یک نانوسیتوکین مبتنی بر IL{0}}به طور ایمن ایمنی ضد سرطانی را از طریق کنترل فضایی و زمانی التهاب برای ریشه‌کنی تومورهای پیشرفته سرماخوردگی تقویت می‌کند.

درمان تومورهای سرد ایمونولوژیک یک چالش بزرگ برای مهارکننده های ایست بازرسی ایمنی (ICIs) است. اینترلوکین 12 (IL-12) می‌تواند با ایجاد ایمنی ضد توموری قوی، ICI را در برابر تومورهای سرد تقویت کند. با این حال، سمیت و القای سیستمیک آن برای مقابله با سیگنال‌های سرکوب‌کننده سیستم ایمنی، ترجمه را مختل کرده است. در اینجا، فعالیت IL-12 از نظر مکانی-زمانی کنترل می‌شود تا با ایجاد یک نانو سیتوکین که در pH فیزیولوژیکی غیرفعال می‌ماند، اما در pH اسیدی تومور، فعالیت کامل خود را آزاد می‌کند، اثربخشی را بدون تحریک پاسخ‌های ایمنی تداخلی افزایش دهد. نانو سیتوکین مبتنی بر IL-12-(Nano-IL-12) در بافت‌های تومور تجمع و آزاد می‌کند و التهاب ضد تومور موضعی ایجاد می‌کند، در حالی که از پاسخ ایمنی سیستمیک، واکنش‌های ایمنی متقابل، و سمیت های نامطلوب حتی پس از تجویز مکرر وریدی. کنترل فضایی-زمانی التهاب با واسطه Nano-IL باعث اثربخشی ضد سرطانی عالی می شود و با ICI ها همکاری می کند تا ریزمحیط تومور را عمیقاً ملتهب کند و تومورهای اولیه و متاستاتیک مقاوم به ICI را کاملاً ریشه کن کند. این استراتژی می‌تواند رویکردی امیدوارکننده به سمت درمان‌های ایمن‌تر و مؤثرتر باشد.

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

1. معرفی

مهارکننده‌های ایست بازرسی ایمنی (ICI)، مانند آنتی‌بادی‌های anti-PD-1 (nivolumab) و anti-CTLA- 4 (ipilimumab)، انقلابی در درمان سرطان ایجاد کرده‌اند. بیماران هنوز از این درمان ها سود نمی برند.[3] چنین پاسخ ناقصی با فنوتیپ تومور سرد غیر حساس به ICI مرتبط است. [4،5] این تومورهای سرد معمولاً یک ریزمحیط سرکوبگر سیستم ایمنی و سطوح پایین نفوذ سلول های T را نشان می دهند که اثرات ICI ها را ضعیف می کند.[5-7]. بنابراین، نیاز فوری به عواملی وجود دارد که تومور را از فنوتیپ سرد به فنوتیپ ملتهب (گرم) با نفوذ سلول T بالا به منظور افزایش کارایی ICIs و گسترش چشم انداز درمانی تغییر دهند. اینترلوکین{13}} (IL-12)، که در میان قوی‌ترین سایتوکاین‌های پیش التهابی است، پتانسیل بالایی برای تقویت ایمنی ضد توموری و غلبه بر مقاومت ICI دارد. عوارض جانبی شدید مرتبط با سیستم ایمنی (irAEs) هنگامی که به صورت سیستمیک تزریق می شود. [8،10] بنابراین، انواع روش های مهندسی پروتئین، از جمله سایتوکاین های ایمنی، [11-13] پروتئین های همجوشی، [14] و سایتوکاین های حساس به پروتئاز، [15] ] تحت بررسی شدید برای بهبود ایمنی IL{26}} از طریق کاهش مواجهه سیستمیک و افزایش گزینش تومور هستند. از سوی دیگر، IL{27}} همچنان دارای اشکالات مهمی است که مربوط به پویایی فضایی و زمانی التهاب است که منجر به واکنش‌های ایمنی متقابل می‌شود که کارایی آن را تضعیف می‌کند. گسترش سیستمیک اینترلوکین ضدالتهابی{31}} (IL{32}}) در بیماران، که اثربخشی ضد تومور را محدود می‌کند. }}التهاب واسطه می تواند عملکردهای موثر را به حداکثر برساند و ایمنی ضد توموری قوی را تحریک کند، در حالی که از تداخل واکنش های ایمنی جلوگیری می کند. متأسفانه، پویایی التهابی برای سیستم‌های مهندسی پروتئین فوق الذکر به طور کامل درک نشده است، و ارتباط آن‌ها با واکنش‌های ثانویه خنثی‌سازی هنوز مشخص نشده است. در اینجا، ما سایتوکاین‌های نانومقیاس پاسخ‌دهنده به محرک‌ها (نانو سیتوکین‌ها) را با کپسوله‌سازی IL{39}} بومی با پلیمرهای زیست سازگار برای دستیابی به کنترل فضایی-زمانی فعالیت آن توسعه دادیم. نانو سیتوکین‌های مبتنی بر IL{40} (Nano-IL{42}}) به گونه‌ای طراحی شده‌اند که IL کاملاً فعال{43}} را پس از تشخیص PH داخل توموری اسیدی آزاد کنند، زیرا اسیدوز یکی از مشخصه‌های سرطان است[23] و با سرکوب سیستم ایمنی مرتبط است. [24،25] در واقع، ما اخیراً دریافته‌ایم که عملکرد تغییرپذیر pH می‌تواند امکان فعال‌سازی انتخابی و بالا را در تومورهای مقاوم به ICI فراهم کند.[26] فارماکوکینتیک، ایمنی و اثربخشی Nano-IL{51}} در مدل‌های موشی ملانوما سرد و سرطان سینه مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج ما نشان داد که NanoIL{52}} با افزایش شدت و مدت قرار گرفتن در معرض IL{53}} یک واکنش التهابی پایدار را در بافت‌های تومور القا می‌کند و در عین حال از تعامل با سلول‌های ایمنی در بافت‌های سالم برای سرکوب خارج شدن آن اجتناب می‌کند. پاسخ ایمنی را هدف قرار دهید بنابراین، Nano-IL{56}} به طور موثری واکنش‌های ثانویه مقابله‌ای را هم به‌صورت سیستمی و هم داخل تومور مسدود می‌کند، و در دوزهایی که 10-برابر کمتر از IL بومی هستند، اثربخشی نشان می‌دهد. ایمنی ضد توموری تقویت‌شده Nano-IL{60}} به‌طور ایمن با ICIs هم‌افزایی کرد تا به شدت ریزمحیط تومور (TME) را ملتهب کند، که منجر به پاسخ‌های کامل (CR) در مدل‌های ملانوم مقاوم به ICI، و متاستاز اولیه و ریوی سه‌گانه شد. سرطان پستان منفی (TNBC).

