یک واکسن MRNA پاسخ های ایمنی ضد توموری وابسته به STING را ایجاد می کند

خلاصه

واکسن های RNA فرموله شده با لیپید به طور گسترده برای پیشگیری و درمان بیماری استفاده شده اند، اما مکانیسم اثر آنها و اجزای فردی که در چنین اقداماتی نقش دارند هنوز مشخص نشده اند. در اینجا، ما نشان می‌دهیم که یک واکسن درمانی سرطان متشکل از یک هسته پروتامین/mRNA و یک پوسته لیپیدی در ارتقای پاسخ‌های سلول‌های CD8þ T سیتوتوکسیک و میانجی‌گری ایمنی ضد تومور بسیار قوی است. از نظر مکانیکی، هم هسته mRNA و هم پوسته لیپیدی برای تحریک کامل بیان اینترفرون‌های نوع I و سیتوکین‌های التهابی در سلول‌های دندریتیک مورد نیاز است. تحریک بیان اینترفرون-b منحصراً به STING بستگی دارد و فعالیت ضد توموری واکسن mRNA به طور قابل توجهی در موش‌های دارای ژن Sting معیوب به خطر افتاده است. بنابراین، واکسن mRNA ایمنی ضد توموری وابسته به STING را ایجاد می کند.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

1. معرفی

توسعه سریع و کاربرد جهانی واکسن‌های mRNA برای پیشگیری از عفونت SARS-CoV{1}} قدرت داروهای مبتنی بر mRNA را در مراقبت‌های بهداشتی نشان داده است. به دلیل وزن مولکولی زیاد و بار منفی، مولکول‌های mRNA باید در وسایل نقلیه تحویل بسته‌بندی شوند تا به طور موثر وارد سلول‌های پستانداران شوند. بسته بندی در وسایل نقلیه تحویل نانومتری نیز از مزایای محافظت از مولکول های mRNA در برابر تخریب آنزیمی برخوردار است. پلتفرم‌های تحویل چندگانه برای مناسب با هدف ایجاد شده‌اند، مانند نانوذرات لیپیدی، لیپو پلی‌پلکس (LPP)5، لیپوزوم-پروتامین-RNA (LPR)6، RNA لیپوپلکس (RNA-LPX)7، و ذرات واکسن شبیه ویروس (VLVP). ) 8. در حالی که هر پلت فرم ساختار و ترکیب منحصر به فرد خود را دارد، اکثر وسایل نقلیه حاوی یک مولکول لیپیدی یونی هستند که بسته‌بندی mRNA و فرار مولکول‌های mRNA از اندوزوم‌ها را تسهیل می‌کند. با موفقیت واکسن‌های پیشگیرانه، یک درک کلی وجود دارد که می‌توان از درمان‌های mRNA برای درمان شاید بیشتر یا نه همه انواع بیماری‌ها استفاده کرد. در واقع، واکسن‌های سرطان درمانی مبتنی بر mRNA سال‌ها مورد مطالعه قرار گرفته‌اند. پیشرفت‌های اخیر در کارآزمایی‌های بالینی نیز پتانسیل کاربرد آن‌ها را در بیماران سرطانی منتخب نشان داده است. برخلاف واکسن‌های سرطان پپتیدی که با مولکول‌های کمکی 18e20 تهیه می‌شوند، ذرات واکسن mRNA می‌توانند به عنوان خود کمکی نیز عمل کنند.

به عنوان مثال، یک واکسن سرطان مبتنی بر mRNA دو جزئی حاوی mRNA آزاد و کمپلکس پروتامین نیز می تواند سیگنال گیرنده 7 (TLR7) را فعال کند. با این حال، با افزایش نگرانی در مورد سمیت حاد ایمنی ذاتی از mRNA برهنه، اکثر محققان و شرکت‌ها از RNA اصلاح شده برای جلوگیری از شناسایی ذاتی توسط TLRs23 استفاده می‌کنند. در نتیجه، اجزای لیپیدی نقش مهمی را در افزایش فعالیت کمکی در ذره واکسن mRNA، ترجیحاً با فعال کردن سیگنال‌دهی غیر TLR ایفا می‌کنند. یک مطالعه اخیر روی RNA-LPX با فرمول لیپیدی و دارای بار منفی شامل 1،2- دی-اکتادسنیل{13}}تری متیل آمونیوم (DOTMA، یک لیپید کاتیونی)/دیولئویل فسفاتیدیل اتانول آمین (DOPE، یک لیپوزوم کمکی آشکار) فعال سازی محور آنتاگونیست گیرنده اینترلوکین 1 (IL1) - اینترلوکین 1 (IL{18}}ra) در تنظیم ترشح سیتوکین های پیش التهابی و نقش اساسی فعال کردن مسیر التهابی دو مرحله ای در مونوسیت ها24. جالب توجه است که تحقیقات اخیر دیگری در مورد BNT162b2 مبتنی بر LNP تهیه شده با ALC{24}} (یک لیپید یونیزه)، 1،2-دی استئاروئیل-sn-گلیسرو{29}}فسفوکولین (DSPC، یک لیپید کمکی) پلی اتیلن گلیکول{30}}N، N-di تترادسیل استامید (PEG{32}}DTA) و کلسترول نقش کلیدی فعال کردن سیگنالینگ MDA5 وابسته به اینترفرون نوع I را نشان دادند، اما نه TLRs یا التهابی را در تحریک هر دو نشان دادند. ایمنی ذاتی و تطبیقی ​​واکسن کووید-1925. این مطالعات به این امکان اشاره می‌کند که پلتفرم‌های تحویل متشکل از مولکول‌های لیپیدی متغیر ممکن است به مسیرهای انتقال سیگنال مختلف برای فعالیت واکسن متکی باشند. بنابراین، بررسی کامل عملکرد مولکول های کلیدی و ترکیبات آنها به منظور بهبود بیشتر درمان mRNA مهم است.

در مطالعه حاضر، آزمایش‌هایی را برای تشریح نقش عملکردی اجزای فردی در یک واکسن درمانی سرطان تنظیم کردیم. ذره واکسن mRNA (MVP) از یک هسته پروتامین/mRNA تشکیل شده است که در یک پوسته لیپیدی متشکل از یک لیپید کاتیونی، یک لیپید کمکی، یک لیپید پگیله شده و کلسترول محصور شده است (شکل 1A). نشان داده شده است که گنجاندن لیپید باردار می تواند تحویل RNA هدفمند را تسهیل کند26، و دیولئویل اتیل فسفاتیدیل کولین (EDOPC) و دیولئویل{2}} تری متیل آمونیوم پروپان (DOTAP) دو لیپید کاتیونی هستند که برای این منظور آزمایش شده اند. ما تحریک بیان اینترفرون-b (IFN-b)، IL{7}}b، و فاکتور نکروز تومور-a (TNF-a) را توسط هسته mRNA، وسیله نقلیه بدون mRNA و کل MVP بررسی کردیم، و چنین فعالیت‌هایی با TLR7، سیگنال‌دهی ضد ویروسی میتوکندری (MAVS، همچنین به عنوان IPS{12}})، محرک ژن‌های IFN (STING) و آداپتور حاوی دامنه TIR که القاکننده سیگنال‌های IFN-b (TRIF) است، مرتبط است. پس از آن، نقش پروتامین در هسته و لیپید کاتیونی در پوسته را در تحریک بیان IFN-b و TNF-a بررسی کردیم. در نهایت، ما پاسخ‌های ایمنی ضد توموری از MVP را در موش‌های نوع وحشی و ژنتیکی مقایسه کردیم.

