انتقال فعال فاز حافظه ترس از تثبیت مجدد به انقراض از طریق پیشگیری از تثبیت مجدد با واسطه ERK

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

اینبازیابی حافظه ترسباعث ایجاد دو فرآیند حافظه متضاد، یعنی تحکیم مجدد و انقراض می شود. بازیابی مختصر باعث تثبیت مجدد برای حفظ یاتقویت حافظه ترس،در حالی که بازیابی طولانی مدت این حافظه را خاموش می کند. اگرچه مکانیسم‌های تثبیت مجدد و انقراض بررسی شده‌اند، هنوز ناشناخته باقی مانده است که چگونه مراحل حافظه ترس از تثبیت مجدد به انقراض در طول بازیابی حافظه تغییر می‌کنند. در اینجا، ما نشان می‌دهیم که یک فرآیند انتقال حافظه وابسته به کیناز تنظیم‌شده با سیگنال خارج سلولی (ERK) پس از بازیابی، با جلوگیری از القای تثبیت مجدد در یک کار اجتنابی مهاری (IA) در موش‌های نر، تغییر فازهای حافظه را از تثبیت مجدد به انقراض تنظیم می‌کند. اول، فاز حافظه گذار، که القای تثبیت مجدد را لغو می کند، اما برای کسب انقراض کافی نیست، پس از تثبیت مجدد، اما قبل از مراحل انقراض شناسایی شد. دوم، فازهای تثبیت مجدد، انتقال و انقراض پس از بازیابی حافظه، امضاهای مولکولی و سلولی متمایز را از طریق پروتئین متصل شونده به عنصر (CREB) پاسخگو به cAMP و فسفوریلاسیون ERK در آمیگدال، هیپوکامپ و قشر پیش پیشانی داخلی (mPFC) نشان دادند. فاز تثبیت مجدد فسفوریلاسیون CREB را افزایش داد، در حالی که فاز انقراض چندین جمعیت عصبی با ترکیبات مختلف فسفوریلاسیون CREB و/یا ERK را در این مناطق مغز نشان داد. جالب توجه است، سه فاز حافظه، از جمله فاز انتقال، فعال سازی گذرا ERK را بلافاصله پس از بازیابی نشان دادند. مهمتر از همه، محاصره ERK در آمیگدال، هیپوکامپ، یا mPFC در مرحله حافظه انتقالی، تقویت حافظه IA ناشی از تحکیم مجدد را مهار کرد. این مشاهدات نشان می دهد که مسیر سیگنال دهی ERK به طور فعال انتقال مرحله حافظه از تثبیت مجدد به انقراض را تنظیم می کند و این فرآیند به عنوان یک سوئیچ عمل می کند که تثبیت مجدد ترس را لغو می کند.حافظه.

کلمات کلیدی: ERK; انقراض؛حافظه ترس; تحکیم مجدد؛ انتقال

1گروه علوم زیستی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه کشاورزی توکیو، توکیو 156-8502، ژاپن، و

2 دانشکده تحصیلات تکمیلی کشاورزی و علوم زیستی، دانشگاه توکیو، توکیو 113-8657، ژاپن

بیانیه اهمیت

بازیابی حافظه ترسدو فرآیند حافظه متضاد را القا می کند. تحکیم مجدد و انقراض تثبیت مجدد حفظ می کند/حافظه ترس را تقویت می کند، در حالی که انقراض حافظه ترس را ضعیف می کند. ناشناخته باقی مانده است که چگونه فازهای حافظه از تثبیت مجدد به انقراض در طول بازیابی تغییر می کنند. در اینجا، ما یک فرآیند انتقال حافظه فعال را شناسایی کردیم که به عنوان یک سوئیچ عمل می کند که از تثبیت مجدد جلوگیری می کند. این مرحله انتقال حافظه افزایش گذرا فسفوریلاسیون کیناز تنظیم‌شده با سیگنال خارج سلولی (ERK) را در آمیگدال، هیپوکامپ و قشر پیش پیشانی داخلی (mPFC) نشان داد. جالب توجه است، مهار ERK در این مناطق در مرحله انتقال، افزایش حافظه اجتنابی مهاری (IA) با واسطه تثبیت مجدد را مهار کرد. این یافته‌ها نشان می‌دهد که فرآیند حافظه گذار به طور فعال تغییر فازهای حافظه ترس حافظه ترس را با جلوگیری از القای تثبیت مجدد از طریق فعال‌سازی مسیر سیگنالینگ ERK تنظیم می‌کند.

مقدمه

بازیابی حافظهیک فرآیند منفعل نیست، بلکه یک فرآیند پویا است که امکان نگهداری، تقویت، تضعیف یا تغییر/به روز رسانی یک حافظه اصلی را فراهم می کند (Misanin و همکاران، 1968؛ اشنایدر و شرمن، 1968؛ لوئیس، 1979؛ مکتوتوس و همکاران. ، 1979؛ گوردون، 1981؛ نادر و همکاران، 2000؛ نادر و هارد، 2009؛ دودای، 2012؛ فوکوشیما و همکاران، 2014). نکته مهم این است که یک حافظه ترس شرطی بازیابی شده با قرار گرفتن مجدد کوتاه مدت در معرض محرک شرطی (CS) ناپایدار می شود و برای حفظ یا تقویت آن نیاز به تثبیت مجدد وابسته به بیان ژن دارد (نادر و همکاران، 2000؛ دودای، 2002؛ کیدا و همکاران، 2002؛ سوزوکی و همکاران، 2004؛ ترونل و همکاران، 2005؛ فوکوشیما و همکاران، 2014). برعکس، قرار گرفتن مجدد مداوم یا مکرر در معرض CS باعث از بین رفتن حافظه می شود که حافظه ترس را ضعیف می کند (پاولوف، 1927؛ رسکولا، 2001؛ مایرز و دیویس، 2002). بنابراینبازیابی حافظه ترسدو فرآیند حافظه متضاد را القا می کند، به عنوان مثال، تحکیم مجدد و انقراض، اگرچه هر دو فرآیند با قرار گرفتن مجدد در معرض یک CS یکسان القا می شوند، اما با توجه به مدت زمان قرار گرفتن مجدد در معرض CS متفاوت هستند.