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

2. نتایج

2.1. Nano-IL{3}} pH داخل توموری را برای آزادسازی سیتوکین کاملا فعال حس می کند.

برای ساختن نانو-IL{1}}، ما پلی (اتیلن گلیکول)-پلی (LLysine) (PEG-pLL(CDM)) اصلاح شده کربوکسی دی متیل مالئیک انیدرید (CDM) را از طریق روش گزارش شده سنتز کردیم [27] (طرح S1، اطلاعات پشتیبانی). پلیمر دارای نیمی از گروه های آمینه در بلوک pLL است که از طریق پیوند آمیدی با CDM کونژوگه شده است (شکل S1-S3، اطلاعات پشتیبانی). Nano-IL{{10}} فقط با مخلوط کردن پلیمر با سیتوکین در شرایط آبی بدون افزودن حلال‌های آلی تشکیل می‌شود (شکل 1a). گروه‌های آمینه در پلیمر با بخش‌های کربوکسیلات در پروتئین‌ها کمپلکس یونی تشکیل می‌دهند، در حالی که گروه‌های CDM با گروه‌های آمینه در IL{12}} و همچنین در رشته‌های پلیمری واکنش می‌دهند تا پیوندهای آمیدی حساس به pH تشکیل دهند. راندمان کپسوله‌سازی IL{14}} در نانوسیتوکین‌ها حدود 80% تعیین شد، همانطور که توسط HPLC با مقایسه نواحی پیک‌های الکسا فلور 647 (A647) نشاندار آزاد IL{19}} و اندازه‌گیری شد. IL{20}} بارگذاری شده در نانوسیتوکین (شکل 1b). در مورد IL بدون فلورسانس، کارایی کپسولاسیون با اندازه‌گیری ELISA تأیید شد، زیرا روش الایزا تنها می‌تواند IL آزاد بدون کپسوله-12 را در مخلوط واکنش‌دهنده تشخیص دهد زیرا پوشش پلیمری نانو است. -IL{26}} شناسایی IL بارگذاری شده-12 را با آنتی بادی تشخیص مسدود می‌کند. بنابراین، با محاسبه نسبت IL-12 غیر محصور شده به کل خوراک IL-12، راندمان کپسولاسیون نیز حدود 80% تعیین شد (شکل S4a، اطلاعات پشتیبانی)، مطابق با نتیجه حاصل از اندازه گیری های HPLC NanoIL{32}} با فیلتراسیون گریز از مرکز برای حذف IL آزاد{33}} و ترکیبات نسبتاً کوچک پلیمر-IL{35}} خالص شد (شکل S4b، اطلاعات پشتیبانی). خالص سازی توسط HPLC تایید شد (شکل 1b، پانل پایینی). تشکیل سپر پلیمری روی Nano-IL{39}} با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و پراکندگی نور دینامیکی (DLS) تأیید شد. در TEM، هسته بارگذاری شده IL{40} NanoIL{41}} که توسط بلوک pLL پلیمر و IL{42}} تشکیل شده است توسط اورانیل استات[28] رنگ آمیزی شد و به صورت نقاط سیاه یکنواخت با مشاهده شد. قطر متوسط ​​در 4 ± 23.2 نانومتر (شکل 1c,d). توسط DLS، قطر هیدرودینامیکی Nano-IL{49}} 2±42 نانومتر اندازه‌گیری شد (شکل 1e). با مقایسه اندازه اندازه گیری شده توسط TEM و DLS، می توان محاسبه کرد که ضخامت پوسته PEG در این ذرات تقریباً 10 نانومتر است. این نتیجه نشان دهنده یک PEGylation متراکم است که برای بهبود فارماکوکینتیک مفید است.[29] علاوه بر این، مطالعات طیف‌سنجی همبستگی فلورسانس (FCS) روی A{55}}Nano-IL نشان‌دار{57}} تشکیل پیوندهایی با وزن مولکولی بزرگ‌تر از A{58}}نشان‌دار IL{59}} را تأیید کرد. (جدول S1، اطلاعات پشتیبانی). با مقایسه تعداد هر مولکول در اندازه‌گیری FCS نمونه‌های A{61}}IL برچسب‌دار-12 و A{63}}Nano-IL نشان‌دار-12، تعیین کردیم که هر Nano-IL{ {67}} به طور متوسط ​​حاوی تقریباً 1.5 IL{70}} مولکول است. علاوه بر این، بار سطحی Nano-IL{72}} نزدیک به خنثی است (جدول S2، اطلاعات پشتیبانی) که نشان می‌دهد پلیمر از IL دارای بار منفی محافظت می‌کند. پیوندهای آمیدی در Nano-IL-12 که بین بخش‌های CDM و آمین‌های اولیه تشکیل می‌شوند، به pH حساس گزارش شده‌اند.[30] بنابراین، انتظار می رود که نانو-IL{80}} در شرایط اسیدی تجزیه شود تا سیتوکین کپسوله شده را آزاد کند. ما ابتدا حساسیت pH نانو-IL{83}} را در مقادیر مختلف pH از 4.5 تا 8.5 با اندازه‌گیری FCS غربال کردیم تا وضعیت تفکیک Nano-IL{89}} را با تغییر آن منعکس کنیم. ضریب انتشار. افزایش ضریب انتشار، مربوط به کاهش وزن مولکولی ذرات، می تواند در شرایط اسیدی زیر PH 7.0 مشاهده شود، که نشان می دهد نانو-IL{93}} در pH فیزیولوژیکی پایدار است، اما می تواند خود را از دست بدهد. یکپارچگی در ضایعات داخل توموری با محیط اسیدی [23،31] (شکل 1f). در مرحله بعد، ما سینتیک تفکیک Nano-IL{98}} را در pH فیزیولوژیکی 7.4 و pH داخل توموری 6.5 با اندازه‌گیری FCS بررسی کردیم. اندازه‌گیری FCS امکان ارزیابی دقیق ضرایب انتشار Nano-IL{104}} و IL آزاد شده را فراهم می‌کند. نتیجه جدید نشان داد که Nano-IL{107}} به سرعت یکپارچگی خود را در pH 6.5 از دست می‌دهد، و ضریب انتشار نمونه پس از 4 ساعت انکوباسیون به مقدار IL آزاد{110}} رسید که نشان‌دهنده فعال‌سازی کامل Nano-IL است. -12 تحت چنین شرایطی. علاوه بر این، در pH 7.4، Nano-IL{117}} پایدار بود (شکل 1g)، ضریب انتشار خود را حتی پس از چند روز حفظ کرد (شکل S4c، اطلاعات پشتیبانی). این مشاهدات از فعال‌سازی انتخابی Nano-IL{121}} در شرایط pH داخل توموری و ثبات در شرایط فیزیولوژیکی پشتیبانی می‌کنند. از آنجایی که IL{122}} می‌تواند ترشح IFN-𝛾 از سلول‌های طحال را تحریک کند، [32] اثر محافظت/حفاظ‌زدایی پلیمری بر زیست فعالی نانو-IL{127}} در شرایط آزمایشگاهی با روش اسپلنوسیت مورد ارزیابی قرار گرفت. شکل 1h). Nano-IL{130}} سطوح پایین‌تری از تولید IFN- 𝛾 از سلول‌های طحال موش را القا می‌کند، که نشان‌دهنده انسداد زیست‌فعالی IL{132}} توسط کپسوله‌سازی پلیمری است. از سوی دیگر، Nano-IL{134}} فعال شده با پیش جوجه کشی در اسید (pH 6.5) دارای زیست فعالی مشابهی با IL بومی{138}} است، که نشان می دهد نانو-IL فعال شده{140}} می تواند به طور کامل زیست فعالی سیتوکین را بازیابی کند.

شکل 1. Nano-IL{2}} در pH داخل توموری فعال می‌شود تا سیتوکین کاملاً فعال را آزاد کند. الف) تشکیل و ساختار نانوسیتوکین مبتنی بر IL-12- (Nano-IL- 12). Nano-IL{7}} در شرایط آبی به سادگی با اختلاط پلیمر با IL{9}} خود مونتاژ می شود. این مجموعه توسط پیوندهای آمیدی حساس به pH و برهمکنش های الکترواستاتیکی هدایت می شود. ب) نتایج HPLC پروتئین آزاد IL{11}}، مخلوط PEG-pLL(CDM) + IL{14}} و نانو-IL خالص{16}}. پروتئین‌های IL{17}} با A647 برچسب‌گذاری شده‌اند. ج) تصویر TEM نماینده Nano-IL خالص شده{20}} به وضوح ساختار هسته ذرات را نشان می‌دهد. د) توزیع قطر هسته ذرات اندازه گیری شده از تصاویر TEM. n=100 ذره شمارش شد. ه) توزیع قطرهای هیدرودینامیکی Nano-IL{23}} اندازه‌گیری شده توسط DLS. f) تجزیه وابسته به pH Nano-IL-12 که با اندازه‌گیری FCS Nano-IL-12 نشان داده می‌شود که تحت pH مختلف به مدت ۲۴ ساعت انکوبه شده است. خط نقطه چین در 5.3 × 107 cm2 s-1 به ضریب انتشار IL آزاد اشاره دارد{35}}. g) نمایه انتشار IL{36}} Nano-IL-12 با روش FCS اندازه‌گیری شد. خطوط نقطه چین در 1.2 × 107 cm2 s-1 و 5.3 × 107 cm2 s-1 به ترتیب به ضرایب انتشار نانو-IL دست نخورده{50}} و IL آزاد آزاد شده{51}} اشاره دارد. h) ترشح IFN-𝛾 توسط سلول‌های طحال موش تحت درمان با Nano-IL{54}}، Nano-IL فعال شده{56}} و IL بومی-12. IFN-𝛾 با روش الایزا اندازه گیری شد. داده ها به صورت میانگین ± SD نشان داده می شوند. برای f و g، n=3 اندازه گیری های موازی. برای h، n=5 اندازه گیری موازی.

حفظ و پایداری فرمولاسیون نیز برای ترجمه Nano-IL{1}} به عنوان دارو مهم است. بنابراین، ما یک نسخه لیوفیلیزه شده از Nano-IL{3}} را با استفاده از ترهالوز به عنوان محافظ سرما ایجاد کردیم.[33] Nano-IL{6}} بازسازی شده اندازه و بار سطحی قابل مقایسه با Nano-IL تازه-12، بدون نشت محموله، و حساسیت pH مشابه و قابلیت القای IFN-𝛾 در شرایط آزمایشگاهی را نشان داد (شکل S4d-g و جدول S2، اطلاعات پشتیبانی). این نتایج از فرمول لیوفیلیزه به عنوان همتای قابل دوام Nano-IL-12 پشتیبانی می‌کنند.

شکل 2. Nano-IL{2}} فارماکوکینتیک و اثربخشی ضد تومور را بهبود می بخشد. الف) تصاویر IVCLSM از پوست لاله گوش موش پس از تزریق داخل وریدی 10 میکروگرم A647-با برچسب IL-12 یا Nano-IL-12 (رنگ قرمز). نوار مقیاس=50 میکرومتر. میانگین شدت فلورسانس در ناحیه بافت (جعبه‌های سفید) در 5 ساعت پس از تزریق اندازه‌گیری شد و به حداکثر شدت در عروق بلافاصله پس از تزریق (Vmax) نرمال شد. ب) پروفایل گردش خون IL آزاد-12 و Nano-IL-12 پس از تزریق داخل وریدی 10 ug IL-12 یا معادل Nano-IL-12 تعیین شده توسط ELISA. همچنین، غلظت IL آزاد شده{18}} از Nano-IL{20}} در خون رسم شده است (داده ها به صورت میانگین ± SD، n=5 موش در هر گروه نشان داده شده است). ج) تصویر IVIS از تومورهای ملانوما B16F10 برداشته شده 24 ساعت پس از تزریق داخل وریدی 10 میکروگرم IL{26}} یا معادل نانو-IL-12 با برچسب A647. د) تعیین کمیت سطح IL{30}} در تومورهای 4T1 TNBC در 24- و 48 ساعت پس از تزریق داخل وریدی 10 میکروگرم IL-12 یا معادل Nano-IL{38}} توسط ELISA ( داده‌ها به‌عنوان میانگین ± انحراف معیار، n=3 موش در هر گروه نشان داده می‌شوند، مقادیر p با ANOVA یک طرفه محاسبه می‌شوند. ه) فعالیت ضد توموری یک تزریق داخل وریدی (روزهای تزریق با فلش نشان داده شده است (روز 8 برای مدل B16F10 و روز 7 برای مدل 4T1)) 10 میکروگرم IL-12 یا معادل Nano-IL{ {51}}. نتایج ملانوم B16F10 در پانل بالایی و نتایج در 4T1 TNBC در پانل پایین نشان داده شده است. منحنی های رشد تومور فردی در پانل سمت چپ نشان داده شده است. منحنی‌های متوسط ​​حجم تومور در پانل‌های مرکزی نشان داده شده‌اند، و منحنی‌های بقا در پانل سمت راست نشان داده شده‌اند (داده‌ها به صورت میانگین ± SEM نشان داده می‌شوند؛ n=5 موش در هر گروه، مقادیر p از طریق تحلیل log-rank محاسبه می‌شوند. ).

