قسمت 1 آکتئوزید با مهار القای C-Fos و مسیر NF-kB و کاهش تولید ROS، استئوکلاستوژنز ناشی از RANKL را سرکوب می کند.

قسمت 1 چگونه آکتئوزیدها رشد استخوان را تقویت می کنند؟

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

سونگ-یوپ لی1،2.، کیون سو لی3.¤، سی هیون یی2.، سونگ-هو کوک2، جئونگ-چای لی2،3* 1 موسسه تحقیقاتی پزشکی بالینی دانشگاه ملی چونبوک، موسسه تحقیقات زیست پزشکی دانشگاه ملی چونبوک بیمارستان، جئونجو، چونبوک، کره جنوبی، 2 گروه ارتودنسی، موسسه علوم زیستی دهان و دانشکده دندانپزشکی، دانشگاه ملی چونبوک، جئونجو، چونبوک، کره جنوبی، 3 گروه علوم مواد زیست فعال، مرکز تحقیقات مواد زیست فعال، دانشگاه ملی چونبوک، جئونجو، چونبوک، کره جنوبی

خلاصه

مطالعات متعددی گزارش کرده اند که سایتوکین های التهابی واسطه های مهمی برای استئوکلاستوژنز هستند و در نتیجه باعث تحلیل بیش از حد استخوان و پوکی استخوان می شوند.اکتئوزیدترکیب فعال اصلی Rehmannia glutinosa که در طب سنتی شرقی کاربرد فراوانی دارد، دارای پتانسیل ضد التهابی و آنتی اکسیدانی است. در این مطالعه، ما دریافتیم که سمت CTE به طور قابل توجهی از تمایز و تشکیل استئوکلاست ها از ماکروفاژهای مغز استخوان (BMMs) و ماکروفاژهای RAW264.7 تحریک شده توسط فعال کننده گیرنده لیگاند هسته ای فاکتور کاپاB (NF-kB) (RANKL) جلوگیری می کند. پیش درمانی Acteoside همچنین از تحلیل استخوان توسط استئوکلاست های بالغ به روشی وابسته به دوز جلوگیری کرد. Acteoside (10 میلی‌مولار) فعال‌سازی کیناز p38، کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال خارج سلولی، و کیناز N ترمینال C-Jun را با RANKL تضعیف کرد و همچنین با مهار فسفوریلاسیون زیرواحد p65 kBa و kBa، فعال‌سازی NF-kB را سرکوب کرد. علاوه بر این، با واسطه RANKL در بیان c-Fos و فاکتور هسته ای سلول های T فعال، سیتوپلاسمی 1 (NFATc1) و در تولید فاکتور نکروز تومور-a، اینترلوکین (IL) b افزایش می یابد. و IL{21}} ظاهراً با پیش تیمار اکتئوزید مهار شدند. بعلاوه، آکتئوزید خوراکی از دست دادن استخوان ناشی از تخمدان و تولید سیتوکین التهابی را برای کنترل سطوح کاهش داد. داده های ما این را نشان می دهداکتئوزیدتمایز و بلوغ استئوکلاست ها از پیش سازهای استئوکلاستیک را با سرکوب فعال سازی پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن و فاکتورهای رونویسی مانند NF-kB، c-Fos و NFATc1 ناشی از RANKL مهار می کند. در مجموع، این نتایج نشان می دهد کهاکتئوزیدممکن است به عنوان یک عامل ضد جذب برای کاهش از دست دادن استخوان با مسدود کردن فعال شدن استئوکلاست عمل کند.

