Acteoside به عنوان یک گزینه درمانی بالقوه برای سرطان کبدی اولیه: یک مطالعه پیش بالینی

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

دی ما، خوان وانگ، لو لیو، میچی چن و ژیونگ وانگ

خلاصه

زمینه و هدف: کارسینوم کبدی (HCC) یک تومور بدخیم شایع با ویژگی های پیش آگهی ضعیف، عوارض بالا و مرگ و میر در سراسر جهان است. به طور خاص، تنها چند گزینه درمانی سیستمیک برای بیماران پیشرفته HCC در دسترس است و شامل سورافنیب و رژیم آتزولیزوماب به همراه بواسیزوماب که اخیراً توضیح داده شده است به عنوان درمان های خط اول ممکن است. ما در اینجا اکتئوزید را پیشنهاد می کنیم، یک گلیکوزید فنیل اتانوئیدی که به طور گسترده در بسیاری از گیاهان دارویی توزیع شده است به عنوان یک کاندید بالقوه در برابر HCC پیشرفته.

روش‌ها: تکثیر سلولی، تشکیل کلنی و مهاجرت در سه رده سلولی HCC انسانی BEL7404، HLF و JHH-7 مورد بررسی قرار گرفت. سنجش آنژیوژنز با استفاده از HUVESs انجام شد. مدل موش برهنه زنوگرافت BEL7404 یا JHH-7 برای تجزیه و تحلیل اثرات ضد توموری احتمالی اکتئوزید ایجاد شد. از qRT-PCR و وسترن بلات برای آشکارسازی مکانیسم‌های ضد توموری بالقوه اکتئوزید استفاده شد.

نتایج:اکتئوزید از سیستانچمهار تکثیر سلولی، تشکیل کلنی و مهاجرت در هر سه رده سلولی HCC انسانی BEL7404، HLF و JHH-7. ممنوعیت رگزایی توسط اکتئوزید با مهار تشکیل لوله و مهاجرت سلولی HUVECها آشکار شد. ترکیب اکتئوزید و سورافنیب باعث مهار قوی‌تر تشکیل کلنی سلولی و مهاجرت سلول‌های HCC و همچنین رگ‌زایی HUVECs شد. اثر ضد توموری in vivo اکتئوزید در مدل موش برهنه پیوند زنوگرافت BEL7404 یا JHH{3}} با افزایش در هنگام ترکیب با سورافنیب در مهار رشد زنوگرافت JHH{4} نشان داده شد. درمان بیشتر سلول‌های JHH{5}} با آکتئوزید، افزایش سطح پروتئین سرکوب‌کننده تومور p53 و همچنین کاهش سطح ژن پپتیداز مرتبط با کالیکرئین (KLK1، 2، 4، 9 و 10) را نشان داد که معنی‌دار نبود. تغییرات بقیه ژن های KLK1-15.

نتیجه گیری:اکتئوزید از سیستانچاحتمالاً از طریق افزایش سطح p53 و همچنین مهار بیان KLK و رگ زایی، اثر ضد توموری را اعمال می کند. Acteoside می تواند به عنوان یک مکمل در درمان HCC پیشرفته در کلینیک مفید باشد.

واژه‌های کلیدی: آکتئوزید، کارسینوم کبدی، سورافنیب، زنوگرافت، p53، کالیکرئین

زمینه

کارسینوم هپاتوسلولار (HCC) یک تومور بدخیم شایع با ویژگی های پیش آگهی ضعیف و عوارض و مرگ و میر بالا در سراسر جهان است [1، 2]. عوامل مختلفی در بروز و پیشرفت HCC شناسایی شده اند، از جمله عفونت با ویروس هپاتیت B یا C، غیرفعال شدن ژن های سرکوبگر تومور مانند p53، فعال شدن غیر طبیعی انکوژن هایی مانند K-ras و برخی مولکول های سیگنالینگ. مانند PI3K، ERK/MAPK، و Wnt/-catenin و همچنین فرار از سیستم ایمنی میزبان [3، 4]. برای مدیریت HCC، برداشتن، پیوند کبد و فرسایش با فرکانس رادیویی گزینه‌هایی برای بیماران HCC در مراحل اولیه هستند، اما با نرخ بالای عود و متاستاز [3، 5، 6]. علاوه بر این، تنها چند گزینه درمانی سیستمیک برای بیماران HCC پیشرفته در دسترس است و شامل سورافنیب و رژیم آتزولیزوماب به همراه بواسیزوماب به‌عنوان درمان‌های خط اول ممکن است [7]. در این زمینه، توسعه عوامل جدید با هدف قرار دادن چندین هدف مولکولی یا راه اندازی یک استراتژی جدید مانند استفاده از درمان ترکیبی در درمان HCC پیشرفته از اهمیت و علاقه برخوردار است.

اکتئوزید از سیستانچیک گلیکوزید فنیل اتانوئیدی است که به طور گسترده در بسیاری از گیاهان دارویی از جمله Ligustrum purpurascens [8]، Rehmannia glutinosa [9] و Ligustrum purpurascens [10] توزیع شده است. شواهد زیاد نشان داده است که اکتئوزید می تواند فعالیت های بیولوژیکی مختلفی از جمله فعالیت ضد توموری خود را اعمال کند. به عنوان مثال، اکتئوزید اثرات ضد تکثیری قوی روی سلول های سرطان پروستات نشان داد [11]. تحویل داخل صفاقی آکتئوزید رشد تومور را در مدل موش ملانوما احتمالاً از طریق مهار پروتئین کیناز C سرکوب کرد [12]. علاوه بر این، اکتئوزید حساسیت سلول‌های سرطانی کولورکتال به 5- فلوئورواوراسیل را از طریق سیگنال‌دهی PI3K/Akt تقویت کرد [13]. داده های قبلی ما همچنین مهار ملانوژنز توسط اکتئوزید در سلول های ملانوما B16 را نشان داده است [14]. با وجود آن، اطلاعات کمی در مورد اثربخشی احتمالی اکتئوزید در درمان HCC و مکانیسم‌های بالقوه زمینه‌ای در دسترس است.