ویژگی مشترک و حیاتی بیوشیمیایی تثبیت مجدد و انقراض، نیاز به بیان ژن با واسطه پروتئین متصل شونده به عنصر (CREB) پاسخگو به cAMP است (Mamiya et al., 2009). جالب توجه است که ما علائم متضاد مولکولی، آناتومیک و رفتاری را بین مراحل تثبیت مجدد و انقراض حافظه ترس زمینه ای نشان داده ایم (سوزوکی و همکاران، 2004؛ مامیا و همکاران، 2009). مسدود کردن سنتز پروتئین در مرحله تثبیت مجدد حافظه ترس اصلی را مختل می کند، در حالی که مسدود کردن سنتز پروتئین در مرحله انقراض این کار را انجام نمی دهد، اگرچه حافظه ترس متنی دوباره فعال شد. نیاز به مناطق مغزی که فعال سازی بیان ژن با واسطه CREB را نشان می دهد بین تثبیت مجدد و انقراض متفاوت است. تثبیت مجدد به آمیگدال و هیپوکامپ بستگی دارد، در حالی که انقراض به آمیگدال و قشر پیش پیشانی داخلی (mPFC) متکی است. با این حال، دوره زمانی فعال‌سازی CREB آمیگدالوئید بین فازهای تثبیت مجدد و حافظه انقراض متفاوت است. این مشاهدات نشان می دهد که فازهای تحکیم مجدد و انقراض مستقل نیستند، بلکه با یکدیگر تعامل دارند. جالب توجه است، مطالعات اخیر یک پنجره زمانی (مرحله گذار) را شناسایی کرده اند که هیچ فعال سازی کیناز تنظیم شده با سیگنال خارج سلولی (ERK) را در آمیگدال پس از تثبیت مجدد نشان می دهد، اما قبل از مراحل انقراض پس از بازیابی حافظه ترس شنوایی (Merlo et al., 2018) ). روی هم رفته، این یافته‌ها مکانیسم‌های احتمالی را نشان می‌دهند که طی آن مراحل حافظه از تثبیت مجدد به انقراض تغییر می‌کنند.بازیابی حافظه ترس. به عبارت دیگر، ممکن است فرآیند انتقال حافظه به طور فعال این سوئیچ را تنظیم کند.

در یک کار اجتنابی مهاری (IA)، موش ها پس از ورود به یک محفظه تاریک از یک محفظه نور، یک شوک الکتریکی دریافت می کنند.حافظهبرای جلوگیری از محفظه تاریک قبلاً، با استفاده از این کار، نشان دادیم که فازهای تثبیت مجدد و انقراض را می توان در نقطه زمانی که یک موش از یک محفظه نور در طول یک جلسه نوردهی مجدد وارد یک محفظه تاریک می شود، تفکیک شود (فوکوشیما و همکاران، 2014). بنابراین، این کار به ما اجازه می‌دهد تا نشانه‌های مولکولی چشم‌انداز فازهای تحکیم مجدد و انقراض را مشخص کنیم، برخلاف الگوی شرطی‌سازی ترس زمینه‌ای کلاسیک که در آن فعال‌سازی مجدد حافظه ترس شرطی شده با قرار گرفتن مجدد در معرض CS، هم تحکیم مجدد و هم انقراض را آغاز می‌کند. قرار گرفتن مجدد کوتاه مدت (3 دقیقه) با زمینه شرطی باعث تثبیت مجدد می شود، در حالی که قرار گرفتن مجدد طولانی مدت (30 دقیقه) یا مکرر در این زمینه باعث انقراض می شود (ایزنبرگ و همکاران، 2003؛ پدریرا و مالدونادو، 2003؛ سوزوکی و همکاران، 2004؛ لی و همکاران، 2008؛ مامیا و همکاران، 2009). علاوه بر این، ما دریافتیم که حافظه IA بازیابی شده از طریق تثبیت مجدد حافظه در این کار افزایش می یابد (فوکوشیما و همکاران، 2014).

برای درک مکانیسم انتقال از تحکیم مجدد به انقراض در طولبازیابی حافظه ترس، هدف ما شناسایی و مشخص کردن علائم مولکولی، سلولی و رفتاری مراحل تثبیت مجدد، انتقال و انقراض حافظه IA بود. ما فعال‌سازی CREB و ERK را در آمیگدال، هیپوکامپ و mPFC در مراحل تثبیت مجدد، انتقال و انقراض تجزیه و تحلیل کردیم و نقش فعال‌سازی ERK را در این فرآیندهای حافظه مورد بررسی قرار دادیم.

مواد و روش ها

موش ها همه آزمایش ها بر اساس راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی (انجمن علوم اعصاب ژاپن و دانشگاه کشاورزی توکیو) انجام شد. تمام آزمایشات حیوانی انجام شده در این مطالعه توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه کشاورزی توکیو (مجوز شماره 280037) تایید شد. تمام اقدامات جراحی تحت بیهوشی Nembutal انجام شد و تمام تلاش برای به حداقل رساندن رنج انجام شد. موش های نر C57BL/6N از رودخانه چارلز به دست آمدند. موش‌ها در قفس‌های پنج یا شش تایی قرار گرفتند، در چرخه نور/تاریکی ۱۲/۱۲ ساعت نگهداری شدند و اجازه دسترسی آزادانه به غذا و آب را داشتند. موش ها هنگام آزمایش حداقل هشت هفته سن داشتند. آزمایش در مرحله نور چرخه انجام شد. همه آزمایش‌ها به صورت نابینا از وضعیت درمان موش‌ها انجام شد.

تست IA دستگاه IA step-through (OHARA Pharmaceutical) شامل یک جعبه با محفظه های روشن و تاریک جداگانه (هر دو 15.5 12.5 11.5 سانتی متر) بود. محفظه نور توسط یک نور فلورسنت روشن شده است (25{15}}0 لوکس؛ فوکوشیما و همکاران، 2008، 2014؛ ژانگ و همکاران، 2011؛ ​​ایشیکاوا و همکاران، 2016). قبل از شروع آموزش IA، موش ها به مدت یک هفته هر روز به مدت 2 دقیقه به صورت جداگانه دست به دست شدند. در طول جلسات آموزشی، به هر موش اجازه داده شد تا به مدت 30 ثانیه به محفظه نور عادت کند و درب گیوتین برای دسترسی به محفظه تاریک بلند شد. تأخیر ورود به محفظه تاریک به عنوان معیاری برای اکتساب در نظر گرفته شد. به محض اینکه موش وارد محفظه تاریک شد، در گیوتین بسته شد. پس از 5 ثانیه، یک شوک پا (0.2 میلی آمپر) برای کل دوره 2 ثانیه (تمرین) تحویل داده شد. در 24 ساعت پس از جلسه تمرین، ماوس دوباره در محفظه نور قرار داده شد تا زمانی که وارد محفظه تاریک شود (میانگین 459 6 15.49 ثانیه). بلافاصله پس از ورود ماوس به محفظه تاریک، درب گیوتین بسته شد و ماوس برای مدت زمان متفاوتی (0، 1 یا 10 دقیقه) بدون ضربه پا (فعال شدن مجدد) در محفظه تاریک ماند. حافظه 48 ساعت بعد [تست حافظه بلندمدت پس از فعال سازی (PR-LTM)] به عنوان تأخیر متقاطع برای ورود موش به محفظه تاریک هنگام جایگزینی در محفظه روشن، مانند فعال سازی مجدد، ارزیابی شد.

