استراتژی تشخیص بیماری‌زای ذاتی شامل یوبیکوئیتیناسیون پروتئین‌های سطحی باکتریایی قسمت 2

بحث

متازوئن ها از ubiquitination به عنوان یک مکانیسم همه کاره برای حفظ هموستاز سیتوزولی، جلوگیری از تجمع پروتئین ها/ارگانل های آسیب دیده و دفاع در برابر پاتوژن های مهاجم استفاده می کنند (40، 41). با توجه به انواع پاتوژن‌ها و مجموعه‌های متنوعی از پروتئین‌های آسیب‌دیده که با آن‌ها مواجه می‌شویم، شناسایی موتیف‌های رایج برای شناسایی سوبسترا و ubiquitination بعدی نشان‌دهنده یک استراتژی هوشمند برای بهینه‌سازی منابع است. پروتئین‌های موجود در سلول‌های یوکاریوتی که برای پروتئولیز در نظر گرفته شده‌اند، معمولاً با یک موتیف سه‌جانبه دگرون شناسایی می‌شوند (24).

ایمنی توانایی بدن برای مبارزه با بیماری ها از جمله پاسخ به باکتری ها، ویروس ها و سایر مواد مضر است. اگر سیستم ایمنی بدن به خطر بیفتد، آنقدر قوی نخواهد بود که بتواند با هجوم بیماری مقابله کند. مطالعات نشان داده است که سوءتغذیه بر عملکرد سیستم ایمنی تأثیر می گذارد و بدن را مستعد ابتلا به عفونت و بیماری می کند. پروتئین یکی از مواد مهم برای حفظ ایمنی است.

پروتئین ها از اسیدهای آمینه ساخته شده اند که برخی از آنها را اسیدهای آمینه ضروری می نامند زیرا باید از طریق غذا تامین شوند و توسط بدن سنتز نمی شوند. این اسیدهای آمینه ضروری عبارتند از تریپتوفان، لوسین، فنیل آلانین، لیزین، ایزولوسین، متیونین، والین و هیستیدین. اگر بدن به اندازه کافی اسیدهای آمینه ضروری دریافت نکند، می تواند منجر به اختلال در متابولیسم پروتئین شود که می تواند بر عملکرد سیستم ایمنی بدن تأثیر بگذارد.

علاوه بر این، مصرف پروتئین با کیفیت بالا به حفظ یک سیستم ایمنی طبیعی و عملکرد بدن کمک می کند. هنگامی که بدن فاقد پروتئین باشد، می تواند منجر به ضعف سیستم ایمنی شود و بدن بیشتر مستعد ابتلا به بیماری است. اگر بدن انسان برای مدت طولانی کمبود پروتئین داشته باشد، ممکن است باعث آسیب طولانی مدت به سیستم ایمنی بدن شود و افراد را مستعد ابتلا به بیماری های مختلف کند.

بنابراین، یک رژیم غذایی متعادل و ورزش مناسب کلیدهای حفظ مصرف پروتئین هستند. افراد می توانند با مصرف بیشتر غذاهای غنی از پروتئین مانند گوشت، مرغ، ماهی، لوبیا، تخم مرغ، محصولات لبنی، غلات، آجیل و دانه ها، نیازهای پروتئینی بدن خود را تامین کنند. علاوه بر این، ورزش متوسط ​​نیز می تواند تقاضای بدن برای پروتئین و کارایی جذب را افزایش دهد. یک رژیم غذایی متعادل و متنوع و یک سبک زندگی سالم کلیدهای حفظ ایمنی، حفظ سلامت و پایداری بدن و مقاومت در برابر تهاجم بیماری ها هستند. از این منظر، ما باید ایمنی خود را تقویت کنیم. سیستانچ می تواند به طور قابل توجهی ایمنی را بهبود بخشد زیرا پلی ساکاریدهای موجود در گوشت می توانند پاسخ ایمنی سیستم ایمنی انسان را تنظیم کنند، توانایی استرس سلول های ایمنی را بهبود بخشند و ایمنی سلول های ایمنی را تقویت کنند. اثر باکتری کش.

روی مکمل cistanche deserticola کلیک کنید

این امر ما را بر آن داشت تا بررسی کنیم که آیا نقوش مشابهی را می توان بر روی سطوح پاتوژن یافت، جایی که ممکن است به عنوان یک پروکسی برای تشخیص بستر عمل کنند. در اینجا، نشان می‌دهیم که لیگازهای یوبیکوئیتین میزبان از امضاهای مولکولی مشابهی برای تشخیص پاتوژن‌های متمایز فیلوژنتیکی استفاده می‌کنند. شناسایی پاتوژن از طریق الگوها/نقوش مولکولی رایج (PAMPs) یک ویژگی کاملا مشخص ایمنی ذاتی است (42). نتایج ما نشان می‌دهد که توالی‌های دگرون مانند در پروتئین‌های سطح باکتری به روشی معادل PAMPs عمل می‌کنند تا نظارت پاتوژن درون سلولی را ایجاد کنند. این روش عمل می‌تواند توسط میزبان برای ارائه آنتی‌ژن‌های پروتئین میکروبی روی کمپلکس اصلی سازگاری بافتی I برای القای یک پاسخ CD8 قوی علیه پاتوژن‌های داخل سلولی مورد استفاده قرار گیرد.