در مطالعه حاضر نشان دادیم کهاکتئوزید از سیستانچاز تکثیر سلولی، تشکیل کلنی و مهاجرت در هر سه رده سلولی HCC انسانی BEL7404، HLF و JHH7 جلوگیری می کند. همانطور که با مهار تشکیل لوله و مهاجرت سلولی HUVECs نشان داده شده است، رگزایی نیز به دنبال درمان با اکتئوزید مهار می شود. اثر ضد توموری in vivo اکتئوزید در مدل موش برهنه زنوگرافت BEL7404 یا JHH{3}} با افزایش زمانی که با سورافنیب ترکیب می‌شود در مهار رشد زنوگرافت JHH{4} نشان داده می‌شود. اثرات ضد توموری اکتئوزید را می توان به تنظیم بالای p53 و همچنین سرکوب KLKs و رگزایی نسبت داد.

مواد و روش ها

کشت سلولی

رده های سلولی کارسینوم کبدی (HCC) BEL7404، HLF، و JHH7 از مجموعه کشت نوع آمریکایی به دست آمد و به طور معمول در محیط کشت DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی همراه با 100 واحد در میلی لیتر پنی سیلین G و 100 میکروگرم بر میلی لیتر کشت داده شدند. در انکوباتور مرطوب شده در دمای 37 درجه با 5 درصد دی اکسید کربن. سلول های اندوتلیال ورید ناف انسانی (HUVECs) از وریدهای بند ناف انسان (ارائه شده توسط آزمایشگاه تحقیقاتی ScienCell، سن دیگو، ایالات متحده) جدا شده و در محیط سلول اندوتلیال همانطور که قبلاً توضیح داده شد نگهداری شدند [15].

معرف هااکتئوزید از سیستانچ (A{3}}1) از Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, China; Lot No. 100581; Purity بیشتر یا مساوی 99 درصد توسط HPLC) خریداری شد. Sorafenib از Selleck Chemicals (هوستون، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. ما اکتئوزید را در سالین 0.9 درصد حل کردیم. محلول ذخیره سورافنیب در دی متیل سولفوکسید (DMSO؛ 10 میلی مولار) تهیه شد، به مقدار کمی تقسیم شد و در دمای 20- درجه نگهداری شد.

حیوانات

موش‌های نر BALB/c (Nu/Nu) (18-20 گرم، ۶ تا ۸ هفته در زمان دریافت) در این مطالعه استفاده شدند (شانگهای Slac Laboratory Animal Co. Ltd.، شانگهای، چین). حیوانات در قفس‌های پلی سولفون تهویه‌شده جداگانه در اتاقی با دما و نور (12 ساعت نور- 12 ساعت چرخه تاریکی، چراغ‌ها در ساعت 7:00 صبح) با دسترسی آزاد به غذا و آب نگهداری می‌شوند. . تمام پروتکل‌های آزمایشی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی تأیید شد و طبق دستورالعمل‌های انجمن بین‌المللی مطالعه درد در مورد استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام شد.

سنجش تکثیر سلولی فعالیت ضد تکثیر با استفاده از روش MTT انجام شد. به طور خلاصه، سلول‌ها با تراکم 4-5 × 103 سلول در هر چاهک در صفحات {4} چاهک قرار گرفتند. پس از اتصال یک شبه، سلول ها با یک سری غلظت آکتئوزید تیمار شدند. پس از درمان دارویی در زمان مشخص شده، سلول ها با 3-(4،{7}} دی متیل تیازول-2-یل){9}}،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) انکوبه شدند. ؛ Roche Diagnostic Corporation، ایندیاناپولیس، IN، ایالات متحده. غلظت نهایی: ug/ml 5) به مدت 3-4 ساعت در دمای 37 درجه. محصول فورمازان در DMSO برای کمی سازی در طول موج 570 نانومتر حل شد.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 سلول در زیر میکروسکوپ نوری شمارش شدند (× 100 بزرگنمایی؛ المپوس، توکیو، ژاپن).

روش التیام زخم سلول ها در {{0}}صفحه چاهک (1 × 105 سلول در هر چاهک) کاشته شدند و تا 90 درصد تلاقی کشت داده شدند. لایه سلولی با نوک پیپت استریل 200 ul برای ایجاد شکاف زخم خراشیده شد. مهاجرت سلولی به ناحیه زخمی در نقاط زمانی مشخص شده (0، 10 و 24 ساعت) در زیر میکروسکوپ نوری معکوس با بزرگنمایی 100 × مشاهده شد. هر آزمایش در سه تکرار انجام شد.

سنجش تشکیل لوله HUVECها همانطور که قبلا توضیح داده شد [15] کشت داده شدند. به طور خلاصه، 96-صفحات چاه با Matrigel (BD Biosciences، Franklin Lakes، USA) طبق دستورالعمل سازنده پوشانده شدند و سپس به انکوباتور بازگردانده شدند تا به مدت 30-40 دقیقه پلیمریزه شوند. سپس HUVECها با تراکم 2 × 105 سلول در میلی لیتر کاشته شدند و با داروهای مختلف به مدت 8 ساعت تیمار شدند. تشکیل لوله با میکروسکوپ معکوس در نقاط زمانی مشخص شده عکسبرداری شد و با استفاده از نرم افزار ImageJ آنالیز شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