برای اولین آزمایش، اثر مهار سنتز پروتئین را پس از فعال‌سازی مجدد بررسی کردیم (قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک برای 0، 1، یا 10 دقیقه؛ شکل 1). مهارکننده سنتز پروتئین آنیزومایسین (ANI؛ Wako) در سالین حل شد (PH تنظیم شده روی 7.{12}}-7.4 با NaOH). موش‌ها همانطور که در بالا توضیح داده شد آموزش دیدند، و در 24 ساعت بعد، بلافاصله پس از قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک به مدت 0، 1 یا 10 دقیقه بدون شوک پا، وسیله نقلیه (VEH) یا ANI (150 میلی‌گرم/کیلوگرم، IP) دریافت کردند. (فعال سازی مجدد). در این دوز، ANI 90/0 درصد از سنتز پروتئین در مغز را در طول 2 ساعت اول مهار می کند (Flood et al., 1973). در 48 ساعت پس از جلسه فعال سازی مجدد، موش های جداگانه یک بار دیگر در محفظه نور قرار گرفتند و تأخیر متقاطع ارزیابی شد.

برای آزمایش دوم [CREB فسفریله (pCREB) و ERK فسفریله (pERK) ایمونوهیستوشیمی. انجیر. 2-5]، ما نواحی مغز را که پس از قرار گرفتن مجدد در معرض نور فعال شده بودند (تا زمانی که موش ها وارد محفظه تاریک شوند، قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک برای 0 دقیقه) یا محفظه تاریک (دوباره- قرار گرفتن در محفظه تاریک به مدت 1 یا 10 دقیقه). موش ها به چهار گروه فوکوشیما و همکاران تقسیم شدند. · انتقال فازهای حافظه ترس پس از بازیابی J. Neurosci.، 10 فوریه 2021، • 41 (6): 1288-1300 • 1289 گروه. در 24 ساعت پس از آموزش، موش‌ها مجدداً در معرض محفظه نور قرار گرفتند و پس از ورود از محفظه تاریک در محفظه تاریک ماندند [فعال‌سازی مجدد: 0 دقیقه در محفظه تاریک، گروه تثبیت مجدد (Recon). 1 دقیقه، گروه انتقال (Tran)؛ 10 دقیقه، گروه انقراض (Ext)]. گروه دیگری از موش ها به محفظه روشن/تاریک [گروه غیرفعال نشده (NR)] بازگردانده نشدند. سپس موش‌ها با Nembutal (750 mg/kg، درون صفاقی) در 5، 15 یا 30 دقیقه پس از فعال‌سازی مجدد بیهوش شدند.

برای آزمایش سوم (ریزانفیوژن U{{20}}}126؛ شکل‌های 6،7)، ما اثرات مهار ERK را در آمیگدال، هیپوکامپ، یا mPFC بر روی تثبیت مجدد/تقویت حافظه، انتقال، بررسی کردیم. و انقراض مهارکننده MEK U0126 (سیگما-آلدریچ) در مایع مغزی نخاعی مصنوعی حاوی سه قطره Tween 80 (سیگما) در 2.5 میلی لیتر دی متیل سولفوکسید 7.5 درصد (Wako) حل شد و روی pH تنظیم شد. 7.4 با NaOH. موش ها همانطور که در بالا توضیح داده شد آموزش داده شدند و 24 ساعت بعد دوباره در محفظه نور قرار گرفتند (فعال سازی مجدد). موش ها با U0126 (1 میلی گرم) یا VEH به نواحی مختلف مغز بلافاصله پس از (شکل 6A, C, E-H, 7A-C) یا در 30 دقیقه پس از (شکل 6B, D) فعال سازی مجدد میکرو تزریق شدند. در 48 ساعت پس از فعال‌سازی مجدد، موش‌های جداگانه یک بار دیگر در محفظه نور قرار گرفتند و تأخیر متقاطع ارزیابی شد (PR LTM). میکرو انفوزیون به هیپوکامپ و mPFC (0.5 میلی لیتر) با سرعت 0.25 میلی لیتر در دقیقه انجام شد. میکرو انفوزیون به آمیگدال (0.2 میلی لیتر) با سرعت 0.1 میلی لیتر در دقیقه انجام شد. کانول تزریقی پس از میکرواینفیوژن به مدت 2 دقیقه در جای خود رها شد و موش ها به قفس خانه خود بازگردانده شدند. مهارکننده MEK SL327 (بیوتکنولوژی سانتا کروز) در دی متیل سولفوکسید حل شد و با سالین رقیق شد. موش ها همانطور که در بالا توضیح داده شد آموزش داده شدند و 24 ساعت بعد، موش های جداگانه در محفظه نور قرار گرفتند (فعال سازی مجدد). به موش‌ها بلافاصله پس از فعال‌سازی مجدد، SL327 (10 یا 20 میلی‌گرم بر کیلوگرم) یا VEH تزریق شد (شکل 7D-F). در 48 ساعت پس از فعال سازی مجدد، موش های جداگانه یک بار دیگر در محفظه نور قرار گرفتند و تأخیر متقاطع ارزیابی شد (PR-LTM).

ایمونوهیستوشیمی همانطور که قبلا توضیح داده شد انجام شد (مامیا و همکاران، 2009؛ سوزوکی و همکاران، 2011؛ ​​ژانگ و همکاران، 2011؛ ​​فوکوشیما و همکاران، 2014؛ ایشیکاوا و همکاران، 2016؛ هاسگاوا و همکاران، 2019). پس از بیهوشی، همه موش ها با 4 درصد پارافورمالدئید پرفیوژن شدند. مغزها برداشته شدند، یک شبه ثابت شدند، به ساکارز 30 درصد منتقل شدند و در دمای 4 درجه نگهداری شدند. مقاطع تاج (30 میلی متر) در یک کرایوستات برش داده شد.

