اثرات مفید Verbascoside از Cistanche Herb

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

ورباسکوزید با مهار فعالیت سم آلفا و پرفرینگولیزین O از موش ها در برابر گانگرن گازی کلستریدیال محافظت می کند.

گانگرن گازی که عمدتاً توسط باکتری بی هوازی کلستریدیوم پرفرنجنس (C. perfringens) ایجاد می شود، ظرف 48 ساعت پس از شروع باعث مرگ می شود. استراتژی های درمانی محدودی در دسترس است و با مرگ و میر بسیار بالایی همراه است. هر دو C. perfringens آلفا سم (CPA) و perfringolysin O (PFO) عوامل بیماری زای مهم در ایجاد گانگرن گازی هستند، که نشان می دهد آنها اهداف درمانی هستند. در اینجا، ما آن را پیدا کردیمورباسکوزید, a گلیکوزید فنیل پروپانوئیدبه طور گسترده در داروهای گیاهی چینی Cistancheمی تواند به طور موثری فعالیت بیولوژیکی CPA و PFO را در سنجش همولیتیک مهار کند.

الیگومریزاسیون PFO بطور قابل ملاحظه ای توسط ورباسکوزید مهار شد. اگرچه هیچ فعالیت ضد باکتریایی مشاهده نشد،ورباسکوزیددرمان سلول های Caco-2 را از آسیب ناشی از CPA و PFO محافظت کرد. علاوه بر این، موش های آلوده تحت درمان قرار گرفتندورباسکوزیدقابل توجهی نشان دادخسارت را کاهش داد, کاهش بار باکتریایی، وکاهش مرگ و میر. به طور خلاصه،ورباسکوزید دارای اثر درمانی موثری در برابر بیماریزایی C. perfringens در شرایط آزمایشگاهی و درون تنی است.با هدف قرار دادن همزمان CPA و PFO. نتایج ما یک استراتژی امیدوارکننده و یک ترکیب سرب بالقوه برای عفونت های C. perfringens، به ویژه قانقاریا گازی ارائه می دهد.

کلیدواژه ها: آلفا توکسین، ضد عفونت، کلستریدیوم پرفرنجنس، گانگرن گازی، پرفرنگولیزین O، ورباسکوزید

کلستریدیوم پرفرنجنس (C. perfringens) یک باکتری بی هوازی گرم مثبت است که به طور گسترده در طبیعت و در روده انسان پراکنده شده است (Fraser and Collee, 1975). C. perfringens می تواند چهار سم اصلی ترشح کند (،، ε، و Ì) و بر این اساس به پنج سروتیپ A-E تقسیم می شود (Titball، 2005). در انسان، C. perfringens می‌تواند باعث بیماری‌های مختلفی مانند مسمومیت غذایی و گانگرن گازی شود، که مورد دوم می‌تواند در حیواناتی مانند گربه، گاو، سگ، گوسفند، اسب و بز نیز رخ دهد (Verherstraeten et al. ، 2015). دوره کمون گانگرن گازی کوتاه است و عفونت می تواند در عرض 6 تا 8 ساعت ایجاد شود (Uzal et al., 2015). به طور جدی تر، بیش از 50 درصد از مبتلایان به سموم سیستمیک ادامه خواهند داد که در نهایت منجر به مرگ می شود. بنابراین، بدون تجویز به موقع و موثر درمان، گانگرن گازی می تواند منجر به خسارات اقتصادی جدی شود (Low et al., 2018). با این حال، درمان‌های معمول، مانند درمان آنتی‌بیوتیکی و درمان جراحی برای قانقاریا گازی، همگی دارای معایب خاصی از جمله مقاومت آنتی‌بیوتیکی و آسیب قطع عضو به بیماران هستند، اما نه محدود به آن (پارک و همکاران، 2010؛ عثمان و الحریری، 2013). بنابراین، یافتن روش ها یا ایده های جدیدی برای درمان قانقاریا گازی ضروری است.

