یک استراتژی تشخیص بیماری‌زای ذاتی شامل یوبیکوئیتیناسیون پروتئین‌های سطحی باکتریایی قسمت 1

معرفی

تهاجم بیماری زا یک باتری از پاسخ های ایمنی را تحریک می کند که توسط مکانیسم های نظارتی میزبان تحریک می شود. این به طور کلی با شناسایی ساختارهای مولکولی میکروبی محافظت شده به نام الگوهای مولکولی مرتبط با بیماری زا (PAMPs) آغاز می شود. سنجش موثر این PAMPها توسط گیرنده‌های تشخیص الگو (PRRs) به سرعت پاسخ‌های ایمنی میزبان مختلف را از طریق فعال‌سازی مسیرهای سیگنالینگ پیچیده که پاکسازی پاتوژن را آغاز می‌کنند، القا می‌کند.

در سال‌های اخیر، با توسعه بیوتکنولوژی و بهبود مستمر فناوری تحقیقات، مردم درک عمیق‌تری از رابطه بین مولکول‌های میکروبی و ایمنی پیدا کرده‌اند. مولکول‌های میکروبی حفاظت‌شده دسته‌ای از مولکول‌های میکروبی هستند که می‌توانند توسط ارگانیسم‌ها شناسایی شوند و پاسخ‌های ایمنی را تحریک کنند. آنها عمدتاً شامل اجزای مولکولی میکروارگانیسم‌ها مانند باکتری‌ها، ویروس‌ها و قارچ‌ها هستند و بسیار حفاظت‌شده و اختصاصی هستند. مطالعات نشان داده اند که مولکول های میکروبی حفاظت شده می توانند در برابر عوامل بیماری زا مقاومت کنند و با فعال کردن سیستم ایمنی بدن، ایمنی بدن را تقویت کنند.

مولکول‌های میکروبی حفاظت‌شده با فعال کردن مولکول‌های مهم در سیستم ایمنی مانند سلول‌های T، سلول‌های B و ماکروفاژها، پاسخ‌های التهابی و ایمنی را تحریک می‌کنند. این سلول‌ها پس از شناسایی مولکول‌های میکروبی حفاظت‌شده، واسطه‌های ایمنی مختلف از جمله سیتوکین‌ها و کموکاین‌ها را آزاد می‌کنند و در نتیجه سلول‌های ایمنی دیگر را برای پیوستن به پاسخ ایمنی جذب می‌کنند. در عین حال، مولکول‌های میکروبی حفاظت‌شده نیز می‌توانند به عنوان آنتی‌ژن برای فعال کردن پاسخ‌های آنتی‌بادی در بدن عمل کنند و در نتیجه محافظت از آنتی‌بادی را تشکیل دهند. تعامل این سلول ها و عوامل ایمنی می تواند بهتر از بدن در برابر عوامل بیماری زا محافظت کند.

بسیاری از مطالعات نشان داده‌اند که مولکول‌های میکروبی حفاظت‌شده می‌توانند ایمنی بدن را بهبود بخشند و در نتیجه از انواع بیماری‌ها مانند بیماری‌های عفونی، بیماری‌های آلرژیک، سرطان و غیره پیشگیری و درمان می‌کنند. به عنوان مثال، واکسن نوترکیب هپاتیت B بر اساس مولکول میکروبی حفظ شده بر روی آنتی ژن سطحی ویروس هپاتیت B پاسخ ایمنی بدن را می توان با تلقیح واکسن القا کرد تا آنتی بادی سطحی ویروس هپاتیت B تولید کند تا به هدف جلوگیری از عفونت ویروس هپاتیت B دست یابد.

در نتیجه، ارتباط قوی بین مولکول های میکروبی حفاظت شده و ایمنی وجود دارد. با استفاده کامل از عملکرد تعدیل کننده ایمنی مولکول های میکروبی حفاظت شده، می توان ایمنی بدن را بهبود بخشید و از بیماری های مختلف بهتر پیشگیری و درمان کرد. بنابراین، ما باید به طور فعال به تحقیقات کاربردی مولکول های میکروبی حفاظت شده توجه کنیم و کاربرد آنها را در پیشگیری و درمان بیماری ها ترویج دهیم. از این منظر، ما نیاز به بهبود ایمنی داریم. سیستانچ می تواند به طور قابل توجهی ایمنی را بهبود بخشد، زیرا خاکستر گوشت حاوی انواع مواد فعال بیولوژیکی مانند پلی ساکاریدها، دو قارچ و Huangli و غیره است. این مواد می توانند سیستم ایمنی بدن را تحریک کنند. انواع مختلف سلول ها، فعالیت ایمنی خود را افزایش می دهند.