برای رنگ‌آمیزی pCREB و pERK، بخش‌های شناور آزاد با 1 درصد H2O2 تیمار شدند و یک شبه با آنتی‌بادی ضد فسفو-CREB (سرین 133؛ S133) خرگوش (1:1000; #{10) انکوبه شدند. }}، Millipore) و/یا آنتی بادی مونوکلونال ضد فسفو-ERK1/2 خرگوش (T202/Y204) (1:300؛ #4370؛ فناوری سیگنالینگ سلولی) در محلول مسدودکننده (سالین بافر با فسفات به اضافه 1 درصد آلبومین سرم بز، 1 mg/ml آلبومین سرم گاوی و 0.05 درصد تریتون ایکس{25}}). بخش‌ها با سالین بافر فسفات شسته شدند و با IgG ضد خرگوش کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی (1:500؛ جکسون تحقیقات ایمنی) برای pCREB یا IgG ضد خرگوش کونژوگه با ترب کوهی برای pERK در دمای اتاق به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. سیگنال‌های pCREB توسط بیوتین تیرامید تقویت شده و با استفاده از استرپتاویدین کونژوگه با فلور الکسا (Invitrogen) تجسم شدند. سیگنال های pERK با TSA-FCM (Invitrogen) تقویت شد. مقاطع بر روی اسلایدها نصب شده و با استفاده از یک محیط نصب (Millipore) پوشش داده شدند.

کمی سازی همانطور که قبلا توضیح داده شد انجام شد (فرانکلند و همکاران، 2006؛ فوکوشیما و همکاران، 2014؛ مامیا و همکاران، 2009؛ ژانگ و همکاران، 2011؛ ​​سوزوکی و همکاران، 2008). ساختارها از نظر تشریحی بر اساس اطلس فرانکلین و پاکسینوس (1997) تعریف شدند. تمام نورون‌های واکنش‌گر ایمنی توسط آزمایش‌گر نابینا به شرایط درمان شمارش شدند

نتایج

مشخص کردن مراحل حافظه پس از بازیابی در کار IA

وظیفه IA به ما امکان می دهد فازهای تثبیت مجدد و انقراض را در نقطه زمانی که موش از یک محفظه نور وارد محفظه تاریک می شود، متمایز کنیم (فوکوشیما و همکاران، 2014). برای درک مکانیسم زیربنای تغییر فازهای حافظه از تثبیت مجدد به انقراض، ما فازهای حافظه IA را پس از بازیابی حافظه با بررسی اثرات مهار سنتز پروتئین که برای تثبیت مجدد و انقراض حافظه IA لازم است مشخص کردیم (فوکوشیما و همکاران، 2014). موش ها ابتدا در محفظه نور قرار گرفتند. در 5 ثانیه پس از ورود آنها به محفظه تاریک، یک شوک الکتریکی مختصر (آموزش) ارائه شد. موش ها 24 ساعت پس از آموزش مجدداً در معرض محفظه نور قرار گرفتند (جلسه فعال سازی مجدد؛ شکل 1A) و تأخیر متقاطع آنها برای ورود به محفظه تاریک ارزیابی شد (شکل 1B). موش‌ها بلافاصله پس از ورود به محفظه تاریک از محفظه نور (0-دقیقه قرار گرفتن در معرض محفظه تاریک، مرحله تثبیت مجدد) به قفس خانه خود بازگردانده شدند یا به مدت 1، 3 یا در محفظه تاریک ماندند. 10 دقیقه بدون دریافت شوک پا (مرحله انقراض؛ شکل 1C-E). بلافاصله پس از جلسه فعال سازی مجدد، موش ها تزریق سیستمیک VEH یا مهارکننده سنتز پروتئین ANI را دریافت کردند. در 48 ساعت بعد، تأخیر متقاطع PR-LTM ارزیابی شد.

مطابق با مطالعه قبلی ما (فوکوشیما و همکاران، 2014)، قرار گرفتن مجدد در محفظه نور (0 گروه دقیقه) باعث تثبیت مجدد و افزایش حافظه IA شد. ANOVA دو طرفه اثرات قابل توجهی از زمان را نشان داد (F(1،24)=10.433، p=0.{{20}}}036)، دارو (F(1) ,24)=23.197, p , 0.0001) و تداخل دارویی زمانی (F(1,24)=25.022, p, 0.0001؛ شکل 1B). آزمون تعقیبی Bonferroni و آزمون t زوجی نشان داد که گروه‌های VEH و ANI به‌ترتیب افزایش یا کاهش معنی‌داری را نشان دادند، تأخیر متقاطع در PR-LTM در مقایسه با جلسه فعال‌سازی مجدد (ps , 0.05؛ VEH, t(6) {{28} }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003؛ شکل 1B). این مشاهدات نشان می دهد که بازیابی حافظه IA در محفظه نور باعث افزایش حافظه می شود، در حالی که مهار سنتز پروتئین حافظه بازیابی شده را مختل می کند، مشاهدات قبلی را تأیید می کند که بازیابی حافظه IA از طریق تثبیت مجدد به روشی وابسته به سنتز پروتئین، حافظه را تقویت می کند.

در مقابل، قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک باعث انقراض طولانی مدت شد [ANOVA دوطرفه، زمان (شکل 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04؛ شکل 1D, F(1,36)=11.699, p=0.0016), دارو (شکل 1C, F(1,28)=4.674, p=0.039؛ شکل 1D, F(1,36)=12}.285, p {{29} }}.0012)، تداخل دارویی زمانی (شکل 1C, F(1,28)=7}.916, p=0.009؛ شکل 1D, F(1,36) {{41 }}.915، p=0.0079)]، همانطور که قبلاً مشاهده شد (فوکوشیما و همکاران، 2014). گروه های VEH که به مدت 3 یا 10 دقیقه در محفظه تاریک ماندند در PR-LTM تأخیر متقاطع به طور قابل توجهی کاهش یافتند در مقایسه با جلسه فعال سازی مجدد، در حالی که گروه های ANI تأخیر متقاطع قابل مقایسه ای را در PR-LTM در مقایسه با جلسه فعال سازی مجدد و نسبت به جلسه نشان دادند. گروه‌های VEH (تست Bonferroni post hoc، ps , 0.05؛ آزمون t زوجی، شکل 1C، VEH، t(7)=4.976، p=0.0016، ANI، t(7) { {59}}.796, p. 0.05؛ شکل 1D, VEH, t(9)=10.211, p , 0.0001, ANI, t(9)=1}}}.02, p. 0.05 ). این مشاهدات نشان می دهد که قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک به مدت 3 یا 10 دقیقه حافظه IA را خاموش می کند و مهار سنتز پروتئین انقراض طولانی مدت را مسدود می کند. بنابراین، بازیابی حافظه IA در محفظه تاریک، حافظه IA را به روشی وابسته به بیان ژن خاموش می کند.