اهمیت بالقوه تشخیص پاتوژن با واسطه یوبیکوئیتین برای دفاع میزبان توسط یوبی کوئیتیناسیون باقیمانده قابل توجهی که در جهش یافته SPN که فاقد هر دو BgaA و PspA هستند، برجسته می شود. این نشان می‌دهد که زیرلایه‌های ناشناخته دیگری از ماشین‌آلات یوبی‌کویتین وجود دارد که افزونگی حاصل از رهگیری پاتوژن قوی را تضمین می‌کند. نکته قابل توجه، برخی سوالات فوری در مورد موتیف دگرون و اهمیت آن برای باکتری ها (به غیر از اینکه یک واحد قابل تشخیص است) زاویه تکاملی جالبی را ارائه می دهد.

موتیف دگرون در داخل بدن غیرقابل استفاده است، و در صورت وجود، جهش یا حذف موتیف ماندگاری درون سلولی را بهبود می‌بخشد که منجر به افزایش حدت می‌شود. این با نتایج ما اثبات می‌شود که جهش در موتیف دگرون می‌تواند توسط پاتوژن‌ها برای فرار از شناسایی با واسطه یوبیکوئیتین همانطور که برای سروتیپ SPN 19F دیده می‌شود، مورد استفاده قرار گیرد. با این حال، ماهیت حفظ شده موتیف degron در BgaA در اکثر سروتیپ‌های SPN می‌تواند حاکی از یک استراتژی متقابل اتخاذ شده توسط باکتری‌ها برای کمتر کشنده بودن برای میزبان باشد.

این می تواند فرصتی را برای پاتوژن فراهم کند تا زیستگاه های قابل اشغال خود را افزایش دهد. به طور همزمان، یوبی کوئیتیناسیون سطح باکتری یا پروتئین های ترشح شده در موتیف دگرون می تواند آنها را از نظر عملکردی تعدیل کند تا پاسخ میزبان را برای منافع نهایی کاهش دهد یا دوباره سیم کشی کند (43). بنابراین، وجود یا عدم وجود حوزه‌ها یا موتیف‌های عملکردی شبه یوکاریوتی (مانند دگرون‌ها) می‌تواند به یک طاقچه بیماری‌زا وابسته باشد و برای فرار یا تعدیل پاسخ‌های ایمنی میزبان سازگار باشد.

یک مکانیسم تشخیص بیماری‌زای مشابه شامل پروتئین‌های اتصال گوانیلات نیز در پاکسازی باکتریایی نقش دارد. با این حال، بر خلاف ubiquitination، نقش آنها به پاتوژن های گرم منفی محدود گزارش شده است (44-47). Ubiquitination بدون در نظر گرفتن منشاء گرم، پاتوژن را هدف قرار می دهد، به عنوان مثال، RNF213 برای هدف قرار دادن گونه های لیستریا مستند شده است. صرف نظر از عدم وجود LPS (48). بنابراین، ما امکان اثر ضد میکروبی آن را در برابر SPN نیز از بین نمی‌بریم.

یک سطح بیماری زا را می توان با انواع زنجیره های متعدد توسط لیگازهای E3 مختلف با فعل و انفعالات زنجیره ای (41) یوبی کوئیتین کرد. به طور خاص، در مورد Mtb، Smurf1 و Parkin ثابت شده است که انواع زنجیره K48 و K63 را تشکیل می دهند که به طور هم افزایی برای تخریب پاتوژن عمل می کنند (12). درک نقش مکانیکی Ubiquitination K48 و لیگازهای E3 درگیر در طول سناریوهای عفونت هنوز مورد مطالعه قرار نگرفته است. در مورد STm، یک لیگاز E3 ARIH1 برای هدف قرار دادن STm سیتوزولی با زنجیره‌های یوبیکوئیتین K48 به تصویر کشیده شده است که منجر به حذف آنها از سیستم می‌شود (15). بر اساس یافته‌های ما و دیگران، پاتوژن‌های برچسب‌دار K{12}}در نهایت تخریب می‌شوند در حالی که با دستگاه‌های پروتئازومی مرتبط هستند.

با این حال، این مطالعه تزئین K{0}}Ub پروتئین‌های سطح باکتری خاص را نشان می‌دهد. برخی از پاتوژن‌ها به‌طور فعال پروتئین‌های سطحی خود را تغییر می‌دهند، از آنها در برابر یوبی‌کوئیتین و کشتن بعدی محافظت می‌کنند، بنابراین بر اهمیت محلی‌سازی سطح سوبسترای یوبی‌کوئیتین تأکید می‌کنند (10). علاوه بر این، چندین پاتوژن درون سلولی اجباری، استراتژی‌هایی را برای از بین بردن خود یا اجزای تنظیم‌کننده میزبان، برای اجتناب از پاکسازی با واسطه یوبی‌کوئیتین ایجاد کرده‌اند (5). با هم، این یافته ها بر اهمیت برانگیختگی هشدار با واسطه یوبیکوئیتین به عنوان یک مکانیسم اساسی سنجش پاتوژن درون سلولی مرکزی برای دفاع میزبان تاکید می کند.

