم که NKCC2 فسفریله شده را درکلیهنمونه هایی از موش های C57BL/6 و 129Sv به همان اندازه خوب بود. آنتی بادی خاص فسفوفرم است و تحت هیچ یک از شرایط آزمایش شده واکنش متقابل آشکاری با NCC فسفریله نشان نمی دهد. با استفاده از این آنتی بادی، ما تأیید کردیم که غلظت‌های پایین کلرید خارج سلولی فسفوریلاسیون NKCC2 را در این مکان افزایش می‌دهد، 7،8 در حالی که غلظت‌های پتاسیم خارج سلولی تغییر یافته نقش تنظیمی قابل‌توجهی ندارد. 24 در نتیجه، کار ما یک تفاوت فشار مهم در توالی اسیدهای آمینه NKCC2 موش را نشان می دهد که بر تشخیص و در نتیجه آنالیز فسفوریلاسیون و تنظیم NKCC2 تأثیر می گذارد. یک آنتی بادی جدید pT96 NKCC2 این اخطار فنی را دور می زند و امکان تشخیص قابل اعتماد فسفوریلاسیون تغییر یافته NKCC2 را مستقل از پس زمینه ژنتیکی مدل های موش فراهم می کند. علاوه بر این، مطالعه ما دوباره تاکید می‌کند که تفاوت‌های زمینه ژنتیکی باید هنگام تجزیه و تحلیل مدل‌های موش در نظر گرفته شود.

مواد و روش ها

حیوانات،موش‌های نر همسان با سن ({0}} هفته) یا از سویه‌های همخون 129S6/SvEvTac، C57BL/6J بودند که در اینجا به‌عنوان 129Sv و C57BL/6 نامیده می‌شود، یا یک سویه ترکیبی ترکیبی 129S/B6 در نسل F2. تمام آزمایش‌های حیوانی بر اساس قوانین رفاه حیوانات سوئیس انجام شد و توسط اداره دامپزشکی کانتون زوریخ، سوئیس تأیید شد (مجوزها: 141/2014، 185/2017 و 135/2018). موش ها برای حذف 15 باز با استفاده از PCR استاندارد با پرایمرهای ارائه شده در جدول S3 ژنوتیپ شدند. طول کامل (f/f) NKCC2 دارای محصول PCR مورد انتظار 87 جفت باز است در حالی که توالی NKCC2 حذف شده (Δ/Δ) در 70 جفت باز انتظار می رود.

پردازش بافتموش ها با ترکیبی از ایزوفلوران (2 درصد - 4 درصد، 0.5 لیتر در دقیقه؛ Provet؛ CH) و Temgesic (بوپرنورفین؛ 0) بیهوش شدند.05- 0. 4 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن؛ Indivor؛ CH). برای تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی، موش‌ها بیهوش شدند و از طریق بطن چپ قلب با سالین بافر فسفات (PBS) پرفیوژن شدند. کلیه‌ها و کولون‌های دیستال برداشت شدند، در نیتروژن مایع منجمد شدند و تا پردازش بیشتر در 8-0 درجه نگهداری شدند. برای ایمونوهیستوشیمی، کلیه ها با استفاده از پارافورمالدئید (PFA) 3 درصد در بافر فسفات 0.1 M (pH 7.4، 300 mOsm) با پرفیوژن رتروگراد موش عمیقاً بیهوش شده از طریق تثبیت شدند. آئورت شکمی و سپس شستشوی کوتاه با 0.1 M بافر فس فات (0.2 M NaH 2 PO 4 x H 2 O , 0. 2 M NaH 2 PO 4 x 2H 2 O , 0. 1 M CaCl 2 ). پس از آن، کلیه ها برداشته شدند، به قطعات بریده شدند و در پروپان مایع منجمد شدند و در دمای 80- درجه نگهداری شدند.

مطالعات قفس متابولیکپس از سازگاری با قفس‌های متابولیک (Techniplast)، موش‌ها به مدت چهار روز متوالی با دسترسی آزاد به آب لوله‌کشی و غذای استاندارد آزمایشگاهی (Ssniff، Spezialdiäten GmbH) در قفس‌های متابولیک نگهداری شدند. وزن بدن، غذا و آب مصرفی روزانه ثبت و ادرار و مدفوع 24 ساعته جمع آوری شد.