2.2. Nano-IL{3}} فارماکوکینتیک IL را بهبود می بخشد و در تومورها فعال می شود تا اثرات ضد توموری را تقویت کند.

کپسوله شدن در Nano-IL-12 می‌تواند فارماکوکینتیک IL-12 را بهبود بخشد. برای تجسم گردش خون Nano-IL{4}} پس از تزریق داخل وریدی (IV)، از میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال in vivo (IVCLSM) برای ردیابی Nano-IL مبتنی بر A647-IL{{6} استفاده شد. -12 در عروق لاله گوش موش پس از تزریق از ورید دم. IL آزاد{9}} خارج شدن را پس از تزریق نشان داد (شکل 2a) که با افزایش شدت فلورسانس در بینابینی بافت نشان داده شد. با توجه به اینکه ماکرومولکول هایی که دارای اندازه قابل مقایسه با IL{11}} (75 کیلو دالتون) هستند، مانند دکستران 70 کیلو دالتون و آلبومین (65 کیلو دالتون)، دسترسی محدودی به پوست نشان می دهند،[34] نشت IL{16}} از عروق نشان دهنده ناپایداری IL{17}} در طول گردش خون است. در واقع، مطالعات قبلی پروتئولیز IL{18}} توسط آنزیم‌های موجود در سرم را نشان داده‌اند.[35،36] برای حمایت بیشتر از تخریب IL{21}} در آزمایش‌های ما، پایداری A{22 }} نشاندار شده IL-12 در پلاسمای موش توسط کروماتوگرافی حذف اندازه (SEC) بررسی شد. پس از انکوباسیون با پلاسمای موش، متوجه شدیم که IL{24}} به قطعاتی با وزن مولکولی کوچک‌تر تجزیه می‌شود (شکل S5، اطلاعات پشتیبانی)، که ناپایداری IL-12 را در خون تأیید می‌کند. از سوی دیگر، Nano-IL{28}} کمترین نشت را به داخل پوست نشان داد که نشان دهنده ثبات آنها در گردش خون است. نمایه گردش کمی اندازه‌گیری شده از روش الایزا تأیید کرد که Nano-IL کلی{30}} گردش بیشتری نسبت به IL آزاد-12 دارد (شکل 2b). در همین حال، سطح Nano-IL فعال شده{34}} که توسط IL آزاد شده تعیین شد، در خون بسیار محدود بود که نشان دهنده پایداری in vivo نانو-IL-12 در طول سیستمیک است. گردش خون، که به کاهش عوارض جانبی سیستمیک کمک می کند. تجمع Nano-IL{39}} در قلب، طحال، ریه و کلیه‌ها مشابه IL آزاد{40}} در 24 و 48 ساعت پس از تجویز بود، در حالی که در کبد، تجمع Nano-IL-12 بالاتر از IL آزاد-12 در 24 ساعت بود، اما در 48 ساعت قابل مقایسه بود (شکل S6، اطلاعات پشتیبانی). نانو-IL{50}} تجمع تومور قابل توجهی بالاتری نسبت به IL آزاد{51}} (شکل 2c) در 24 ساعت پس از تزریق نشان داد. علاوه بر این، در حالی که IL آزاد{54}} در 48 ساعت پس از تزریق از تومورها پاک شد، غلظت Nano-IL{57}} بالا باقی ماند (حدود 4-برابر بیشتر از IL آزاد{59} }) (شکل 2d)، نشان می دهد که Nano-IL{62}} باعث افزایش سطح زیر منحنی غلظت (AUC) IL-12 در داخل تومورها شده است. در راستای افزایش تجمع و فعال‌سازی زنده در تومورها، Nano-IL{65}} اثر ضد توموری بهبود یافته‌ای نسبت به IL آزاد{66}} در ملانوم زیر جلدی B16F10 و مدل‌های سرطان پستان سه‌گانه منفی 4T1 (TNBC) نشان داد (شکل 2e). در هر دو مدل، تنها یک تزریق داخل وریدی Nano-IL-12 با 10 میکروگرم IL-12 معادل، منجر به بهبود قابل توجهی مهار رشد تومور نسبت به IL-12 شد که منجر به زمان بقای طولانی‌تر شد. . قابل ذکر است، در مدل 4T1 TNBC، که به دلیل سرکوب سیستم ایمنی قوی و مقاومت در برابر درمان ICI بدنام است، [37] درمان با Nano-IL{82}} به یک اثر درمانی واضح و قابل توجه منجر شد، در حالی که IL آزاد{83} } در برابر رشد تومور بیهوده بود.

2.3. Nano-IL{3}} پاسخ التهابی را از نظر فضایی و زمانی کنترل کرد

برای بررسی بیشتر تفاوت بین اثرات بیولوژیکی Nano-IL-12 و IL آزاد-12، سطح پاسخ التهابی برانگیخته شده از درمان توسط پاسخ سیتوکین در هر دو مکان خارج از هدف ارزیابی شد. خون و اندام های سالم و در تومورها (مدل ارتوتوپیک 4T1). چهار سیتوکین پایین دست IL-12، یعنی IFN- -10 (IL{13}}) به عنوان شاخص پاسخ التهاب انتخاب شدند. در میان آنها، IFN-𝛾، TNF- 𝛼، و IL{16}} سایتوکاین های مهم پیش التهابی مرتبط با اثر ضد تومور IL{17}}،[2{31}}،38] در حالی که IL{20 }} یک سایتوکین ضد التهابی است که یک بازخورد منفی با تحریک IL{21}} مخالف است. 3، و پاسخ التهاب روزانه به مدت 1 هفته پیگیری شد. این تنظیمات تجربی به ما اجازه داد تا اثرات هر دو تزریق منفرد و دوز مکرر بر پاسخ التهابی فضایی و زمانی را تعیین کنیم. اولین تزریق IL آزاد{30}} در روز 0 منجر به ترشح چهار سیتوکین در خون و اندام‌ها شد، با حداکثر غلظت پلاسمایی که در روز 2 مشاهده شد (شکل 3a–e,g)، که نشان‌دهنده خاموشی قوی است. التهاب هدف مرتبط با عوارض جانبی مرتبط با ایمنی (irAEs) IL{36}}.[8،10] از سوی دیگر، اولین تزریق Nano-IL{40}} سطوح سیتوکین به طور قابل‌توجهی پایین‌تر از IL را نشان داد. IL آزاد{41}} در خون و اندام‌های سالم، که نشان‌دهنده تنظیم پاسخ التهابی خارج از هدف است. تزریق دوم IL آزاد{43}} در روز 3 دوباره ترشح IFN-𝛾، TNF-𝛼 و IL{47}} را تحریک کرد. با این حال، سطوح اوج IFN-𝛾 و TNF-𝛼 مشاهده شده در روز 5 به وضوح کمتر از سطح مشاهده شده در روز 2 پس از اولین تزریق IL{52}} بود. علاوه بر این، تزریق دوم IL آزاد{53}} سطح IL ضد التهابی-10 را در پلاسما، اندام‌ها و تومورها به شدت افزایش داد، که با گسترش بیش از حد سیستمیک سلول‌های Th1 برای القاء همراه است. یک مرحله تنظیمی.[40] چنین پاسخ متمایز ناشی از درمان مکرر IL{59}} در کارآزمایی‌های بالینی انسانی تأیید شده است، و به کاهش اثرات بیولوژیکی IL{60}}، از جمله قدرت ضد توموری، کمک می‌کند.[20] برخلاف IL{62}}، تزریق دوم Nano-IL-12 باعث تشدید ترشح IL{{-10 در خون و اندام‌ها نشد. همچنین غلظت سیتوکین های التهابی در خون و بافت های سالم به طور معنی داری کمتر از IL آزاد بود. این نتایج نشان می‌دهد که Nano-IL{68}} نه تنها می‌تواند پاسخ التهابی سیستمیک را کاهش دهد، بلکه بر محدودیت‌های تجویز مکرر IL{69}، که باعث ایجاد پاسخ ضد التهابی متقابل می‌شود، غلبه کند. در تومورها، یک تزریق داخل وریدی Nano-IL{72}} تولید IFN-𝛾، TNF-𝛼 و IL{75}} التهابی را افزایش داد و به غلظت های داخل توموری به طور قابل توجهی بالاتر از IL آزاد رسید{77} } درمان (شکل 3f,g). در همین حال، درمان Nano-IL{80}} IL ضد التهابی کمتری را در تومورها نسبت به IL آزاد-12 ایجاد کرد و از شروع پاسخ ضد التهابی جلوگیری کرد. علاوه بر این، با تزریق دوم Nano-IL{86}}، سطح بالای سایتوکین های التهابی در تومورها حفظ شد، در حالی که غلظت IL{87}} داخل توموری پایین نگه داشت. این تنظیم مثبت IFN-𝛾، TNF-𝛼، و IL{90}} و کاهش IL{91}} در تومورها با سطوح بالای و پایدار داخل توموری Nano-IL-12 و پشتیبانی مرتبط است. یک واکنش التهابی بالا برای Nano-IL{95}}، که برای افزایش اثر ضد تومور بسیار مهم است.[41]

برای آزمایش اینکه آیا Nano-IL-12 می‌تواند اثربخشی را از طریق کنترل مکانی - زمانی التهاب بهبود بخشد، آزمایش شکل 2e را تکرار کردیم، اما این بار موش‌ها را با دوز 10- برابر کمتر درمان کردیم، به عنوان مثال، 1 ug معادل IL-12، با استفاده از یک برنامه دوز مکرر که پاسخ ایمنی را برای مقابله با IL رایگان- 12 تحریک می‌کند. تحت این درمان مکرر با دوز پایین، Nano-IL{9}} به وضوح اثر ضد تومور را نسبت به IL{11}} در تومورهای 4T1 TNBC افزایش داد (شکل 3h)، که منجر به رشد کندتر تومور و بقای طولانی‌تر شد. از سوی دیگر، درمان رایگان IL{15}} حتی پس از شش بار تزریق شدید، اثربخشی ناچیزی از خود نشان داد، که می‌توان آن را به گسترش سایتوکاین‌های ضدالتهابی مانند IL{17}} نسبت داد. این نتایج از توانایی Nano-IL{19}} برای تقویت اثر ضد توموری با کنترل مکانی - زمانی التهاب پشتیبانی می‌کند. کنترل پاسخ التهابی نیز به افزایش ایمنی منجر شد. ما یک ارزیابی بافت‌شناسی و آنالیز خون برای تعیین سمیت IL{{{20}} و Nano-IL-12 پس از دو تزریق در روزهای 0 و 3 انجام دادیم (شکل S7a,c، اطلاعات پشتیبانی) . نتایج سمیت کمتری را برای کبد، کلیه و لوزالمعده در درمان Nano-IL در مقایسه با IL آزاد نشان داد. همچنین تغییرات وزن بدن در طی تیمارها به عنوان پارامتر سمیت ردیابی شد. حیوانات تحت درمان با نانو IL{30}} اندکی در طول درمان وزن اضافه کردند، در حالی که موش های دریافت کننده IL رایگان{31}} از کاهش وزن رنج بردند (شکل S7b، اطلاعات پشتیبانی). بنابراین، این مشاهدات نشان می‌دهد که Nano-IL{34}} ترجیحاً می‌تواند پاسخ التهابی را در تومورها تقویت کند تا اثر ضد توموری را افزایش دهد در حالی که اثرات خارج از هدف را در بافت‌های سالم محدود می‌کند تا سمیت را کاهش دهد و پاسخ ضد التهابی ضدالتهابی را کاهش دهد.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. درمان Nano-IL{3}} باعث ایجاد نفوذ سلول های ایمنی ضد تومور در TME می شود