لیزات سلولی کل با بافر سنجش رادیوایمونو رسوب (RIPA) (5{2}} میلی مولار Tris HCl در pH 8 تهیه شد.{7}}، mM 150 NaCl، 1 درصد NP40، 1 درصد دی اکسی کولات سدیم، 0.1 درصد SDS، 10 ug/ml لوپپتین، ug/ml 10 آپروتینین و 2 میلی مولار PMSF). نمونه های پروتئینی با مقادیر مساوی (20 میکروگرم در خط) روی ژل SDS-PAGE جدا و به غشاهای PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA) منتقل شدند. غشاها یک شبه با آنتی بادی p53 (Cell Signaling Technology, Boston, MA) انکوبه شدند. برای کنترل بارگذاری، غشاها با یک بافر جداسازی شسته شده و با آنتی بادی -اکتین مجدداً بررسی شدند (سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، CA). پروتئین ها با استفاده از یک سیستم تشخیص ECL (Perkin Elmer Life Sciences، بوستون، ایالات متحده آمریکا) شناسایی شدند.

qRT-PCR

RNA کل از رده های سلولی با استفاده از معرف Trizol (Invitrogen، ایالات متحده آمریکا) استخراج شد و تحت یک واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR) برای سنتز cDNA با استفاده از یک کیت تجاری موجود قرار گرفت. qRT-PCR بلادرنگ با استفاده از 2xSYBR سبز qPCR Supermix بر روی چینی Stratagene Mx3000P PRC (Agilent Technologies، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. توالی پرایمر در زیر نشان داده شد: حس 5'-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3' و ضد حس 5'- CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3' برای KLK1. حس 5'-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3' و ضد حس 5'-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3' برای KLK2؛ Sense 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ and anti-sense 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3′ for KLK3; Sense 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ and anti-sense 5′- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3′ for KLK4; Sense 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ and antisense 5′- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3′ for KLK5; Sense 5′- CTCTCTCCTGGGGGACACAGA-3′ and antisense 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ for KLK6; حس 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ و ضد حس 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′ برای KLK7؛ حس 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ و ضد حس 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ برای KLK8; حس 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ و ضد حس 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ برای KLK9; حس 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ and antisense 5′- CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3′ for KLK10; حس 5′-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3′ و ضد حس 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3′ برای KLK11; حس 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ و ضد حس 5′-GGATCCAGTCACATACTTGC-3′ برای KLK12؛ حس 5′-CCTGAACCCACGACCATGACA{104}}′ و ضد حس 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3′ برای KLK13؛ حس 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3′ و ضد حس 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3′ برای KLK14؛ حس 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ و ضد حس 5'-TGGCTAACATCTGGGGCCTTG- 3' برای KLK15؛ Sense 5'-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3' and anti-sense 5'- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3' for GAPDH. مقادیر آستانه چرخه (Ct) هر ژن KLK به GAPDH نرمال شد و با نرم افزار MxPro تجزیه و تحلیل شد.

فعالیت ضد توموری در داخل بدن A01 به تنهایی یا در ترکیب با سورافنیب. 4 سوسپانسیون سلولی BEL74 تهیه شد (3 × 106 سلول) و به صورت زیر جلدی به سمت راست تزریق شد. موش های برهنه آتیمیک ده روز پس از تلقیح، موش های حامل تومور (وزن بدن (گرم): 22-26؛ میانگین ± SEM: 23.8 ± 0.14) غربالگری شدند و برای تصادفی سازی در 7 گروه درمانی به دنبال حجم تومور ({ {12}} mm3). در مجموع 38 موش به گروه‌های درمانی مختلف (n=5 در هر گروه به جز گروه مدل (n=8)) اختصاص داده شدند. سپس حیوانات از طریق گاواژ خوراکی با آکتئوزید (A01؛ 12.5، 25 و 50 میلی گرم بر کیلوگرم)، سورافنیب به تنهایی (50 میلی گرم بر کیلوگرم) یا همراه با A01 (50 میلی گرم بر کیلوگرم) یک بار در روز به مدت 14 روز تحت درمان قرار گرفتند. علاوه بر این، دوز 20 میلی گرم بر کیلوگرم A01 نیز به صورت داخل وریدی تحویل داده شد. دوزها بر اساس مطالعات قبلی و داده های اولیه ما انتخاب شدند [15]. رشد تومور هر 3 یا 4 روز با استفاده از کولیس الکترونیکی، با حجم 0.5x طول و عرض (mm3) محاسبه شد. علاوه بر این، یک آزمایش موازی با استفاده از تلقیح JHH{34}} گنجانده شد. هفت روز پس از تلقیح، موش های حامل تومور (وزن بدن (گرم): 20-26؛ میانگین ± SEM: 0.20 ± 24.0) غربالگری شدند و برای تصادفی سازی در گروه های درمانی مطابق با حجم تومور (80-130 mm3) انتخاب شدند. ). در مجموع 23 موش به 4 گروه درمانی (n=5 در هر گروه به جز گروه مدل (n=8)) اختصاص داده شدند. سپس حیوانات A01 (20 mg/kg، IV)، سورافنیب به تنهایی (50 mg/kg، IG) یا همراه با A01 (20 mg/kg، IV) یک بار در روز به مدت 14 روز متوالی دریافت کردند. تمام موش ها با کلرال هیدرات (350 میلی گرم بر کیلوگرم) بیهوش شدند و در پایان دوره مشاهده با دررفتگی گردن قربانی شدند. و توده تومور برداشته شد و با دوربین دیجیتال تصویربرداری شد.