مطالعه ما بیشتر نقش مرکزی لیگاز SCF E3، به‌ویژه با FBXW7 را در یوبی‌کوئیتیناسیون باکتریایی که باعث تخریب پاتوژن می‌شود، نشان داد. جهش های هتروزیگوت در FBXW7، به ویژه R505C (یک باقیمانده حیاتی در جیب شناسایی سوبسترا)، باعث ایجاد سرطان های متعدد و لوسمی لنفوسیتی در انسان می شود (49، 50). یک مطالعه اخیر مبتنی بر کوهورت نشان داد که تقریباً 43 درصد از بیماران مبتلا به لوسمی لنفوسیتی مزمن (CLL) در معرض ذات الریه باکتریایی و سپسیس و به دنبال آن عفونت های قارچی قرار می گیرند (51).

این مشاهدات ما را از توانایی لغو شده سلول‌های میزبان دارای جهش FBXW7 برای تشخیص و حذف پاتوژن‌ها تأیید می‌کند. بنابراین، یافته های ما توضیح مولکولی غیرمنتظره ای از افزایش خطر عفونت در بیماران مبتلا به CLL ارائه می دهد. ارتباط بین پلی‌مورفیسم ژنتیکی در ژن‌های لیگاز E3 و حساسیت به عفونت‌های باکتریایی نیز توسط بیماران مبتلا به بیماری پارکینسون که در برابر تب حصبه یا جذام آسیب‌پذیر هستند ثابت شده است (14) که نشان‌دهنده سهم قابل‌توجه لیگازهای E3 در ایمنی میزبان در برابر عفونت‌های باکتریایی و حفظ آن است. حالت پایدار سلولی

در نتیجه، ما یک زبان جهانی از سنجش پاتوژن‌های ساکن در سیتوزول را رمزگشایی کردیم که می‌تواند به طور موثر توسط میزبان برای شناسایی میکروارگانیسم‌ها برای حذف بعدی اعمال شود. در مجموع، این یافته ها درک فرآیندهای ایمنی سلولی ابتدایی را روشن می کند، که می تواند برای تقویت ایمنی ضد باکتریایی مورد استفاده قرار گیرد.

مواد و روش ها

کشت سلولی

هر دو رده سلولی کارسینوم آلوئولار ریه انسان (پنوموسیت نوع II) A549 [مجموعه کشت نوع آمریکایی (ATCC) شماره. CCL185)] و رده سلولی آدنوکارسینوم گردن HeLa (ATCC no. CRM-CCL{3}}) در محیط کشت Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM؛ HiMedia) همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی (Gibco) در دمای 37 درجه و 5 کشت داده شدند. درصد CO2

سویه و شرایط رشد باکتری

SPN (R6، سروتیپ 2، هدیه از تیم جی. میچل، دانشگاه بیرمنگام، بریتانیا) در آبگوشت تاد-هویت همراه با 1.5 درصد عصاره مخمر در دمای 37 درجه در 5 درصد CO2 رشد داده شد. آنتی‌بیوتیک‌های زیر برای رشد کشت‌های SPN در صورت نیاز استفاده شد: کانامایسین (2{12}}0 میکروگرم در میلی‌لیتر)، اسپکتینومایسین (100 میکروگرم در میلی‌لیتر) و کلرامفنیکل (4.5 میکروگرم در میلی‌لیتر). نهصد میکرولیتر 0.4 OD600 (چگالی نوری در 600 نانومتر) کشت SPN رشد یافته با 600 میکرولیتر گلیسرول 80 درصد استریل (غلظت نهایی گلیسرول 32 درصد) مخلوط شد و در فریزر عمیق 80- درجه نگهداری شد. این ذخایر گلیسرول به عنوان تلقیح اولیه برای همه آزمایش ها استفاده شد.

کشت های اشرشیاکلی DH5 و STm (ATCC 14{10}}28) در آبگوشت لوریا برتانی (LB) در دمای 37 درجه تحت شرایط تکان دادن (200 دور در دقیقه) رشد کردند و در صورت لزوم از آنتی بیوتیک های زیر استفاده شد: کانامایسین (50). ug/ml)، اسپکتینومایسین (100 ug/ml)، کلرامفنیکل (20 ug/ml) و آمپی سیلین (100 ug/ml). برای همه سنجش‌های عفونت، باکتری‌ها تا OD600 ~ 0.4 رشد کردند و به دنبال آن در سالین بافر فسفات (PBS) به تراکم مشابه قبل از آلوده کردن سلول‌های میزبان تعلیق مجدد شدند.