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

2. مواد و روشها

2.1. مواد

1،2-دیولئویل-sn-گلیسررو{4}}اتیل فسفوکولین (EDOPC) (890704)، 1،2-دیولئویل-sn-گلیسررو{10}}فسفاتیدیل-اتانول آمین (DOPE) (850725) )، 1،2-دی استئاروئیل-sn-گلیسررو-3-فسفواتانولامین-N- [آمینو(پلی اتیلن گلیکول){20}} (DSPE-PEG2k) (880128)، 1،{25}} دیولئویل{26}}تری متیل آمونیوم-پروپان (DOTAP) (890890)، 1،{30}} دیولئویل-sn-گلیسررو{33}}فسفوکولین (DOPC) (850375) از Avanti Polar Lipids, Inc. بیرمنگام، AL، ایالات متحده آمریکا). کلسترول (C{35}}) از سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. معرف ها در اتانول با غلظت 2 میلی گرم در میلی لیتر برای DSPE-PEG2k، 10 میلی گرم در میلی لیتر برای کلسترول و DOPC و 20 میلی گرم در میلی لیتر برای EDOPC، DOPE و DOTAP به ترتیب در اتانول حل شدند. سولفات پروتامین (P4020) از سیگما آلدریچ به دست آمد. مولکول های mRNA کد کننده اووالبومین (OVA-mRNA) (L-7210)، eGFP (eGFP mRNA) (L-7201) و لوسیفراز (Luc-mRNA) (L-7204) از TriLink Biotechnologies (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا). آب بدون RNase (W{49}}) از GeneDEPOT (Baker، TX، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. آگونیست TLR7 imiquimod (tlrimq) و آگونیست Sting 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) محصولاتی از Invivogen (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) بودند. Lipofectamine 2000 (11668019) و کیت سنجش RNA Quant-iT RiboGreen™ (R11490) از Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) خریداری شد. موش نوترکیب GM-CSF (554586) از BD Biosciences (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. کوکتل 500 Protein transporter inhibitor (00-4980-93) محصولی از Invitrogen بود. کیت Cytofix/Cytoperm (AB_2869010) از BD Biosciences خریداری شد. کیت جداسازی سلول T ماوس EasySep (19851) از شرکت STEMCELL Technologies (ونکوور، BC، CAN) تهیه شد. آنتی بادی های زیر از BioLegend (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد: anti-CD80-PE-Cy7 (104734)، anti-CD{70}}FITC (105006)، anti-CD11b-APC- Cy7 (101226)، anti-CD8-BV510 (100752)، anti-CD{83}}APC (103012)، anti-CD69-APC (104514) و anti-H{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604)، anti-CD64- PE-Cy7 (139314)، anti-B220-APC (103212)، anti-MHCII-BV711 (107643)، و ضد CD{105}}PE (121406). Anti-CD{108}}FITC (553723)، anti-LY6C-AF700 (557979) و anti-IFN-g-PE (554412) از BD Biosciences بودند. OVA257e{120}}MHCI dextramerPE (JD2163) از ImmuDex (Fairfax، VA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. کیت های الایزا برای IL{122}}b (EM2IL1B) و TNF-a (BMS{126}}) از Invitrogen خریداری شدند، و کیت های ELISA برای CCL5 (DY478) و IFN-b (DY8234) از R&D Systems تهیه شدند. ، شرکت (مینیاپولیس، MN، ایالات متحده آمریکا). آنتی بادی ها برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات شامل anti-MAVS (4983)، anti-STING (13647)، anti-TBK1 (3504)، antiphospho-TBK1 (5483)، anti-b-actin (4970) و anti-GAPDH (5174) از Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) خریداری شدند.

شکل 1 تهیه و شناسایی ذرات mRNA. (الف) نمای شماتیک آماده سازی ذرات واکسن. (ب) الکتروفورز ژل آگارز نشان می دهد که مولکول های mRNA در چاه بارگذاری نمونه در نمونه های تهیه شده با mRNA/پروتامین در نسبت 1:1 تا 1:2 حفظ شده اند. (CeF) خصوصیات ذرات واکسن mRNA (MVPs) بر اساس درصد کپسولاسیون، شاخص پراکندگی چندگانه، پتانسیل زتا و اندازه. (G) تصاویر TEM نماینده ذرات MVP2، نوار مقیاس Z 50 نانومتر. (H) درصد بیان eGFP پس از سلول های DC2.4 با eGFP-MVPs به مدت 16 ساعت درمان شدند. (I) تصویربرداری فلورسنت از سلول‌های DC2.4 بیانگر eGFP، نوار مقیاس Z 4{25}}0 میلی‌متر. (J) تجزیه و تحلیل کمی بر روی بیولومینسانس در BMDCهای تیمار شده با MVPهای محصور شده با mRNA کدکننده لوسیفراز به مدت 16 ساعت. (K) تغییرات در قابلیت زنده ماندن BMDCهای تیمار شده با PBS، وسیله نقلیه بدون mRNA، هسته mRNA/پروتامین، یا MVP2 محصور شده با mRNA. غلظت تیمار معادل mRNA بود. داده ها به صورت میانگین SEM (nZ 3) ارائه می شوند. *P <0.05; ** P < 0.01.

2.2. خطوط سلولی و کشت سلولی

رده سلولی دندریتیک موش DC2.4 از ATCC (ماناساس، VA، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد و در RPMI{2}} حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (FBS) و 1 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین کشت داده شد. رده سلولی ملانوم موش B16-OVA از دکتر کنت راک، موسسه سرطان دانا-فاربر (بوستون، MA، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. سلول های B{8}OVA در DMEM حاوی 10% FBS و 1% پنی سیلین-استرپتومایسین کشت داده شدند. رده سلولی آدنوکارسینوم کولون موش MC38 از ATCC خریداری شد. سلول ها با بیان OVA مهندسی شدند و در DMEM با 10% FBS و 1% پنی سیلین-استرپتومایسین کشت داده شدند. کشت سلولی در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 درصد CO2 نگهداری شد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