تحلیل آماری

همه داده ها به صورت میانگین ± انحراف استاندارد (SD) بیان می شوند. در غیر این صورت، آنالیزهای آماری با استفاده از آنالیز واریانس (ANOVA) و سپس آزمون توکی پس از مرگ انجام شد. مقادیر حجم تومور به صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM) نشان داده شده است. برای تجزیه و تحلیل داده های حجم تومور از آنالیز واریانس دو طرفه و به دنبال آن تست های توکی استفاده شد. برای تجزیه و تحلیل آماری از نرم افزار GraphPad Prism استفاده شد. مقدار p < 0.05="" از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

نتایج

اثرات A01 بر تکثیر و تشکیل کلونی HCCs در شرایط آزمایشگاهی

از سه رده سلولی HCC (BEL7404، HLF و JHH7) برای سنجش تکثیر سلولی استفاده شد. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، سنجش MTT نشان داد که A01 تکثیر هر سه سلول HCC را مهار می کند. برای پرسیدن بیشتر اینکه آیا فعالیت ضد تکثیر A01 به دلیل توانایی آن در مهار کلونزایی سلولی است، سنجش تشکیل کلونی انجام شد. A01 در 100 میکرومولار مهار قوی تشکیل کلنی در سلولهای BEL7404 را نشان داد (شکل 2a و b). هنگامی که با سورافنیب (2 میکرومولار) ترکیب شد، قدرت مهار قوی تر از A01 یا سورافنیب به تنهایی بود. نتایج مشابهی نیز در دو سلول HCC دیگر، HLF و JHH{11}} مشاهده شد (شکل 2c و d).

اثرات A01 به تنهایی یا در ترکیب با سورافنیب بر مهاجرت سلولی HCCs در شرایط آزمایشگاهی

سپس مهاجرت سلولی را با استفاده از روش زخم خراش ارزیابی کردیم. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، ترکیب A01 (100 یا 500 میکرومولار) و سورافنیب (10 میکرومولار) در مقایسه با گروه کنترل به طور قابل توجهی از بهبود زخم در هر سه سلول HCC جلوگیری کرد. برای سلول های BEL7404، هر دو A01 (100 یا 500 میکرومولار) و سورافنیب (10 میکرومولار) تنها تمایل به پیشگیری از بهبود زخم را بدون اهمیت آماری ایجاد کردند (شکل 3a و d). برای سلول های HLF، A01 در 500 میکرومولار و سورافنیب در 10 میکرومولار از بهبود زخم جلوگیری کردند. به طور خاص، A01 (500 میکرومولار) همراه با سورافنیب (10 میکرومولار) مهار قوی‌تری از بهبود زخم نسبت به سورافنیب به تنهایی ایجاد کرد (شکل 3b و e). برای سلول های JHH، بهبود زخم توسط A01 (500 میکرومولار) و سورافنیب (10 میکرومولار) جلوگیری شد. ترکیب A01 (100 میکرومولار) و سورافنیب (10 میکرومولار) مهار قوی‌تری از بهبود زخم نسبت به A01 (100 میکرومولار) یا سورافنیب (10 میکرومولار) به تنهایی ایجاد کرد. علاوه بر این، A01 در 500 میکرومولار همراه با سورافنیب (10 میکرومولار) مهار قوی‌تری از بهبود زخم نسبت به A01 (500 میکرومولار) یا سورافنیب (10 میکرومولار) به تنهایی نشان داد (شکل 3c و f).

اثرات A01 به تنهایی یا همراه با سورافنیب بر رگزایی در شرایط آزمایشگاهی

آنژیوژنز ارتباط نزدیکی با رشد، پیشرفت و متاستاز تومور دارد [16] و بنابراین به عنوان یکی از اهداف مداخله گر برای درمان سرطان در نظر گرفته می شود. ما ابتدا یک روش تشکیل لوله را برای تجزیه و تحلیل رگزایی بالقوه در شرایط آزمایشگاهی انجام دادیم. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، درمان به مدت 3 ساعت با سورافنیب به تنهایی (10 میکرومولار) یا ترکیبی از A01 (100 و 500 میکرومولار) و سورافنیب (10 میکرومولار) شروع به نشان دادن اثرات بازدارنده بر تشکیل ساختارهای عروق مانند کرد. ازدیاد طول و تراز HUVECها (شکل 4a و c). پس از درمان به مدت 8 ساعت، A01 (100 و 500 میکرومولار)، سورافنیب (10 میکرومولار) و همچنین ترکیب A01 و سورافنیب همگی به طور قابل توجهی از تشکیل ساختارهای رگ مانند با مهار قوی تر با ترکیب A01 و سورافنیب جلوگیری کردند. A01 یا سورافنیب به تنهایی (شکل 4a و c). علاوه بر این، مهاجرت سلولی HUVECs یک گام کلیدی برای تشکیل عروق جدید در طول رگ زایی است و از این طریق مورد بررسی قرار می گیرد. همانطور که در شکل 4b و d نشان داده شده است، A01 (500 میکرومولار)، سورافنیب (10 میکرومولار) و همچنین ترکیب A01 (100 و 500 میکرومولار) و سورافنیب (10 میکرومولار) همگی به طور قابل توجهی مهاجرت سلولی HUVECs را مهار کردند. A01 (500 میکرومولار) همراه با سورافنیب (10 میکرومولار) مهار قوی‌تری نسبت به A01 (500 میکرومولار) یا سورافنیب (10 میکرومولار) به تنهایی ایجاد کرد.