روی فواید سلامتی سیستانچ کلیک کنید

تا به امروز، چندین کلاس از PRRها، مانند گیرنده‌های Toll مانند، گیرنده‌های مشابه ژن القایی با رتینوئیک اسید (RIG-I)، گیرنده‌های NOD مانند، و گیرنده‌های DNA (حسگرهای سیتوزولی برای DNA)، کشف و مشخص شده‌اند (1). ). این PRR ها در خط مقدم تشخیص پاتوژن خارج سلولی و درون سلولی قرار دارند و کلاس های مختلفی از مولکول ها را در میکروب ها از جمله پروتئین ها، لیپیدها، کربوهیدرات ها و اسیدهای نوکلئیک حس می کنند (2). این امر برای توقف پیشرفت بیماری و ارتقای بقای میزبان بسیار مهم است.

نظارت بر محیط درون سلولی برای محدود کردن تکثیر پاتوژن برای حفظ عقیمی سیتوزولی بسیار مهم است. نقض چنین مکانیسم‌های دفاعی، پاتوژن را از ایمنی ذاتی خارج سلولی پناه می‌دهد و فرصتی برای تکثیر و انتشار سریع در میزبان فراهم می‌کند (3). بنابراین، مکانیسم‌های سنجش پاتوژن قوی و سیستم‌های دفاعی خودگردان سلولی برای محدود کردن پاتوژن‌های مهاجم حیاتی هستند. Ubiquitination یکی از راهبردهایی است که نقش اساسی در شناسایی و حذف پاتوژن ایفا می کند (4).

مسیر تخریبی دیکته شده توسط یوبیکوئیتیناسیون به عنوان یک مرز نهایی در برابر باکتری های ساکن در سیتوزول عمل می کند که اغلب با پاره کردن واکوئل های حاوی پاتوژن برای حمله به سیتوزول میزبان از کشتن اندوسیتی کلاسیک فرار می کنند. چندین لیگاز میزبان E3 یوبیکوئیتین برای تزئین محموله‌ها از جمله پاتوژن‌های داخل سلولی با زنجیره‌های پلی یوبی‌کوئیتین (Ub) شناسایی شده‌اند (5)، و اگرچه تعداد کمی از اهداف باکتریایی مانند پروتئین‌های غشای بیرونی شناسایی شده‌اند (6)، دانش گسترده‌ای در مورد استراتژی شناسایی سوبسترا باقی مانده است. محدود.

یک مطالعه اخیر نشان داده است که پروتئین‌های اثرگذار ترشح شده حاوی دامنه مرتبط با یوبی‌کویتین (UBA) در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (Mtb) است که به طور غیرفعال بخش‌های یوبی‌کوئیتین را جذب می‌کند و در نهایت پاتوژن را به پروتئین مرتبط با میکروتوبول 1A/1B زنجیره سبک 3 (LC3) مرتبط می‌کند. (7). در کنار آن، سوبستراهای غیرمعمول یوبی کوئیتین مانند لیپوپلی ساکارید (LPS) و گلیکان به زیبایی در چند پاتوژن باکتریایی نشان داده شده اند که تطبیق پذیری بسترهای یوبی کوئیتیناسیون را به نمایش می گذارد (8، 9).

به طور مکمل، Rickettsia parkeri به طور فعال پروتئین های سطحی را اصلاح می کند و از آنها در برابر یوبی کوئیتیناسیون و کشتن بعدی محافظت می کند (10). این مطالعات مستقل با هم بر اهمیت محلی سازی سطح بستر یوبیکوئیتین تاکید می کنند. با این حال، هویت یک بستر پروتئینی در پاتوژن و چگونگی شناسایی دقیق آنها توسط لیگاز E3 میزبان همچنان مبهم باقی مانده است.
تعداد کمی از لیگازهای یوبیکوئیتین میزبان، مانند تکرار غنی از لوسین و موتیف استریل حاوی 1 (LRSAM1)، پارکین، پروتئین انگشت حلقه 166 (RNF166)، RNF213، Ariadne RING-BetweenRING-RING (RBR) E{9} پروتئین لیگاز یوبیکوئیتین 1 (ARIH1)، پروتئین لیگاز 1 خاص SMAD E{13} (Smurf1) و پروتئین Skip-Cullin-F-box 2 حاوی کمپلکس (SCFFBXO2) برای تزئین واکوئل های پاتوژن یا پاتوژن گزارش شده است. با انواع توپولوژی های زنجیره ای یوبیکوئیتین (8، 9، 11-18). به طور مشخص، به ویژه، LRSAM1 از طریق یوبی‌کوئیتین‌سازی خودکار احتمالاً یک سیگنال یوبی‌کوئیتین قوی در اطراف باکتری‌ها برای به‌کارگیری ماشین‌های اتوفاژیک تولید می‌کند (19، 20). لیگازهای یوبیکوئیتین مسئول علامت گذاری پاتوژن نیز در حفظ هموستاز سلولی نقش دارند و یک سیستم بسیار مقرون به صرفه برای استفاده کارآمد و بهینه از منابع ایجاد می کنند.