پروتکل محدودیت آبموش ها به مدت 24 ساعت در قفس های متابولیک (Techniplast) بدون دسترسی به آب لوله کشی نگهداری شدند. پودر غذای استاندارد آزمایشگاهی (Ssniff، Spezialdiäten GmbH) با آب مخلوط شد، ادرار 24 ساعته به نسبت 1:1 و مدفوع جمع آوری و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. پس از 24 ساعت، موش ها دوباره به قفس های معمولی (T 2L (IVC)، LASC، UZH قرار گرفتند.

اندازه گیری های بیوشیمیاییغلظت ادراری Na plus، K plus، Ca2 plus با استفاده از فتومتری شعله (EFOX 5053، Eppendorf) مورد بررسی قرار گرفت. غلظت Mg 2 پلاس در ادرار و پلاسما در مرکز فیزیولوژی جوندگان یکپارچه زوریخ با سیستم(های) SYNCHRON LX®، UniCel® DxC 800 Synchron®® و سیستم Synchron® Multi Calibrator اندازه گیری شد. کراتینین ادرار به روش Jaffe اندازه گیری شد. غلظت گاز و یون خون در خون کامل هپارینه شده با استفاده از آنالایزر گاز خون (رادیومتر) ABL825Flex بلافاصله پس از جمع‌آوری خون از ورید اجوف اندازه‌گیری شد. سطح آلدوسترون پلاسما و غلظت ادراری uromodulin (UMOD) با کیت های ELISA موجود در بازار اندازه گیری شد (کیت Aldosterone ELISA توسط Cayman؛ #501090 و Mouse Uromodulin ELISA کیت توسط Abcam؛ ab245726 به ترتیب).

واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی در زمان واقعی (RT- qPCR)

RNA از کلیه ها و کولون دیستال با استفاده از کیت جداسازی RNA کل SV (PROMEGA) جدا شد. غلظت مساوی از RNA جدا شده (250 نانوگرم در 129Sv در مقابل C57BL/6 یا 500 نانوگرم در f/f، Δ/Δ و f/Δ) با کیت GoScript™ Reverse Transcriptase (PROMEGA) به cDNA رونویسی معکوس شد. cDNAهای تولید شده بیشتر با آب بدون DNAse/RNAse رقیق شدند (1:5). آغازگرها برای تعیین کمیت کل Slc12a1، Slc12a3، Trpm6، Trpv5، Scnn1a، Scnn1b، Scnn1g و Kcnj1 طراحی شدند (جدول S3). تجزیه و تحلیل کمی PCR با استفاده از LightCycler ® 480 (Roche) برای اندازه گیری سطح بیان ژن های مورد نظر انجام شد. بیان نسبی ژن با استفاده از روش دلتا سی تی با استفاده از -اکتین به عنوان ژن مرجع محاسبه شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلاتکلیه ها در یک بافر لیز بدون مواد شوینده (DFLB) حاوی مانیتول 200 میلی مولار، HEPES [4- ({3}} هیدرو زایل اتیل)- 1پیپرازین اتان سولفونیک همگن شدند. اسیدها] 80 میلی‌مولار، هیدروکسید پتااس سیوم 41 میلی‌مولار، مهارکننده‌های پروتئاز (کامپل اولترا، روش) و مهارکننده‌های فسفاتاز (فوسستاپ، روشه) با استفاده از 32 دانه سبز Magna Lyser (روش) در هموژنایزر بافت Precellys 24 (Montigny-le-, برتوننو). دانه ها با سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه (1987 rcf) ته نشین شدند و پروتئین حاوی رویی در مقادیر یکبار مصرف در دمای 80- درجه نگهداری شد. برای وسترن بلات، 50 میکروگرم پروتئین در بافر Laemmli دناتوره شد، توسط SDS-PAGE با استفاده از ژل‌های 8 درصد - 12 درصد جدا شد و متعاقباً به غشاهای نیتروسلولزی منتقل شد. محل‌های اتصال غیر اختصاصی با استفاده از محلول مسدودکننده ادیسه 1 برابر (Li-COR Biosciences) قبل از انکوبه شدن غشاها با آنتی‌بادی‌های اولیه (جدول S4) رقیق‌شده در محلول مسدودکننده 0.2x Odyssey در دمای 4 درجه به مدت 12 ساعت مسدود شدند. پس از شستشو در PBS{28}}.1 درصد توئین، غشاها با آنتی‌بادی‌های ثانویه انکوبه شدند. - COR Biosciences) رقیق شده در بافر مسدود کننده کازئین 0.1x (سیگما). نوارهای شناسایی شده با سیستم تصویربرداری مادون قرمز Odyssey (Li-COR Biosciences) مشاهده شدند. برای اطمینان از بارگیری پروتئین برابر، غشاها یا با آنتی بادی علیه اکتین رنگ آمیزی شدند یا پروتئین کل با استفاده از رنگ آمیزی پروتئین کل REVERT (Li-COR Biosciences) قبل از تشخیص آنتی بادی رنگ آمیزی شد. باندهای Immunoreactive در فیجی (ImageJ) کمی سازی شدند و به ترتیب در برابر سیگنال اکتین یا رنگ پروتئین REVERT توتال نرمال شدند.