اثرات A01 به تنهایی یا همراه با سورافنیب بر رشد تومور درون تنی بیگانه‌گرافت‌های BEL7404 و JHH-7 HCC

برای ارزیابی بیشتر اثربخشی A{8}}1 به تنهایی یا همراه با سورافنیب بر رشد تومور درون تنی HCC، یک مدل موش برهنه زنوگرافت زیر جلدی با استفاده از BEL7404 یا JHH-7 ایجاد کردیم. سلول ها. همانطور که در شکل 5 نشان داده شده است، حجم تومور پس از درمان با A{17}}1 (25 و 5{29}} mg/kg، از طریق گاواژ خوراکی؛ 20 mg/kg، به شدت کاهش یافت. از طریق ورید دم؛ همه p <0.01 در="" مقابل="" گروه="" مدل)="" یا="" سورافنیب="" (50="" میلی="" گرم="" بر="" کیلوگرم،="" از="" طریق="" گاواژ="" خوراکی؛="" p=""><0.01 در="" مقابل="" گروه="" مدل)="" به="" تنهایی="" (شکل="" 5a="" و="" b).="" ترکیب="" a01="" (50="" میلی‌گرم="" بر="" کیلوگرم)="" و="" سورافنیب="" (50="" میلی‌گرم="" بر="" کیلوگرم)="" در="" مقایسه="" با="" سورافنیب="" به="" تنهایی،="" مهار="" قوی‌تری="" از="" رشد="" تومور="" را="" نشان="" داد=""><)، اما="" اثری="" مشابه="" با="" a01="" به="" تنهایی="" ایجاد="" کرد="" (شکل="" 5a="" و="" c).="" ).="" ما="" در="" مرحله="" بعد="" از="" مدل="" موش="" برهنه="" زنوگرافت="" jhh{21}}="" برای="" آزمایش="" بیشتر="" اثرات="" ضد="" توموری="" احتمالی="" a01="" استفاده="" کردیم.="" همانطور="" که="" در="" شکل="" 6="" نشان="" داده="" شده="" است،="" درمان="" با="" a01="" (20="" میلی="" گرم="" بر="" کیلوگرم،="" iv)="" یا="" سورافنیب="" (50="" میلی="" گرم="" بر="" کیلوگرم،="" ig)="" باعث="" مهار="" قابل="" توجهی="" از="" رشد="" تومور="" پیوند="" jhh{28}}="" شد="">< در="" مقابل="" گروه="" مدل).="" هنگامی="" که="" با="" هم="" ترکیب="" شوند،="" با="" مهار="" بیشتر="" (شکل="" 6a="" و="" b؛="" p=""><0.01 در="" مقابل="" a01="" یا="" گروه="" sorafenib="" به="">

مدولاسیون احتمالی پپتیداز مرتبط با کالیکرئین و p53 توسطاکتئوزید از سیستانچ

پپتیداز مرتبط با کالیکرئین (KLK) به عنوان یک نشانگر زیستی سرطان در تشخیص و پیش آگهی سرطان های مختلف، از جمله کارسینوم سلول های کبدی به دلیل بیان بی نظم آن پیشنهاد شده است [17-19]. در این سناریو، بیان ژن KLK1-15 را در رده سلولی HCC JHH{5}} شناسایی کردیم. همانطور که در شکل 7 نشان داده شده است، تیمار با اکتئوزید باعث مهار قابل توجهی از سطوح mRNA KLK1، 2، 4، 9 و 10 شد (شکل 7a-e)، بدون تغییر قابل توجهی در بقیه KLK1-15 (داده ها نشان داده نشده است. ). علاوه بر این، سطح پروتئین p53 سرکوبگر تومور را نیز شناسایی کردیم و افزایش را با درمان با اکتئوزید نشان دادیم (شکل 7f).

بحث

مدیریت HCC پیشرفته به دلیل ناتوانی در تشخیص در مراحل اولیه و مقاومت شیمیایی تومور برای مدت طولانی غیرقابل حل بوده است [5، 6]. سورافنیب، مهارکننده مولتی کیناز گزارش شده که از تکثیر سلولی و رگزایی جلوگیری می کند، همراه با یک مهارکننده خوراکی مولتی کیناز، لنواتینیب، به درمان استاندارد HCC پیشرفته تبدیل شده است [3، 5، 20، 21]. با این حال، نرخ بقای کلی با توجه به نرخ پاسخ پایین و نامناسب بودن در تنظیمات بالینی متوسط ​​است [3، 22]. یک مطالعه اخیر نشان داد که آتزولیزوماب به همراه بواسیزوماب نتایج بالینی بهتری نسبت به سورافنیب در بیماران مبتلا به HCC غیرقابل برداشت ایجاد می‌کند و این ترکیب را به یک گزینه درمانی جدید و جدید برای HCC پیشرفته تبدیل می‌کند [7]. در این زمینه، ما شناسایی کرده ایم که گلیکوزید فنیل اتانوئید،اکتئوزید از سیستانچمهار تکثیر سلولی، تشکیل کلنی و مهاجرت در سه رده سلولی HCC انسانی BEL7404، HLF، و JHH-7 و همچنین رگزایی HUVECs را ممنوع کرد. ترکیب اکتئوزید و سورافنیب باعث مهار قوی‌تر تشکیل کلنی سلولی و مهاجرت سلول‌های HCC و همچنین رگ‌زایی HUVECs شد. Acteoside اثر ضد توموری را در مدل موش‌های برهنه پیوند زنوگرافت BEL7404 یا JHH{3}} ارائه می‌کند، با افزایش زمانی که با سورافنیب ترکیب می‌شود در مهار رشد زنوگرافت JHH{4}}. آنالیزهای بیشتر افزایش p53 و همچنین کاهش برخی از ژن های KLK را نشان داد. بر این اساس، استفاده احتمالی از اکتئوزید به عنوان مکمل در درمان HCC پیشرفته در کلینیک باید مورد توجه قرار گیرد.