غربالگری پروتئین های هدف احتمالی یوبیکوئیتین

تمام پروتئین های سطحی موجود در پروتئوم STm و SPN برای اولین بار از ادبیات منتشر شده شناسایی شدند. توالی های پروتئینی کامل پروتئین های سطحی از UniProt به دست آمد که سپس برای شناسایی حضور نقوش دگرون استفاده شد. مجموعه ای از 29 نقوش دگرون فرضی از ادبیات منتشر شده (24، 52، 53) و پایگاه داده موتیف خطی یوکاریوتی تهیه شده است. ماژول regex پایتون برای شناسایی مکان همه چنین نقوشی در توالی‌های پروتئین سطحی استفاده شد. جستجوی خطی بیشتر برای شناسایی وجود یک باقی مانده لیزین در نزدیکی (8 تا 14 باقی مانده اسید آمینه) به هر موتیف دگرون شناسایی شده انجام شد. فرض بر این است که این باقیمانده لیزین به عنوان محل اتصال بخش یوبیکوئیتین عمل می کند. در نهایت، توالی‌های پروتئینی انتخاب شده به IUPred (54)، یک ابزار پیش‌بینی ساختار پروتئین، برای تعیین محل وجود یک منطقه بی‌نظم در بین موتیف دگرون و لیزین پروگزیمال وارد شدند. پروتئین های حاصل (BgaA و PspA برای SPN و RlpA برای STm) برای ارزیابی به عنوان اهداف ubiquitination و رمزگشایی نقش آنها در پاکسازی پاتوژن انتخاب شدند.

ساخت سویه باکتریایی

تبادل آللی با نوترکیبی همولوگ با استفاده از نواحی جناحی ژن حامل کاست آنتی بیوتیکی درج شده برای تولید سویه های جهش یافته در هر دو SPN و STm انجام شد (جدول S2).

برای SPN، 500-bp نواحی بالادست و پایین دست bgaA، pspA و ژن‌های او از ژنوم با آغازگرهای مناسب (جدول S3) تکثیر و در وکتور pBKS مونتاژ شدند. پس از شبیه سازی این قطعات، کاست مقاومت آنتی بیوتیکی (اسپکتینومایسین برای کیسه و همچنین pspA و کلرامفنیکل برای hysA) در این سازه قرار داده شد. پلاسمیدهای نوترکیب خطی شده سپس با استفاده از پپتید محرک صلاحیت 1 (GenPro Biotech) به WT SPN تبدیل شدند، نوترکیب ها با استفاده از آنتی بیوتیک های مربوطه انتخاب شدند و جایگزینی ژن با واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) و تعیین توالی جایگاه های ژن مربوطه تایید شد. برای STm، از روش رکامبیناز λ-قرمز برای تولید جهش‌های حذف ژن استفاده شد (55).

به طور خلاصه، توالی‌های همولوگ با انتهای ژن طناب در توالی‌های آغازگر که برای تقویت کاست مقاومت به کانامایسین استفاده می‌شوند، اضافه شدند. سپس کاست به سوی سویه WT STm الکتروپوره شد و ناک اوت های تولید شده توسط نوترکیبی همولوگ بر اساس مقاومت کانامایسین انتخاب شدند. حذف ژن با استفاده از PCR و تعیین توالی جایگاه ژن تایید شد. pspA تمام طول، hysA و bgaA-T کوتاه شده (1 تا 3168 جفت باز) در زیر پروموتر P23 در وکتور شاتل pIB166 (56) کلون شدند و برای تکمیل استفاده شدند.

این پلاسمیدهای نوترکیب همچنین برای جهش زایی مستقیم به محل مورد استفاده قرار گرفتند تا انواع مختلف bgaA-T (bgaA-TK96R، bgaA-TK97R، bgaA-TK96R، K97R، و bgaATΔDegron)، pspA (pspAK314R، pspAK315R، pspAK315R، pspAK315R، pspAK315R، و pspAK315R، pspAK315R، و pspAK315R، و pspAK315R، و pspAK315R، و pspAK315R، و pspAK315R، و pspAK315R, و او (hysADegron-BgaA و hysADegron-PspA) با استفاده از مجموعه آغازگرهای مناسب (جدول S3) و تبدیل به جهش‌یافته ΔbgaA و ΔpspA شدند. تمامی کلون ها با تعیین توالی DNA تایید شدند. بیان انواع مختلف BgaA، PspA و HysA توسط وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های مناسب تایید شد.

آنتی بادی ها و معرف ها

سرم ضد انولاز و ضد PspA (S. Hammerschmidt، دانشگاه گریفسوالد، آلمان)؛ سرم ضد BgaA (S. King، دانشگاه ایالتی اوهایو، ایالات متحده)؛ و آنتی بادی های اختصاصی برای His6 (Invitrogen، MA1-21315)، K{5}}پیوند Ub (میلیپور، 05-1307)، K63-پیوند Ub (میلیپور، 14-6077-80) ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} })، گلیسرآلدئید فسفات دهیدروژناز (Millipore، MAB374)، GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z]، phosphothreonene (CST, 9381S)، IgA، Kappa from myeloma myine, clone TEPC, clone TEPC (S,{21-Arich) M1421) و PSMB7 (Invitrogen, PA{25}}) تهیه شد. آنتی بادی های ثانویه زیر مورد استفاده قرار گرفتند: ضد خرگوش با برچسب پراکسیداز ترب (HRP) (BioLegend، 406401)، ضد موش با برچسب HRP (BioLegend 405306)، ضد خرگوش Alexa Fluor 488 (Invitrogen، A27206 Alexa)، ضد خرگوش فلور 555 (اینویتروژن، A31572)، ایمونوگلوبولین A ضد موش کونژوگه با بیوتین (Life Technologies، M31115)، فلور الکسا ضد موش (Invitrogen، A31570)، فلور ضد موش Alexa 488 (Invitrogen، Anti-A2020) Fluor 633 (Invitrogen, A21082) و FM{48}} (Thermo Fisher Scientific, T13320).