ایمونوهیستوشیمیمقاطع کرایوستات (ضخامت 4 میکرومتر) برای اتصال آنتی بادی غیر اختصاصی با 10 درصد سرم طبیعی بز مسدود شد و متعاقباً با آنتی بادی های اولیه انکوبه شد (جدول S4)

یک شب در 4 درجه پس از شستشو با 1X PBS، اسلایدها با آنتی بادی های ثانویه (Cy3 - کونژوگه بز- IgG ضد خرگوش، شماره محصول 111- 165- 144، 1:1{21}}00 و FITC - بز مزدوج- IgG ضد موش انکوبه شدند. ، شماره محصول 115- 095- 068، به ترتیب 1:100، هر دو از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی جکسون ایمونو) به مدت 2 ساعت در دمای اتاق. تمام آنتی بادی ها در 1 درصد BSA/1xPBS رقیق شدند. هسته‌های سلولی با DAPI (4',{17}} Diamidino- 2- pentyl-indole, Sigma- Aldrich, Co.) در غلظت 0.1 میکروگرم بر میلی‌لیتر رنگ‌آمیزی شدند. تصویربرداری با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس Leica DM6000 B (Leica Microsystems, 35578) با دوربین دیجیتال تک رنگ فلورسانس Leica DFC350 FX (Leica Microsystems, 35578) انجام شد. تصاویر در فیجی (ImageJ) پردازش شدند.

تولید آنتی بادی pT96 NKCC2 خرگوش-ضد موش خالص شده با تمایلتولید آنتی بادی توسط سرویس آنتی بادی Pineda (برلین، آلمان) انجام شد. خرگوش ها با یک فسفوپپتید شامل اسیدهای آمینه 105- 114 از توالی NKCC2 موش C57BL/6 (NH{5}} YYLQ(p) TMDAV-COOH) ایمن شدند. کسر IgG تک اختصاصی با میل ترکیبی در برابر فسفوپپتید خالص شد و متعاقباً با دفسفوپپتید پیش جذب شد و در نتیجه یک بخش آنتی بادی اختصاصی فسفوفرم ایجاد شد. ویژگی آنتی بادی این فراکسیون توسط ایمونوهیستوشیمی و آنالیز وسترن بلات مورد آزمایش قرار گرفت (شکل 5 و شکل S4).

درمان فسفاتازلیزهای پروتئینی به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه با آلکالین فسفاتاز روده گوساله (CIAP) (1 U/1 میکروگرم پروتئین) انکوبه شدند تا هیدرولیز گروه‌های 5'- فسفات پروتئین‌های فس‌فوریله شده را القاء کنند که اتصال ویژه pT96 را مهار می‌کند. آنتی بادی NKCC2 به پروتئین های روی غشای وسترن بلات نیتروسلولز (شکل 5B). کلیه های بایگانی شده با پارافین از موش های C57BL6 استفاده شد. درمان مقاطع با استفاده از آلکالین فسفاتاز روده گوساله (Sigma Aldrich) همانطور که قبلاً با تغییرات جزئی توضیح داده شد انجام شد. 56 پس از مسدود کردن گروه‌های آلدهید آزاد، بخش‌ها پنج بار در بافر آلکالین فسفاتاز (1{16}}{23}} میلی‌متر Tris، 50 میکرومتر CaCl2، 0.1 میلی‌متر MgCl2، 8.4 میکرومتر لوپپتین، 4 میلی‌متر Pefablock، شست‌وشو داده شدند. pH 9.0). سپس مقاطع در بافر آلکالن فسفاتاز با یا بدون آلکالین فسفاتاز روده گوساله (~130 واحد در میلی لیتر) در انکوباتور در دمای 35 درجه به مدت 2 ساعت انکوبه شدند. ایمونوهیستوشیمی و میکروسکوپ نوری متعاقباً با جزئیات انجام شد. 57

تراز کردن توالی اسیدهای آمینهتوالی اسیدهای آمینه برای گونه های مختلف و سویه های موش از پایگاه داده باز "Ensembl Genome Browser" (www.ensem bl.org، موسسه Sanger) به دست آمد. 42 منابع شناسه های رونوشت در جدول S1 فهرست شده اند. توالی ها با استفاده از Qiagen © CLC Main Workbench 20 تراز شدند.