برای اطلاعات بیشتر لطفاً تماس بگیرید:ali.ma@wecistanche.com

برای محصولات جلوه های سیستانچ کلیک کنید

مقدمه

استخوان به طور مداوم با فعالیت متعادل استئوکلاست و استئوبلاست بازسازی می شود [1]. استئوکلاست ها از سلول های پیش ساز خونساز دودمان مونوسیت/ماکروفاژ به وجود می آیند، در حالی که استئوبلاست ها از دودمان مزانشیمی هستند [2]. فعال شدن غیر طبیعی استئوکلاست یا کاهش استئوبلاستوژنز می تواند هموستاز استخوان را مختل کند و در نهایت باعث ایجاد بیماری هایی مانند پوکی استخوان، آرتریت و سرطان استخوان شود [3،4]. پوکی استخوان یک بیماری شایع استخوانی است که منجر به افزایش خطر شکستگی می شود. شایع ترین شکل پوکی استخوان ناشی از کمبود استروژن در زنان یائسه است. داروهایی مانند کورتیکواستروئیدها و داروهای ضد صرع نیز ممکن است باعث عدم تعادل بین جذب و تشکیل استخوان شوند که می تواند منجر به پوکی استخوان شود [5]. بسیاری از مهارکننده های ضد جذب از جمله بیس فسفونات ها، کلسی تونین، استروژن و تعدیل کننده های انتخابی گیرنده استروژن برای درمان پوکی استخوان استفاده شده اند. این مهارکننده ها با مهار عملکرد استئوکلاست ها توده استخوانی را حفظ می کنند [6]. درمان جایگزینی استروژن محبوب ترین درمان برای پیشگیری و درمان پوکی استخوان پس از یائسگی است. با این حال، درمان جایگزین استروژن طولانی مدت می تواند خطر ابتلا به سرطان آندومتر و سینه را افزایش دهد. بنابراین، بسیاری از محققین تلاش خود را بر توسعه یک عامل ضد جذب جدید متمرکز کرده اند که عوارض جانبی نداشته باشد [7-10]. از آنجایی که استئوکلاست ها در تحلیل استخوان عمل می کنند، به طور خاص مهار استئوکلاست ها هدف اصلی در مطالعات متعدد در نظر گرفته شده است. استئوکلاست ها سلول های غول پیکر چند هسته ای هستند که توسط پیش سازهای تک هسته ای خانواده مونوسیت/ماکروفاژ از طریق تکثیر متوالی، تمایز و ادغام سلول های پیش ساز خونساز شکل می گیرند [11]. فاکتور تحریک کننده کلنی ماکروفاژها (M-CSF) و فعال کننده گیرنده لیگاند فاکتور هسته ای (NF)-kB (RANK) (RANKL) از عوامل ضروری برای تمایز استئوکلاست ها هستند [12]. علاوه بر این، چندین سایتوکاین التهابی، مانند فاکتور نکروز تومور (TNF) و اینترلوکین (IL){17}}b، با تعدیل القای RANKL، استئوپروتجرین و M-CSF به استئوکلاستوژنز کمک می‌کنند [7،13]. اتصال RANKL به گیرنده RANK سطح سلول منجر به کمپلکس های فاکتورهای مرتبط با RANKL/RANK/TNFR (TRAF) می شود که به طور متوالی NF-kB و پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن (MAPKs)، از جمله کیناز N ترمینال c-Jun (JNK)، p38 را فعال می کند. کیناز و کیناز مرتبط با سیگنال خارج سلولی (ERK) [14]. این فعال‌سازی نقش کلیدی در تمایز، فعال‌سازی و بقای استئوکلاست دارد. RANKL همچنین بیان فاکتورهای رونویسی مانند فاکتور هسته‌ای سلول‌های T فعال، سیتوپلاسمی 1 (NFATc1) و-Fos را فعال می‌کند که برای توسعه استئوکلاست‌ها ضروری هستند. 7،9]. بنابراین، سیگنالینگ RANKL هدف اصلی عوامل ضد جذب است که فعال شدن استئوکلاست و از دست دادن استخوان را سرکوب می کند.

اکتئوزیدترکیب فعال اصلی Rehmannia glutinosa است که به طور گسترده در طب سنتی شرقی استفاده می شود [15،16]. Acteoside یک آنتی اکسیدان قوی است و دارای فعالیت های ضد کبدی، ضد التهابی و ضد درد است [17-20]. قبلا متوجه شدیم کهاکتئوزیدفعالیت تیروزیناز و بیوسنتز ملانین را با تنظیم سیگنال دهی ERK کاهش می دهد [21]، از آسیب لثه با واسطه گونه های اکسیژن فعال (ROS) محافظت می کند [22]، و آسیب سلولی ناشی از مایکوتوکسین را سرکوب می کند [23]. این اثرات ارتباط نزدیکی بااکتئوزیدتوانایی حذف ROS و تنظیم سیگنالینگ با واسطه MAPK. به طور خاص، ROS برای واسطه مسیرهای سیگنالینگ ناشی از RANKL و رویدادهای سلولی در استئوکلاست‌ها پیشنهاد می‌شود. پیش درمانی با آنتی اکسیدان‌ها، فعال‌سازی NF-kB، ERK و IkBa ناشی از RANKL را مهار کرد و در نتیجه استئوکلاستوژنز را سرکوب کرد [24]. این یافته ها قویاً نشان می دهد که علاوه بر فعالیت ضد التهابی، فعالیت آنتی اکسیدانی نیز برای یک عامل ضد جذب بسیار مهم است، بنابرایناکتئوزیدمی تواند استئوکلاستوژنز ناشی از RANKL را سرکوب کند.

در مطالعه حاضر، بررسی کردیم که آیااکتئوزیداثر درمانی بر تحلیل استخوان دارد. اثرات آن را بررسی کردیماکتئوزیددر مورد تمایز استئوکلاست ها و تحلیل استخوان و مکانیسم های سلولی مرتبط با استفاده از سیستم های آزمایشگاهی آزمایشگاهی و درون تنی

مواد و روش ها

بیانیه اخلاق

شیوه‌های مراقبت و استفاده از حیوانات توسط کمیته اخلاق در مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه ملی Chonbuk تأیید شد (شماره مجوز CBU 2010-0007). تمام آزمایشات در این مطالعه بر اساس دستورالعمل کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه انجام شد.