2.3. آماده سازی ذرات واکسن mRNA

تمام ذرات واکسن mRNA با استفاده از ابزار میکروسیال NanoAssemblr Benchtop از شرکت Precision Nanosystems (Vancouver، BC، CAN) با مخلوط کردن فاز آلی و فاز آبی تهیه شدند. برای تهیه فاز آلی، EDOPC (20 میلی گرم در میلی لیتر)، DOPE (20 میلی گرم در میلی لیتر)، کلسترول (10 میلی گرم در میلی لیتر)، و bis-DSPE-PEG2k (2 میلی گرم در میلی لیتر) در اتانول حل و در 34 مخلوط شدند. نسبت :30:35:1 M با سرعت جریان 9 میلی لیتر در دقیقه. برای تهیه هسته mRNA فاز آبی، mRNA با سولفات پروتامین در 1:1 (وزنی/وزنی) در ابزار میکروسیالی با سرعت جریان 9 میلی لیتر در دقیقه مخلوط شد. پس از 20 دقیقه انکوباسیون در دمای 20 درجه سانتیگراد، هسته mRNA فاز آبی با فاز آلی مخلوط شد تا ذرات واکسن mRNA تولید شود. پس از 20 دقیقه، سوسپانسیون ذرات واکسن به یک فیلتر فوق گریز از مرکز Amicon (MWCO 30 کیلو دالتون) منتقل شد و {19}}آب با درجه مولکولی حجمی به غلظت اتانول رقیق از 25٪ به 2.5٪ اضافه شد. سپس سوسپانسیون ذرات با سانتریفیوژ در 2000 گرم (Multifuge X4، Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، USA) در دمای 4 درجه سانتیگراد تغلیظ شد. حجم مساوی 2 PBS به محصول غلیظ شده اضافه شد تا فشار اسمزی تنظیم شود.

2.4. سنجش عقب ماندگی ژل

هسته mRNA / پروتامین ابتدا با تاخیر ژل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. به طور خلاصه، هسته mRNA/پروتامین حاوی 0.5 میلی‌گرم mRNA در چاه ژل آگارز 1 درصد در محلول 1 TBE بارگذاری شد و الکتروفورز در ولتاژ 120 ولت به مدت 30 دقیقه انجام شد (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). نوارهای RNA با Gelred (Biotium، Hayward، CA) رنگ آمیزی شدند و با یک سیستم GelDoc (Gel Doc XRþ، BioRad Co., Ltd.) شناسایی شدند.

2.5. خصوصیات ذرات واکسن mRNA

توزیع اندازه و پتانسیل زتا با Zetasizer پراکندگی نور پویا (Zetasizer Nano، Malvern Pananalytical، Inc.، Westborough، MA، USA) اندازه‌گیری شد. میزان کپسولاسیون با استفاده از کیت سنجش RNA Quant-iT RiboGreen™ تعیین شد. به طور خلاصه، یک نمونه ذرات واکسن حاوی 0.5 میلی‌گرم mRNA با یک بافر TriseEDTA (10 میلی مول در لیتر TriseHCl، 1 میلی مول در لیتر EDTA، pH 7.5) با یا بدون 2 درصد Triton-X100 در {{101} رقیق شد. {10}}صفحه چاه. پس از 10 دقیقه انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد، RiboGreen به هر چاهک اضافه شد و شدت فلورسنت اندازه گیری شد. راندمان کپسولاسیون همانطور که در معادله نشان داده شده محاسبه شد. (1): میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) ذرات واکسن به دنبال روشی که قبلاً شرح داده شد انجام شد.

2.6. حیوانات

تمام عملیات حیوانات توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات بیمارستان متدیست هیوستون (شماره پروتکل AUP06200042) تایید شد. موش ها در محیطی قرار گرفتند که کاملاً استانداردهای نظارتی مؤسسه ملی بهداشت و انجمن آمریکایی مراقبت از حیوانات آزمایشگاهی را برآورده می کرد. موش های نوع وحشی C57BL/6J و موش های دستکاری شده ژنتیکی شامل موش های Tlr7 /، Sting /، Mavs /، و Trif / از آزمایشگاه جکسون خریداری شدند.

2.7. تولید سلول های دندریتیک مشتق از مغز استخوان موش (BMDCs)

سلول های مغز استخوان از استخوان ران و درشت نی با RPMI 1640 کامل خارج شدند. گلبول های قرمز با یک بافر لیز ACK لیز شدند و سلول های مغز استخوان نابالغ در RPMI 1640 همراه با 20 نانوگرم در میلی لیتر GM-CSF موشی نوترکیب به مدت 10 کشت داده شدند. روز در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5٪ CO2. محیط کشت سلولی در روزهای 3، 6 و 8 تجدید شد و سلول‌های دندریتیک غیرچسبنده در روز 10 جمع‌آوری شدند.

2.8. اندازه گیری سیتوکین ها و کموکاین ها

BMDCها در یک صفحه چاهک 24- با تراکم 5  105 سلول در چاه کاشته شدند. پس از 1 ساعت نشست، سلول‌ها با 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر ایمیکیمود، 20 میلی‌گرم در میلی‌لیتر 20 30 -cGAMP، (معادل 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر mRNA) ذرات واکسن یا گروه شاهد تیمار شدند. محیط کشت سلولی 24 ساعت بعد جمع‌آوری شد و سطوح TNF-a، CCL5، IFN-b و IL{11}}b با استفاده از کیت‌های سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) با پیروی از روش‌های پیشنهادی سازنده اندازه‌گیری شد.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

2.9. تجزیه و تحلیل ترانسفکشن DC، بلوغ DC و تحریک

برای تجزیه و تحلیل کارایی ترانسفکشن DC در شرایط آزمایشگاهی، سلول‌های DC2.4 در 2.{3}} سلول/چاه در یک صفحه چاهک کاشته شدند. سلول ها با ذرات محصور شده با mRNA کد کننده eGFP یا لوسیفراز در غلظت نهایی 1 میلی گرم mRNA/ml تیمار شدند. سلول ها 24 ساعت بعد برداشت شدند، با 2% FBS در محلول PBS شسته شدند و سپس در همان محلول مجدداً معلق شدند قبل از اینکه برای آنالیز فلوسیتومتری با فلوسایتومتر BD LSR II (LSR II، BD Biosciences، San Jose، CA) استفاده شوند. . برای اندازه‌گیری بلوغ DC و ارائه آنتی‌ژن در شرایط آزمایشگاهی، BMDCها در 2.{12}} سلول/چاه در یک صفحه چاهک کاشته شدند و با 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر OVA-MVP به مدت 24 ساعت تیمار شدند. BMDCها به مدت 30 دقیقه با آنتی بادی‌های اختصاصی برای CD11c، MHC I، MHC II، CD40، CD80، و CD{21}} برای بلوغ DC، و آنتی‌H{23}}Kb (SIINFEKL) برای ارائه آنتی‌ژن رنگ‌آمیزی شدند. برای تعیین قدرت تحریک در داخل بدن، موش‌های C57BL/6J یک بار با 10 میلی‌گرم OVA-MVP به ازای هر موش در کف پا واکسینه شدند و LN‌های پوپلیتئال تخلیه‌کننده 24، 48 و نشانگرهای سطح سلولی زیر برداشت شدند: CD11c، MHC I، CD11b، B220. , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD{37}}.