در میان توپولوژی‌های زنجیره‌ای یوبی‌کوئیتین مختلف که روی پاتوژن تشکیل شده‌اند، تزئینات M{0}}Ub عمدتاً القای التهاب را تحریک می‌کند (21)، در حالی که توپولوژی‌های زنجیره K48- و K{3}}به طور مؤثر میکروب‌ها را به سمت اتوفاژی یا سیستم پروتئازومی به ترتیب (22). اخیراً نشان داده‌ایم که زنجیره K{5}}Ub در مقایسه با K63-Ub اثر ضد باکتریایی غالب‌تری دارد (23). به طور کلی، پروتئین های سلولی که برای تخریب پروتئازومی تعیین شده اند توسط لیگازهای خاص زنجیره Ub برچسب گذاری می شوند. سیگنال حیاتی برای تشخیص بستر توسط چنین لیگازهایی عمدتاً توسط یک موتیف دگرون هدایت می شود (24).

در این مطالعه، ما وجود موتیف‌های دگرون را در پروتئین‌های سطحی باکتری‌های فیلوژنتیکی متنوع با منشا گرم مثبت و گرم منفی شناسایی می‌کنیم. هدف قرار دادن چنین بسترهایی توسط ماشین آلات ubiquitination باعث حذف موثر پاتوژن از سلول میزبان می شود. با استفاده از این، ما تبدیل یک پروتئین سطحی غیرقابل تطبیق را به یک بستر یوبیکوئیتین با مهندسی درج دگرون برای ترویج پاکسازی باکتریایی نشان می‌دهیم. این اصل ساده و در عین حال عمومی برای شناسایی سوبستراهای باکتریایی به طور بالقوه به عنوان یک مکانیسم حفاظت شده برای شناسایی پاتوژن سیتوزولی عمل می کند، که نوید می دهد که در دفع عفونت های باکتریایی کارآمد و چند منظوره باشد.

نتایج

زنجیره K{0}}Ub حس پاتوژن های باکتریایی سیتوزولی را تقویت می کند

میزبان پس از تشخیص تهاجم سیتوزولی توسط پاتوژن ها، آنها را با زنجیره های poly-Ub علامت گذاری کرد تا پاکسازی آنها را تحریک کند (22). از آنجایی که چنین زنجیره‌های polyUb عمدتاً از K48- و K63-Ub تشکیل شده‌اند، ما ابتدا غلبه و موقعیت مکانی این نوع زنجیره‌ها را بر روی دو پاتوژن متمایز فیلوژنتیکی، استرپتوکوکوس پنومونیه (SPN) و سالمونلا انتریکا سرووار بررسی کردیم. تیفی موریوم (STM) که به ترتیب باعث پنومونی و گاستروانتریت در انسان می شود. برای این پاتوژن ها، بقا و تکثیر در سیتوزول سلول میزبان ثبت شده است (13، 25). با استفاده از آنتی‌بادی‌های خاص پیوند یوبی‌کوئیتین، مشاهده کردیم که نسبت بیشتری از باکتری‌های داخل سلولی با نوع زنجیره Ub K{6}} مشخص شده‌اند (~26 درصد برای SPN و 37 درصد برای STm) در مقابل K{9}} Ub (شکل 1A).