موش، مواد شیمیایی و محصولات آزمایشگاهی

موش های ماده چهار هفته ای ICR از OrientBio Inc. (سئول، کره) خریداری شدند و در دمای 2261 درجه سانتی گراد و رطوبت 5565 درصد در چرخه نور/تاریکی 12 ساعت با دسترسی آزاد به غذا و آب نگهداری شدند. آکتئوزید (3،{6}}دی هیدروکسی-ب-فنتیل-Oa-رامنوپیرانوز-سیل-(1R3){16}}O-کافئویل-bD-گلوکوپیرانوزید؛ C29H36O15) (شکل S1) از برگ های رحمانیا گلوتینوزا. اکتئوزید قبل از استفاده در سالین بافر فسفات (PBS) حل شد. RANKL، TNF-a، IL{27}}b، IL{28}}، و M-CSF از سیستم‌های تحقیق و توسعه (مینیاپولیس، MN، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. آنتی بادی های مخصوص c-Fos، p65، p-p65، p-ERK، ERK، JNK، p-JNK، NFATc1، IkBa، p-IkBa، و b-actin از بیوتکنولوژی سانتا کروز (سانتا کروز، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. ). آنتی بادی برای p-p38 و p38 از Cell Signaling Technology (دانورز، MA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. کیت های سنجش کلسیم و استئوکلسین (OC) EIA به ترتیب از BioAssay Systems (Hayward، CA، USA) و Biomedical Technologies (Stoughton، MA، USA) برای تعیین پارامترهای بیوشیمیایی سرم خریداری شدند. کیت سنجش اسید فسفاتاز مقاوم به تارتارات موش (TRAP) (سیستم‌های تشخیصی ایمنی، اسکاتسدیل، AZ، ​​ایالات متحده آمریکا) نیز برای اندازه‌گیری سطح سرمی TRAP5b استفاده شد. مگر اینکه در غیر این صورت مشخص شود، مواد شیمیایی اضافی از شرکت شیمیایی سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) و محصولات آزمایشگاهی از SPL Life Sciences (پوچون، کره جنوبی) تهیه شد.

کشت های سلولی

سلول‌های مغز استخوان از درشت نی و استخوان ران موش‌های ماده ۶ هفته‌ای ICR بر اساس روش‌هایی که قبلاً توضیح داده شد، به‌دست آمدند [25]. سوسپانسیون مغز استخوان در یک ظرف کشت{3} میلی‌متری در حضور ng/ml 50 M-CSF انکوبه شد. پس از 3 روز، سلول های چسبنده به عنوان ماکروفاژهای مغز استخوان (BMMs) برای القای تمایز استئوکلاستیک استفاده شدند. برخی از سلول های مغز استخوان نیز به مدت 48 ساعت بدون M-CSF انکوبه شدند و سلول های چسبنده در یک محیط تمایز دهنده استئوبلاست، همانطور که در جاهای دیگر توضیح داده شد، کشت داده شدند [25]. سلول‌های ماکروفاژ RAW264.7 در محیط Eagle اصلاح‌شده Dulbecco (DMEM) همراه با 10 درصد سرم جنین گاو (FBS)، 2 میلی‌مولار ال-گلوتامین و آنتی‌بیوتیک‌ها کشت داده شدند. این سلول‌ها به‌عنوان یک خط سلولی همتا برای BMMs برای بررسی اثر اکتئوزید بر استئوکلاستوژنز استفاده شدند.

تمایز استئوکلاستیک و رنگ آمیزی TRAP

BMMها با غلظت‌های مختلف ({0}}-50 میلی‌مولار) آکتئوزید به مدت 2 ساعت قبل از تحریک با 100 نانوگرم در میلی‌لیتر RANKL پیش تیمار شدند. محیط کشت در روزهای 2 و 5 با محیط کشت تازه جایگزین شد. پس از 7 روز انکوباسیون، کشت ها در 4 درصد پارافورمالدئید بافر PBS تثبیت شدند و با استفاده از کیت آلدریچ سیگما طبق دستورالعمل سازنده با TRAP رنگ آمیزی شدند. سلول های TRAP مثبت با استفاده از میکروسکوپ نوری شمارش شدند و سلول های حاوی 3 هسته یا بیشتر به عنوان استئوکلاست در نظر گرفته شدند. سلول های RAW 264.7 نیز پس از پیش تیمار با اکتئوزید به مدت 2 ساعت و پس از 7 روز انکوباسیون در معرض 100ng/ml RANKL قرار گرفتند. سلول ها برای رنگ آمیزی TRAP پردازش شدند.

اندازه گیری زنده ماندن سلول

زنده ماندن سلول ها با استفاده از معرف نمک تترازولیوم محلول در آب (WST) تعیین شد. به طور خلاصه، سلول‌های BMM یا RAW264.7 کشت‌شده در محیط رشد حاوی 10 درصد FBS و آنتی‌بیوتیک‌ها با 10 میلی‌مولار آکتئوزید یا یک ترکیب فنلی مانند کوئرستین، لوتئولین، آپیژنین یا اپی گالوکاتچین گالات (EGCG) تیمار شدند. پس از 48 ساعت انکوباسیون، معرف WST{7}} به کشت ها اضافه شد. پس از انکوباسیون به مدت 4 ساعت دیگر، جذب ویژه WST در 450 نانومتر با استفاده از یک میکروپلیت خوان (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA) اندازه گیری شد.

سنجش تحلیل استخوان

BMMها (16105 سلول در میلی‌لیتر) در a-MEM حاوی 50 نانوگرم در میلی‌لیتر M-CSF و 100 نانوگرم در میلی‌لیتر RANKL معلق شدند، سپس در یک صفحه{5} چاه پوشیده شده با نانوبلورهای فسفات کلسیم (OAAS{6}) تقسیم شدند. }؛ زیرلایه سنجش فعالیت استئوکلاست، شرکت Oscotec، Choongnam، کره جنوبی) با تراکم 26104 سلول/cm2 با و بدون اکتئوزید. پس از انکوباسیون به مدت 7 روز، سلول ها با هیپوکلریت سدیم 5 درصد از پلیت ها خارج شدند و اطلاعات در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شد. ناحیه جذب شده نیز توسط یک تحلیلگر تصویر اندازه گیری شد و به صورت درصدی از مقدار کنترل بیان شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