IL{0}} همچنین به عنوان یک عامل تحریک کننده سلول های T شناخته می شود، زیرا می تواند رشد و عملکرد سلول های T را برای شروع واکنش های ایمنی ضد تومور تقویت شده تحریک کند. بنابراین، ما نفوذ سلول‌های CD8+ در تومورها را پس از درمان مکرر Nano-IL{4}} ارزیابی کردیم. تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری ملانوم B16F10 درمان شده با دو تزریق داخل وریدی IL آزاد-12 یا Nano-IL-12 در 1 میکروگرم IL{11}} معادل/تزریق نشان داد که Nano-IL{13} } به طور قابل توجهی نفوذ سلول های CD{14}} T را در تومور در مقایسه با IL آزاد{15}} افزایش داد (شکل 4a). با انجام آزمایش تخلیه سلول های ایمنی در موش حامل تومورهای 4T1 TNBC، ما سهم جمعیت های مختلف سلول های ایمنی را در پاسخ به درمان Nano-IL{20}} بررسی کردیم. Nano-IL{22}} پنج بار در روزهای 7، 9، 11، 13 و 15 تزریق شد (1 ug IL-12 معادل/تزریق). علاوه بر این، در روزهای 6، 8 و 10، به موش‌ها آنتی‌بادی‌های anti-CD4، anti-CD8 یا anti-asiago GM1 به صورت داخل صفاقی (IP) تزریق شد تا CD{39}}، CD{40}} یا سلول های NK به ترتیب. نتایج نشان داد کاهش سلول‌های T سیتوتوکسیک، سلول‌های CD{42}} و سلول‌های NK به طور قابل‌توجهی کارآیی درمانی Nano-IL{44}} را کاهش داد، همانطور که رشد سریع‌تر تومور نشان داد. و کاهش بقا در گروه‌های تهی شده در مقایسه با موش‌هایی که فقط درمان Nano-IL{46}} را دریافت کردند (شکل 4b). این نتیجه با عملکرد بیولوژیکی IL مطابقت دارد، از جمله افزایش فعالیت سیتوتوکسیک سلول های CD8 T [42] و سلول های NK، [43] و واسطه تمایز سلول های T ساده به سلول های کمکی T (Th) [44]

علاوه بر این، راندمان کاهش متفاوت فعالیت ضد توموری ناشی از آزمایش تخلیه، ارتباط هر جمعیت سلولی را بر اثربخشی نانو-IL{1}} نشان می‌دهد، که سلول‌های T سیتوتوکسیک CD{2}} مهمترین بخش هستند. . تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی مقاطع تومور 4T1 TNBC، توزیع فضایی سلول های موثر نفوذ کننده تومور را نشان داد (شکل 4c). در حالی که IL آزاد{7}} حضور سلول‌های T سیتوتوکسیک CD و سلول‌های Tbet+ (Th1) را در تومورها بهبود نمی‌بخشد، نانو-IL{12}} باعث افزایش نفوذ بالای هر دو سلول به عمق می‌شود. مناطق تومور همچنین، تنظیم مثبت Granzyme B در سلول‌های CD، سطح فعال‌سازی بالاتر سلول‌های T سیتوتوکسیک را پس از درمان NanoIL{14}} پیشنهاد می‌کند (شکل 4d). علاوه بر این، مشاهده کردیم که درمان Nano-IL{17}} بیان PD-L1 را در تومورها در مقایسه با تومورهای درمان شده با PBS و IL آزاد{{20} افزایش داد. این افزایش سطح PD-L1 می تواند به دلیل افزایش IFN-𝛾 تومور ناشی از Nano-IL{25}} باشد، که گزارش شده است بیان PD-L1 را در بافت تومور تحریک می کند، [45] به عنوان مکانیزم سرکوب سیستم ایمنی عمل می کند. برای مقاومت در برابر نفوذ لنفوسیتی این دخیل درون توموری PD-L1 پتانسیل همکاری با اثر ضد توموری Nano-IL{32}} را با ترکیب آن با ضد PD-1 یا ICIs ضد PD-L1 نشان می‌دهد. بر اساس مشاهدات بالا، ما اثر Nano-IL{39}} را به عنوان یک درمان تک‌درمانی و در ترکیب با آنتی‌بادی‌های antiPD{40}} روی TME بررسی کردیم (شکل 4e). آزمایش در تومورهای TNBC ارتوتوپی تهیه‌شده از سلول‌های 4T1 انجام شد که هماگلوتینین (4T{45}}HA) را بیان می‌کنند، زیرا هماگلوتینین یک ایمونوژن کاملاً تعریف شده است که می‌تواند پاسخ لنفوسیت T سیتوتوکسیک آنتی‌ژن خاص را در مدل موش القا کند.[46 47] موش‌ها دو بار با 10 ug IL{52}} یا معادل Nano-IL-12 در روزهای 0 و 3 تحت درمان قرار گرفتند و برای درمان ترکیبی، موش‌ها به طور همزمان دو بار تزریق 100 میکروگرم ضد PD دریافت کردند. -1 آنتی بادی. در روز 7، نمونه های تومور برای فلوسیتومتری برداشت شدند.

نتایج تأیید کرد که درمان با نانو-IL{1}} باعث نفوذ بیشتر لکوسیت‌ها (CD{2}}) در تومور نسبت به IL{3}} می‌شود. ترکیب Nano-IL{5}} با آنتی‌بادی‌های ضد PD-1 نیز سلول‌های CD{8} بالاتری را در تومورها نشان داد. در بین لکوسیت‌ها، سلول‌های لنفوئیدی و سلول‌های T توسط Nano-IL{10}} و توسط ترکیب آنتی‌بادی Nano-IL{- 12/anti-PD{14}} تنظیم مثبت شدند. درمان Nano-IL{16}} منجر به تغییر متوسطی در جمعیت سلول‌های NK شد، اما منجر به تغییرات قابل‌توجهی در زیرگروه سلول‌های T در مقایسه با IL آزاد{17}} شد. قابل ذکر است که نفوذ سلول‌های CD{18}} T در تومورهای 4T{20}HA به وضوح توسط Nano-IL-12 نسبت به IL آزاد-12 افزایش یافته است. علاوه بر این، سلول‌های HA-tetramer+ T، که مربوط به سلول‌های T اختصاصی آنتی‌ژن هستند، در ترکیب آنتی‌بادی Nano-IL{28}} به‌علاوه anti-PD{30}} به‌طور قابل‌توجهی افزایش یافتند، که نشان‌دهنده ارتقای ایمنی تطبیقی ​​است. پاسخ توسط هم افزایی Nano-IL{32}} و ICIs. سلول‌های T عمومی CD{33}} در گروه‌های تحت درمان با NanoIL{34}} تنظیم دگرگونی نشان دادند. برای مشخص کردن بیشتر زیرجمعیت سلول‌های CD{35}} T در تومورها، سلول‌ها را با ضد Foxp3 رنگ‌آمیزی کردیم تا سلول‌های T تنظیمی (Tregs) را بررسی کنیم. در حالی که تک‌تراپی ضد PD{39}} هیچ سرکوبی بر Tregs در مدل تومور 4T{41} HA نشان نداد، ترکیبی از Nano-IL-12 به علاوه anti-PD{45}} به طور چشمگیری Tregs را تخلیه کرد. علاوه بر این، تومورهای تحت درمان با Nano-IL{47}} سلول‌های Th بالاتری نسبت به IL آزاد{48}} نشان دادند. این نتایج نشان می‌دهد که درمان Nano-IL{50}} سلول‌های ایمنی ضد تومور را در فیلتراسیون تقویت کرده و با آنتی‌بادی‌های ضد PD{53}} برای غلبه بر TME سرکوب‌کننده سیستم ایمنی همکاری می‌کند.

شکل 3. Nano-IL{2}} پاسخ التهابی را از نظر فضایی و زمانی کنترل می‌کند. الف) سطوح سیتوکین پیش التهابی (IFN-𝛾، TNF-𝛼، IL-6) و ضد التهابی (IL-10) در خون در موش‌های حامل 4T{14 }} ug IL-12 یا معادل Nano-IL-12 دو بار در روزهای 0 و 3. سطوح سیتوکین توسط ELISA اندازه‌گیری شد. مقادیر اوج پس از دو تزریق (در روزهای 2 و 5 برای IFN-𝛾، TNF-𝛼، و IL{20}}؛ در روزهای 2 و 6 برای IL-6) به صورت نمودارهای نواری روی پنل سمت راست b-f) سطوح سیتوکین در اندام‌ها و تومورهای موش‌های حامل 4T{25} که 10 ug IL{27}} یا معادل Nano-IL{29}} دو بار در روزهای 0 و 3 تزریق شدند. موش‌ها در روزهای 2 و 5 برای جمع آوری بافت ها قربانی شد. (داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده می شوند؛ n=6 موش در هر گروه؛ مقادیر p از طریق آزمون t-paired محاسبه می شود.) g) نقشه های حرارتی سطوح سیتوکین در خون، اندام ها و تومورها از مقادیر متوسط ​​در af به امتیاز Z تبدیل شد. ح) فعالیت ضد توموری تزریق داخل وریدی مکرر (تزریق شده در روزهای 7، 9، 11، 13، 15، و 25، نشان داده شده با فلش) 1 ug IL{46}} یا معادل Nano-IL{48}} در برابر TNBC موش منحنی های رشد تومور فردی در پانل سمت چپ نشان داده شده است. منحنی‌های متوسط ​​حجم تومور در پانل مرکزی و منحنی‌های بقا در پانل سمت راست نشان داده شده‌اند (داده‌ها به صورت میانگین ± SEM نشان داده می‌شوند؛ n=6 موش در هر گروه، مقادیر p از طریق تجزیه و تحلیل log-rank محاسبه می‌شوند. ).