تجزیه و تحلیل مکان فضایی توسط میکروسکوپ روشنایی ساختاریافته (SIM) نشان داد که سیتوزولی (عاری از بقایای واکوئلی) یا باکتری های در معرض سیتوزول (در داخل اندوزوم آسیب دیده) عمدتاً با K48-Ub مرتبط هستند، در حالی که K{2}}Ub سیگنال روی آندوزوم‌های آسیب‌دیده قرار داشت که با Galectin{3}} (Gal8؛ نشانگر سنجش آسیب آندوزوم) مشخص شده بود (شکل 1، B تا E) (26). حدود 99 و 76 درصد از K{9}} SPN و STm یوبیکوئیتین شده، به ترتیب، فاقد Gal8 بودند (شکل 1F). حضور باکتری در سیتوزول با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و رنگ‌آمیزی ایمنی با نشانگر غشایی FM{12}} بیشتر تأیید شد (شکل S1، A تا F). ما به ترتیب 78.4 و 80.4 درصد K{18}}Ub مثبت SPN و STm را بدون هیچ گونه ارتباط غشایی یافتیم، در حالی که به ترتیب 77.7 و 74.4 درصد K63-Ub مثبت SPN و STm در داخل محدود بودند. واکوئل (شکل 1G). در مجموع، این یافته‌ها نشان می‌دهد که پوشش سطح باکتری با زنجیره‌های K{25}}Ub یک مکانیسم اصلی تشخیص پاتوژن است که توسط میزبان برای شناسایی میکروب‌های ساکن در سیتوزول استفاده می‌شود.

دگرون یک کد عمومی برای یوبی کوئیتیناسیون باکتریایی است

ما در مرحله بعد سعی کردیم بستر را برای یوبیکوئیتیناسیون K48 روی سطح باکتری شناسایی کنیم. به طور بحرانی، لیگازهای یوبیکوئیتین میزبان E3، که گزارش شده است در یوبی کوئیتیناسیون باکتریایی دخیل هستند، همچنین در عملکردهای سلولی حیاتی نقش دارند (12، 14) که در آن زنجیره‌های K{4}}Ub به عنوان یک سیگنال اصلی برای پروتئوستاز سلولی عمل می‌کنند. ما فرض کردیم که اصول مشابهی می تواند توسط میزبان برای شناسایی بستر K48-Ub روی سطح باکتری اتخاذ شود. برای پروتئین‌های میزبان، وجود یک موتیف سه‌جانبه (یک توالی دگرون اولیه به دنبال باقی‌مانده لیزین پروگزیمال و یک ناحیه بی‌نظم در بین آن) پیش‌نیاز برای یوبی‌کوئیتیناسیون K48 گزارش شده است (24).

ما پروتئین‌های سطحی SPN را برای وجود ویژگی‌های مشابه غربال کردیم (شکل 1H)، BgaA و PspA را به عنوان اهداف احتمالی برای ubiquitination شناسایی کردیم (شکل 1H و شکل S2، A و B). BgaA یک گالاکتوزیداز است که به عنوان یک چسبنده برای SPN عمل می کند، در حالی که PspA یک پروتئین متصل به کولین است که به لاکتوفرین متصل می شود و برای فرار از مکمل لازم است (27، 28). ما کاهش 50 تا 53 درصدی در ارتباط نوع زنجیره K{9}}Ub را برای جهش‌یافته ΔbgaA و ΔpspA مشاهده کردیم، بدون اینکه تغییری در سطوح K{10}}Ub (شکل 1I). این کاهش (~75 درصد) در یک سویه دو ناک اوت (ΔbgaAΔpspA) مشخص شد، که نشان دهنده ماهیت غیر زائد این بسترهای یوبیکوئیتین است (شکل 1I).

علاوه بر این، بیان BgaA-T (نسخه کوتاه شده پروتئین، متشکل از اسیدهای آمینه 1 تا 1049) و PspA در سلول های میزبان منجر به یوبی کوئیتیناسیون آنها با توپولوژی K{3}}Ub می شود (شکل 1J). اعتبار اهداف پیش‌بینی‌شده توسط مکمل تأیید شد، و مدل با استفاده از جهش ΔhysA (پروتئین سطحی SPN که معیارهای سه‌جانبه دگرون را برآورده نمی‌کند) به‌عنوان کنترل برای امتیاز دادن به سطوح ارتباط K{5}}Ub (شکل 1I) تقویت شد. ).

بعداً تأثیر تزئین K{0}}Ub بر پاکسازی باکتریایی را بررسی کردیم.