نکته مهم این است که گروه VEH زمان تأخیر متقاطع قابل مقایسه ای را در PR-LTM در مقایسه با جلسه فعال سازی مجدد و گروه ANI هنگامی که به مدت 1 دقیقه در محفظه تاریک ماندند [آنوا دو طرفه، زمان (F(1,36) {{ 5}}.03، p . 0.{19}}5)، دارو (F(1،36)=0.019، p. 0.05)، تداخل دارویی زمانی (F(1,36)=0.011, p . 0.05); آزمون بونفرونی تعقیبی، ps. 0.05; آزمون t زوجی، VEH، t(9)=0.091، p. 0.05، ANI، t(9)=0.328، p. 0.05; شکل 1E]. این مشاهدات نشان می‌دهد که گروه VEH نه افزایش و نه از بین رفتن حافظه IA را نشان داد و گروه ANI هیچ اختلالی در حافظه IA نشان نداد. بنابراین، قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک به مدت 1 دقیقه، هم بهبود و هم اختلال ناشی از ANI در حافظه IA فعال شده را مسدود کرد، اما حافظه IA خاموش نشد، نشان می‌دهد که این 1-دقیقه قرار گرفتن مجدد، القای تثبیت مجدد را لغو می‌کند. ، اما برای خاموش کردن حافظه IA کافی نیست.

به طور خلاصه، این نتایج نشان داد که قرار گرفتن مجدد در محفظه نور باعث ایجاد فاز تثبیت مجدد می شود، در حالی که قرار گرفتن مجدد مجدد در محفظه تاریک (3 یا 10 دقیقه) باعث فاز انقراض می شود. مهمتر از آن، ماندن به مدت 1 دقیقه در محفظه تاریک، مرحله گذار از تثبیت مجدد به انقراض را القا می کند، که بدون ایجاد انقراض، از تثبیت مجدد حافظه ترس جلوگیری می کند.

امضاهای مولکولی فازهای تثبیت مجدد، انتقال و انقراض در آمیگدال، هیپوکامپ و mPFC پس از بازیابی حافظه IA

تثبیت مجدد و انقراض حافظه ترس متنی افزایش فسفوریلاسیون CREB را در S133 نشان می‌دهد، نشانگر فعال‌سازی بیان ژن که برای تثبیت مجدد و انقراض طولانی‌مدت لازم است، اما پویایی متمایز فسفوریلاسیون CREB را نشان می‌دهد (Mamiya et al., 2{11}}09). ). جالب توجه است، مطالعات اخیر نشان داده‌اند که هیچ افزایشی در فسفوریلاسیون ERK، تنظیم‌کننده بالادستی CREB (Impey و همکاران، 1998؛ وو و همکاران، 2001)، در ناحیه قاعده‌ای جانبی آمیگدال در انتقال از تحکیم مجدد وجود ندارد. به انقراض یک حافظه ترس نشانه‌ای، اگرچه این فسفوریلاسیون در ناحیه قاعده‌ای جانبی افزایش می‌یابد زمانی که حافظه ترس نشانه‌ای دوباره تثبیت و خاموش می‌شود (Merlo et al., 2014, 2018). مطالعه دیگری نشان داد که ERK هیپوکامپ تنها زمانی فعال می شود که حافظه ترس متنی خاموش شود، اما دوباره تثبیت نمی شود (ترونسون و همکاران، 2009). این یافته‌ها نشان می‌دهد که فازهای تثبیت مجدد، انتقال و انقراض، نشانه‌های مولکولی و سلولی متمایز را نشان می‌دهند. بنابراین، ما سطوح pCREB و pERK را در مراحل تثبیت مجدد، انتقال و انقراض با استفاده از ایمونوهیستوشیمی اندازه‌گیری و مقایسه کردیم. ما برنامه های آزمایشی مشابه شکل 1B، D، E را با استفاده از چهار گروه آزمایشی انجام دادیم. موش ها در 24 ساعت پس از آموزش مجدداً در محفظه نور قرار گرفتند و سپس در محفظه تاریک ماندند [فعال سازی مجدد: 0 دقیقه در محفظه تاریک، گروه تثبیت مجدد (Recon). 1 دقیقه، گروه انتقال (Tran)؛ 10 دقیقه، گروه انقراض (Ext)]. گروه دیگری از موش ها به محفظه روشن/تاریک (گروه NR فعال نشده) بازگردانده نشدند. ما نورون‌های pCREB مثبت (pCREB1)، نورون‌های pERK مثبت (pERK1) و نورون‌های دو مثبت (pCREB1/pERK1) را در آمیگدال، هیپوکامپ و mPFC در 30 دقیقه پس از جلسه فعال‌سازی مجدد شمارش کردیم.

آمیگدال (منطقه جانبی) CREB در مراحل انقراض و تحکیم مجدد فعال شد، در حالی که ERK فقط در مرحله انقراض فعال شد (شکل 2A-C). ANOVA یک طرفه اثر قابل توجهی از گروه را نشان داد (شکل 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). مشابه با یافته‌های قبلی (مامیا و همکاران، 2009)، آزمون تعقیبی نیومن-کولز نشان داد که گروه‌های Recon و Ext نورون‌های pCREB1 بیشتری نسبت به گروه‌های دیگر نشان دادند (05/0 p.). این مشاهدات نشان داد که مشابه مشاهدات در سطوح رفتاری (شکل 1)، قرار گرفتن در محفظه تاریک به مدت 1 دقیقه (مرحله گذار) "روشن کردن" فسفوریلاسیون CREB را که در مرحله تحکیم مجدد افزایش می یابد، لغو می کند. در مقابل، نورون‌های pERK1 به طور قابل‌توجهی در گروه Ext بیشتر از سایر گروه‌ها مشاهده شد، اگرچه نورون‌های pERK1 بسیار کمتر از نورون‌های pCREB1 در گروه Ext وجود داشت (F(3,29)=3}.793, p { {23}}.0207؛ شکل 2C).