گانگرن گازی کلستریدیایی یک بیماری عفونی شعله ور است که عمدتاً در اثر برهمکنش سم C. perfringens (CPA) و perfringolysin O (PFO) ایجاد می شود (Hifumi et al., 2018). CPA که متعلق به خانواده آنزیم‌های روی متالو فسفولیپاز باکتریایی است، توسط تمام C. perfringens تولید می‌شود، توسط کروموزوم‌ها کدگذاری می‌شود، یک سم اصلی در C. perfringens است و فعالیت‌های فسفولیپاز C و اسفنگومیلیناز را نشان می‌دهد (van Bunderen et al. ، 2010؛ ماساتاکا و همکاران، 2015). در دهه 1990، عوض و همکاران. (1995) از جهش‌های CPA برای آزمایش مدل موش گانگرن گازی استفاده کردند و دریافتند که سویه‌های فاقد ژن CPA، بیماری‌زایی کاهش یافته و آسیب بافتی کمتری پس از عفونت نشان می‌دهند. این کار تایید کرد که CPA سم اصلی در گانگرن گازی است. در سال 2000، آلبرتو با ساخت یک مدل مولکولی از a-toxin و جهش یافته های سه حلقه ای در دامنه C ترمینال، مطالعات عمیقی انجام داد و فعالیت همولیتیک و سمیت سلولی جهش یافته ها در مقایسه با نوع وحشی کاهش یافت. نشان داده شد که فعالیت اسفنگومیلیناز و دامنه C ترمینال برای سمیت قلبی در داخل بدن ضروری هستند (Alape-Giron و همکاران، 2000). PFO، یک سیتولیزین وابسته به کلسترول (CDC)، با غشای سلولی به عنوان یک مونومر برهمکنش می‌کند و کمپلکس تهیه‌شده سپس با الیگومریزاسیون وارد لایه پشتیبان غشایی می‌شود و در نهایت سلول‌های میزبان را لیز می‌کند (جانسون و هیوک، 2014). اگرچه PFO برای کشندگی ضروری نیست، اما می تواند باعث سمیت سلولی ماکروفاژها در مراحل اولیه میونکروز شود و برای تشکیل ترومبوز در مراحل پایانی عفونت مهم است و به پاتوژنز گانگرن گازی کمک می کند (Verherstraeten et al., 2015). CPA می تواند با PFO ترکیب شود تا به نوتروفیل های انباشته شده در محل آلوده آسیب برساند و باعث اختلال عملکرد سلول های اندوتلیال، ادم و ایسکمی شود و در نهایت منجر به هیپوکسی بافتی شود و یک محیط بی هوازی مطلوب برای رشد و تولید مثل C. perfringens فراهم کند (برایانت و استیونز، 1996). ). بنابراین، این مطالعه CPA و PFO را هدف قرار می‌دهد و هدف آن نشان دادن روشی جدید برای درمان قانقاریا گازی است.

در این مطالعه، دو بازدارنده سم از 17 ترکیب طبیعی با همولیز غربالگری شدند تا یک مهارکننده بالقوه گانگرن گازی پیدا شود. داده های همولیتیک برای ترکیبات مختلف در جدول 1 نشان داده شده است. در میان 17 نوع ترکیب طبیعی، ورباسکوزید بهترین اثر بازدارندگی را بر روی هر دو سم دارد، و بنابراین ما ورباسکوزید را به عنوان ترکیب هدف برای این مطالعه انتخاب کردیم. ورباسکوزید به طور گسترده در گیاهان دارویی مختلف چینی مانند سیستانچ توزیع می شود و از آن جدا و استخراج شده است.ورباسکوزیدتوسط یک دانشمند ایتالیایی در سال 1963 (Speranza و همکاران، 2010؛ ژو و همکاران، 2016). مطالعات نشان داده است کهورباسکوزید اثرات بیولوژیکی و دارویی زیادی دارد، مانندخواص ضد التهابی، آنتی اکسیدانی، ضد باکتریایی، ضد توموری، ضد قارچی و کیلاسیون، وقابل استفاده در لوازم آرایشی پوستوآماده سازی موضعیگزارش های دیگر نشان داده اند که ورباسکوزید می تواند در عرض 1 ساعت به طور کامل جذب شود و به غلظت خونی بالایی برسد و فراهمی زیستی آن در هنگام زایمان از طریق روش های مختلف تزریقی از 25 درصد تجاوز نمی کند (Dai et al., 2017; Feng et al., 2018). بر اساس فعالیت‌های دارویی ذکر شده، این مطالعه مهارکننده را پیدا و مورد بررسی قرار داداثرات ورباسکوزیددر مورد قانقاریا گازی از طریق یک سری آزمایشات in vitro و in vivo.