2.10. آنالیز فلوسیتومتری بر روی فعال سازی و تکثیر سلول های T

برای اندازه گیری فعال سازی سلول های T در داخل بدن، موش ها یک بار با 10 میلی گرم OVA-MVP واکسینه شدند و LN های پوپلیتئال در 24 یا 48 ساعت جدا شدند. سلول های T با آنتی بادی های زیر رنگ آمیزی شدند: CD45، CD3، CD4، CD8 و CD69. برای شناسایی سلول‌های T اختصاصی آنتی‌ژن، تومورها، طحال و غدد لنفاوی پوپلیتئال 5 روز پس از واکسیناسیون دوم برداشت شدند. بافت‌ها برای تولید سوسپانسیون‌های تک سلولی پردازش شدند و سلول‌ها با آنتی‌بادی‌های اختصاصی سلول T و دکسترامر OVA257e264-MHCI رنگ‌آمیزی شدند. برای اندازه‌گیری سطح IFN-g داخل سلولی، 2  106 سلول‌های طحال یا سلول‌های جدا شده از LNs و تومورهای پوپلیتئال با 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر پپتید OVA257e264 در محیط کامل RPMI 1640 همراه با 55 میلی‌مول در لیتر b-mercaptoethanol inbitor protein و 1 پروتئین انتقال‌دهنده تحریک شدند. کوکتل به مدت 18 ساعت سلول ها برداشت و با آنتی بادی های اختصاصی سلول T رنگ آمیزی شدند. پس از تثبیت و نفوذپذیری با کیت Cytofix/Cytoperm، سلول ها با آنتی بادی anti-IFN-g رنگ آمیزی شدند و برای تجزیه و تحلیل بر روی فلوسایتومتر BD LSR II (BD Biosciences) استفاده شد. برای اندازه‌گیری تکثیر سلول‌های T، سلول‌های T از طحال موش‌های تراریخته OT-I با استفاده از کیت جداسازی سلول‌های T موش جدا شدند. آنها با 1 میلی مول در لیتر CFSE در RPMI 1640 حاوی 200 میلی گرم در میلی لیتر BSA به مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد رنگ آمیزی شدند. سلول های T نشاندار شده با CFSE دو بار با 5 حجم RPMI 1640 سرد کامل شستشو شدند. 2 میلی گرم بر میلی لیتر OVA MVP کپسوله شده با mRNA به مدت 24 ساعت قبل از جداسازی سلول T. هنگامی که سلول های T آماده شدند، سلول های BMDC و T در نسبت 1:5 (DC: T) به مدت 72 ساعت با هم کشت شدند. سلول ها جمع آوری و با آنتی بادی های سطحی برای سلول های T رنگ آمیزی شدند، تکثیر با استفاده از فلوسایتومتر BD LSR II (BD Biosciences) مورد آزمایش قرار گرفت و آنالیز شد. تمام نتایج فلوسایتومتری با نرم افزار FlowJo v10 (اشلند، OH، ایالات متحده آمریکا) آنالیز شد.

2.11. ردیابی بیان پروتئین در موش های زنده

موش‌های BALB/c با تزریق داخل پد پا با 10 میلی‌گرم MVP کپسوله‌شده با mRNA Luc تحت درمان قرار گرفتند. 6، 12، 24 یا 48 ساعت بعد به آنها 30 میلی گرم RediJect D-luciferin داخل صفاقی به هر موش تزریق شد و بیولومینسانس با سیستم تصویربرداری Xenogen IVIS اندازه‌گیری شد (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA، ایالات متحده آمریکا).

2.12. سنجش ELISpot

صفحات فیلتر IP از قبل با 5{19}} میلی‌لیتر اتانول 35 درصد شستشو داده شدند و قبل از تبخیر اتانول، 3 بار با PBS شسته شدند. صفحات متعاقبا با آنتی بادی های جذب ضد IFN-g در دمای 4 درجه سانتیگراد یک شبه پوشانده شدند. پلیت ها با محیط کامل RPMI 1640 حاوی 55 میلی مول در لیتر b-mercaptoethanol به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد مسدود شدند. سلول ها ({12}} طحال، 1  105 سلول از LN پوپلیتئال) در هر چاهک کاشته شدند، و به مدت 36 ساعت با 10 میلی گرم در میلی لیتر پپتید OVA257e264 تحریک شد. محیط ها دور ریخته شدند و سلول ها 4 بار با PBST (PBS حاوی 0.05% Tween 20) و دو بار با PBS شسته شدند. پس از شستشوی نهایی، یک آنتی بادی تشخیص ضد IFN-g اضافه شد و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد. صفحات 4 بار با PBST و دو بار با PBS شسته شدند و آویدین-HRP اضافه شد و به مدت 45 دقیقه دیگر در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد. در نهایت، صفحات دوباره با PBST و PBS همانطور که در بالا توضیح داده شد، شسته شدند و 50 میلی لیتر از بستر AEC اعمال شد و برای واکنش نقطه ای تحت نظر قرار گرفت. هنگامی که لکه ها قابل مشاهده شدند، واکنش با دور ریختن بستر AEC و شستشوی آن با آب دوبار مقطر 5 بار متوقف شد. پس از خشک شدن در هوا در طول شب، صفحات اسکن شدند و با استفاده از CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa{32}}, CTL Inc., Cleveland, OH, USA) آنالیز شدند.

2.13. تجزیه و تحلیل وسترن بلات

BMDC های مشتق شده از موش های نوع وحشی، Mavs KO یا Sting KO جمع آوری شدند و سلول ها در بافر لیز سلولی RIPA تکمیل شده با مهارکننده های پروتئاز و فسفاتاز لیز شدند. غلظت پروتئین در لیز سلولی با کیت سنجش پروتئین BCA اندازه گیری شد. نمونه های پروتئین با الکتروفورز ژل دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) جدا و به غشای پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) منتقل شدند. بیان MAVS و STING پس از انکوبه شدن غشاء با آنتی بادی ضد MAVS یا ضد STING در رقت 1:2000 و به دنبال آن تشخیص ایمنی با SuperSignal West Pico و زیرلایه Femto Chemiluminescent شناسایی شد. برای اندازه‌گیری فعال‌سازی مسیر STING، BMDC‌های مشتق‌شده از موش‌های نوع وحشی با MVP محصور شده با mRNA حاوی وسیله نقلیه یا OVA در غلظت مشخص‌شده به مدت ۲ ساعت تحت درمان قرار گرفتند. سلول ها لیز شدند و برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات با آنتی بادی های anti-TBK1 و antiphospho-TBK1 در رقت 1:2000 اقدام کردند.