لیزهای پروتئین کامل در بافر لیز همانطور که در جاهای دیگر توضیح داده شد آماده شدند [26]. پروتئین های سیتوزولی و هسته ای همانطور که قبلاً توضیح داده شد آماده شدند [25]. مقادیر مساوی از عصاره پروتئینی توسط 12-15 درصد SDS-PAGE جدا شد و بر روی غشاهای پلی وینیل دی فلوراید لکه دار شد. بلات‌ها با آنتی‌بادی‌های اولیه یک شبه در دمای 4uC قبل از انکوباسیون با آنتی‌بادی ثانویه در بافر مسدودکننده به مدت 1 ساعت بررسی شدند. لکه ها با نورتابی شیمیایی افزایش یافته (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) ساخته شدند و در معرض فیلم اشعه ایکس (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA) قرار گرفتند.

سنجش فعالیت MAPK

سلول ها به مدت 2 ساعت با آکتئوزید پیش تیمار شدند و سپس با RANKL به مدت -30 دقیقه اضافی تحریک شدند. فعالیت های MAPK با استفاده از کیت های سنجش ایمونومتری، مانند کیت سنجش p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, USA)، کیت سنجش آنزیم p-ERK (Assay Designs) و کیت ELISA ساندویچ p-SAPK/JNK ( فناوری سیگنالینگ سلولی، MA، ایالات متحده). تمام مراحل از دستورالعمل های سازنده پیروی می کردند و میزان جذب توسط دستگاه میکروپلیت خوان اندازه گیری می شد.

سنجش جابجایی الکتروفورتیک (EMSA)

واکنش های اتصال به پروتئین DNA به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق، با 10-15 میلی گرم پروتئین در 20 میلی لیتر بافر حاوی 1 میلی گرم در میلی لیتر BSA، 0.5 میلی گرم در میلی لیتر پلی (dI-dC)، 5 درصد گلیسرول انجام شد. 1 میلی‌مولار DTT، 1 میلی‌مولار PMSF، 10 میلی‌مولار Tris-Cl (pH 7.5)، 50 میلی‌متر NaCl، 30،{18}} CPM الیگونوکلئوتیدهای نشاندار شده با dCTP [a{19}}P] و قطعه کلنو DNA پلیمراز نمونه ها بر روی ژل های پلی آکریل آمید 6 درصد جدا شدند، که خشک شده و در معرض فیلم اشعه ایکس (شرکت ایستمن کداک) به مدت 12 تا 24 ساعت در دمای 270 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. توالی پرایمر الیگونوکلئوتیدی خاص برای NF-were 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 و 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{30 }}.

سنجش NF-kB لوسیفراز

ماکروفاژهای RAW264.7 در 24-چاه پلیت با ناقل گزارشگر KB-لوسیفراز 8/0 میلی گرم 0 با استفاده از 2 میلی لیتر Lipofectamine2000 (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) طبق دستورالعمل سازنده ترانسفکت شدند. در 24 ساعت پس از ترانسفکشن، سلول ها با RANKL در حضور و عدم حضور آکتئوزید به مدت 24 ساعت تحریک شدند. سلول ها در 100 میلی لیتر بافر لیز گزارشگر (Promega، Madison، WI، USA) مجدداً معلق شدند. مقادیر مساوی از نمونه های پروتئین در میکروپلیت های چاهی قرار داده شد و با سوبسترای لوسیفراز مخلوط شد. لومینسانس با استفاده از نور سنج میکروپلیتی (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) اندازه گیری شد. در این آزمایش، یک پپتید بازدارنده نفوذپذیر NF-B (BIOMOL، Butler Pike، PA، USA) به عنوان یک مهارکننده kB مثبت استفاده شد.

اندازه گیری سیتوکین ها

سلول‌های BMM یا RAW264.7 با RANKL در حضور تحریک شدنداکتئوزیددر 24-صفحات کشت چاه. پس از 48 ساعت انکوباسیون، سوپرناتانت های کشت با استفاده از کیت های OptEIATM اختصاصی TNF-a-، IL{4}}b- و IL-6-بر اساس دستورالعمل سازنده توسط ELISA جمع آوری و ارزیابی شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس در زمان واقعی (RT-PCR)

بیان mRNA نشانگرهای استئوکلاستیک، مانند c-Fos، NFATc1، و TNF-a، توسط RT-PCR بلادرنگ تعیین شد. به طور خلاصه، RNA کل طبق دستورالعمل سازنده (Invitrogen) از ماکروفاژها با Trizolreagent استخراج شد. cDNA با 1 میلی گرم RNA کل با استفاده از SuperScriptReverse Transcripatase II و پرایمرها (Invitrogen) سنتز شد. Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) برای تشخیص انباشت محصول PCR در طول چرخه با سیستم تشخیص توالی ABI 7500 استفاده شد (کاربرد با استفاده از چهل 3-چرخه دناتوراسیون در دمای 95uC انجام شد. برای 15 ثانیه، بازپخت در دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 ثانیه، و گسترش در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه. تمام واکنش‌های PCR حداقل در سه تکرار انجام شد و سطح بیان به ژنHPRT در همان واکنش نرمال شد. این مطالعه از همان توالی پرایمرهای توصیف شده استفاده کرد. در جای دیگر [7].