شکل 4. اثر ضد توموری Nano-IL{3}} از نفوذ افزایش یافته سلول های موثر در TME ایجاد می شود. الف) آنالیز فلوسایتومتری نفوذ CTLs در ملانوم پس از درمان با نانو-IL{5}}. موش ها با سلول های B16F10 در روز 0 تلقیح شدند. IL{9}} (1 ug) یا معادل آن Nano-IL{12}} دو بار در روزهای 8 و 11 تزریق شد. نمونه‌های تومور جمع‌آوری و در روز 15 آنالیز شدند (داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده است؛ n {{{ 16}} موش در هر گروه؛ p-value از طریق ANOVA یک طرفه محاسبه شد. ب) فعالیت ضد توموری Nano-IL{20}} پس از تخلیه سلول‌های CD4+، CD{22}} و NK. موش‌های حامل تومور 4T1 در روزهای 7، 9، 11، 13 و 15 با Nano-IL{26}} (معادل 1 میکروگرم IL-12) تزریق شدند. همچنین به موش‌ها آنتی CD4 تزریق شد. آنتی‌بادی‌های ضد CD8، و ضدآسیاگو GM1 در روزهای 6، 8 و 10. منحنی‌های رشد تومور (داده‌ها به صورت میانگین ± SEM نشان داده شده‌اند) و منحنی‌های بقا ثبت شدند (n=6 موش در هر گروه، مقادیر p از طریق تحلیل log-rank محاسبه می شوند). ج) تصاویر IHC از مقاطع تومور 4T1. موش‌های حامل تومورهای 4T1 TNBC (متوسط ​​حجم تومور: 200 میلی‌متر مکعب) دو بار با PBS، 10 ug IL{52}} یا معادل نانو-IL{54}} در روزهای 0 و 3 تزریق شدند. در روز 7، موش ها برای جمع آوری تومورها قربانی شدند. سلول‌های CD{58}}، Tbet، یا PD-L{1+ در تومورها به رنگ زرد دیده می‌شوند. هسته های سلولی با هوخست (آبی) رنگ آمیزی شدند. نوار مقیاس=1 میلی متر. د) رنگ آمیزی ایمنی گرانزیم B (سبز) و CD8 (قرمز) در مقاطع تومور 4T1. هسته های سلولی با هوخست (آبی) رنگ آمیزی شدند. پیکسل‌های زرد سلول‌های CD{65} T فعال شده را نشان می‌دهند. نوار مقیاس=100 میکرومتر. ه) تجزیه و تحلیل نفوذ سلول‌های لنفاوی در تومورهای 4T1-HA درمان‌شده با PBS، آنتی‌بادی‌های ضد PD1، IL{71}}، Nano-IL-12، IL-12 به علاوه ضد آنتی بادی های PD1 و Nano-IL{78}} به علاوه آنتی بادی های ضد PD1. IL{81}} و Nano-IL-12 در روزهای 7 و 9 پس از تلقیح با غلظت 10 میکروگرم به صورت داخل وریدی تزریق شدند. Anti-PD{88}} در روزهای 8 و 10 پس از تلقیح با غلظت 100 میکروگرم تزریق شد. در روز 17، موش‌ها قربانی شدند و تومورها برای اندازه‌گیری فلوسیتومتری همگن شدند (داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار، n=5 نمونه در هر گروه نشان داده می‌شوند، مقادیر p از طریق ANOVA یک طرفه محاسبه می‌شوند).

2.5. درمان Nano-IL{3}} TME را از سطح رونویسی فعال می‌کند تا پاسخ ICI را تقویت کند.

سپس فعال شدن TME تومورهای 4T1-HA را پس از درمان از سطح بیان ژن با تجزیه و تحلیل رونوشت بررسی کردیم. توالی‌یابی کل نمونه‌های RNA استخراج‌شده از بافت‌های تومور پس از درمان با PBS، آنتی‌بادی‌های anti-PD{3}}، IL{4}}، Nano-IL-12 و ترکیبی از سیتوکین‌ها با ICI ها نقشه حرارتی بیان ژن جهانی به وضوح نمایه های ژنی متمایز در تومورهای دریافت کننده Nano-IL-12 و ترکیبی از Nano-IL{10}} با anti-PD- 1 را نشان داد (شکل S11، اطلاعات پشتیبانی ). برای مشخص کردن فرآیندهای بیولوژیکی تحت تأثیر تیمار Nano-IL{15}}، ژن‌های بیان شده متفاوت را در هر گروه تجزیه و تحلیل کردیم و یک تجزیه و تحلیل غنی‌سازی بر روی ژن‌های تنظیم‌شده و کاهش‌یافته انجام دادیم (شکل 5a،b). هر دو تجزیه و تحلیل GOBP و KEGG نشان دادند که در مقایسه با IL{17}} و PBS، درمان Nano-IL{19}} به طور مشخص تحریک تکثیر، تمایز و فعال‌سازی عملکردی سلول‌های ایمنی مؤثر مختلف مانند سلول T را تنظیم می‌کند. تکثیر، تمایز سلول های T به سلول های Th، و فعال سازی سلول های T و مسیر سیگنالینگ گیرنده سلول T. علاوه بر این، ژن‌های مربوط به بیان PD-L1 و مسیر ایست بازرسی PD{22}} نیز با درمان Nano-IL{24}} تنظیم مثبت شدند. این نتایج از تحریک قوی NanoIL{25}} به سلول های T مشاهده شده در مطالعات فلوسیتومتری و ایمونوهیستولوژی حمایت می کند. در عین حال، ژن‌های مرتبط با سایر سلول‌های ایمنی مانند مونوسیت‌ها و سلول‌های NK به طور مثبت تحت تأثیر تیمار Nano-IL{27}} قرار گرفتند. همچنین، پاسخ سیتوکین و سایر فرآیندهای ایمنی، مانند ارائه آنتی ژن، از درمان Nano-IL{29}} تنظیم مثبت شد. از سوی دیگر، Nano-IL{31} مسیرهای مرتبط با تقسیم سلولی را کاهش داد، که نشان می‌دهد این درمان می‌تواند تکثیر سلول‌های تومور را سرکوب کند (شکل S11، اطلاعات پشتیبانی). این نتایج نشان دهنده مزایای Nano-IL{34}} در فعال کردن هر دو بازوی ذاتی و تطبیقی ​​ایمنی داخل توموری است.

تحقیقات بیشتر روی درمان‌های ترکیبی نشان داد که درمان ترکیبی آنتی‌بادی‌های Nano-IL-12 به علاوه anti-PD{3}} ایمنی داخل توموری را در مقایسه با IL-12 به علاوه anti-PD{6} افزایش می‌دهد. } آنتی بادی ها یا تک درمانی ضد PD-1 با تحریک مسیرهای ایمنی ذاتی و تطبیقی ​​(شکل 5b و شکل S11c، اطلاعات پشتیبانی). به طور چشمگیری، ترکیب آنتی بادی‌های NanoIL{11}} و ضد PD{13}} منجر به مهار قوی‌تر در مسیرهای مرتبط با میتوز می‌شود، استنباط این ترکیب می‌تواند یک فعالیت کشتن قوی‌تر سلول‌های مؤثر نفوذ شده علیه سلول‌های تومور را واسطه کند. بر اساس نتایج RNA-seq، ما همچنین جمعیت سلول های ایمنی نفوذگر تومور را تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 5c,d). مانند نتیجه فلوسایتومتری، گروه‌های تحت درمان با Nano-IL{18} افزایش نفوذ سلول‌های CD{19}} را نشان دادند. علاوه بر این، نتایج همچنین تنظیم مثبت مونوسیت‌ها و گرانولوسیت‌ها را نشان داد، که التهاب تقویت‌شده در تومورها را از مسیرهای ایمنی ذاتی تقویت‌شده تأیید می‌کند. این نتایج تایید کرد که Nano-IL{21}} یک پاسخ ایمنی قوی در برابر تومورها ایجاد می‌کند و ترکیب با anti-PD{23}} می‌تواند این فرآیند را تقویت کند.

شکل 5. درمان Nano-IL{2}} فعال سازی ایمنی را در TME تقویت می کند تا آنتی بادی های ضد PD1 را تقویت کند. الف) نمودارهای آتشفشانی ژن‌های بیان‌شده متفاوت در مقایسه بین Nano-IL-12 در مقابل IL-12 و Nano-IL-12 + anti-PD{11}} در مقابل IL{12} } ضد PD{14}}. نمودارها از تجزیه و تحلیل RNA-seq تومورهای 4T1-HA که با تیمارهای مختلف درمان شده بودند به دست آمد: 10 میکروگرم IL{19}} و معادل Nano-IL{21}} در روزهای هفتم و نهم پس از تلقیح داخل وریدی تزریق شد. . Anti-PD{25}} در روزهای 8 و 10 پس از تلقیح با غلظت 100 ug تزریق شد. در روز هفدهم، موش‌ها برای جمع‌آوری نمونه‌های تومور قربانی شدند. ب) تجزیه و تحلیل غنی سازی که مسیرهای تنظیم شده را در دو جفت مقایسه در الف نشان می دهد. ج) نقشه حرارتی جمعیت های سلولی در TME تعیین شده توسط RNA-seq. جمعیت ها برای رسم شکل به امتیاز Z تبدیل شدند. د) هیستوگرام جمعیت های سلولی که تفاوت های قابل توجهی را در مقایسه های متعدد نشان می دهد (داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار، برای گروه PBS، n=5 نمونه، برای گروه های دیگر، n=4 نمونه در هر گروه، مقادیر p نشان داده شده است. از طریق ANOVA یک طرفه محاسبه می شود).