شواهد در حال افزایش اثرات ضد توموری را نشان داده استاکتئوزید از سیستانچدر سلول‌های تومورهای مختلف مانند سلول‌های ملانوم B16، سلول‌های گلیوبلاستوم، سلول‌های سرطان کولورکتال، سلول‌های کارسینوم سلول سنگفرشی دهان، سلول‌های سرطان پروستات و سلول‌های آدنوکارسینومای پستان انسان [11-13، 23-25] یا در حیواناتی که تومور دارند [12]. با وجود آن، مطالعات کمی بر روی اثرات اکتئوزید بر HCC در شرایط آزمایشگاهی یا درون تنی متمرکز شده‌اند، به جز یک مطالعه که از دی‌اتیل نیتروزامین به‌عنوان ماده سرطان‌زا برای القای سرطان کبد در موش‌ها استفاده می‌کند و پیشگیری شیمیایی توسط اکتئوزید را آشکار می‌کند [26]. در مطالعه حاضر، ما مهار تکثیر سلولی، تشکیل کلنی، و مهاجرت در رده‌های سلولی HCC و همچنین رشد تومور را در موش‌های حامل زنوگرافت رده سلولی HCC نشان دادیم، در نتیجه مستقیماً اثرات ضد توموری اکتئوزید در HCC را نشان دادیم. علاوه بر این، ترکیب اکتئوزید و سورافنیب اثرات ضد توموری قوی تری ایجاد کرد. همراه با شواهدی مبنی بر اینکه اکتئوزید در برابر صدمات کبدی محافظت می کند [27-29] بدون اثرات سمی در حیوانات و بدون جهش زایی [30]، به نظر می رسد برای کاربرد آتی درمان ترکیبی اکتئوزید و سورافنیب در بیماران مبتلا به پیشرفته امکان پذیر باشد. HCC در کلینیک

خانواده کالیکرئین انسانی شامل 15 پروتئاز سرین تریپسین یا کیموتریپسین مانند همولوگ، تک زنجیره ای ترشح شده (KLK1-15) است و در تنظیم رشد تومور، پیشرفت نئوپلاستیک، رگزایی و متاستاز نقش دارد [18، 31]. به طور خاص، KLKs به عنوان یک نشانگر زیستی سرطان در تشخیص و پیش‌آگهی سرطان‌های مختلف، از جمله کارسینوم سلول‌های کبدی به دلیل بیان بی‌نظم آن پیشنهاد شده است [17-19]. به عنوان مثال، KLK1 به عنوان نشانگر زیستی سرطان معده به دلیل افزایش سطح KLK1 در نئوپلاسم معده و جلوگیری از رشد تومور در سرطان معده با مهار فعالیت KLK1 با پروتئین متصل شونده به کالیکرئین (KBP) پیشنهاد شده است [32]. در این سناریو، ما مهار قابل توجهی از سطوح mRNA KLK توسط اکتئوزید (KLK1، 2، 4، 9، و 10) را مشاهده کردیم. استفاده از KBP، که به طور خاص به کالیکرئین بافت متصل می شود و فعالیت کالیکرئین را مهار می کند، احتمالاً از طریق فعالیت ضد رگ زایی آن، رشد HCC را در موش سرکوب می کند [33]، که نشان دهنده دخالت احتمالی KLKs در پیشرفت HCC است. علاوه بر این، پروتئین p53 سرکوبگر تومور قادر به القای پیری، آپوپتوز و همچنین توقف چرخه سلولی است. افزایش بیان p53 باعث افزایش حساسیت شیمیایی در سلول های سرطانی می شود [34]. در این راستا، نتایج غربی ما افزایش سطح p53 را به دنبال درمان با اکتئوزید نشان داد. روی هم رفته، منطقی است استنباط کنیم که اکتئوزید احتمالاً از طریق تنظیم بالای p53 و همچنین مهار KLK و رگزایی، اثرات ضد توموری را بر HCC اعمال می کند.

لازم به ذکر است که هدف مولکولی مستقیم به آناکتئوزید از سیستانچمی تواند به طور مستقیم متصل شود هنوز نامشخص است. داده های اولیه ما با استفاده از اتصال مولکولی اتصال مستقیم اکتئوزید با کالیکرئین را نشان داد (داده ها نشان داده نشده است). آزمایش های بیشتری برای روشن شدن این فرض ضروری است. علاوه بر این، در مورد دوزهای اکتئوزید مورد استفاده برای سنجش سلولی در مطالعه 10-50 برابر بیشتر از سورافنیب (10 میکرومولار)، ابتدا آن دوزهای اکتئوزید را مطابق با رابطه دوز-پاسخ در سنجش MTT دوم، دوزهایی که ما استفاده کردیم (100، 500 میکرومولار) با مطالعات قبلی [35] قابل مقایسه بود، که در آن اکتئوزید (100 میکرومولار) از تکثیر سلولی سلول‌های سرطان کولورکتال جلوگیری می‌کرد. در آخر، علیرغم دوز بالاتر در آزمایش سلولی، اکتئوزید در مطالعه ما (25 و 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم)، مانع رشد تومور در مدل موش برهنه زنوگرافت HCC شد، که اثرات مشابه سورافنیب (50 میلی‌گرم بر کیلوگرم) بود. برای سورافنیب، در مطالعه ما با دوز 10 میکرومولار در سطح سلولی استفاده شد. این دوز با مطالعات قبلی قابل مقایسه است که در آنها مشخص شد که سورافنیب زنده ماندن سلولی را با IC50 4.0-6.5 میکرومولار در رده های سلولی HCC سلول های PLC/PRF/5 و HepG2 مهار می کند. در مقابل، دوز سورافنیب مورد استفاده برای سرکوب رشد بیگانه‌گرافت‌های HCC در موش‌های ماده SCID 30 میلی‌گرم بر کیلوگرم (پو با گاواژ) بود [36]. در کلینیک، دوز توصیه شده سورافنیب برای بیمار 400 میلی گرم در نوبت (2*0.2 گرم)، دو بار در روز (در مجموع 800 میلی گرم در روز) است. این دوز برای سورافنیب مورد استفاده در کلینیک با دوز مورد استفاده در سنجش سلولی (مقدار IC50 در سطح میکرومولار)، احتمالاً به دلیل جذب ضعیف آن در شرایط in vivo است. برای آکتئوزید، بر اساس دوز آن در موش (50 میلی گرم بر کیلوگرم، IG)، دوز معادل آن برای انسان (60 کیلوگرم وزن بدن) حدود 250 میلی گرم است. این دوز با سورافنیب مورد استفاده در کلینیک قابل مقایسه است و باید برای بیماران قابل قبول باشد.