برش های کلیهکلیهبرش‌های موش C57BL/6 برای آزمایش‌های خارج از بدن همانطور که قبلاً توضیح داده شد استفاده شد. به طور خلاصه، موش ها یک شبه با دسترسی آزاد به آب روزه گرفتند تا از هرگونه اثرات بالقوه دریافت یون رژیم غذایی بر سطوح فسفوریلاسیون NKCC2 و NCC جلوگیری شود. کلیه‌ها از حیوانات بی‌هوش برداشته شدند، با استفاده از میکرو اسلایسر ارتعاشی (Vibratome، Microm؛ Thermo Scientific) به برش‌هایی با ضخامت 280 میکرومتر برش داده شدند و در محلول رینگر (در میلی‌مولار): 98.5 NaCl، 25 NaHCO 3، 3 KCl، 1 Na2 قرار گرفتند. HPO 4، 2.5 CaCl 2، 1.8 MgCl 2 و 25 گلوکز به مدت 30 دقیقه در 30.5 درجه با حباب ثابت با 95 درصد O 2 و 5 درصد CO 2 . پس از آن، محلول رینگر با محلول‌های مشابه جایگزین شد، اما با کلر متفاوت (5 میلی‌مولار برای کلر کم، 110 میلی‌مولار برای کلر نرمال، 110 میلی‌مولار برای کلر معمولی) و غلظت‌های K به علاوه (3 میلی‌مولار برای K پلاس نرمال، 10 میلی‌مولار برای K پلاس بالا) برای 30 دقیقه اضافی در نهایت، برش ها به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شدند.

آماربرای مقایسه دو گروه از آزمون t استودنت جفت نشده و ولش در مورد واریانس های نابرابر استفاده شد (GraphPad Prism, Version 8.{1}}.2). برای مقایسه چندگانه، ANOVA یک طرفه یا دو طرفه و پس از آن پس آزمون مقایسه چندگانه توکی (GraphPad Prism, Version 8.{7}}.2) انجام شد. داده ها به صورت میانگین ± SEM (در جداول و شکل ها) نمایش داده می شوند. زمانی که P < 0.05="" تفاوت="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

سپاسگزاریها  نویسندگان از دکتر گری شول (دانشگاه سینسیناتی، سینسینیت، OH) برای ارائه موش های NCC-KO، دکتر بیف فوربوش (دانشکده پزشکی ییل، نیوهیون، CT) برای آنتی بادی "R5" pNKCC1 و دکتر هنریک دیمکه ( دانشگاه جنوب دانمارک، اودنسه، دانمارک) برای آنتی بادی مونوکلونال تام NCC موش. نویسندگان همچنین از Monique Carrell و Inger Merete Paulsen برای کمک های فنی و دکتر Eszter Banki برای ارائه قدردانی می کنند.کلیهنمونه ها. اندازه گیری تراکم استخوان و بخشی از تجزیه و تحلیل ادرار و پلاسما به ترتیب توسط دکتر پترا سیبک و نادین ناگله (فیزیولوژی جوندگان یکپارچه زوریخ، دانشگاه زوریخ) انجام شد. از نظرات بسیار مفید دکتر آلیشیا مک دونا (دانشگاه کالیفرنیای جنوبی) و دکتر اولیویر دوویست (دانشگاه زوریخ) بسیار قدردانی شد.

تضاد منافع گروه JL برای آنتی بادی های دارای مجوز علیه NCC و فسفریله Nedd4- 2 به ترتیب از Milipore و Abcam حق امتیاز دریافت می کند. هر دو آنتی بادی در مطالعه حاضر استفاده نشدند. علاوه بر این، JL در سال 2019 از VIFOR برای ارائه شفاهی در سمپوزیومی که توسط VIFOR سازماندهی شده بود، جایزه دریافت کرد.