فقدان سوبستراهای K{0}}Ub از پاکسازی باکتریایی جلوگیری می کند، که منجر به بهبود قابل توجهی ماندگاری درون سلولی برای هر دو سویه جهش یافته SPN می شود (~1.{2}} برابر برای ΔbgaA و ~2- برابر برای ΔpspA) ( شکل 1K). جهانی بودن رویکرد پیش‌بینی سوبسترا ما با شناسایی چندین پروتئین در معرض سطح در پاتوژن‌های مختلف دیگر به عنوان بسترهای احتمالی برای ubiquitination تأیید شد (جدول S1). یکی از این نامزدهای احتمالی، پروتئین غشای بیرونی RlpA در STm به عنوان یک هدف برای ماشین آلات یوبیکوئیتیناسیون میزبان تایید شد، زیرا جهش ΔrlpA ~1.{8}} برابر کاهش ارتباط با K48-Ub را در مقایسه با وحشی نشان داد. -نوع (WT) STm (شکل 1L). این یافته کاربرد گسترده استراتژی انتخاب بستر ما را ایجاد کرد. با بهترین دانش ما، اینها اولین پروتئین های سطحی باکتریایی هستند که توسط ماشین آلات یوبی کوئیتیناسیون میزبان برای سنجش و پاکسازی پاتوژن شناسایی شده اند.

یک موتیف سه‌جانبه یک پیش‌نیاز برای برچسب‌گذاری دقیق یوبیکوئیتین پروتئین‌های سطح باکتری است

پس از شناسایی بستر، هدف ما آزمایش ویژگی‌های مهم موتیف سه‌جانبه است که ستون فقرات صفحه ما را تشکیل می‌دهد (شکل 2A و شکل S2A). حذف توالی دگرون (102VTPKEE107) در BgaA-T منجر به کاهش 50 درصدی ارتباط نوع زنجیره K{6}}Ub، در مقایسه با WT SPN بدون توجه به سینتیک رشد مشابه و توانایی چسبندگی سلول شد (شکل 2C) و شکل S3، A، و B). این کاهش قابل مقایسه با سویه حذفی ΔbgaA بود که فنوتیپ اختصاصی دگرون را تأیید می‌کرد. جدا از توالی دگرون، باقیمانده لیزین در مجاورت نزدیک برای اتصال بخش یوبیکوئیتین به بستر بسیار مهم است. در BgaA، توالی دگرون با دو یوبیکوئیتیناسیون پروگزیمال کاهش یافته K48 در مقایسه با BgaA-T همراه است (شکل 2D). قابل ذکر است، احتمال تغییر ساختاری شدید در پروتئین BgaA-TΔDegron برای تأثیر بر یوبی کوئیتینیشن توسط طیف‌سنجی پیش‌بینی سیلیکونی و دو رنگی دایره‌ای (CD) پروتئین خالص‌شده BgaA-TΔDegron، که نشانه‌های ساختاری مشابهی با BgaA-T نشان داد، باطل شد (شکل S3، ج و د). مانند BgaA، حذف توالی دگرون (327PETPAPE333) و جهش لیزین (K315R) در PspA نیز منجر به کاهش قابل توجه ارتباط K{20}}Ub، همراه با توانایی طولانی مدت بقا شد (شکل S4، A تا D).

ما در مرحله بعدی پروتئین سطحی SPN HysA را که در اصل فاقد توالی دگرون اولیه بود، با افزودن یک توالی دگرون در یک ناحیه از نظر ساختاری بی نظم از پروتئین که حاوی باقیمانده لیزین است، مهندسی کردیم (شکل 2، F و G، و شکل S2، C). به E). این اصلاح به رسمیت شناختن و Ubiquitination K48 از پروتئین HysA که قبلا غیرقابل استفاده بود. سطح ارتباط K{3}}Ub سویه‌های SPN حامل پروتئین HysA مهندسی شده (ΔbgaA:pHysADegron-BgaA و ΔpspA:pHysADegron-PspA) 2.{7}} و 3.2-برابر بیشتر از به ترتیب ΔbgaA و ΔbgaA: سویه های pHysA یا ΔpspA (شکل 2H).