بیان و تصفیه پروتئین

BgaA-T و انواع آن در pET28 با استفاده از سایت های محدود Xba I/Not I کلون شدند. پلاسمیدهای نوترکیب کد کننده BgaA-T با نشان His-نترمینال به سلول های E. coli BL21 (DE3) برای بیان پروتئین تبدیل شدند. کلنی های تازه تبدیل شده در LB حاوی کانامایسین (5{13}} ug/ml) در دمای 37 درجه در انکوباتور شیکر به مدت 12 ساعت رشد داده شدند. یک درصد از کشت اولیه به 1 لیتر براث LB اضافه شد و در دمای 37 درجه در انکوباتور شیکر انکوبه شد تا زمانی که OD6{15}}0nm بین 0.6 و 0.8 برسد. بیان پروتئین با افزودن 100 میکرومولار ایزوپروپیل{18}D-تیوگالاکتوپیرانوسید (IPTG) و رشد بیشتر کشت در دمای 37 درجه به مدت 5 تا 6 ساعت با هم زدن در 150 دور در دقیقه القا شد.

سلول ها با سانتریفیوژ در 6{5}}00 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه برداشت شدند. گلوله سلولی در بافر A [25 میلی مولار tris (pH 8.0) و 300 میلی مولار NaCl] مجدداً معلق شد و با فراصوت لیز شد. بقایای سلولی با سانتریفیوژ (14،{8}} دور در دقیقه، 50 دقیقه، 4 درجه) جدا شد و مایع رویی بر روی یک ستون Ni-NTA، متعادل شده با بافر A اعمال شد. ستون با 10 حجم ستون بافر شسته شد. A و پروتئین‌های نشان‌دار His با ایمیدازول (250 میلی‌مولار) در بافر A شسته شدند. تمام واریانت‌های BgaA-T بیان و با استفاده از همان روش خالص‌سازی شدند. FBXW7 در وکتور pGEX{17}} T{18}} دارای برچسب N ترمینال گلوتاتیون S-transferase (GST) از وکتور pCMV{21}}Entry-FBXW7 با استفاده از آنزیم محدود کننده Eco RI کلون شد.

FBXW7 با برچسب GST در سلول های E. coli BL21 (DE3) به دنبال القای بیان پروتئین با 0.1 میلی مولار IPTG و رشد در 30 درجه به مدت 4 ساعت بیان شد. GST-FBXW7 از عصاره خام E. coli با استفاده از ستون کروماتوگرافی گلوتاتیون-سفاروز (GE HealthCare) خالص شد. فراکسیون های حاوی پروتئین های خالص شده با استفاده از فیلتر قطع وزن مولکولی 10- کیلو دالتونی (Amicon) با سانتریفیوژ در 4700 دور در دقیقه در 4 درجه تا 0.5 میلی گرم بر میلی لیتر تغلیظ و تغلیظ شدند. خلوص پروتئین ها در الکتروفورز ژل SDS-پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) و سپس رنگ آمیزی با Coomassie blue بررسی شد.

ترانسفکشن های سلول میزبان

BgaA-T در ناقل القایی با داکسی سایکلین pAK_Tol{3}}TRE{4}}Blast (Addgene شماره 130261) با استفاده از کیت شبیه سازی تزریقی (Takara) کلون شد. یک کلون مثبت با توالی یابی سنگر تایید شد. جهش FBXW7R505C توسط جهش زایی سایت-directed با استفاده از pMRX-GFP-FBXW7 به عنوان یک الگو انجام شد و با توالی یابی Sanger تأیید شد. تمام ترانسفکشن ها با استفاده از معرف Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) و انتخاب ها در حضور بلاستیسیدین هیدروکلراید (2 میکروگرم در میلی لیتر؛ HiMedia) انجام شد.

نابودی ژن هدایت شده توسط siRNA

برای از بین بردن ژن‌های خاص با واسطه تداخل RNA، از siRNA‌های زیر استفاده شد: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005)، siCullin1 (Qiagen، 1027423)، siSKP1 (Qiagen، SI00301819 (DharmaconGNT) SMARTpool L-003010-00-0005). به طور خلاصه، سلول‌های A549 که در یک صفحه چاهک رشد کرده‌اند، به‌طور موقت با siRNA‌های اختصاصی ژن یا اسکرامبل (siControl) (150 pmol) با استفاده از Lipofectamine 3000 طبق دستورالعمل‌های سازنده ترانسفکت شدند. سی و شش ساعت پس از ترانسفکشن، سلول‌ها برای وسترن بلات و ایمونوفلورسانس یا سنجش حفاظت پنی سیلین-جنتامایسین پردازش شدند.