اندازه گیری ROS داخل سلولی

محلول ذخیره‌ای از 29،{1}}دی کلرودی‌هیدروفلورسئین-دی استات (DCFH-DA) (5{11}} میلی‌مولار؛ Calbiochem، دارمشتات، آلمان) در DMSO تهیه شد و در دمای 220 درجه سانتی‌گراد در تاریکی ذخیره شد. به طور خلاصه، BMMs (106 سلول در میلی‌لیتر در 6-صفحه چاهک) با 50 نانوگرم/MLM-CSF به مدت 24 ساعت کشت داده شدند و سپس با غلظت‌های مختلف (0-10 میلی‌مولار) اکتئوزید 2 ساعت قبل از تحریک با 100 تیمار شدند. ng/mlRANKL. پس از 1 ساعت انکوباسیون همزمان، این سلول ها متعاقبا با 25 میلی مولار DCFH-DA به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. فلورسانس سبز 29،{21}}دی کلروفلورسئین (DCF) در 515 نانومتر (FL 1) با استفاده از سیستم FACS VantageH (Becton-Dickinson، San Jose، CA، USA) و 10،{26}} رویداد ثبت شد. در هر نمونه شمارش شدند

القای پوکی استخوان ناشی از اواریکتومی

برای این مطالعه از موش های ماده ICR (6 هفته ای) استفاده شد. موش‌ها تحت بیهوشی تحت عمل جراحی ساختگی (Sham, n=10) یا برداشتن تخمدان با جراحی (OVX, n=20) قرار گرفتند. یک هفته پس از جراحی، موش‌های OVX به‌طور تصادفی به 2 گروه 10 تایی تقسیم شدند: OVX دوطرفه و OVX دوطرفه با 200 میلی‌لیتر PBS حاوی 1 میلی‌مولار آکتئوزید خوراکی (گروه AC). دهانیاکتئوزیدهر 3 روز یک بار به مدت 8 هفته پس از جراحی تجویز شد و به همان میزان PBS به گروه های شم و OVX داده شد. پس از 1 روز از آخرین تجویز، موش‌ها قربانی شدند و سپس پارامترهای بیوشیمیایی در سرم و ساختار استخوان بعدی آنالیز شد.

تعیین پارامترهای بیوشیمیایی سرم

نمونه خون از طریق سوراخ قلبی و سرم با سانتریفیوژ جمع آوری شد. نمونه های سرم در دمای 280 درجه سانتی گراد برای تجزیه و تحلیل پارامترهای بیوشیمیایی ذخیره شدند. سطوح سرمی IL-1b و IL-6 با استفاده از کیت ELISA همانطور که در بالا توضیح داده شد، برآورد شد، در حالی که فعالیت آلکالین فسفاتاز (ALP) با استفاده از یک روش رنگ سنجی بیوشیمیایی که مقدار p را اندازه می‌گیرد، تعیین شد. -نیتروفنول تولید شده از یک بستر فسفات p-نیتروفنل، همانطور که در جاهای دیگر توضیح داده شد [27]. برای تخمین بیومارکرهای تشکیل و جذب استخوان، سطوح سرمی OC، کلسیم و TRAP5b نیز طبق دستورالعمل سازنده تعیین شد.

تجزیه و تحلیل ساختار استخوان و پارامترهای مورفومتریک

استخوان ران موش ها (گروه های شم، OVX و AC) تشریح شد و با سالین فیزیولوژیکی برای آزمایش مکانیکی پر شد. استحکام مکانیکی استخوان ران همانطور که در جای دیگر توضیح داده شد اندازه گیری شد [28]. بار شکستگی به عنوان نیروی اوج بر حسب نیوتن در نقطه ای ثبت شد که میل شفت استخوان ران راست شکسته شد. علاوه بر این، استخوان ران سبک هر حیوان با استفاده از یک سیستم توموگرافی میکروکامپیوتری (micro-CT) (سیستم میکروفوکوس اشعه ایکس SkyScan 1076، Kontich، بلژیک) به صورت هیستومورفومتری آنالیز شد. به طور خلاصه، استخوان‌های موجود در ذخیره‌سازی فرمالدئید 4 درصد، قبل از بسته‌شدن در «فیلم چسبنده» پلاستیکی یا در پارافیلم، به‌طور سطحی روی بافت کاغذی خشک شدند تا از خشک شدن در طول اسکن جلوگیری شود. هر استخوان بسته بندی شده با پلاستیک در لوله های فوم پلاستیکی/پلی استایرن قرار داده شد که به صورت عمودی در محفظه نمونه اسکنر 1076 برای تصویربرداری میکرو CT نصب شده بودند. اسکن با استفاده از ولتاژ منبع 100 کیلوولت و جریان منبع 140 میلی آمپر با وضوح 35 میلی متر انجام شد. مدل‌های سه‌بعدی استخوان‌های ترابکولار استخوان ران با استفاده از SkyScan CT Analyzer نسخه 1.11 بازسازی شدند. پارامترهای ساختاری مانند تراکم معدنی استخوان ترابکولار (BMD، g/cm3)، درصد حجم استخوان (حجم استخوان (BV) / حجم بافت (TV)، درصد)، ضخامت (Tb.Th، mm)، جداسازی (Tb.Sp. ، میلی متر) و تعداد (Tb.N، 1/mm) اندازه گیری شد.