2.14. سنجش ضد تومور

مدل‌های تومور موش با تلقیح سلول‌های 2  105 B16-سلول‌های ملانوم OVA یا سلول‌های 5  105 MC38-OVA در هر موش به صورت زیر جلدی در سمت چپ 6 تا {{5} ایجاد شدند. }موش ماده یک هفته ای C57BL/6J. موش‌ها به‌طور تصادفی به گروه‌های درمانی تقسیم شدند و دو بار به مدت 7 روز با 10 میلی‌گرم OVA MVP یا گروه کنترل در بالشتک تحت درمان قرار گرفتند. رشد تومور هر 2 روز یکبار بررسی شد. حجم تومور با توجه به معادله محاسبه شد. (2):

موش‌ها 5 روز پس از واکسیناسیون دوم کشته شدند و وزن بافت‌های تومور ثبت شد.

2.15. تحلیل آماری

تمام نتایج به صورت میانگین SEM ارائه شده است. آمار با آزمون ANOVA یک طرفه با استفاده از تصحیح توکی برای مقایسه چند گروهی و آزمون t دو دنباله بدون جفت برای مقایسه دو گروهی مورد ارزیابی قرار گرفت. داده ها با نرم افزار GraphPad Prism v8.0.2 تجزیه و تحلیل شد. P < 0.{{10}}5 از نظر آماری معنادار در نظر گرفته شد (*P < 0.05؛ **P <0.01; ***P <0.005؛ ****P <0.001).

3. نتایج

3.1. MVP بیان قوی mRNA را در سلول های دندریتیک (DC) واسطه می کند.

ما ذرات واکسن هسته پوسته را در یک رویکرد میکروسیال دو مرحله ای آماده کردیم (شکل 1A)، و به طور سیستماتیک اجزای منفرد در نانوذره را برای جمع آوری یک ذره واکسن با پایداری بالا، جذب سلولی بالا و پتانسیل بیان بالا در DCها ارزیابی کردیم. الکتروفورز ژل نشان داد که زمانی که نسبت mRNA به پروتامین 1 یا کمتر باشد، یک هسته mRNA پایدار می تواند تشکیل شود (شکل 1B). با استفاده از mRNA رمزگذاری کننده eGFP به عنوان نشانگر جایگزین، متوجه شدیم که ترکیب لیپیدی با نسبت مولی 34% EDOPC/30% DOPE/35% کلسترول/1% DSPEPEG2k نرخ کپسولاسیون ایده‌آل و بهترین بازده بیان را ارائه می‌کند (جدول 1, اطلاعات پشتیبان شکل S1AeS1D). تغییر نسبت بار به طور قابل توجهی نرخ کپسولاسیون، شاخص پراکندگی چندگانه یا بار سطحی ذرات را تغییر نداد (جدول 2، شکل 1CeE). با این حال، اندازه ذرات حاصل بین 70 تا 80 نانومتر در قطر بود، زمانی که نسبت بین 12 و 16 بود، در مقایسه با قطر 120e130 نانومتر زمانی که نسبت از محدوده خارج شد (شکل 1F و G). بهترین بیان در سلول های DC2.4 تیمار شده با MVP2 که دارای نسبت بار 12 بودند شناسایی شد (شکل 1H و I). یک الگوی مشابه زمانی مشاهده شد که ذرات با mRNA کدکننده لوسیفراز تهیه شدند و بیان وابسته به دوز تشخیص داده شد (شکل 1J). ذرات محصور شده با mRNA پایداری مطلوبی از خود نشان دادند زیرا پس از لیوفیلیزاسیون یا انجماد-ذوب فعالیت خود را از دست ندادند (شکل S1E و S1F). علاوه بر این، هیچ سمیت سلولی پس از درمان سلول‌های دندریتیک مشتق از مغز استخوان (BMDCs) با هسته mRNA به تنهایی، یک ذره حامل بدون مولکول‌های mRNA، یا MVP2 حاوی mRNA (شکل 1K) وجود نداشت. بنابراین، MVP2 بهترین پتانسیل بیان را نشان داد. برای تمام آزمایش‌های بعدی در مطالعه استفاده شد و در بقیه متن به عنوان MVP برچسب‌گذاری شد. ذرات MVP می توانند به طور موثر مولکول های mRNA را در داخل بدن تحویل دهند، و هیچ سمیت قابل تشخیصی از MVP محصور در mRNA بر اساس تغییرات وزن بدن وجود نداشت (شکل S1GeS1I).

3.2. MVP به طور موثر ارائه آنتی ژن و فعال سازی سلول های T را در شرایط in vitro و in vivo القا می کند

ما هسته mRNA، وسیله نقلیه بدون mRNA و OVA mRNA کپسوله شده MVP را آماده کردیم و از آنها برای آزمایش بلوغ DC و ارائه آنتی ژن استفاده کردیم (شکل 2A). BMDCهای درمان شده با MVP بیانگر بیش از حد وابسته به دوز نشانگرهای بلوغ DC از جمله CD40، CD80 و CD{5}} را نشان دادند (شکل 2BeD). درمان با وسیله نقلیه بدون mRNA یا MVP محصور شده با mRNA باعث بروز بیش از حد MHC I شد (شکل 2E)، که نشان می‌دهد این اثر به جای مجموعه mRNA با وسیله نقلیه مرتبط است. علاوه بر این، درمان MVP منجر به نمایش سطح سلولی آنتی ژن OVA257e264 کمپلکس اپی توپ-MHC I (SIINFEKL-MHC I) شد که با آنتی بادی ضد SIINFEKL-MHCI (شکل 2F) شناسایی شد، که پردازش و ارائه آنتی ژن موثر توسط BMDCها را نشان می دهد. . علاوه بر این، انکوباسیون همزمان BMDC های تحت درمان با MVP با B3Z، یک رده سلولی CD8þ T که به طور خاص اپی توپ OVA257e264 را شناسایی می کند، یا سلول های T جدا شده از طحال یک موش OT-I که یک سلول T خاص OVA257e را بیان می کند. گیرنده، ترشح IL-2 را تحریک می‌کند، نتیجه‌ای که در سلول‌های T همزمان با DCهای درمان شده با وسیله نقلیه به تنهایی یا هسته mRNA/پروتامین به تنهایی مشاهده نشد (شکل 2G). آنالیز فلوسایتومتری 32.5% سلول های CD8þ T تکثیر یافته را پس از انکوباسیون همزمان با MVP شناسایی کرد (شکل 2H و I). ذرات MVP کپسوله شده با mRNA OVA نیز برای درمان موش ها با تزریق داخل جلدی استفاده شد. بررسی سلول‌ها در غدد لنفاوی تخلیه‌کننده افزایش مداوم بیان CD{34}} را در بین هر دو DC کلاسیک (CD8þ DC، CD11bþ DC، CD103þ DC) و DCهای پلاسماسیتوئید (pDC) در طول 48 ساعت اول نشان داد که نشان دهنده تحریک DC است. بلوغ (شکل 2J). درمان همچنین غنی‌سازی سلول‌های CD8þ T را در غدد لنفاوی، با افزایش قابل توجهی در جمعیت سلول‌های T CD69þCD8þ (شکل 2K و L) ترویج کرد که نشان‌دهنده فعال شدن سلول‌های T توسط درمان است. برای تعیین فعال‌سازی سلول T، سلول‌ها را در غدد لنفاوی تخلیه‌کننده 3، 5 یا 7 روز پس از درمان MVP جمع‌آوری کردیم و پس از به چالش کشیدن سلول‌ها با پپتید آنتی ژن OVA257e264، آنالیز ELISpot را انجام دادیم (شکل S2). درمان MVP باعث جهش بزرگی در سلول های ترشح کننده IFN-g در طول زمان شد، با اوج فعالیت در روز 5 (شکل 2M). این نتایج تحریک قوی DC، ارائه آنتی ژن، و فعال سازی سلول های T را پس از درمان با MVP نشان داد.