2.6. Nano-IL{3}} با ICI ها برای ریشه کنی موثر تومورهای اولیه و متاستاتیک همکاری می کند

برای بررسی پتانسیل درمانی Nano-IL-12 برای هم افزایی با ICI، تومورهای اولیه TNBC ارتوتوپی در موش با تلقیح سلول های 4T1 به پد چربی پستانی ایجاد شد. موش‌ها بر اساس برنامه‌های دوز مختلف و الگوهای ترکیبی با ICIs با Nano-IL-12 تحت درمان قرار گرفتند تا اثربخشی ضد توموری درمان‌های مربوطه را آزمایش کنند. ما دریافتیم که حتی تحت دوز پایین (1 میکروگرم IL-12 معادل/تزریق)، درمان مکرر با Nano-IL{9}} یک فعالیت ضد توموری واضح در برابر تومورهای TNBC اولیه به عنوان یک درمان تک‌درمانی اعمال می‌کند. با سرکوب سرعت رشد تومور و بقای طولانی مدت نشان داده شده است (شکل S12، اطلاعات پشتیبانی). با این حال، درمان رایگان IL-12 تحت این دوز، حتی زمانی که با درمان ضد PD{14}} ترکیب شد، هیچ اثری را نشان نداد. ترکیب Nano-IL- 12 با anti-PD{18}} کارایی را بیشتر افزایش داد و CR به دست آمد. سپس دوز بالاتر Nano-IL{20}} (10 میکروگرم IL-12 معادل/تزریق) را مطالعه کردیم و آن را با کوکتل‌های ICI (antiPD-1 و آنتی‌بادی‌های ضد CTLA4) ترکیب کردیم تا درمان را انجام دهیم. پتانسیل. قابل ذکر است، در این دوز، درمان ترکیبی Nano-IL-12 با ICIs رشد تومور را متوقف کرد و تومورها را به طور کامل ریشه کن کرد (شکل 6a)، با همه موش‌ها CR در این گروه درمانی. علاوه بر این، موش‌های درمان‌شده در برابر چالش مجدد تومور با سلول‌های 4T1 مقاومت نشان دادند که از وجود یک حافظه ایمنی قوی از درمان با Nano-IL{32}} و درمان ترکیبی ICI پشتیبانی می‌کند.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

TNBC به عنوان یک تومور تهاجمی با میزان بالایی از متاستاز دور شناخته می شود. یک مدل TNBC متاستاتیک خودبخودی با برداشتن تومورهای ارتوتوپی اولیه 4T1 ایجاد شد که منجر به ایجاد متاستاز در اندام‌های متعدد، عمدتاً ریه‌ها می‌شود.[50] در این مدل، درمان ترکیبی Nano-IL-12 با ICIs نیز نتایج رضایت‌بخشی را نشان داد که پیشرفت متاستاز ریه را متوقف کرد (شکل 6b) و منجر به CR در تمام موش‌های تحت درمان شد. علاوه بر این، پس از به چالش کشیدن مجدد با تزریق داخل وریدی سلول‌های 4T1، اکثر موش‌های درمان‌شده مقاومت قوی نشان دادند که نشان‌دهنده حافظه ایمنی مؤثر از ترکیب Nano-IL{13}} و ICIs است. علاوه بر TNBC، Nano-IL{15}} را در ترکیب با ICI در مدل ملانوما اولیه B16F10 نیز آزمایش کردیم (شکل S13، اطلاعات پشتیبانی). نتایج نشان داد که ترکیب Nano-IL{20}} (10 میکروگرم IL-12 معادل/تزریق) با آنتی بادی ضد PD{24}} منجر به CR در 4 موش از 6 موش در گروه شد. و موش های درمان شده در برابر چالش مجدد با سلول های B16F10 مقاومت نشان دادند که نشان دهنده حافظه ایمونولوژیک قوی است.

3. بحث

ما با استفاده از نانوسیتوکین‌های حساس (Nano-IL{3}}) یک استراتژی فعال‌سازی تومور IL-12 ایجاد کرده‌ایم که می‌تواند فعالیت زیستی IL-12 را در pH 7.4 قطع کند، اما سیتوکین کاملاً فعال را در زمان بازیابی می‌کند. pH داخل توموری پس از تزریق سیستمیک، Nano-IL{8}} به طور پایدار در جریان خون گردش می‌کند و پاسخ ایمنی را در مکان‌های غیر پاتولوژیک کاهش می‌دهد و بروز irAEs را حتی پس از تجویز مکرر کاهش می‌دهد. از سوی دیگر، تجمع و فعال‌سازی بالای Nano-IL{11}} در تومورها منجر به افزایش قابل‌توجه کارآیی و هم‌افزایی با ICI‌ها، دستیابی به CR در مدل‌های تومور سرد مقاوم به ICI، و دادن یک جامد می‌شود. حافظه ایمنی پس از درمان

Nano-IL{1}} عمیقاً TME را با برانگیختن ترشح قوی سیتوکین‌های التهابی، افزایش نفوذ سلول‌های مؤثر و کاهش حضور سلول‌های سرکوبگر ایمنی، فعال کرد. علاوه بر این، Nano-IL{3}} سطح PD-L1 را در سلول‌های تومور تنظیم کرد، که می‌تواند فعالیت آنتی‌بادی‌های ضد PD-1 را افزایش دهد. تغییرات در TME ناشی از Nano-IL-12 با آنتی‌بادی‌های antiPD{10}} برای تحریک ایمنی سرطان از طریق افزایش ارائه آنتی‌ژن، افزایش حضور سلول‌های مؤثر و تقویت فعالیت آنها، و ارتقای تعاملات سلولی ایمنی مطالعات بالینی نشان داده‌اند که محاصره نقطه بازرسی anti-PD1/anti-PD-L1 در بیماران PD-L{17}TNBC مثبت با تعداد بالایی از لنفوسیت‌های نفوذکننده تومور، نرخ پاسخ بالاتری دارد.[51،52] عملکرد کلی انسداد ایست بازرسی ایمنی به عنوان یک تک درمانی در برابر TNBC رضایت بخش نبود [53،54] به دلیل بیان عمومی کم و TME ناهمگن قابل توجه TNBC [55،56] در واقع، تنها انسداد PD-L1 در ترکیب با شیمی درمانی (Nab-Paclitaxel) در بیماران TNBC متاستاتیک تایید شده است، که فقط در بخش کوچکی از بیماران TNBC سود کلی بقای متوسطی را به همراه دارد.[57] بنابراین، پتانسیل Nano-IL{30}} برای غلبه بر TME سرکوبگر سیستم ایمنی و تقویت بیان PD-L1 TNBC ممکن است یک جایگزین قوی برای افزایش نرخ پاسخ محاصره ایست بازرسی ارائه دهد. ایمنی پیشرفته Nano-IL{34}} نیز یک مزیت قابل توجه برای کاربرد درمانی است. مطالعات بالینی قبلی نشان داده‌اند که تزریق سیستمیک IL{35}} باعث ایجاد سمیت‌های خونی و کبدی قوی می‌شود. } درمان.[42،60] در مطالعه ما، Nano-IL{44}} سطوح سیتوکین به طور قابل‌توجهی پایین‌تر از IL آزاد-12 در خون و اندام‌ها نشان داد که آسیب اندام را محدود می‌کرد. بنابراین، توانستیم Nano-IL- 12 را چندین بار با 10 ug IL-12 در هر ماوس تزریق کنیم، یعنی حدود 500 ug kg-1، که تقریباً {{52} است. }برابر بیشتر از حداکثر دوز قابل تحمل (MTD) IL-12 در انسان، یعنی 500 نانوگرم کیلوگرم-1. [61] یکی دیگر از عوارض جانبی مهم درمان سیستمیک IL{57}} مشاهده شده در مطالعات بالینی، شروع یک پاسخ ضد التهابی تطبیقی ​​پس از تجویز دوم IL-12 است که منجر به کاهش اثربخشی می‌شود. [20،21] چنین پدیده‌ای با مکانیسم‌های بازخورد منفی مرتبط با تولید بیش از حد IL ضد التهابی{63}}، و کاهش سیتوکین‌های پیش‌التهابی مانند IFN-𝛾، TNF-𝛼، و IL{{{{ 67}}.[20،22] Nano-IL-12 از افزایش IL{-10 در خون و اندام‌ها پس از تجویز دوم جلوگیری کرد، که می‌تواند برای انجام برنامه‌های تجویز مکرر بدون کاهش میزان مفید باشد. اثرات ضد تومور قابل ذکر است که درمان با Nano-IL غلظت IL را در تومورها افزایش نداد و سطوح بالای IFN-𝛾، TNF-𝛼 و IL را حفظ کرد.

شکل 6. Nano-IL{2}} با مهارکننده های ایست بازرسی ایمنی برای ریشه کن کردن تومورهای سینه همکاری می کند. در هر دو مدل TNBC ارتوتروپیک و متاستاتیک، موش‌ها برای دریافت PBS، IL{3}} ICIs (ضد CTLA4 و ضد PD{7}})، و درمان‌های ICI Nano-IL{9}} (دوز) گروه‌بندی شدند. و برنامه درمان به ترتیب در طرح در پانل های بالایی نشان داده شد). الف) درمان ترکیبی Nano-IL{11}} و ICIs منجر به ریشه‌کنی کامل تومورهای ارتوتوپی در تمام موش‌های تحت درمان شد. منحنی های رشد تومور فردی در پانل سمت چپ نشان داده شده است. میانگین حجم تومور و منحنی های بقا در پانل بالا سمت راست نشان داده شده است. موش های درمان شده دفاع قوی در برابر تزریق مجدد با سلول های 4T1 به پستان نشان دادند، بدون رشد تومور در موش های درمان شده (پانل پایین سمت راست). ب) درمان ترکیبی Nano-IL{17}} و ICIs مهار قوی در برابر پیشرفت تومور متاستاتیک نشان داد. پس از درمان (روز 23)، ریه‌های موش‌هایی که با درمان ترکیبی Nano-IL{20}} ICIs درمان شدند، متاستاز کمتری را نشان دادند که با عکس‌های نماینده (فلش‌های سبز: متاستاز ماکروسکوپی) و ارزیابی بافت‌شناسی (نوار مقیاس {21) نشان داده شد. }} میکرومتر) در پانل سمت چپ ارائه شده است. درمان ترکیبی نانو IL{23}} در نهایت منجر به پاسخ کامل در تمام موش‌های تحت درمان شد، همانطور که توسط منحنی‌های بقا (پانل بالا سمت راست) نشان داده شده است. همچنین، موش های درمان شده با تزریق سلول های 4T1 (پانل پایین سمت راست) دفاع قوی در برابر چالش مجدد تومور نشان دادند. (داده ها به صورت میانگین ± SEM نشان داده می شوند؛ n=6 موش در هر گروه؛ مقادیر p از طریق تجزیه و تحلیل log-rank محاسبه می شوند).