تزیین تقویت‌شده سویه‌های ΔbgaA:pHysADegron-BgaA و ΔpspA:pHysADegron-PspA با K{2}}Ub، SPN را از افزایش بقای ناشی از عدم وجود دگرون در ΔbgaA و ΔbgaA ربوده است: pHysA یا ΔpspA (شکل 2I). همه سویه های SPN مهندسی شده سطوح مشابهی از سم منفذساز پنومولیزین (Ply) را تولید کردند (شکل 2، B و G)، که پیش نیازی برای آسیب غشای درونی و یوبیکوئیتیناسیون بعدی است (25). این امر سهم احتمالی آسیب کم یا گسترده غشاء را باطل می‌کند و باعث تغییر قابل توجه سطوح یوبی کوئیتیناسیون در سویه‌های جهش یافته SPN می‌شود. در مجموع، اینها نشان می‌دهند که افزودن مصنوعی توالی دگرون، تشخیص و حذف پاتوژن‌ها با واسطه یوبیکوئیتین را ترویج می‌کند. به طور قابل‌توجهی، توالی دگرون در BgaA در سروتیپ‌های مختلف پنوموکوکی به شدت حفظ شد (شکل S5A).

با این حال، در سروتیپ 19F که اغلب با افزایش خطر مرگ ناشی از پنومونی باکتریمی و سپسیس همراه است (29-31)، دگرون اولیه جهش یافته بود (P104Q). ما مشاهده کردیم که تقلید از این جهش در BgaA (شکل S5B) به یوبی کوئیتیناسیون ضعیف و بهبود توانایی بقا در ΔbgaA:pBgaA-TP104Q در مقایسه با ΔbgaA:pBgaA-T (شکل S5، C و D) منجر شد. این امر شناسایی دگرون را به عنوان یک استراتژی مورد استفاده میزبان برای محافظت از خود در برابر عفونت های شدید باکتریایی برجسته می کند.

SCFFBW7 یک یوبیکوئیتین لیگاز ضد میکروبی E3 است

پیش‌بینی می‌شود که توالی دگرون متعارف موجود در بسترهای انتخابی یوبی‌کوئیتین توسط کمپلکس لیگاز یوبی‌کوئیتین SCFFBW7 E3 (24)، که در تنظیم چرخه سلولی و رشد نقش دارد، شناسایی شود (32). این پروتئین از دو پروتئین حفاظت شده تشکیل شده است، پروتئین 1 مرتبط با فاز S کیناز (SKP1) و عضوی از خانواده پروتئین Cullin، همراه با یک پروتئین F-box متغیر که ویژگی سوبسترا را فراهم می کند (33). برای تأیید دخالت SCFFBW7 در ubiquitination SPN، ابتدا ارتباط FBXW7 با SPN را ارزیابی کردیم. بر اساس تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس، حدود 31 درصد از SPN داخل سلولی با FBXW7 مرتبط است (شکل 3A و شکل S6A). انتظار می رود، FBXW{16}}SPN مثبت نیز با یوبیکوئیتین K48 (شکل S6B) کلوکالیزه شد. برای اثبات دخالت SCFFBW7، برچسب‌گذاری باکتری‌ها با زنجیره‌های K{20}}Ub توسط ایمونوفلورسانس، به دنبال کاهش بیان ژن‌های Cullin1، SKP1، و FBXW7 با استفاده از RNA‌های مداخله‌گر کوچک مورد بررسی قرار گرفت (siRNAs؛ شکل. S7، A تا C).

به طور خاص، خاموش کردن FBXW7 توسط سطح تجمع cyclin E1 در سلول‌های تحت درمان با siFBXW{2} تایید شد (شکل S7F). ما 45 تا 60 درصد کاهش در ارتباط SPN با K48-Ub را در سلول های Cullin1، SKP1 و FBXW7 مشاهده کردیم (شکل 3B)، که به نوبه خود منجر به ~1 شد.{12}} 1.{14}}افزایش برابری در ماندگاری SPN در سلول‌های میزبان (شکل 3E). هدف‌گیری خاص موتیف دگرون توسط SCFFBW7 با تفاوت‌های بدون تغییر در کولوکالیزاسیون K{17}}Ub و توانایی بقای سویه‌های ΔpspAΔbgaA و ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron در سلول‌های تیمار شده siFBXW{19}} اثبات شد (شکل S8, A). د). این یافته ها با کاهش قابل توجه در یوبیکوئیتیناسیون K48 از BgaA-T در سلول های میزبان به دنبال نابودی FBXW7 اثبات شد (شکل 3C).