سنجش تمایز استخوانی و کانی سازی

سلول‌های مغز استخوان کشت‌شده در {0}صفحه‌های کشت چاهک با DAG (10 نانومولار دگزامتازون، 50 میلی‌مولار اسید اسکوربیک، و 20 میلی‌مولار b-گلیسروفسفات) در حضور 10 میلی‌مولار تیمار شدند.اکتئوزید. پس از 2 هفته تمایز، سلول ها با اتانول سرد یخ 70 درصد (vol/vol) به مدت 1 ساعت تثبیت شدند و با آب مقطر آلیزارین رد سین 2 درصد به مدت 30 دقیقه در اتاق رنگ آمیزی شدند. درجه حرارت. پس از رنگ‌آمیزی سلول‌ها و خشک شدن در هوا، صفحات کشت سلولی با میکروسکوپ نوری با استفاده از میکروسکوپ معکوس (Nikon TS100، ژاپن) ارزیابی شدند. برای تعیین کمیت رنگ قرمز، لکه با استیل پیریدینیم کلرید 10 درصد با تکان دادن به مدت 20 دقیقه شستشو داده شد و جذب در طول موج 560 نانومتر اندازه‌گیری شد. میزان کلسیم رسوب شده در لایه های سلولی نیز با استفاده از کیت کلسیم (Wako Chemical Inc. Osaka، ژاپن) طبق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد. علاوه بر این، بیان نشانگرهای mRNA اختصاصی استخوان، مانند فاکتور رونویسی مربوط به runt-2(Runx2)، استریکس، سیالوپروتئین استخوان (BSP) و OC توسط RT-PCR بلادرنگ تعیین شد. پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی این نشانگرها با اندازه محصول کمتر از 200 جفت باز با استفاده از PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) همانطور که در جاهای دیگر توضیح داده شد، طراحی شدند[27].

تحلیل آماری

مگر اینکه خلاف آن نشان داده شود، همه داده ها به عنوان میانگین 6 انحراف استاندارد (SD) 3 یا بیشتر آزمایش مستقل بیان می شوند. برای مقایسه‌های چندگانه با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 12، از آنالیز واریانس یک طرفه استفاده شد.{4}}. مقدار p،0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج

Acteoside تشکیل استئوکلاست توسط ماکروفاژین را به روشی وابسته به دوز مهار می کند.

برای بررسی تأثیر اکتئوزید بر تمایز BMM به استئوکلاست، سلول‌ها با غلظت‌های مختلف ({0}}-20 میلی‌مولار) آکتئوزید به مدت 7 روز در حضور 50 نانوگرم در میلی‌لیتر M-CSF و 100 نانوگرم در میلی‌لیتر کشت داده شدند. RANKL. Acteoside تعداد استئوکلاست ها را به صورت وابسته به دوز کاهش داد. هنگامی که سلول ها با 10 میلی مولار آکتئوزید به مدت 2 ساعت پیش تیمار شدند، تعداد استئوکلاست ها 43 درصد در مقایسه با سلول های مکمل M-CSFand RANKL کاهش یافت (شکل 1A). شکل 1B تمایز استئوکلاست با واسطه RANKL و مهار آن را با درمان ترکیبی با آکتئوزید نشان می دهد. مطابق با این نتیجه، پیش تیمار آکتئوزید تمایز سلول‌های RAW264.7 و تشکیل استئوکلاست را با RANKL کاهش داد (شکل‌های 1C و D). هنگامی که پتانسیل ضد استئوکلاستیک اکتئوزید بر روی BMMها با پتانسیل ضد استئوکلاست چندین ترکیب فنلی در یک غلظت (10 میلی مولار) مقایسه شد، لوتئولین بیشترین فعالیت را نشان داد (شکل 2A). با این حال، لوتئولین، کوئرستین، یا آپیژنین خود زنده ماندن سلول ها را کاهش داد (شکل 2B). همه ترکیبات تمایز استئوکلاستیک توسط ماکروفاژهای RAW264.7 را با فعالیت‌های نسبی زیر مهار کردند: لوتئولین. کورستین=آپیژنین .EGCG=اکتئوزید (شکل 2C). لوتئولین، کوئرستین، یا خود آپیژنین نیز کاهش زنده ماندن سلول ها را نشان دادند (شکل 2D). در مقابل، تیمار کوئرستین تنها باعث کاهش قابل توجه زنده ماندن در سلول‌های BMM و RAW264.7 شد، زمانی که این سلول‌ها به مدت 2 روز در معرض 10 میلی‌مولار از هر ترکیب با 50 نانوگرم بر میلی‌لیتر M-CSF، 100 نانوگرم بر میلی‌لیتر RANKL قرار گرفتند. یا هر دو (داده ها نشان داده نشده اند). زمانی که غلظت این ترکیبات برای مهار 50 درصد لازم باشد

تشکیل استئوکلاست در BMMs (IC50) با استفاده از منحنی های غلظت-فعالیت، IC50 محاسبه شد.اکتئوزیدکوئرستین، لوتئولین، آپیژنین و EGCG به ترتیب 5.1، 2.3، 2.6، 4.8 و 6.6 میلی مولار بود (شکل 2E). این نتیجه مشابه موردی بود که ماکروفاژهای RAW264.7 مورد بررسی قرار گرفتند. این داده‌ها نشان می‌دهد که لوتئولین و کورستین دارای فعالیت‌های ضدکلاستوژنیک بالاتر از اکتئوزید هستند. در مقابل، کورستین در IC50 نیز یک اثر سمی خفیف بر روی سلول ها داشت (داده ها نشان داده نشده است).