جدول 1 ترکیب نانوذرات محصور شده با mRNA کد کننده eGFP.

جدول 2ترکیب لیپید و نسبت بار MVPذرات.

3.3. MVP ایمنی ضد توموری قوی در مدل های موش تومور کولورکتال و ملانوم ایجاد می کند.

MVP برای درمان موش های مبتلا به سرطان کولون MC38 و ملانوم B16 استفاده شد. در هر دو مدل، درمان با mRNA OVA کپسوله شده MVP دو بار رشد تومور را به صورت زیر جلدی مسدود کرد. در مقایسه، درمان با mRNA eGFP محصور شده MVP یا وسیله نقلیه به تنهایی هیچ اثر بازدارنده قابل تشخیصی بر رشد تومور نداشت (شکل 3AeD، اطلاعات پشتیبانی شکل. S3). مطابق با الگوی تغییر CD4 به CD8 در غدد لنفاوی (شکل 2)، ما افزایش نسبت سلول های T CD8þ/CD4þ را در تومورهای موش های تحت درمان با MVP محصور شده با mRNA OVA مشاهده کردیم (شکل 3E). علاوه بر این، ما سطوح بالایی را در سلول‌های T IFN-gþCD8þ در طحال، غدد لنفاوی و تومورها در موش‌های تحت درمان با MVP محصور شده با mRNA OVA، اما نه با وسیله نقلیه به تنهایی یا MVP محصور شده با mRNA GFP شناسایی کردیم (شکل 3FeH، اطلاعات پشتیبانی شکل S4). علاوه بر این، افزایش قابل توجهی در سلول‌های CD8þ T OVA257e{17}}MHCI دکسترامر مثبت در تومورهای گروه درمان MVP محصور شده با mRNA OVA وجود داشت که نشان‌دهنده تکثیر سلول‌های CD8þ T اختصاصی آنتی ژن است (شکل 3I). سنجش ELISpot با سلول‌های جدا شده از طحال و غدد لنفاوی، پشتیبانی بیشتری از فعال‌سازی سلول‌های T ارائه کرد (شکل 3JeM).

3.4. MVP با فعال کردن سیگنال‌های وابسته به STING، پاسخ‌های ایمنی ذاتی را تحریک می‌کند

ما از هسته mRNA، وسیله نقلیه بدون mRNA و MVP محصور شده mRNA برای درمان BMDCs استفاده کردیم تا عوامل کلیدی و مسیرهای مسئول تحریک IFN نوع I و بیان سیتوکین های التهابی را شناسایی کنیم. جالب اینجاست که MVP به اندازه ایمیکویمود آگونیست Tlr7 در تحریک ترشح IFN-b قوی بود، و وسیله نقلیه به تنهایی نیز در ترویج ترشح IFN-b فعالیت داشت، اگرچه قدرت آن به اندازه MVP نبود. با این حال، هسته mRNA به تنهایی در تحریک ترشح IFN-b بی اثر بود (شکل 4A). نتیجه نشان داد که هم mRNA و هم اجزای موجود در وسیله نقلیه برای به حداکثر رساندن بیان IFN-b مورد نیاز است. در عین حال، ایمیکویمود و وسیله نقلیه فعالیت مشابهی در ترویج بیان TNF-a و IL{8}}ب نشان دادند، در حالی که MVP بسیار قوی تر از هر یک از آنها بود (شکل 4B و C). بیان CCL5، یک سیتوکین که معمولاً با عوامل تنظیم کننده NF-kB و IFN مرتبط است، به همان اندازه در سلول های تیمار شده با ایمیکویمود، فقط وسیله نقلیه، یا MVP تحریک شد (شکل 4D). TLR7، MAVS، STING و TRIF فاکتورهای کلیدی در مسیرهای اصلی انتقال سیگنال هستند که واسطه پاسخ سلولی به RNA ویروسی و DNA28e30 آسیب دیده هستند. ما BMDCها را از موش‌هایی با حذف ژن Tlr7، Mavs، Sting یا Trif (KO) تولید کردیم و سلول‌ها را با هسته mRNA، وسیله نقلیه بدون mRNA، یا MVP محصورشده mRNA برای بررسی بیان IFN-b و TNF-a درمان کردیم.

شکل 2 تحریک پاسخ های ایمنی توسط MVP. (الف) نمای شماتیک از هسته mRNA/پروتامین، وسیله نقلیه بدون mRNA و MVP کامل. (BeD) بلوغ BMDCها پس از درمان با OVA-MVP به مدت 24 ساعت. (E و F) بیان MHC I و آنتی ژن OVA257e264 کمپلکس اپی توپ-MHC I در BMDCها پس از درمان با OVA-MVP به مدت 24 ساعت. (G) سطح IL{9}} از BMDCهای تیمار شده همراه با سلولهای T B3Z یا OT-I. (H و I) آنالیز فلوسیتومتری سلول های T پرولیفراتیو. کروماتوگرام های نماینده سلول های T نشان داده شده است. (J) بلوغ DC پس از درمان MVP در داخل بدن. موش‌های C57BL/6J با OVA-MVP تحت درمان قرار گرفتند و DCها در غدد لنفاوی پوپلیتئال مورد بررسی قرار گرفتند. (K و L) تجزیه و تحلیل جمعیت سلول T. موش‌های C57BL/6J با وسیله نقلیه یا OVA-MVP تحت درمان قرار گرفتند و سلول‌های T در غدد لنفاوی پوپلیتئال با فلوسیتومتری آنالیز شدند. (M) سنجش ELISpot. موش های C57BL/6J با OVA-MVP تحت درمان قرار گرفتند و غدد لنفاوی در نقاط زمانی مشخص شده جمع آوری شدند. سلول های جدا شده برای اندازه گیری سلول های بیان کننده IFN-g استفاده شد. داده ها به صورت میانگین SEM (nZ 3) ارائه می شوند. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0.005; ****P <0.001; ns، قابل توجه نیست.