علاوه بر این، در شرایط آزمایشگاهی، ubiquitination با BgaA-T خالص شده (شکل S9، A تا D) و اجزای کمپلکس SCF به طور واضح SCFFBW7 را به عنوان لیگاز E3 واقعی مسئول یوبی کوئیتیناسیون BgaA نشان می دهد. نوترکیب SCFFBW7 قادر به Ubiquitinating BgaA-T خالص بود، اما نتوانست نوع حذف شده با دگرون BgaA-TΔDegron یا نوع جایگزینی لیزین به آرژنین BgaA-TK97R (شکل 3D) را بیکوئیتین کند. علاوه بر این، سلول‌های میزبان بیان‌کننده نوع FBXW7R505C، که توانایی تشخیص مختل سیکلین E1 (زیر لایه FBXW7) (شکل S7E) را نشان می‌دهد، کاهش (~50 درصد) Ubiquitination K48 SPN و همچنین ~{20}} برابر را نشان داد. بقای بالاتر SPN در مقایسه با سلول های WT (شکل 3، F و G). این آزمایش‌ها نقش کلیدی لیگاز SCFFBW7 E3 را در تشخیص پاتوژن‌های ساکن در سیتوزول و هدف قرار دادن آنها به سمت مسیرهای کشتن ثابت می‌کند.

GSK{0}}فسفوریلاسیون موتیف دگرون با واسطه GSK فعالیت ضد میکروبی SCFFBW7 را تقویت می کند

به طور کلی، پروتئین‌های F-box، سوبستراهای فسفریله شده را برای ارتقای یوبی‌کوئیتیناسیون خود تشخیص می‌دهند (34). بنابراین، ما احتمال و تأثیر فسفوریلاسیون بسترهای باکتریایی را بر روی پوشش K{2}}Ub پاتوژن بررسی کردیم. تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک وجود یک باقی مانده ترئونین فسفریل پذیر (102VT * PKEE107) را در توالی دگرون در BgaA نشان داد. ما مشاهده کردیم که سویه SPN حاوی جهش BgaA-TT103A (ΔbgaA:pBgaA-TT103A) (شکل 4A) 71 درصد کاهش کلوکالیزاسیون با K48-Ub در مقایسه با WT (شکل 4B) را نشان می‌دهد، که ارتباط فسفوریلاسیون در شناسایی سوبسترا توسط کمپلکس SCF

به طور اساسی، کاهش تمایل فسفوریلاسیون BgaA در ΔbgaA:pBgaA-TT103A توانایی میزبان را برای از بین بردن بارهای باکتریایی داخل سلولی (~1.{3} برابر) لغو کرد (شکل 4C). به موازات BgaA، یک نوع دگرون PspA (ΔpspA:pPspAT329A) نیز کاهش 51 درصدی در کولوکالیزاسیون K{7}}Ub را نشان داد که با ماندگاری طولانی مدت درون سلولی همراه بود (شکل S10، A تا C). به طور کلی، سوبستراهای هدف SCFFBW7 دارای یک ترئونین/سرین (T/S*) در کنار یک باقیمانده پرولین هستند که توسط یک پروتئین کیناز هدایت‌شده به پرولین، GSK3 (35-37) فسفریله می‌شود. بنابراین، ما سعی کردیم نقش GSK3 را در افزایش تشخیص بستر کشف کنیم.

ما ابتدا نشان دادیم که GSK3 با SPN یوبیکوئیتین شده که با FBXW7 مشخص شده است، ارتباط نزدیکی دارد (شکل 4، D و E). پس از آن، با انجام یک سنجش کیناز آزمایشگاهی، مشاهده کردیم که GSK3 می‌تواند BgaA-T نوترکیب را فسفریله کند. در همان زمان، نوع BgaA-TT103A غیرفسفریله باقی ماند (شکل 4F). این امر هویت باقیمانده ترئونین را در توالی دگرون BgaA-T به عنوان هدفی برای فسفوریلاسیون با واسطه GSK تأیید کرد. نابودی هدفمند GSK3 توسط siRNA (شکل S7D) منجر به کاهش 58 درصدی Ubiquitination K48 از SPN شد (شکل 4G). این کاهش یوبی کوئیتیناسیون، به دنبال کاهش بیان GSK3، منجر به کاهش توانایی میزبان در پاکسازی پاتوژن های حمله شده به سلول شد (~1.{19} برابر) (شکل 4H) اما هیچ تأثیری بر ΔbgaA نشان نداد. : pBgaA-TT103A (شکل S8، E، و F). در مجموع، این اولین شواهد از یک کیناز میزبان، به ویژه GSK3 را فراهم می کند، که یوبی کوئیتیناسیون پروتئین های سطح باکتری را برای پاکسازی موثر پاتوژن ها تنظیم می کند (شکل 4 I).