به‌طور مداوم، نورون‌های دوگانه مثبت‌تر (pCREB1/pERK1) در گروه Ext مشاهده شد (F(3,29)=6.698, p=0.{14}}{27}} 14؛ شکل 2D)، در حالی که به طور قابل توجهی نورون های pCREB1/perK- (pCREB تک مثبت) بیشتری در گروه های Recon و Ext مشاهده شد (F(3,29)=13.689, p , 0 .{48}}001؛ شکل 2E). بنابراین، فاز تثبیت مجدد تنها یک جمعیت واحد از نورون‌های pCREB1/pERK- را نشان داد. در مقابل، فاز انقراض دو جمعیت از نورون‌های pCREB1/pERK– و pCREB1/pERK1 را نشان داد، که نشان می‌دهد ERK تنها در زیر مجموعه‌ای از نورون‌های pCREB1 فعال می‌شود. نکته مهم، نتایج مشابهی در ناحیه قاعده جانبی آمیگدال مشاهده شد (شکل 2G, F(3,29)=13}.042, p , 0.0001؛ شکل 2H, F(3,29) {{32} }.824، p=0.0201؛ شکل 2I, F(3,29)=12.633, p , 0.0001؛ شکل 2J, F(3,29)=12 0.505, p , 0.0001).

فعالسازی دو فازی ERK در مرحله انقراض ERK یک فعال کننده بالادستی CREB است و در نتیجه، فعالسازی ERK برای تثبیت و تثبیت مجدد حافظه ترس مورد نیاز است (Schafe et al., 200{{31). }}؛ دووارچی و همکاران، 2005). با این حال، به طور متناقض، هیچ فعال سازی ERK در آمیگدال، هیپوکامپ، یا mPFC در مرحله تثبیت مجدد مشاهده نشد، زمانی که pERK در 3{52}} دقیقه پس از جلسه فعال سازی مجدد اندازه گیری شد (شکل های 2-4). بنابراین، دوره های زمانی فسفوریلاسیون ERK و CREB را بررسی کردیم. ما آزمایش مشابهی را مانند شکل‌های {4}} انجام دادیم، با این تفاوت که سطوح pCREB و pERK در 5، 15 و 3{59}} دقیقه پس از جلسه فعال‌سازی مجدد اندازه‌گیری شد (قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک برای {{ 66}}، 1، یا 1{80}} دقیقه؛ شکل 5A). مطابق با داده های نشان داده شده در شکل 2-4، افزایش قابل توجهی در نورون های pCREB1 در 30 دقیقه، اما نه در 5 دقیقه، پس از جلسه فعال سازی مجدد در Recon (آمیگدال، mPFC و هیپوکامپ) و Ext (آمیگدال و mPFC مشاهده شد. ) گروه ها، اما نه گروه Tran (شکل 5E، ANOVA یک طرفه، آمیگدال، 5 دقیقه، F(3،23)=0.346، p. 0.05، 30 دقیقه، F(3،23)=15.272, p , 0.0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1.169, p. 0.05, 30 min, F(3,23)=32. 346، p، 0.0001؛ هیپوکامپ، 5 دقیقه، F(3،23)=0.154، p. 0.05، 30 دقیقه، F(3،23)=16.197، p، 0.0001; تست t unpaired، آمیگدال، تحکیم مجدد، 5 در مقابل 30 دقیقه، t(12)=7.807، p، 0.0001، انقراض، 5 در مقابل 30 دقیقه، t(12)=5}}.405، p { {73}}.0002؛ mPFC، تحکیم مجدد، 5 در مقابل 30 دقیقه، t(12)=5.727، p، 0.0001، خاموشی، 5 در مقابل 30 دقیقه، t(12)=4.188 ، p=0.0013؛ ناحیه CA1 هیپوکامپ، تثبیت مجدد، 5 در مقابل 30 دقیقه، t(12)=2}.339، p=0.0374).

جالب توجه است که افزایش قابل توجهی در نورون‌های pERK1 در آمیگدال، mPFC و هیپوکامپ گروه‌های Recon، Tran و Ext در 5 دقیقه پس از جلسه فعال‌سازی مجدد در مقایسه با گروه NR مشاهده شد (شکل 5F، آمیگدال، F(3،23)=10.961, p=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011؛ هیپوکامپ، F(3،23)=6.924، p=0.0017). این مشاهدات نشان داد که ERK بلافاصله پس از جلسه فعال سازی مجدد در تمام مراحل حافظه فعال می شود. با این حال، این افزایش‌ها در تعداد نورون‌های pERK1 در 15 دقیقه پس از جلسه فعال‌سازی مجدد به سطوح پایه (قابل مقایسه با گروه NR) بازگشت (شکل 5F, آمیگدال, F(3,20)=2}.676, p. 0.05؛ mPFC، F(3،23)=0}.683، p. 0.05؛ هیپوکامپ، F(3،20)=0}.74، ص. 0.05). علاوه بر این، مطابق با یافته‌های نشان‌داده‌شده در شکل‌های 2-4، نورون‌های pERK1 به میزان قابل‌توجهی در آمیگدال، mPFC و هیپوکامپ در 30 دقیقه پس از جلسه فعال‌سازی مجدد فقط در گروه Ext مشاهده شد (شکل 5F، آمیگدال، F( 3،23)=6.616، p=0.022؛ mPFC، F(3،23)=8.012، p=0.0008؛ هیپوکامپ، F( 3،23)=6.206، ص=0.003). بنابراین، فازهای تثبیت مجدد و انتقال، فعالسازی گذرا ERK را تنها در نقطه زمانی اولیه (5 دقیقه) نشان می‌دهند، در حالی که فاز انقراض فعال‌سازی دو فازی ERK را در نقاط زمانی اولیه (5 دقیقه) و اواخر (30 دقیقه) پس از فعال‌سازی مجدد نشان می‌دهد. جلسه این مشاهدات نشان داد که مکانیسم‌های تنظیم فعال‌سازی ERK در فازهای تثبیت مجدد/ گذار و انقراض متفاوت است. در مجموع، مشاهدات ما نشان داد که فازهای تثبیت مجدد، انتقال و انقراض، نشانه‌های مولکولی متمایز را نشان می‌دهند.

نقش فعال سازی ERK در مراحل تثبیت مجدد و انقراض حافظه IA

فازهای تثبیت مجدد / گذار و انقراض به ترتیب فعال سازی ERK تک فازی و دو فازی را نشان دادند. ما در مرحله بعد نقش اولیه (5 دقیقه) و دیرهنگام (30 دقیقه) فعال سازی ERK را در mPFC در فازهای تثبیت مجدد و انقراض با بررسی اثرات مهار ERK بررسی و مقایسه کردیم (شکل 6).