شکل 3 فعالیت ضد توموری از MVP. (الف) مهار رشد تومور MC{2}}OVA. موش‌های ماده C57BL/6J به صورت زیر جلدی با 5  105 MC38-سلول‌های تومور OVA/موش در روز 0 تلقیح شدند و با کنترل PBS، کنترل وسیله نقلیه، GFP-MVP یا OVA-MVP در روز تحت درمان قرار گرفتند. روزهای 3 و 10. (B) مهار رشد تومور B{12}}OVA. موش‌های ماده C57BL/6J به صورت زیر جلدی با 2  105 B16-سلول‌های توموری OVA/موش در روز 0 تلقیح شدند و با کنترل PBS، کنترل وسیله نقلیه، GFP-MVP یا OVA-MVP تحت درمان قرار گرفتند. در روزهای 3 و 10. (C و D) تصویر و وزن تومورهای B16-OVA در روز 17. (E) جمعیت سلول T در تومورهای موش‌های پس از درمان. (FeH) سلول های T IFN-gþCD8þ در طحال، غدد لنفاوی (LN) و تومورهای موش های پس از درمان. (I) سلول های CD8þ T اختصاصی OVA در تومورهای موش های پس از درمان. (JeM) تصاویر و تجزیه و تحلیل کمی از روش ELISpot سلول های طحال و LN از موش های پس از درمان. داده ها به صورت میانگین SEM (nZ 5) ارائه می شوند. *P < 0.05; ** P < 0.01; ***P <0.005; ****P <0.001.

وضعیت KO Mavs و Sting در BMDCها با تجزیه و تحلیل وسترن بلات تایید شد (اطلاعات پشتیبانی شکل S5A). با کمال تعجب، Sting KO فعالیت تحریکی ترشح IFN-b را از هر دو وسیله نقلیه به تنهایی و MVP از بین برد (شکل 4E)، که نشان می دهد MVP بیان IFN نوع I را از طریق STING فعال می کند. برای حمایت از این مفهوم، ما فسفوریلاسیون کیناز 1 (TBK1) متصل به مخزن را شناسایی کردیم (شکل S5B)، کینازی که معمولاً با فعالیت STING مرتبط است. علاوه بر این، این مسیر مستقل از سیگنال دهی TLR7 بود، زیرا بیان IFN-b در سلول های تیمار شده با ایمیکیمود به خطر نیفتاد (شکل 4E). در مقایسه، Trif یا Mavs KO تأثیر حداقلی بر بیان IFN-b ترویج شده توسط MVP داشتند. همانطور که انتظار می رفت، ایمیکویمود در تحریک ترشح IFN-b در BMDCهای مشتق شده از Tlr7 KO بی اثر بود. با این حال، Tlr7 KO تأثیر منفی بر اثر تحریکی MVP داشت (شکل 4E). جالب توجه است، مشخصات متفاوتی در ترشح TNF-a از همان تیمارها مشاهده شد. ناک اوت Sting، Trif، یا Tlr7 هیچ تاثیری بر بیان سیتوکین تحریک شده MVP نداشت. از سوی دیگر، ناک اوت Mavs، سطوح TNF-a را در سلول‌هایی که با وسیله نقلیه به تنهایی یا MVP درمان شده بودند، به‌طور چشمگیری کاهش داد (شکل 4F). نتیجه نشان می‌دهد که MAVS یک تنظیم‌کننده کلیدی بیان TNF-a در DCها پس از درمان MVP است.

3.5. MVP مسیرهای STING و MAVS را برای ترویج ترشح IFN-I و سایتوکین های التهابی تحریک می کند.

برای شناسایی اجزای موجود در وسیله نقلیه که مسئول تحریک سیگنالینگ STING و MAVS هستند، وسایل نقلیه و MVP ها را با جایگزینی یا حذف اجزای کلیدی آماده کردیم و از آنها برای درمان BMDCها استفاده کردیم. آگونیست استینگ حلقوی GMP-AMP (cGAMP) به عنوان یک کنترل مثبت در تحریک ترشح IFN-b عمل کرد. جایگزینی لیپید کاتیونی EDOPC در خودرو با یک لیپید با بار مثبت دیگر، DOTAP، ترشح IFN-b را به طور کامل از بین برد. در مقایسه، اثر تحریکی از وسیله نقلیه و MVP با یا بدون پروتامین حفظ شد، و چنین فعالیت تحریکی وابسته به یک ژن Sting دست نخورده بود (شکل 4G). جالب توجه است که BMDCهای تیمار شده با اجزای جداگانه پوسته لیپیدی از جمله EDOPC باعث ترشح قوی IFN-b نمی شوند (اطلاعات پشتیبانی شکل S6). بنابراین، EDOPC برای فعال‌سازی STING ضروری بود و فعالیت آن به تشکیل یک نانوذره لیپیدی (یعنی وسیله نقلیه یا MVP) وابسته است. وسیله نقلیه و MVP تهیه شده با EDOPC یا DOTAP نیز برای درمان BMDCS مشتق شده از موش‌های نوع وحشی و Mavs KO استفاده شد و سطوح TNF در محیط‌های رشد سلولی تعیین شد. همانطور که انتظار می رفت، جایگزینی EDOPC با DOTAP یا DOPC تلاش تحریکی را از وسیله نقلیه و MVP حذف کرد. علاوه بر این، سطح TNF-a در سلول‌های Mavs KO در مقایسه با سلول‌های نوع وحشی به طور قابل‌توجهی کاهش یافت، اما کاهش پیدا نکرد (شکل 4H)، که نشان می‌دهد عوامل اضافی ممکن است در میانجی‌گری بیان TNF-a تحریک‌شده با MVP دخیل باشند.

3.6. مسیر STING برای پاسخ های ایمنی ضد تومور با واسطه MVP ضروری است

موش های نوع وحشی و حذفی با MVP محصور شده با mRNA OVA تحت درمان قرار گرفتند و بلوغ DC و تکثیر سلول های T مورد بررسی قرار گرفت. Sting KO به طور قابل توجهی درصد سلول های CD80þ و CD86þ DC و سلول های CD69þ T را کاهش داد (شکل 5AeD). سنجش ELISpot نشان داد که سلول‌های تولیدکننده IFN-g در طحال و غدد لنفاوی موش‌های Sting KO در مقایسه با موش‌های نوع وحشی پس از درمان با همان دوز MVP (شکل 5EeH) کاهش قابل‌توجهی داشت. تأثیر Mavs KO حداقل بود، زیرا هیچ تفاوتی روی سلول‌های T حافظه CD44þCD8þ، سلول‌های T CD8þ MHCI دکسترامر مثبت یا تعداد سلول‌های تولیدکننده IFN-g در غدد لنفاوی در مقایسه با سلول‌های وحشی مشاهده نشد. نوع موش (شکل 5IeL). نتیجه این تصور را تقویت می کند که عوامل دیگری علاوه بر MAVS ممکن است در بیان سیتوکین های التهابی تحریک شده با MVP دخیل باشند. موش‌های نوع وحشی و Sting KO برای تلقیح تومورهای B{20}OVA استفاده شدند و موش‌ها با کنترل PBS یا MVP کپسوله‌شده با mRNA OVA تحت درمان قرار گرفتند. آنالیز فلوسایتومتری روی نمونه‌های غدد لنفاوی و تومور جمع‌آوری‌شده از موش‌های واکسینه شده، کاهش قابل توجهی از سلول‌های CD8þ T تولیدکننده IFN-g را در موش‌های Sting KO نشان داد (شکل 6A و B). در نتیجه، رشد تومور در موش‌های نوع وحشی تحت درمان با MVP در مقایسه با مهار جزئی در موش‌های Sting KO کاملاً مهار شد (شکل 6C).