Verbascoside فعالیت همولیتیک PFO و CPA را مهار کرد

گزارش شده است که برخی از فلاونوئیدها مهارکننده‌های مؤثری در برابر سموم منافذ هستند (لی و همکاران، 2013؛ وانگ و همکاران، 2017؛ ژو و همکاران، 2017). در اینجا، verbascoside، یک فنیل پروپانوئید، برای مهار فعالیت همولیتیک هر دو PFO و سموم CPA ترشح شده توسط C. perfringens پیدا شد. هنگامی که غلظت ورباسکوزید از 2 تا 32|ig/mL بود، تیمار ورباسکوزید به طور قابل توجهی فعالیت همولیتیک این سموم را به روشی وابسته به دوز مهار کرد، که نشان می‌دهد ورباسکوزید یک مهارکننده موثر PFO و CPA است.

ورباسکوزید بر رشد C. perfringens تأثیری ندارد

We further performed MIC and bacterial growth curve studies to determine the antibacterial activity of verbascoside against C. perfringens, revealing a MIC assay result (Figure 2A) >256|ig/mL. به طور مشابه، نتایج منحنی رشد باکتری (شکل 2B) نشان می دهد که ورباسکوزید بر رشد طبیعی باکتری تأثیر نمی گذارد. با هم، نتایج ما نشان می دهد که درمان ورباسکوزید هیچ تاثیری بر زنده ماندن C. perfringens در غلظت های مورد نیاز برای مهار فعالیت PFO و CPA ندارد.

Verbascoside از سلول ها در برابر آسیب های ناشی از PFO یا CPA محافظت می کند

Clostridium perfringens آلفا سم و PFO در C. perfringens سموم اصلی هستند که باعث گانگرن گازی می شوند. بنابراین، اینکه آیا ورباسکوزید می تواند سلول ها را از این دو سم محافظت کند نیز مورد بررسی قرار گرفت. ابتدا یک آزمایش سمیت سلولی با داروی verbascoside انجام دادیم که به سلول ها آسیبی نمی رساند (شکل 3A). سپس این ترکیب به سیستم هم کشت سلولی و PFO یا CPA اضافه شد. Vارباسکوزید سمیت سلولی این دو سم را مهار کرددر سلول های Caco{{0}}. در مقایسه با نمونه‌هایی که با ورباسکوزید تیمار نشده‌اند، آسیب ناشی از سموم به سلول‌های کاکو{1}} تیمار شده با ورباسکوزید در سطح {5}}. جیگ در میلی‌لیتر به طور قابل توجهی به صورت وابسته به دوز کاهش یافت. به خصوص برای پروتئین PFO، سلول ها به طور موثر در غلظت دارویی 25/0/{ سنجش زنده ماندن/مرگ سلولی بعدی (شکل 3D-K) بیشتر برای اثبات این اثر محافظتی مورد استفاده قرار گرفت. همانطور که انتظار می رفت، درمان با ورباسکوزید به وضوح در برابر آسیب سلولی ناشی از PFO یا CPA محافظت می کند. روی هم رفته، نتایج ما نشان داد که ورباسکوزید به طور قابل توجهی آسیب سلولی ناشی از PFO یا CPA را به روشی وابسته به دوز مهار می کند.

ورباسکوزید با کاهش الیگومریزاسیون آن، فعالیت همولیتیک PFO را مهار می کند.

فعالیت همولیتیک PFO باید با وقوع الیگومریزاسیون و تشکیل منافذ همراه باشد (جانسون و هیوک، 2014). در اینجا، الیگومریزاسیون PFO توسط KCl و خون خرگوش القا شد، و الیگومریزاسیون PFO تشخیص داده شد (شکل 4)، که نشان دهنده کاهش شدت نوار الیگومریزاسیون با افزایش غلظت ورباسکوزید است. با هم، نتایج ما نشان می‌دهد که درمان با ورباسکوزید از الیگومریزاسیون PFO جلوگیری می‌کند و در نتیجه فعالیت همولیتیک این سم را کاهش می‌دهد.