از آنجایی که IL{0}} به عنوان یکی از قوی ترین سایتوکاین های تحریک کننده ایمنی در نظر گرفته می شود، چندین رویکرد به شدت برای کاهش سمیت های ناشی از IL-12- و تقویت اثربخشی آن مورد بررسی قرار می گیرند. استراتژی‌هایی با استفاده از تزریق مستقیم داخل توموری، مانند فرمولاسیون‌های مبتنی بر IL-12 و ادجوانت‌ها،[62] و DNA پلاسمید[63] یا RNA پیام‌رسان[64] کدکننده IL{6}} برای تولید سیتوکین در محل، می‌توانند شاخص درمانی را به حداکثر برسانید.[8] با این حال، دولت محلی ممکن است با محدودیت‌های متعددی در کلینیک مواجه شود، از جمله درمان تومورهایی که در موقعیت‌های غیر قابل تزریق رشد می‌کنند، [65] اثربخشی وابسته به اپراتور، [66] توزیع نابرابر داروهای تزریقی در تومور، [67] و تحویل خارج از هدف ناشی از نشت.[68] علاوه بر این، فعالیت ضد سرطانی فرمولاسیون های تزریق داخل توموری در برابر متاستازهای دور تا حد زیادی به اثربخشی متغیر یک اثر آبسکوپ وابسته است، [69] که نرخ بروز کم را در مطالعات بالینی نشان داده است [70-72] و ممکن است قادر به غلبه بر سیگنال های سرکوب کننده سیستم ایمنی نباشد. در متاستاز.[73] امکان تجویز ایمن Nano-IL-12 با تزریق داخل وریدی سیستمیک، که یک روش بالینی استاندارد است، می‌تواند فارماکوکینتیک قابل پیش‌بینی را فراهم کند و پتانسیل دسترسی به همه مکان‌های تومور را از طریق خونرسانی دارد. پروتئین‌های فیوژن مبتنی بر IL[14] و ایمونوسیتوکین‌ها[11-13] نیز این مزایا را با NanoIL به اشتراک می‌گذارند. با این حال، جزء IL{28}} در این ترکیبات به صورت سیستمی فعال است، که نگرانی‌های ایمنی را افزایش می‌دهد. برای مثال، پروتئین‌های همجوشی طولانی‌مدت IL{30}} سطوح بالایی از IFN-𝛾[74،75] و سیتوکین‌های ایمنی IL{34}} سرم را نشان داده‌اند که در مکان‌های خارج از هدف تجمع پیدا کرده‌اند.[76, 77] توانایی Nano-IL{39}} برای کنترل فعال‌سازی فضایی-زمانی می‌تواند یک استراتژی ایمن و قوی با ویژگی در هدف‌گیری تومور ارائه دهد.

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

محدودیت مطالعه فعلی ما این است که Nano-IL-12 بر اساس IL ماوس-12 است. با توجه به اینکه همسانی بین IL موش-12 و IL انسان-12 حدود 60 تا 70 درصد است، مطالعات بیشتری برای تعیین فرمول نانوسیتوکین مبتنی بر IL انسانی با فعالیت و پروفایل های ایمنی که با سیستم مبتنی بر ماوس قابل مقایسه هستند. خوشبختانه، آزمایش‌های اولیه نشان داده‌اند که پلیمرهای مورد استفاده در مطالعه ما می‌توانند IL انسان را نیز با حساسیت pH مشابهی بپوشانند. علاوه بر این، از آنجایی که پلیمرها را می‌توان دقیقاً مهندسی کرد، می‌توان یک سیستم مبتنی بر IL انسانی با پروفایل‌های مکانی-زمانی مناسب برای استفاده انسانی توسعه داد. در نتیجه، نانو-IL{12}} به‌عنوان نانو سیتوکین‌ها، پس از تجویز سیستمیک، به کنترل فضایی-زمانی مؤثری بر فعالیت IL{13}} دست یافت و از تحریک دقیق ایمنی داخل توموری برای به دست آوردن ایمنی و نتایج درمانی رضایت‌بخش در تومور سرماخوردگی اولیه و متاستاتیک اطمینان حاصل کرد. مدل ها، هم افزایی با محاصره ایست بازرسی. از آنجایی که پلیمرهای مورد استفاده برای مونتاژ Nano-IL{15}} را می‌توان برای محصور کردن طیف گسترده‌ای از پروتئین‌ها با وزن‌های مولکولی و بار سطحی مختلف مهندسی کرد، این سیستم پتانسیل کاربرد گسترده‌تری را دارد، مانند محصور کردن سایر سایتوکاین‌های درمانی یا حتی کوکتل های سیتوکین علاوه بر این، با توجه به اینکه سیستم پلیمری می تواند بیشتر مهندسی شود تا محرک های دیگر را علاوه بر pH حس کند، [78] نانو سیتوکین ها را می توان برای هدف قرار دادن ریزمحیط های مختلف تومور طراحی کرد. در نهایت، با توجه به پتانسیل انتقالی پلیمرها و نانو سیتوکین های مورد استفاده، این استراتژی نویدبخش آینده ایمونوتراپی سرطان است.

منابع

[1] AJ Korman، SC Garrett-Thomson، N. Lonberg، Nat. Rev. Drug Discovery 2021, 21, 509.

[2] A. Ribas, JD Wolchok, Science 2018, 359, 1350.

[3] A. Haslam, V. Prasad, JAMA Network Open 2019, 2, e192535.

[4] P. Sharma، BA Siddiqui، S. Anandhan، SS Yadav، SK Subudhi، J. Gao، S. Goswami، JP Allison، Cancer Discovery 2021، 11، 838.

[5] JD Martin، H. Cabral، T. Stylianopoulos، RK Jain، Nat. کشیش کلین. اونکول. 2020، 17، 251.

[6] CM Fares، EM Van Allen، CG Drake، JP Allison، S. HuLieskovan، Am. Soc. کلین. اونکول. آموزش. کتاب. 2019، 39، 147.

[7] K. Chamoto، R. Hatae، T. Honjo، Int. جی. کلین. اونکول. 2020، 25، 790.

[8] KG Nguyen، MR Vrabel، SM Mantooth، JJ Hopkins، ES Wagner، TA Gabaldon، DA Zaharoff، Front. ایمونول. 2020، 11، 2510.

[9] EA Chiocca، AB Gelb، CC Chen، G. Rao، DA Reardon، PY Wen، WL Bi، P. Peruzzi، C. Amidei، D. Triggs، L. Seften، G. Park، J. Grant، K ترومن، جی وای باک، ن. هادار، ن. دیمارس، جی. میائو، تی. استوپینان، جی. لووی، کی. چادا، جی. ترینگالی، ال. کوپر، آر. وی لوکاس، انکولوژی عصبی 2021، 24، 951.

[10] B. Mirlekar, Y. Pylayeva-Gupta, Cancers 2021, 13, 167.

[11] A. Mansurov، J. Ishihara، P. Hosseinchi، L. Potin، TM Marchell، A. Ishihara، J.-MM Williford، AT Alpar، MM Raczy، LT Gray، MA Swartz، JA Hubbell، Nat. بیومد. مهندس 2020, 4, 531.

[12] N. Pasche, D. Neri, Drug Discovery Today 2012, 17, 583.

[13] J. Strauss، CR Heery، JW Kim، C. Jochems، RN Donahue، AS Montgomery، S. McMahon، E. Lamping، JL Marte، RA Madan، M. Bilusic، MR Silver، E. Bertotti، J. Schlom، JL Gulley، Clin. سرطان Res. 2019، 25، 99.

[14] K. Jung، JH Ha، JE Kim، JA Kim، YJ Kim، CH Kim، YS Kim، OncoImmunology 2018، 7، e1438800.

[15] A. Mansurov، P. Hosseinchi، K. Chang، AL Lauterbach، LT Gray، AT Alpar، E. Budina، AJ Slezak، S. Kang، S. Cao، A. Solanki، S. Gomes، J.- م. Williford، MA Swartz، JL Mendoza، J. Ishihara، JA Hubbell، Nat. بیومد. مهندس 2022، 6، 819.

[16] HD Chang، A. Radbruch، متخصص کشیش کلین. ایمونول. 2014، 3، 709.

[17] H. Chang، A. Radbruch، D. Rheumaforschungszentrum، Ann. آکادمی نیویورک علمی 2007، 1109، 40.

[18] S. Tugues, SH Burkhard, I. Ohs, M. Vrohlings, K. Nussbaum, J. Vom Berg, P. Kulig, B. Becher, Cell Death Differ. 2014، 22، 237.

[19] C. Asselin-Paturel، M. Isabelle Vergnon، B. Hamid Echchakir، M. Guillaume Dorothé، M. Sé vrine Blesson، M. Franç oise Gay، B. Fathia Mami-Choaib، S. Chouaib، سرطان 2001، 91، 113.

[20] JEA Portielje، CHJ Lamers، WHJ Kruit، A. Sparreboom، RLH Bolhuis، G. Stoter، C. Huber، JW Gratama، Clin. سرطان Res. 2003، 9، 76.

[21] JP Leonard، ML Sherman، GL Fisher، LJ Buchanan، G. Larsen، MB Atkins، JA Sosman، JP Dutcher، NJ Vogelzang، JL Ryan، Blood 1997، 90، 2541.

[22] E. Bajetta, M. Del Vecchio, R. Mortarini, R. Nadeau, A. Rakhit, L. Rimassa, C. Fowst, A. Borri, A. Anichini, G. Parmiani, Clin. سرطان Res. 1998، 4، 75.

[23] C. Corbet، O. Feron، Nat. Rev. Cancer 2017, 17, 577. [24] M. Bellone, A. Calcinotto, P. Filipazzi, A. De Milito, S. Fais, L. Rivoltini, Oncoimmunology 2013, 2, e22058.

[25] S. Damgaci، A. Ibrahim-Hashim، PM Enriquez-Navas، S. PilonThomas، A. Guvenis، RJ Gillies، Immunology 2018، 154، 354.

[26] J. Liu, H. Cabral, B. Song, I. Aoki, Z. Chen, N. Nishiyama, Y. Huang, K. Kataoka, P. Mi, ACS Nano 2021, 15, 13526.

[27] A. Tao، GLo Huang، K. Igarashi، T. Hong، S. Liao، F. Stellacci، Y. Matsumoto، T. Yamasoba، K. Kataoka، H. Cabral، Macromol. Biosci. 2020، 20، 1900161.

[28] Y. Mochida, H. Cabral, Y. Miura, F. Albertini, S. Fukushima, K. Osada, N. Nishiyama, K. Kataoka, ACS Nano 2014, 8, 6724.

[29] JS Suk، Q. Xu، N. Kim، J. Hanes، LM Ensign، Adv. Drug Delivery Rev. 2016, 99, 28.

[30] CY Sun، Y. Liu، JZ Du، ZT Cao، CF Xu، J. Wang، Angew. Chem., Int. اد. 2016، 55، 1010.