پیش بینی و مدل سازی ساختار

همه ساختارها توسط AlphaFold (موتور تشخیص مشابهت/پروتئین V 2.0) (57) پیش‌بینی و با استفاده از PyMOL (سیستم گرافیک مولکولی PyMOL، نسخه 2.{4}} شرودینگر، LLC) تجسم شدند. ساختارها در PyMol بر اساس امتیازهای IUPred (54) از مرتب (آبی) تا بی نظم (قرمز) تا سفید کدگذاری شدند.

وسترن بلاتینگ

کشت‌های SPN رشد کرده تا {{0}}.4 OD600nm توسط فراصوت لیز شدند و عصاره‌های خام پس از سانتریفیوژ کردن (15،{4}} دور در دقیقه، 30 دقیقه، 4 درجه) جمع‌آوری شدند. برای A549، تک‌لایه‌ها چندین بار با PBS شسته شدند و در بافر (RIPA) [50 میلی‌مولار tris-Cl (pH 7.89)، 150 میلی‌مولار NaCl، 1 درصد Triton X{15}}، 0.5 درصد سدیم لیز شدند. دئوکسی کولات و 1 درصد SDS] حاوی کوکتل مهارکننده پروتئاز (Promega)، سدیم فلوراید (10 میلی‌مولار)، و EDTA (5 میلی‌مولار). سوسپانسیون سلولی برای مدت کوتاهی سونیک شده و سانتریفیوژ شد تا لیزات سلولی جمع آوری شود. پروتئین های موجود در لیزات سلولی باکتریایی یا A549 (10 یا 20 میکروگرم) روی ژل های 12 درصد SDS-PAGE جدا شده و به غشای پلی وینیلیدین دی فلوراید فعال شده منتقل شدند. پس از مسدود شدن در شیر بدون چربی 5 درصد، غشاها با آنتی بادی های ثانویه اولیه و برچسب HRP مناسب بررسی شدند. لکه ها در نهایت با استفاده از یک بستر افزایش یافته نورتابی شیمیایی (Bio-Rad) ساخته شدند.
سنجش حفاظتی پنی سیلین-جنتامایسین

سویه های SPN رشد کردند تا زمانی که OD600nm 0.4 در براث تاد هیویت تکمیل شده با 0}.۲ درصد عصاره مخمر (THY) گلوله شدند، مجدداً در PBS معلق شدند. pH 7.4)، و در محیط سنجش برای عفونت تک لایه‌های A549 با تعدد عفونت (MOI) 10 رقیق شد. ) و جنتامایسین (400 ug/ml) به مدت 2 ساعت برای از بین بردن SPN خارج سلولی. سپس سلول‌ها با 0.025 درصد Triton X{16}} لیز شدند و لیزات روی صفحات Brain Heart Infusion آگار قرار داده شد تا SPN زنده را شمارش کند. درصد تهاجم به صورت [واحدهای تشکیل دهنده کلنی (CFU) در لیزات/CFU مورد استفاده برای عفونت] × 100 محاسبه شد. برای ارزیابی بقای درون سلولی، در 9 ساعت پس از عفونت (از آغاز درمان با پنی سیلین-جنتامایسین)، لیزهای سلولی به عنوان تهیه شد. در بالا ذکر شد، و باکتری های پخش شده و باقیمانده شمارش شدند. بازده بقا (درصد) به عنوان یک تغییر برابری در درصد بقا نسبت به شاهد در نقطه زمانی مشخص شده (به 0 ساعت عادی شده) نشان داده شد.

ایمونوفلورسانس

برای سنجش ایمونوفلورسانس، سلول‌های A549 یا HeLa روی پوشش‌های شیشه‌ای رشد کردند و با سویه‌های SPN یا STm در MOI ~ 25 به مدت 1 ساعت و سپس درمان آنتی‌بیوتیکی به مدت 2 ساعت آلوده شدند. در نقاط زمانی مورد نظر پس از عفونت (9 ساعت برای عفونت SPN در A549s و 3 ساعت برای عفونت با STm در HeLa)، سلول‌ها با DMEM شسته شدند و با متانول سرد شده با یخ در درجه 2-2 به مدت 10 دقیقه ثابت شدند. علاوه بر این، ورقه های پوششی با 3 درصد آلبومین سرم گاوی (BSA) در PBS به مدت 2 ساعت در دمای اتاق (RT) مسدود شدند. سپس سلول ها با یک آنتی بادی اولیه مناسب در 1 درصد BSA در PBS در یک شب در دمای 4 درجه تیمار شدند، با PBS شسته شدند و با یک آنتی بادی ثانویه مناسب در 1 درصد BSA در PBS به مدت 1 ساعت در RT انکوبه شدند. در انتها، روکش‌ها با PBS شسته شدند و روی لغزش‌های شیشه‌ای به همراه VECTASHIELD با یا بدون 4،6-دیامیدینو-2-فنی‌لیندول (آزمایشگاه‌های برداری) برای تجسم با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری (LSM 780، Carl Zeiss) نصب شدند. ) زیر اهداف نفتی 40× یا 63×. تصاویر پس از برش نوری به دست آمد و سپس با استفاده از نرم افزار ZEN lite (نسخه 5.0) پردازش شد. میکروسکوپ فوق رزولوشن به طور مشابه با استفاده از Elyra 7 (Carl Zeiss) در حالت سیم کارت انجام شد. برای تجزیه و تحلیل colocalization، باکتری ها با شمارش بصری n> 100 باکتری در هر تکرار به ثمر رسید.