بحث

در این مطالعه، مکانیسم‌های انتقال حافظه از فازهای تثبیت مجدد به فاز انقراض پس از بازیابی حافظه IA را بررسی کردیم. ما ابتدا علائم رفتاری فازهای حافظه IA را پس از بازیابی مشخص کردیم. مطابق با مطالعه قبلی ما (فوکوشیما و همکاران، 2014)، تثبیت مجدد و خاموشی ناشی از بازیابی حافظه IA با قرار گرفتن مجدد در معرض نور ({12}} دقیقه در محفظه تاریک) و تاریکی ( به ترتیب 3 یا 10 دقیقه). جالب توجه است، حافظه IA نه تقویت شده و نه خاموش شد و زمانی که موش‌ها تنها به مدت 1 دقیقه مجدداً در محفظه تاریک قرار گرفتند، مقاومت در برابر مهار سنتز پروتئین نشان داد. بنابراین، این مشاهدات نشان می‌دهند که قرار گرفتن مجدد 1- دقیقه‌ای در محفظه تاریک، القای تثبیت مجدد را لغو می‌کند، اما برای خاموش کردن حافظه IA کافی نیست. علاوه بر این، ما دریافتیم که ERK در آمیگدال، هیپوکامپ و mPFC در یک نقطه زمانی اولیه (5 دقیقه) پس از قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک به مدت 0، 1 یا 10 دقیقه فعال شد. به طور مداوم، مهار ERK در این مناطق مغز، تثبیت مجدد / تقویت و انقراض حافظه IA را مسدود کرد. مهمتر از همه، مهار ERK در آمیگدال، هیپوکامپ و mPFC به دنبال 1-دقیقه قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک، مانع از تقویت حافظه IA با واسطه تثبیت مجدد شد، که نشان می‌دهد فعال شدن ERK پس از قرار گرفتن مجدد کوتاه مدت (۱ دقیقه) به محفظه تاریک برای مهار تثبیت مجدد حافظه IA مورد نیاز است. برعکس، یک 1-دقیقه قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک برای خاموش کردن حافظه IA کافی نبود، اگرچه قرار گرفتن مجدد طولانی مدت در محفظه تاریک (3 یا 10 دقیقه) این حافظه را خاموش کرد. بنابراین، نتایج ما نشان می‌دهد که یک 1-دقیقه قرار گرفتن مجدد در محفظه تاریک باعث ایجاد یک فرآیند انتقال حافظه می‌شود که تثبیت/تقویت مجدد را لغو می‌کند اما یادگیری انقراض را آغاز نمی‌کند. در مجموع، ما پیشنهاد می‌کنیم که فرآیند انتقال حافظه به تغییر فازهای حافظه از تثبیت مجدد به انقراض از طریق پیشگیری از تثبیت مجدد با واسطه ERK کمک می‌کند.

مشابه مشاهدات کنونی ما، یک مطالعه اخیر با استفاده از شرطی سازی ترس شنوایی نشان داد که ارائه CS منفرد (1) یا طولانی مدت (10) به ترتیب از طریق افزایش سطوح pERK در ناحیه قاعده جانبی آمیگدال، باعث تثبیت مجدد و انقراض حافظه می شود. در مقابل، تظاهرات CS متوسط ​​(4-7) سطوح pERK را در ناحیه قاعده‌ای جانبی آمیگدال تغییر نمی‌دهد. نکته مهم، مهار ERK در ارائه‌های CS میانی بر حافظه ترس تأثیری نداشت. این مطالعه نشان داد که پس از بازیابی حافظه ترس، یک انتقال فاز حافظه از تثبیت مجدد به انقراض وجود دارد (Merlo et al., 2018). در مطالعه حاضر، ما این یافته را گسترش دادیم و پیشنهاد کردیم که فاز انتقال به طور فعال فازهای حافظه را از تثبیت مجدد به انقراض از طریق فعال‌سازی مسیر انتقال سیگنال ERK تغییر می‌دهد. برخلاف یافته‌های قبلی (Merlo و همکاران، 2018)، ما دریافتیم که فاز انتقال شامل فسفوریلاسیون ERK در آمیگدال، هیپوکامپ و mPFC است. این اختلافات ممکن است به دلیل تفاوت نقاط زمانی بررسی فسفوریلاسیون ERK باشد. مطالعه قبلی سطوح pERK را در 12 دقیقه پس از ارائه CS اندازه گیری کرد (Merlo et al., 2018)، در حالی که مطالعه ما نشان داد که افزایش سطح pERK در حدود این نقطه زمانی (15 دقیقه پس از قرار گرفتن در معرض مجدد) به سطح پایه بازگشت. علاوه بر این، مهم است که توجه داشته باشیم که وظیفه IA مشاهده افزایش حافظه IA را از طریق تثبیت مجدد امکان پذیر می کند، در نتیجه منجر به یافتن ما می شود که مهار ERK در مرحله انتقال مانع از افزایش حافظه IA می شود.

مطالعات قبلی نشان داده‌اند که فسفوریلاسیون ERK در ناحیه قاعده‌ای جانبی آمیگدال در 20 تا 60 دقیقه پس از یادگیری خاموشی حافظه ترس افزایش می‌یابد (هری و همکاران، 2006؛ مرلو و همکاران، 2014، 2018)، در حالی که هیپوکامپ نشان می‌دهد. این فعال سازی در 1 ساعت پس از یادگیری انقراض حافظه ترس زمینه ای (فیشر و همکاران، 2007؛ ترونسون و همکاران، 2009). در مطالعه حاضر، مشاهدات مشابهی به دست آوردیم که pERK در 30 دقیقه پس از جلسه فعال‌سازی مجدد در مرحله انقراض افزایش می‌یابد. این یافته‌ها نشان می‌دهد که فسفوریلاسیون ERK یک امضای مولکولی رایج در مرحله انقراض دیررس (20 تا 60 دقیقه) است.

علاوه بر این، مشاهده کردیم که فعال سازی ERK به صورت دو فازی در نقاط زمانی اولیه و دیررس (5 و 30 دقیقه) پس از جلسه فعال سازی مجدد در مرحله انقراض رخ می دهد، در حالی که این فعال سازی به صورت تک فازی در نقطه زمانی اولیه در مرحله تثبیت مجدد رخ می دهد (شکل 5). . به طور مداوم، مهار ERK در نواحی مغز در این نقاط زمانی فازهای تثبیت مجدد و انقراض، به ترتیب تثبیت/تقویت مجدد و انقراض طولانی مدت را مسدود می کند (شکل 6A، C-H). این مشاهدات نشان می دهد که فعال سازی ERK تک فازی و دو فازی به ترتیب برای تقویت و انقراض حافظه IA با واسطه تثبیت مجدد مورد نیاز است. توجه به این نکته مهم است که ERK به عنوان یک تنظیم کننده بالادستی فسفوریلاسیون CREB عمل می کند. بنابراین، فعال سازی گذرا ERK در مرحله اولیه حافظه ممکن است، حداقل تا حدی، به این فسفوریلاسیون CREB کمک کند، که بیان ژن های مورد نیاز برای تثبیت مجدد و انقراض طولانی مدت را فعال می کند.