[31] A. Ibrahim-Hashim, V. Estrella, Cancer Metastasis Rev. 2019, 38, 149.

[32] G. Trinchieri، F. Gerosa، J. Leukocyte Biol. 1996، 59، 505.

[33] T. Starciuc، B. Malfait، F. Danede، L. Paccou، Y. Guinet، NT Correia، A. Hedoux، J. Pharm. علمی 2020، 109، 496.

[34] G. Egawa, S. Nakamizo, Y. Natsuaki, H. Doi, Y. Miyachi, K. Kabashima, Stem Cells Int. 2013، 3، 1932.

[35] S. Jayanthi، BP Koppolu، KG Nguyen، SG Smith، BK Felber، TKS Kumar، DA Zaharoff، Stem Cells Int. 2017, 7, 5360.

[36] MP Hwuang، RJ Fecek، T. Qin، WJ Storkus، Y. Wang، J. Controlled Release 2019، 318، 270.

[37] Q. Wang, Y. Wang, J. Ding, C. Wang, X. Zhou, W. Gao, H. Huang, F. Shao, Z. Liu, Nature 2020, 579, 421.

[38] G. Trinchieri, Annu. کشیش ایمونول. 1995، 13، 251.

[39] L. Meyaard, E. Hovenkamp, ​​SA Otto, F. Miedema, J. Immunol. 1996، 156، 2776.

[40] A. Cope، GLe Friec، J. Cardone، C. Kemper، Trends Immunol. 2011، 32، 278.

[41] SP Kerkar، RS Goldszmid، P. Muranski، D. Chinnasamy، Z. Yu، RN Reger، AJ Leonardi، RA Morgan، E. Wang، FM Marincola، G. Trinchieri، SA Rosenberg، NP Restifo، J. Clin . سرمایه گذاری. 2011, 121, 4746.

[42] W. Lasek، R. Zago˙zd˙zon، M. Jakobisiak، سرطان ایمونول. ایمنی دیگر. 2014، 63، 419.

[43] C. Zhang، J. Zhang، J. Niu، Z. Zhou، J. Zhang، Z. Tian، Hum. ایمونول. 2008، 69، 490.

[44] NG Jacobson، SJ Szabo، RM Weber-Nordt، Z. Zhong، RD Schreiber، JE Darnell، KM Murphy، J. Exp. پزشکی 1995، 181، 1755.

[45] K. Mimura، JL Teh، H. Okayama، K. Shiraishi، LF Kua، V. Koh، DT Smoot، H. Ashktorab، T. Oike، Y. Suzuki، Z. Fazreen، BR Asuncion، A. Shabbir , WP Yong, J. So, R. Soong, K. Kono, Cancer Sci. 2018، 109، 43.

[46] T. Watanabe، S. Watanabe، G. Neumann، H. Kida، Y. Kawaoka، J. Virol. 2002، 76، 767.

[47] AS Bergot، A. Durgeau، B. Levacher، BM Colombo، JL Cohen، D. Klatzmann، Cancer Gene Ther. 2010، 17، 645.

[48] ​​R. Dent، M. Trudeau، KI Pritchard، WM Hanna، HK Kahn، CA Sawka، LA Lickley، E. Rawlinson، P. Sun، SA Narod، Clin. سرطان Res. 2007، 13، 4429.

[49] BG Haffty، Q. Yang، M. Reiss، T. Kearney، SA Higgins، J. Weidhaas، L. Harris، W. Hait، D. Toppmeyer، J. Clin. اونکول. 2006، 24، 5652.

[50] AV Paschall، K. Liu، J. Visualized Exp. 2016, 2016, 54040.

[51] A. Marra، G. Viale، G. Curigliano، BMC Med. 2019، 17، 90.

[52] ر. توماس، ج.الخضایری، ج.دکاک، جبهه. اونکول. 2021, 10, 3464.

[53] S. Adams، P. Schmid، HS Rugo، EP Winer، D. Loirat، A. Awada، DW Cescon، H. Iwata، M. Campone، R. Nanda، R. Hui، G. Curigliano، D. Toppmeyer، J. O'Shaughnessy، S. Loi، S. Paluch-Shimon، AR Tan، D. Card، J. Zhao، V. Karantza، J. Cortés، Ann. اونکول. 2019, 30, 397.

[54] LY Dirix، I. Takacs، G. Jerusalem، P. Nikolinakos، HT Arkenau، A. Forero-Torres، R. Boccia، ME Lippman، R. Somer، M. Smakal، LA Emens، B. Hrinczenko، W Edenfield، J. Gurtler، A. von Heydebreck، HJ Grote، K. Chin، EP Hamilton، Breast Cancer Res. درمان شود. 2018, 167, 671.

[55] EA Mittendorf، AV Philips، F. Meric-Bernstam، N. Qiao، Y. Wu، S. Harrington، X. Su، Y. Wang، AM Gonzalez-Angulo، A. Akcakanat، A. Chawla، M. Curran، P. Hwu، P. Sharma، JK Litton، JJ Molldrem، G. Alatrash، Cancer Immunol. Res. 2014، 2، 361.

[56] MT Barrett، E. Lenkiewicz، S. Malasi، A. Basu، JH Yearley، L. Annamalai، AE McCullough، HE Kosiorek، P. Narang، MA Wilson Sayres، M. Chen، KS Anderson، BA Pockaj، Breast سرطان Res. 2018, 20,71.

[57] P. Schmid، S. Adams، HS Rugo، A. Schneeweiss، CH Barrios، H. Iwata، V. Diéras، R. Hegg، S.-A. Im، GS Wright، V. Henschel، L. Molinero، SY Chui، R. Funke، A. Husain، EP Winer، S. Loi، LA Emens، N. Engl. جی. مد. 2018, 379, 2108.

[58] MK Gately، U. Gubler، MJ Brunda، RR Nadeau، TD Anderson، JM Lipman، U. Sarmiento، Ther. ایمونول. 1994، 1، 187.

[59] UM Sarmiento، JH Riley، PA Knaack، JM Lipman، JM Becker، MK Gately، R. Chizzonite، TD Anderson، آزمایشگاه. سرمایه گذاری. 1994، 71، 862.

[60] VM Eng، BD Car، B. Schnyder، M. Lorenz، S. Lugli، M. Aguet، TD Anderson، B. Ryffel، VFJ Quesniaux، J. Exp. پزشکی 1995، 181، 1893.

[61] JA Gollob، KG Veenstra، RA Parker، JW Mier، DF McDermott، D. Clancy، L. Tutin، H. Koon، MB Atkins، J. Clin. اونکول. 2003، 21، 2564.

[62] Y. Agarwal، LE Milling، JYH Chang، L. Santollani، A. Sheen، EA Lutz، A. Tabet، J. Stinson، K. Ni، KA Rodrigues، TJ Moyer، MB Melo، DJ Irvine، KD Wittrup ، نات. بیومد. مهندس 2022، 6، 129.

[63] ML Lucas، L. Heller، D. Coppola، R. Heller، Mol. آنجا 2002، 5، 668.

[64] SL Hewitt، D. Bailey، J. Zielinski، A. Apte، F. Musenge، R. Karp، S. Burke، F. Garcon، A. Mishra، S. Gurumurthy، A. Watkins، K. Arnold، جی. مونیهان، ای. کلنسی تامپسون، کی. مولگرو، جی. ادجی، کی. دشلر، دی. پوتز، جی. مودی، دی. ای. Lapointe، H. Si، C. Morehouse، M. Sedic، RW Wilkinson، R. Herbst، و همکاران، Clin. سرطان Res. 2020, 26, 6284.

[65] RS Riley، CH ژوئن، R. Langer، MJ Mitchell، Nat. Rev. Drug Discovery 2019, 18, 175.

[66] I. Melero، E. Castanon، M. Alvarez، S. Champiat، A. Marabelle، Nat. کشیش کلین. اونکول. 2021، 18، 558.

[67] LM Wein، JT Wu، DH Kirn، Cancer Res. 2003، 63، 1317.

[68] J. Hong، C.-O. یون، بی ام سی بیومد. مهندس 2019، 1، 17.

[69] A. Mukhopadhyay، J. Wright، S. Shirley، DA Canton، C. Burkart، RJ Connolly، JS Campbell، RH Pierce، Gene Ther. 2018، 26، 1.

[70] MA Postow، MK Callahan، CA Barker، Y. Yamada، J. Yuan، S. Kitano، Z. Mu، T. Rasalan، M. Adamow، E. Ritter، C. Sedrak، AA Jungbluth، R. Chua AS Yang، R.-A. رومن، اس. روسنر، بی. بنسون، جی پی آلیسون، ام.ام لسوخین، اس. گنجاتیچ، جی.دی. ولچوک، ن. انگل. جی. مد. 2012، 366، 925.

[71] EF Stamell، JD Wolchok، S. Gnjatic، NY Lee، I. Brownell، Int. ج. رادیات. Oncol., Biol., Phys. 2013، 85، 293.

[72] EB Golden، S. Demaria، PB Schiff، A. Chachoua، SC Formenti، Cancer Immunol. Res. 2013، 1، 365.

[73] TY Seiwert، AP Kiess، J. Clin. اونکول. 2021، 39، 1.

[74] E. Gutierrez, M. Bigelow, C. LaCroix, P. Kirby, L. Markowitz, M. Naill, S. O'Neil, PA Hull, J. Engelhardt, J.-M. Cuillerott، A. Cheung، A. Grinberg، N. Wagtmann، Cancer Res. 2021، 81، 1714

[75] R. Varma, K. Liu, C. Bonzon, R. Rashid, N. Rodriguez, N. Hassanzadeh-Kiabi, C. Ardila, SY Chu, US Muchhal, JR Desjarlais, MJ Bernett, Cancer Res. 2020, 80, 5549.

[76] J. Sharifi, LA Khawli, P. Hu, S. King, AL Epstein, Hybrid Hybridomics 2001, 20, 305.

[77] سی. هالین، اس. روندینی، اف. نیلسون، آ. برنت، اچ. کوسمهل، ال. زردی، دی. نری، نات. بیوتکنول. 2002، 20، 264.

[78] S. Mura, J. Nicolas, P. Couvreur, Nat. ماتر 2013، 12، 991.

[79] E. Becht، NA Giraldo، L. Lacroix، B. Buttard، N. Elarouci، F. Petitprez، J. Selves، P. Laurent-Puig، C. Sautès-Fridman، WH Fridman، A. de Reyniès، ژنوم بیول. 2016، 17، 218