Acteoside از جذب استخوان توسط ماکروفاژها جلوگیری می کند

Acteoside همچنین از تحلیل استخوان با واسطه RANKL به روشی وابسته به دوز جلوگیری کرد، همانطور که توسط یک سیستم مدل آزمایشگاهی اندازه گیری شد (شکل 3A). هنگامی که BMMs با 1 میلی مولار اکتئوزید انکوبه شدند، تحلیل استخوان به طور قابل توجهی مهار شد (شکل 3B). یک 10 میلی متراکتئوزیددرمان تقریباً به طور کامل اطلاعات ناشی از RANKL توسط BMMها را کاهش داد. به طور مشابه، آکتئوزید جذب استخوان را در سلول های RAW264.7 تحریک شده با RANKL کاهش داد (شکل های S2A و B). توانایی اکتئوزید برای مهار تحلیل استخوان به زمان درمان نسبت به تحریک RANKL بستگی دارد. Acteoside (10 میلی مولار) اضافه شده 4 روز پس از تحریک RANKL اطلاعات را در BMM ها کاهش نداد، در حالی که تعداد استئوکلاست های تشکیل شده را سرکوب کرد (شکل 3C). این نتیجه متفاوت تا حدی به دلیل ناحیه گودالی بود که پس از 4 روز از تشکیل تحریک RANKL تشکیل شده بود (شکل 3D).

Acteoside Down-Regulating Early Signaling Pathways RANKL

RANKL باعث فعال شدن 3 MAPK معروف و NF-kB در پیش سازهای استئوکلاست می شود و این فعال سازی برای تمایز اولیه استئوکلاست ها لازم است. برای درک مکانیسم های احتمالی که توسط آن اکتئوزید باعث مهار استئوکلاستوژنز می شود، ما اثراکتئوزیددر MAPK ها و فعال سازی NF-B در ماکروفاژها سلول های BMM و RAW264.7 با 10 میلی مولار آکتئوزید به مدت 2 ساعت پیش تیمار شدند و سپس با 100 نانوگرم در میلی لیتر RANKL به مدت 30 دقیقه تحریک شدند. فسفوریلاسیون MAPK با وسترن بلات و آنالیز ایمونومتری مورد بررسی قرار گرفت. RANKL باعث فسفوریلاسیون p38، ERK و JNK در BMMs (شکل 4A) و سلول های RAW264.7 (شکل 4B) شد. Acteoside از این افزایش های ناشی از RANKL در p-p38، p-ERK و p-JNK جلوگیری کرد. این نتیجه توسط تجزیه و تحلیل ایمونومتری، که پیش تیمار با 10 میلی مولار پشتیبانی شداکتئوزیدبه طور قابل توجهی سطوح MAPKهای فسفریله شده در این ماکروفاژها را مهار کرد (شکل 4C). درمان RANKL اتصال به DNA NF-kB را افزایش داد، در حالی که آکتئوزید فعال سازی NF-kB-DNA ناشی از RANKL را مهار کرد (شکل 5A). این مهار در سلول‌های BMM بیشتر از سلول‌های RAW264.7 بود. Acteoside همچنین p65 تحریک شده با RANKL و فسفوریلاسیون IkBa را در سلول های BMM و RAW264.7 کاهش داد (شکل 5B و C). افزودن 10 mMacteoside تقریباً به طور کامل هم از تخریب و هم فعال شدن IkBa در BMMs جلوگیری کرد (شکل 5B). برای تأیید بیشتر اینکه فعال‌سازی NF kB در عمل اکتئوزید نقش دارد، سازه‌های پروموتر-لوسیفراز kB به طور موقت به سلول‌های RAW264.7 ترانسفکت شدند. سلول‌های انکوبه‌شده با 100 نانوگرم در میلی‌لیتر RANKL دارای فعالیت پروموتر kB {20} برابر بیشتر بودند که به‌طور قابل‌توجهی توسط اکتئوزید 10 میلی‌مولار کاهش یافت (شکل 5D).

Acteoside تولید سیتوکین های التهابی و بیان TNF-a، c-Fos و NFATc1in ماکروفاژهای تحریک شده با RANKL را سرکوب می کند.

TNF-a، IL-1b، و IL-6 در تشکیل و عملکرد استئوکلاست‌ها مهم هستند، که توسط سیگنال‌دهی NF-kB در ماکروفاژهای تحریک‌شده با RANKL انجام می‌شود. RANKL تولید این سیتوکین ها را تحریک کرد و این تولید به میزان قابل توجهی 10 میلی مولار کاهش یافت.اکتئوزیدپیش تصفیه در BMMها (شکل 6A). به طور مشابه، آکتئوزید تولید سیتوکین های ناشی از RANKL را به جز IL{2}} در ماکروفاژهای RAW264.7 کاهش داد (شکل S3). برای درک مکانیسم‌های مولکولی عمل اکتئوزید در استئوکلاستوژنز، ما بیشتر اثر اکتئوزید را بر بیان TNF-a، c-Fos و NFATc1 بررسی کردیم. RANKL بیان mRNA این عوامل را در سلول‌های BMM و RAW264.7 تنظیم کرد (شکل‌های 6B و C). پیش تیمار با 10 میلی مولار اکتئوزید به طور قابل توجهی بیان این عوامل ناشی از RANKL را در هر دو مهار کرد.