میکروسکوپ الکترونی عبوری

پس از عفونت با SPN و STm، سلول ها با بافر سدیم کاکودیلات 1.1 مولار، با 2.5 درصد گلوتارآلدئید (سیگما آلدریچ) در بافر 0}.1 مولار سدیم کاکودیلات شسته شدند. سیگما آلدریچ) به مدت 3 ساعت در 4 درجه. پس از تثبیت، سلول‌ها از طریق یک اسکراپر سلولی جمع‌آوری شدند و با سرعت 2{15}}00 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه پلت شدند. سپس سلولها با بافر 1/0 مولار سدیم کاکودیلات شسته و با تتروکسید اسمیم 1 درصد در بافر 1/0 مولار سدیم کاکودیلات به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه پس از تثبیت شدند. پس از شستشوی بعدی با بافر کاکودیلات و آب مقطر، سلول‌ها در غلظت‌های فزاینده اتانول (50، 70، 95 و 100 درصد) و پروپیلن اکسید به مدت 30 دقیقه آب‌گیری شدند و در نهایت در رزین اپوکسی جاسازی شدند (Electron Microscopy Sciences، 114300). پلیمریزاسیون در دمای 75 درجه به مدت 45 دقیقه. سپس کپسول ها به مدت 45 دقیقه به فر 95 درجه منتقل شدند. مقاطع بسیار نازک (70 نانومتر) با استفاده از یک چاقوی الماسی بر روی اولترامیکروتوم لایکا EM UC7 و رنگ آمیزی با 2 درصد استات اورانیل و 1 درصد سیترات سرب و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (Talos L120 C، Thermo Fisher Scientific) در ولتاژ 120 کیلو ولت مشاهده شدند.

Ubiquitination Ex vivo

A{0}بیان کننده BgaA-T و انواع آن با MG132 (5 میکرومولار) تیمار شدند و بیان پروتئین با داکسی سایکلین (100 میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 24 ساعت القا شد. سپس سلول ها در بافر RIPA لیز شدند و نمونه ها توسط SDS-PAGE (8 درصد) الکتروفورز شدند. تایید بیان پروتئین و یوبی کوئیتیناسیون BgaA-T و انواع آن با وسترن بلات به دنبال کاوش با آنتی بادی های ضد BgaA و آنتی-K{10}}Ub به ترتیب ثابت شد.

یوبی کوئیتیناسیون آزمایشگاهی

برای سنجش یوبی کوئیتیناسیون آزمایشگاهی، پروتئین های نوترکیب همانطور که قبلاً توضیح داده شد خالص شدند (58). کمپلکس لیگاز SCFFBW7 E3 با 0.1 میلی‌مولار E1 نوترکیب (UBE1؛ Boston Biochem)، 0.25 میلی‌مولار E2 (cdc34؛ Boston Biochem) و یوبیکوئیتین (2.5 ug/ml؛ بوستون) انکوبه شد. Biochem) در حضور BgaA-T خالص شده و انواع آن. واکنش‌های Ubiquitylation در بافر سنجش [5{21}} mM tris (pH 8)، 5 میلی‌مولار MgCl2، 5 میلی‌مولار آدنوزین تری فسفات (ATP)، 1 میلی‌مولار - مرکاپتواتانول و 0.1 درصد توئین 20] به مدت 2 ساعت در دمای 25 درجه انجام شد. . واکنش‌ها با بافر 5× Laemmli متوقف شدند، روی ژل‌های SDS-PAGE حل و فصل شدند و با استفاده از آنتی‌بادی ضد BgaA با ایمونوبلات تجزیه و تحلیل شدند.

سنجش کیناز آزمایشگاهی

برای انجام سنجش in vitro کیناز، از سیستم آنزیم کیناز GSK3 (Promega) طبق پروتکل سازنده با تغییرات زیر استفاده شد. به طور خلاصه، 3 میکروگرم از BgaA-T نوترکیب به 0.5 میکروگرم GSK3 فعال با 400 میکرومولار ATP در بافر واکنش متشکل از 40 میلی‌مولار tris، (pH 7.5)، 20 میلی‌مولار MgCl2 اضافه شد. ، BSA (0.1 میلی گرم در میلی لیتر) و 50 میکرومولار دی تیوتریتول. واکنش به مدت 2 ساعت در دمای 30 درجه انکوبه شد و با افزودن بافر 1× Laemmli متوقف شد. سپس نمونه ها جوشانده و برای وسترن بلاتینگ الکتروفورز شدند، همانطور که قبلا ذکر شد. BgaA-T فسفریله شده با آنتی بادی ضد فسفوترئونین شناسایی شد.