یوبی کوئیتیناسیون پاتوژن های سیتوزولی سرنوشت مشخصی را برای از بین بردن آنها رقم می زند. به طور خاص، یوبی کوئیتیناسیون K48 هدف قرار دادن سوبستراها را به سمت پروتئازوم ها ترویج می کند (22). به طور مشابه، نتایج ما ارتباط SPN یوبیکوئیتین شده با زیرواحد پروتئازومی 7 را نشان می دهد (شکل S11، A و C). علاوه بر این، مهار پروتئازومی توسط درمان MG132 تداوم WT SPN را بهبود می بخشد اما توانایی بقای ΔpspAΔbgaA را تغییر نمی دهد. فنوتیپ های مشابهی در مورد جهش STm و ΔrlpA مشاهده شد (شکل S11، B و D).

نظارت پاتوژن با هدایت دگرون میزبان را از سپسیس محافظت می کند

سپس ما به دنبال تعیین تأثیر تشخیص SPN از طریق دستگاه ubiquitination سلولی بر روی پیامدهای عفونت بودیم. با استفاده از یک مدل ثابت شده از سپسیس SPN (38)، ما حدت جهش ΔbgaA را با جهش WT SPN و همچنین سویه های تکمیل شده با BgaA-T (ΔbgaA: pBgaA-T) یا نسخه ای فاقد توالی دگرون مقایسه کردیم. ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron). مطابق با گزارش‌های قبلی (39)، سویه حذف bgaA قدرت بیماری‌زایی ضعیف‌تری را نشان داد، در حالی که موش‌های آلوده به WT، ΔbgaA:pBgaA-T، یا ΔbgaA: BgaA-TΔDegron تسلیم عفونت شدند (شکل 5A و شکل S12، A تا D) . با این حال، گروه موش‌های آلوده به سویه SPN فاقد توالی دگرون نسبت بیشتری از مرگ و میر اما با مرگ و میر تاخیری را در مقایسه با گروه آلوده به ΔbgaA:pBgaA-T نشان دادند (P=0.0492، آزمون log-rank) (شکل 5A). مقایسه بار باکتریایی در خون (شکل 5B) و طحال (شکل 5C) و دوره زمانی علائم مرئی بیماری در موش های آلوده (شکل 5D) روند افزایش حدت را در سویه ΔbgaA:pBgaATΔDegron تایید کرد.

مطالعات قبلی نشان داده اند که سپسیس SPN از مخزن باکتری در طحال ایجاد می شود (38). در حالی که موج اول باکتری های مهاجم در گردش خون به سرعت توسط مکانیسم های ایمنی ذاتی میزبان پاک می شود، بخشی از SPN قبل از کشت مجدد در خون زنده می ماند و در داخل ماکروفاژهای طحال تکثیر می شود. ما فرض کردیم که تاخیر در شروع بیماری شدید در موش‌های آلوده به ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron ممکن است نتیجه بقای طولانی مدت SPN در ماکروفاژهای طحال باشد، به دلیل کاهش شناسایی درون سلولی باکتری توسط دستگاه یوبیکوئیتیناسیون میزبان. در حمایت از این، ما شروع تاخیری موج دوم باکتریمی را در موش‌های آلوده به سویه ΔbgaA:pBgaA TΔDegron در مقایسه با ΔbgaA:pBgaA-T (24 ساعت در مقابل 12 ساعت)، پس از مرحله کلیرانس اولیه مشاهده کردیم (شکل 5E).

با این حال، در مرحله کسوف، که طی آن باکتری‌ها از خون پاک می‌شوند، تعداد باکتری‌های طحال به طور مداوم در موش‌های آلوده به ΔbgaA بیشتر بود: pBgaA-TΔDegron (شکل 5F). این یافته‌ها نشان می‌دهد که فاز انتشار SPN در ماکروفاژهای طحال در غیاب تشخیص عفونت درون سلولی از طریق دستگاه ubiquitination گسترش می‌یابد. در نتیجه، افزایش تراکم باکتری‌ها می‌تواند در طحال انباشته شود (شکل 5F)، و متعاقباً به تعداد بیشتری در خون بذر می‌شود، که ممکن است علت مرگ و میر تاخیری اما افزایش یافته موش‌های آلوده به ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron باشد. با هم، این داده‌ها نشان می‌دهند که شناسایی و ubiquitination SPN درون سلولی به کنترل میزبان پاتوژن‌ها در طول سپسیس کمک می‌کند.

For more information:1950477648nn@gmail.com