BMM ها و سلول های RAW264.7. پیش تیمار آکتئوزید همچنین سطوح پروتئین c-Fos و NFATc1 را در BMMهای تحریک شده با RANKL به شدت کاهش داد (شکل 6D). این نتایج نشان می‌دهد که اکتئوزید واسطه‌های القای RANKL تشکیل استئوکلاست را در سطح ژن و پروتئین کاهش می‌دهد.

Acteoside تولید ROS داخل سلولی را در BMM ها به روشی وابسته به دوز کاهش می دهد از آنجایی که شناخته شده است که تولید ROS داخل سلولی با استئوکلاستوژنز تحریک شده توسط RANKL در ارتباط است، ما بررسی کردیم که آیا اکتئوزید در طول تمایز استئوکلاست حساس به استئوکلاست با واسطه RANKL، تولید ROS را مهار می کند یا خیر. ، DCFH-DA. آنالیز فلوسایتومتری نشان داد که میانگین سیگنال فلورسانس مخصوص DCF در BMMها ظاهراً پس از تحریک با RANKL در مقایسه با سلول‌های کنترل درمان نشده به راست جابه‌جا شد (شکل 7A). این تغییر مشابه موردی بود که ماکروفاژهای RAW264.7 پس از تحریک RANKL مشاهده شدند (داده‌ها نشان داده نشده است). درمان BMMs با اکتئوزید شدت سیگنال DCF را به صورت وابسته به دوز کاهش داد. پیش تیمار با 10 میلی مولار آکتئوزید تقریباً به طور کامل سطوح ROS داخل سلولی تولید شده در طی تمایز استئوکلاست را به سطوح شاهد درمان نشده کاهش داد (شکل 7B).

تجویز خوراکی آکتئوزید از تغییر نشانگرهای بیوشیمیایی پوکی استخوان و از دست دادن استخوان در موش های تخمدان برداشته شده جلوگیری می کند.

برای بررسی اثر اکتئوزید بر از دست دادن استخوان، ما یک مدل حیوانی پوکی استخوان با اوارکتومی تهیه کردیم. در طول دوره آزمایشی تفاوت معنی داری در وزن بدن بین OVX و Shammice وجود داشت (داده ها نشان داده نشده است). سطح سرمی IL-1b و IL{{1} در این گروه به طور قابل توجهی بالاتر از گروه شم بود (شکل 8). افزایش ناشی از اواریکتومی در این سایتوکین های التهابی با تجویز خوراکی آکتئوزید (گروه AC) کاهش یافت. سطح سرمی نشانگرهای گردش استخوان مانند ALP، کلسیم، TRAP5b و OC در گروه OVX به طور قابل توجهی افزایش یافت. از این نشانگرهای پوکی استخوان، افزایش سطوح کلسیم، TRAP5b و OC در موش‌های OVX ظاهراً با درمان اکتئوزید مهار شد، در حالی که سطح سرمی ALP با درمان تغییر نکرد. میانگین حداکثر بار شکستگی در وسط شفت فمورال راست به طور قابل توجهی در گروه OVX کمتر از گروه شم بود (شکل 9A). درمان آکتئوزید حداکثر پشتیبان شکستگی را به گروه شم افزایش داد. هنگامی که استخوان قشر فمور تشریح شد و با میکروسکوپ نوری مشاهده شد، ویژگی های پوکی استخوان نشان داده شده در گروه OVX تقریباً به طور کامل در موش های AC ناپدید شده بود (شکل 9B). برای بررسی اثر اکتئوزید بر مدل پوکی استخوان ناشی از OVX، BMD و پارامترهای مورفولوژیک استخوان در ترابکولار پروگزیمال فمور سبک توسط میکرو CT آنالیز شد. همانطور که در شکل 9C نشان داده شده است، تغییری در ساختار ترابکولار فمور در موش های OVX مشاهده شد، در حالی که این تغییر با درمان با اکتئوزید کاهش یافت. نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل micro-CT نشان داد که BMD، معیاری برای استحکام استخوان، به طور چشمگیری در OVXmice کاهش یافته است (شکل 9D). در مقایسه با گروه شم، موش‌های OVX نیز تغییرات قابل‌توجهی در BV/TV، Tb نشان دادند. Sp و Tb. N، اما نه در Tb.Th. درمان آکتئوزید خوراکی موش های OVX به طور قابل توجهی از تغییر در BMD و همچنین BV/TV و Tb.N جلوگیری کرد.

Acteoside بر استئوبلاستوژنز در سلول های مغز استخوان تأثیر نمی گذارد

نقش اکتئوزید در تمایز استئوبلاستی با استفاده از سلول‌های مغز استخوان بیشتر مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 10A نشان داده شده است، تیمار DAG باعث افزایش تعداد سلول های آلیزارین قرمز رنگ شده شد و این با پیش تیمار 10 میلی مولار آکتئوزید تغییر نکرد. مقدار رنگ موجود نشان داد که تیمار ترکیبی آکتئوزید و DAG تغییری در کانی‌سازی ایجاد نکرده است (شکل 10B). به طور مشابه، افزایش های ناشی از DAG در محتوای کلسیم داخل سلولی (شکل 10C) و سطوح mRNA (شکل 10D) نشانگرهای اختصاصی استخوان، مانند Runx2، osterix، BSP، و OC، تحت تأثیر پیش تیمار بااکتئوزید.