مدل in vivo

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 درصد وزن اولیه بدن و ترشحات شدید بینی یا چشمی. نمونه خون با سوراخ قلب و تحت بیهوشی نهایی گرفته شد و طحال پس از مرگ برای شمارش باکتری ها برداشته شد. نمونه‌های بافت با یک هموژنایزر بافت دستی پردازش شدند و هموژن‌ها به‌طور سریالی در PBS رقیق شدند قبل از لکه‌گیری روی صفحات خون آگار. پلیت ها یک شبه در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 انکوبه شدند و تعداد کلنی های باکتری روز بعد بررسی شد.

تحلیل آماری

برای تجزیه و تحلیل آماری از GraphPad Prism نسخه 5 استفاده شد. آزمایش های آماری انجام شده برای آزمایش های فردی در افسانه های شکل مربوطه ذکر شده است. P < 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد. داده ها برای نرمال بودن و برای تعریف واریانس هر گروه مورد آزمایش قرار گرفتند. همه آنالیزهای چند پارامتری شامل اصلاحاتی برای مقایسه‌های چندگانه بودند و داده‌ها به صورت میانگین ± SD ارائه می‌شوند، مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد.

مراجع و یادداشت ها

ME Bianchi، DAMPs، PAMPs و alarmins: همه چیزهایی که باید در مورد خطر بدانیم. J. Leukoc. Biol. 81، 1-5 (2007).

2. TH Mogensen، تشخیص پاتوژن و سیگنال دهی التهابی در دفاع های ایمنی ذاتی. کلین میکروبیول. Rev. 22, 240-273 (2009).

3. K. Ray، B. Marteyn، PJ Sansonetti، CM Tang، زندگی در درون: شیوه زندگی درون سلولی باکتری های سیتوزولی. نات Rev. Microbiol. 7, 333-340 (2009).

4. X. Jiang، ZJ Chen، نقش ubiquitylation در دفاع ایمنی و فرار پاتوژن. نات کشیش ایمونول. 12، 35-48 (2011).

5. V. Vozandychova، P. Stojkova، K. Hercik، P. Rehulka، J. Stulik، سیستم ubiquitination در تعاملات باکتریایی میزبان و پاتوژن. Microorganisms 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin، T. Bionda، I. Dikic، C. Behrends، تجزیه و تحلیل جهانی میزبان و باکتری یوبیکوئیتینوم در پاسخ به عفونت سالمونلا تیفی موریوم. مول. سلول 62، 967-981 (2016).

7. Q. Chai، X. Wang، L. Qiang، Y. Zhang، P. Ge، Z. Lu، Y. Zhong، B. Li، J. Wang، L. Zhang، D. Zhou، W. Li، W. Dong، Y. Pang، GF Gao، CH Liu، یک پروتئین سطحی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، یوبیکوئیتین را برای تحریک بیگانه‌خواری میزبان استخدام می‌کند. نات اشتراک. 10، 1973 (2019).

8. EG Otten، E. Werner، A. Crespillo-Casado، KB Boyle، V. Dharamdasani، C. Pathe، B. Santhanam، F. Randow، Ubiquitylation لیپوپلی ساکارید توسط RNF213 در طول عفونت باکتریایی. Nature 594, 111-116 (2021).

9. A. Yamada، M. Hikichi، T. Nozawa، I. Nakagawa، کمپلکس یوبیکوئیتین لیگاز FBXO2/SCF از طریق شناسایی گلیکان سطح باکتری، بیگانه‌خواری را هدایت می‌کند. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom، TP Burke، CJ Tran، AT Iavarone، MD Welch، متیلاسیون لیزین از یک پاتوژن داخل سلولی در برابر ubiquitylation و autophagy محافظت می کند. علمی Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli، LRSAM1، E3 یوبیکوئیتین لیگاز با حس باکتری. سلول میزبان میکروب 12، 735-736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, The Ubiquitin Ligase Smurf1 در اتوفاژی انتخابی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و دفاع میزبان ضد سل عمل می کند. سلول میزبان میکروب 21، 59-72 (2017).

13. J. Noad، A. von der Malsburg، C. Pathe، MA Michel، D. Komander، F. Randow، زنجیره های یوبیکوئیتین خطی سنتز شده LUBAC باکتری های مهاجم سیتوزول را با فعال کردن اتوفاژی و NF-kB محدود می کنند. نات میکروبیول. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo، JS Ayres، RO Watson، AC Collins، G. Souza، CS Rae، DS Schneider، K. Nakamura، MU Shiloh، JS Cox، پارکین لیگاز یوبیکوئیتین واسطه مقاومت در برابر پاتوژن های داخل سلولی است. Nature 501, 512-516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18، 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com