مشابه یافته‌های قبلی ما با استفاده از شرطی‌سازی ترس زمینه‌ای (Mamiya و همکاران، 2009)، CREB در فازهای حافظه مجدد (آمیگدال/هیپوکامپ/mPFC) و انقراض (آمیگدال/mPFC) فعال شد، در حالی که ERK فقط در مرحله انقراض فعال شد. در 30 دقیقه پس از جلسه فعال سازی مجدد. به طور مداوم، تنها یک جمعیت واحد از نورون‌های pCREB1/pERK- در مرحله تحکیم مجدد مشاهده شد، در حالی که جمعیت‌های نورون متمایز در مرحله انقراض مشاهده شدند: نورون‌های pCREB1/pERK- و pCREB1/pERK1 در آمیگدال (شکل 2). نورون های pCREB-/pERK1 در هیپوکامپ (شکل 3). و نورون‌های pCREB1/pERK–، pCREB–/pERK1، و pCREB1/pERK1 در mPFC (شکل 4). این مشاهدات، به‌ویژه مشاهده متضاد نورون‌های pCREB-/pERK1 و pCREB1/pERK-، نشان می‌دهد که فعال‌سازی CREB و ERK در هر ناحیه مغزی زمانی که حافظه خاموش می‌شود به طور متفاوتی تنظیم می‌شود و فعال‌سازی فاز پایانی ERK خاص و متمایز است. نقش در انقراض حافظه ترس در مقایسه با سایر فرآیندهای حافظه مانند تثبیت و تثبیت مجدد همانطور که در زیر بحث شده است. به طور جالب توجهی، مشاهده کردیم که نورون‌های pERK1 در mPFC در مقایسه با هیپوکامپ و آمیگدال فراوان‌تر بودند، زیرا mPFC نسبت بالاتری از نورون‌های pERK1 (مرحله انقراض) و نورون‌های pCREB1 (مرحله تحکیم مجدد) را در مقایسه با هیپوکامپ و آمیگدال نشان داد. فعال شدن ERK در mPFC نقش ویژه تری در انقراض حافظه ایفا می کند.

هنوز مشخص نیست که آیا جمعیت های مشابه یا متفاوتی از نورون ها در فازهای تثبیت مجدد، انتقال و حافظه انقراض فعال می شوند یا خیر. مطالعه قبلی فعال شدن «نرون‌های ترس» و «نرون‌های انقراضی» را در آمیگدال زمانی که حافظه ترس نشانه‌ای دوباره فعال یا خاموش می‌شود، شناسایی کرد (هری و همکاران، 2008). بنابراین، ممکن است ERK و CREB در جمعیت‌های مختلف نورون‌ها با پروفایل‌های زمانی متفاوت (یعنی «نرون‌های تثبیت مجدد» و نورون‌های انقراضی) فعال شوند. همانطور که در بالا مورد بحث قرار گرفت، نورون‌های pCREB1، از جمله نورون‌های pCREB1/pERK1، ممکن است تثبیت مجدد و انقراض طولانی‌مدت حافظه IA را از طریق فعال‌سازی بیان ژن به ترتیب به عنوان نورون‌های تثبیت مجدد و انقراض تنظیم کنند. برعکس، فعال‌سازی ERK در نورون‌های pCREB-/pERK1 ممکن است به لغو فعال‌سازی رونویسی با واسطه CREB کمک کند که برای تثبیت مجدد مورد نیاز است، زیرا این فعال‌سازی ERK به طور خاص در مرحله انقراض اواخر مشاهده می‌شود. ERK در نورون های تثبیت مجدد فعال شده است تا فعال سازی بیان ژن را در مرحله انقراض لغو کند. جالب توجه است، مطالعه قبلی نشان داد که فعال‌سازی ERK هیپوکامپ القای c-fos را هنگامی که حافظه ترس متنی خاموش می‌شود، مسدود می‌کند (Guedea و همکاران، 2011)، و این احتمال را افزایش می‌دهد که این فعال‌سازی ERK با مسیر سیگنال‌دهی CREB مخالفت کند. شناسایی جمعیت های عصبی که تثبیت مجدد، انتقال، و انقراض را تنظیم می کنند و بررسی امضاهای مولکولی و اهمیت عملکردی آن نورون ها مهم است. علاوه بر این، تعاملات بین جمعیت های عصبی شناسایی شده در این مطالعه ناشناخته باقی مانده است. این امکان وجود دارد که «نرون‌های انقراض (انتقال)» عملکرد نورون‌های تثبیت مجدد را تعدیل کنند تا مانع از تثبیت مجدد از طریق تعامل بین آنها شوند (ایزنبرگ و همکاران، 2003؛ مرلو و همکاران، 2014). بنابراین، بررسی این فعل و انفعالات در و بین آمیگدال، mPFC و هیپوکامپ نیز مهم است.

پیش از این، ما نشان دادیم که هیپوکامپ هیچ تغییری در فسفوریلاسیون CREB و بیان قوس به دنبال یادگیری انقراض ترس زمینه‌ای نشان نمی‌دهد و به طور مداوم، مهار سنتز پروتئین در هیپوکامپ در مرحله انقراض نمی‌تواند انقراض طولانی‌مدت را مسدود کند (Mamiya et al. ، 2009). این مشاهدات این احتمال را افزایش داده است که هیپوکامپ برای انقراض طولانی مدت مورد نیاز نیست. با این حال، ما نشان دادیم که ERK پس از یادگیری انقراض حافظه IA در هیپوکامپ فعال می‌شود و به طور مداوم، مسدود کردن فعال‌سازی ERK در هیپوکامپ انقراض طولانی‌مدت را مختل می‌کند. بنابراین، مشاهدات فعلی ما نقش اساسی هیپوکامپ در انقراض حافظه را نشان می دهد. در کنار یافته‌های قبلی، ما پیشنهاد می‌کنیم که هیپوکامپ برای انقراض حافظه لازم است، اما نه برای یک فرآیند شبیه‌سازی برای تثبیت «حافظه انقراض» از طریق فعال‌سازی بیان ژن.