نتیجه گیری در نتیجه،اکتئوزید از سیستانچقادر به اعمال یک اثر ضد توموری در رده‌های سلولی HCC و در موش‌های برهنه دارای پیوند زنوگرافت رده سلولی HCC است که احتمالاً از طریق افزایش سطح p53 و همچنین جلوگیری از KLK و رگ‌زایی تأثیر می‌گذارد. Acteoside می تواند به عنوان یک مکمل در درمان HCC پیشرفته در کلینیک مفید باشد.

منابع

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. آمار جهانی سرطان 2018: برآوردهای GLOBOCAN از بروز و مرگ و میر در سراسر جهان برای 36 سرطان در 185 کشور. CA سرطان جی کلین. 2018؛ 68 (6): 394-424..

2. Llovet JM، Zucman-Rossi J، Pikarsky E، Sangro B، Schwartz M، Sherman M، Gores G. سرطان هپاتوسلولار. Nat Rev Dis Primers. 2016؛ 2:16018.

3. Sim HW، Knox J. کارسینوم سلولهای کبدی در عصر ایمونوتراپی. مشکل سرطان. 2018؛ 42 (1): 40-8. 4. Jiang Y، Han QJ، Zhang J. کارسینوم سلولهای کبدی: مکانیسم های پیشرفت و ایمونوتراپی. جهانی جی گاستروانترول. 2019؛ 25 (25): 3151-67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Controversies in the management of hepatocellular carcinoma. JHEP Rep. 2019؛ 1 (1): 17-29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. تشخیص و درمان کارسینوم کبدی. سمین تشخیص پاتول. 2017؛ 34 (2): 153-9.

7. Finn RS، Qin S، Ikeda M، Galle PR، Ducreux M، Kim TY، Kudo M، Breder V، Merle P، Kaseb AO، و همکاران. آتزولیزوماب به همراه بواسیزوماب در سرطان کبدی غیرقابل برداشت. N Engl J Med. 2020؛ 382 (20): 1894-905.

8. He ZD، Ueda S، Akaji M، Fujita T، Inoue K، Yang CR. گلیکوزیدهای مونوترپنوئید و فنیل اتانوئید از Ligustrum peduncular. فیتوشیمی. 1994؛ 36 (3): 709-16.

9. Li H، Chou GX، Wang ZT، Hu ZB. تعیین HPLCاکتئوزیددر Radix Rehmanniae. ژونگگو ژونگ یائو زا ژی. 2006؛ 31 (10): 822-4.

10. Wong IY، He ZD، Huang Y، Chen ZY. فعالیت آنتی اکسیدانی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از Ligustrum purpurascens. J Agric Food Chem. 2001؛ 49 (6): 3113-9.

11. Mulani SK، Guh JH، Mong KK. یک استراتژی کلی مصنوعی و خواص ضد تکثیر روی رده های سلولی سرطان پروستات برای گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید طبیعی Org Biomol Chem. 2014؛ 12 (18): 2926-37.

12. Cheimonidi C، Samara P، Polychronopoulos P، Tsakiri EN، Nikou T، Myrianthopoulos V، Sakellaropoulos T، Zoumpourlis V، Mikros E، Papassideri I، و همکاران. سمیت سلولی انتخابی ماده گیاهی اکتئوزید در برابر سلول های تومور و بینش مکانیکی آن ردوکس بیول. 2018؛ 16:169-78.

13. Attia YM، El-Kersh DM، Wagdy HA، Elmazar MM. Verbascoside: شناسایی، کمی سازی، و حساسیت بالقوه سلول های سرطانی کولورکتال به 5-FU با هدف قرار دادن مسیر PI3K/AKT. Sci Rep. 2018؛ 8 (1): 16939.

14. Liu S، Zhao Z، Huo Z، Xu Z، Zhong Y، Wang X، Yang Y، Wang Z. عصاره آبی گل Osmanthus fragrans و اکتئوزید غنی شده آن، ملانوژنز و رنگدانه های ناشی از اشعه ماوراء بنفش را مهار می کند. Nat Prod Commun. 2018؛ 13 (5): 575-80.

15. Wang J، Ma S، Chen X، Zhang S، Wang Z، Mei Q. مهارکننده جدید PI3K S1 با سورافنیب در سلول‌های سرطانی سلول غیرکوچک ریه که سیگنال‌دهی Akt-S6 را درگیر می‌کنند، هم‌افزایی می‌کند. بررسی داروهای جدید 2019؛ 37 (5): 828-36.

16. Hanahan D، Weinberg RA. علائم سرطان: نسل بعدی سلول. 2011؛ ​​144 (5): 646-74. 17. امامی ن، دیاماندیس EP. کاربرد پپتیدازهای مرتبط با کالیکرئین (KLKs) به عنوان نشانگرهای زیستی سرطان. کلین شیمی. 2008؛ 54 (10): 1600-7.

18. Tailor PD، Kodeboyina SK، Bai S، Patel N، Sharma S، Ratnani A، Copland JA، She JX، Sharma A. پتانسیل بیومارکر تشخیصی و پیش آگهی ژن های خانواده کالیکرئین در انواع مختلف سرطان. انکوتارگت. 2018؛ 9 (25): 17876-88.