Verbascoside از موش ها در برابر عفونت C. perfringens محافظت می کند

یک مدل ماهیچه پای موش از قانقاریا برای تعیین اینکه آیا حفاظت مشاهده شده در شرایط آزمایشگاهی می تواند در داخل بدن نیز مشاهده شود ایجاد شد. پاهای موش‌های آلوده به ATCC{0}}در مقابل، تعداد سلول‌های التهابی در گروه دارو به طور قابل‌توجهی کاهش یافت و بافت پس از درمان با ورباسکوزید سالم ماند. علاوه بر این، تعداد باکتری های کلون شده در عضلات پا پس از درمان با ورباسکوزید به طور قابل توجهی کاهش یافت. همانطور که در نتایج آزمایش نشان داده شد، 93.33 درصد از موش های آلوده تا 32 ساعت پس از آلودگی مردند. همانطور که انتظار می‌رفت، نرخ بقای موش‌هایی که ورباسکوزید دریافت کردند 33.33 درصد افزایش یافت، زیرا تنها 60 درصد از موش‌های آلوده مردند (015/0=0 با استفاده از آزمون log-rank). علاوه بر این، درمان با ورباسکوزید اوج دوره مرگ را نزدیک به 8 ساعت به تاخیر انداخت (از 32 ساعت برای موش‌های آلوده به ATCC تا 40 ساعت برای موش‌های تحت درمان با ورباسکوزید) و بنابراین می‌تواند زمان ارزشمند مورد نیاز برای نجات بالینی را افزایش دهد. در مجموع، نتایج ما نشان داد که در موش‌ها، ورباسکوزید می‌تواند از نظر سیستمیک محافظت مؤثری در برابر قانقاریای گازی ناشی از C. perfringens ایجاد کند.

به عنوان یک باکتری بی هوازی گرم مثبت، C. perfringens به طور گسترده در طبیعت پراکنده است و می تواند سموم مختلفی ترشح کند که می تواند منجر به بیماری های مختلفی در انسان و حیوانات شود، از جمله گانگرن گازی (Fraser and Collee, 1975; Verherstraeten et al. .، 2015). قانقاریا گازی عمدتاً در اثر ترکیب سموم a و تتا ترشح شده توسط C. perfringens ایجاد می شود که می تواند منجر به مرگ حیوانات آلوده و در نتیجه خسارات اقتصادی زیادی شود. با این حال، تا به امروز، روش های موثر برای درمان گانگرن گازی شامل اکسیژن هیپرباریک، جراحی و آنتی بیوتیک ها می باشد. در این میان، جراحی می تواند آسیب های فیزیکی قابل توجهی به بیماران وارد کند و تأثیر بسیار نامناسبی بر زندگی پس از عمل داشته باشد. ژن های متعدد مقاومت به تتراسایکلین در جدایه های C. perfringens از سوئد، نروژ، دانمارک و جاهای دیگر یافت شده است. بنابراین، استراتژی ها یا عوامل جدیدی برای مبارزه با این عفونت باکتریایی مورد نیاز است (پارک و همکاران، 2010؛ عثمان و الحریری، 2013). در این مطالعه، ورباسکوزید فنیل پروپانوئید، که با درمان‌های آنتی‌باکتریایی سنتی (آنتی‌بیوتیک‌ها) متفاوت است، می‌تواند فعالیت همولیتیک هر دو CPA و PFO را مهار کند، دو سم مهم منافذ تشکیل که نقش مهمی در بیماری‌زایی C. perfringens دارند. در سطح سلولی، ورباسکوزید همچنین می‌تواند به طور موثری از سلول‌های Caco{6}} از این دو سم در غلظت‌های پایین (0.{8}} ig/mL) محافظت کند. به طور خاص، ورباسکوزید می تواند فعالیت سموم را با مهار الیگومریزاسیون PFO کاهش دهد. این نتایج می تواند داده های پایه کافی برای تحقیقات in vivo را فراهم کند.