19. Kontos CK، Mavridis K، Talieri M، Scorilas A. پپتیدازهای مرتبط با Kallikrein (KLKs) در سرطان دستگاه گوارش: جنبه های مکانیکی و بالینی. ترومب هموست. 2013؛ 110 (3): 450-7.

20. Cheng AL، Kang YK، Chen Z، Tsao CJ، Qin S، Kim JS، Luo R، Feng J، Ye S، Yang TS، و همکاران. اثربخشی و ایمنی سورافنیب در بیماران منطقه آسیا و اقیانوسیه مبتلا به سرطان کبدی پیشرفته: یک کارآزمایی تصادفی، دوسوکور و کنترل شده با دارونما فاز III. Lancet Oncol. 2009؛ 10 (1): 25-34. 21. Llovet JM، Ricci S، Mazzaferro V، Hilgard P، Gane E، Blanc JF، de Oliveira AC، Santoro A، Raoul JL، Forner A، و همکاران. سورافنیب در کارسینوم سلولی پیشرفته کبدی. N Engl J Med. 2008؛ 359 (4): 378-90.

22. آهنگ ام جی. شیمی درمانی انفوزیون شریان کبدی برای کارسینوم سلولی پیشرفته کبدی. جهانی جی گاستروانترول. 2015؛ 21 (13): 3843-9.

23. Liao YF، Rao YK، Tzeng YM. عصاره آبی Anisomeles India و ترکیب خالص‌شده آن از طریق مهار فعال‌سازی NF kappaB/AP-1-وابسته MMP{3}} در سلول‌های MCF{4}} سرطان سینه انسان، فعالیت ضد متاستاتیکی دارد. مواد غذایی شیمیایی سم. 2012؛ 50 (8): 2930-6.

24. Zhang Y، Yuan Y، Wu H، Xie Z، Wu Y، Song X، Wang J، Shu W، Xu J، Liu B، و همکاران. اثر ورباسکوزید بر آپوپتوز و متاستاز در کارسینوم سلول سنگفرشی دهان انسان. Int J سرطان. 2018؛ 143 (4): 980-91.

25. هوانگ تی دبلیو، کیم دی اچ، کیم دی بی، جانگ تی دبلیو، کیم جی اچ، مون ام، یون کا، چوی دی، پارک جی اچ، کیم جی جی. اثر ضد سرطان سینرژیست شیمی درمانی گلیوبلاستوما مبتنی بر اکتئوزید و تموزولوماید. Int J Mol Med. 2019; 43 (3): 1478-86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. اکتئوزید از طریق استرس اکسیداتیو و آپوپتوز تنظیم‌شده STAT، پیشگیری شیمیایی از سرطان‌زایی تجربی کبد را واسطه می‌کند. سم محیطی 2016؛ 31 (7): 782-98.

27. Cui Q، Pan Y، Zhang W، Zhang Y، Ren S، Wang D، Wang Z، Liu X، Xiao W. متابولیت‌های Acteoside رژیمی: پروفایل‌ها، جداسازی، شناسایی و ظرفیت‌های محافظت از کبد. J Agric Food Chem. 2018؛ 66 (11): 2660-8.

28. Xiong Q، Hase K، Tezuka Y، Namba T، Kadota S. Acteoside آپوپتوز را در D-galactosamine و آسیب کبدی ناشی از لیپوپلی ساکارید مهار می کند. زندگی علمی. 1999؛ 65 (4): 421-30.

29. Zhao J، Liu T، Ma L، Yan M، Zhao Y، Gu Z، Huang Y. اثر محافظتی اکتئوزید بر آسیب ایمونولوژیک کبد ناشی از Bacillus Calmette Guerin به همراه لیپوپلی ساکارید. Planta Med. 2009؛ 75 (14): 1463-9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. عصاره غنی از گلیکوزید فنیل اتانوئید گل معطر Osmanthus: مطالعات سمیت حاد و تحت مزمن. جی اتنوفارماکول. 2016؛ 187:205-12.

31. دیاماندیس ای پی یوسف جی.ام. کالیکرئین های بافت انسانی: خانواده ای از نشانگرهای زیستی سرطان جدید کلین شیمی. 2002؛ 48 (8): 1198-205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. مقایسه بیان گیرنده های کالیکرئین و کینین بافتی در زخم ها و نئوپلاسم های معده. INT Immunopharmacol. 2001؛ 1 (12): 2063-80.

33. Lu L، Yang Z، Zhu B، Fang S، Yang X، Cai W، Li C، Ma JX، Gao G. پروتئین اتصال دهنده Kallikrein با فعالیت ضد رگ زایی رشد سرطان کبد را سرکوب می کند. سرطان لت. 2007؛ 257 (1): 97-106.

34. Guntur VP، Waldrep JC، Guo JJ، Selting K، Dhand R. افزایش پروتئین p53 سرطان ریه سلول غیر کوچک را به پاکلی تاکسل و سیس پلاتین در شرایط آزمایشگاهی حساس می کند. ضد سرطان Res. 2010؛ 30 (9): 3557-64.

35. Zhou L، Feng Y، Jin Y، Liu X، Sui H، Chai N، Chen X، Liu N، Ji Q، Wang Y، Li Q. Verbascoside با تنظیم سیگنال‌دهی HIPK{1}}p53 در انسان، آپوپتوز را ترویج می‌کند. سرطان روده بزرگ. سرطان BMC. 2014؛ 14:747.

36. Liu L، Cao Y، Chen C، Zhang X، McNabola A، Wilkie D، Wilhelm S، Lynch M، Carter C. Sorafenib مسیر RAF/MEK/ERK را مسدود می کند، رگزایی تومور را مهار می کند و آپوپتوز سلول تومور را در سلول های کبدی القا می کند. کارسینوم مدل PLC/PRF/5. سرطان Res. 2006؛ 66: 11851-8.