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. بحث

در مطالعه حاضر، ما به طور سیستماتیک نقش عملکردی اجزای فردی در MVP را در تحریک پاسخ‌های ایمنی ضد تومور بررسی کرده‌ایم. مطالعه مبتنی بر سلول ما به وضوح نشان داده است که مولکول‌های mRNA و وسیله نقلیه بدون RNA در MVP برای فعالیت کامل آن در ترویج بیان IFN-b و تعدادی از سایتوکین‌های التهابی از جمله IL{4}}b و TNF مورد نیاز هستند. -a در سلول های دندریتیک نشان داده شده است که چنین سیتوکین هایی نقش اساسی در فعال سازی سلول های دندریتیک و ایمنی ضد توموری با واسطه واکسن ایفا می کنند. مطالعه ما همچنین نشان داد که تحریک تولید سیتوکین به تعدادی از مسیرهای انتقال سیگنال کلیدی درگیر در حس ایمنی ذاتی از جمله مسیرهایی که توسط STING و MAVS واسطه می‌شوند، وابسته است. در حالی که STING برای بیان IFN-b ضروری است، MAVS عمدتاً در تنظیم بیان TNF-a نقش دارد (شکل 6D). اهمیت سیگنال دهی STING در ایمنی ضد توموری با واسطه MVP با کاهش فعالیت سلول های T و در نتیجه مهار رشد تومور در موش های Sting KO نشان داده می شود. این نتیجه با گزارش‌های دیگر همخوانی دارد که فعال‌سازی STING ایمنی ضد توموری با واسطه سلول‌های T سیتوتوکسیک را تعیین می‌کند. MAVS یک واسطه کلیدی در سیگنال دهی گیرنده RIG-I (RLR) در پاسخ به عفونت ویروسی است. فعال شدن این مسیر منجر به آبشاری از پاسخ های التهابی می شود. جالب است که فعالیت سلول های T در موش های Mavs KO به خطر نیفتد، با توجه به اینکه سیگنال دهی MAVS به وضوح نقش مهمی در تنظیم بیان سایتوکاین های التهابی از جمله TNF-a ایفا می کند. یک دلیل احتمالی این است که تحریک چنین سیتوکین‌هایی توسط MVP توسط مسیرهای متعدد انجام می‌شود و اختلال در مسیر MAVS بیان سیتوکین را به سطح کافی پایین نمی‌آورد تا تأثیر قابل‌توجهی ایجاد کند. روش دیگر، از دست دادن سیگنالینگ MAVS توسط مسیرهای دیگر جبران می شود. مطالعات بیشتری برای شناسایی این مسیرها برای درک بیشتر مکانیسم اثر واکسن MVP مورد نیاز است. اگرچه TLR7 به طور سنتی با داروهای mRNA درمانی مرتبط بوده است، به نظر نمی رسد سیگنال دهی TLR7 نقش مهمی در میانجیگری فعالیت MVP ایفا کند. استفاده از مولکول‌های mRNA کاملا متیله در مطالعه حاضر ممکن است سیگنال‌دهی TLR7 را کمتر مرتبط کند. به خوبی نشان داده شده است که متیلاسیون RNA شناسایی توسط TLRs23 را سرکوب می کند. TRIF یک پروتئین آداپتور کلیدی برای سیگنال دهی TLR3/7/828 است. حذف Trif نیز بر فعالیت MVP تأثیر نمی‌گذارد، و این تصور را تقویت می‌کند که TLR‌های فوق از جمله TLR7 نقش عمده‌ای در میانجی‌گری پاسخ‌های سلولی به MVP بازی نمی‌کنند. آگونیست های متعدد نیش در ساخت واکسن سرطان از جمله دی نوکلئوتیدهای حلقوی و ترکیبات مولکولی کوچک و بزرگ34e37 استفاده شده است. چنین آگونیست های نیش باید به عنوان کمک های خارجی در طول آماده سازی واکسن اضافه شوند که لایه دیگری از پیچیدگی را به ترکیب واکسن اضافه می کند. علاوه بر این، آگونیست Sting اضافه شده خارجی ممکن است پس از جدا شدن از کمپلکس mRNA، عوارض نامطلوبی ایجاد کند. در مقایسه، MVP ما به عنوان یک خود کمکی عمل می کند و در زمینه واکسن سرطان کار می کند، زیرا هیچ یک از اجزای منفرد واکسن از جمله EDOPC نمی تواند بیان سیتوکین را تقویت کند. جالب اینجاست که فسفولیپید کاتیونی EDOPC را نمی توان با DOTAP غیر فسفولیپیدی که بار مثبت نیز دارد جایگزین کرد. حدس زدن مکانیسم بالقوه برای تفاوت بین این دو لیپید کاتیونی جالب است. با این حال، مستند شده است که سایر خواص یک جزء مولکول لیپیدی مانند آبگریزی ممکن است تأثیر عمیقی بر عملکرد کلی یک نانوذره و کارآیی تحویل آن برای اسیدهای نوکلئیک داشته باشد. بنابراین، باید در انتخاب مولکول‌های مناسب برای تهیه واکسن mRNA کاملاً کاربردی دقت شود. به طور خلاصه، ما یک واکسن سرطان درمانی قوی مبتنی بر mRNA را ایجاد کرده‌ایم و اجزای فردی را در واکسن با عملکرد آنها اختصاص داده‌ایم. مکانیسم اثر آن کاملاً متفاوت از سایر پلتفرم های mRNA است که برای مداخلات پیشگیرانه و درمانی استفاده می شود. دانش به دست آمده از مطالعه فعلی قطعاً توسعه آینده درمان های mRNA اضافی را هدایت خواهد کرد.

شکل 4 ارتقای پاسخ های ایمنی ذاتی توسط MVP. (AeD) BMDCها به مدت 24 ساعت با 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر ایمی‌کویمود، 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر هسته‌ی معادل mRNA، وسیله نقلیه یا MVP درمان شدند. سطوح IFN-b، TNF-a، IL{7}}b و CCL5 با الایزا اندازه گیری شد. (E و F) بیان IFN-b و TNF-a از BMDCs مشتق شده از موش های نوع وحشی و ناک اوت ژن (KO). BMDC ها با معرف های مشخص شده به مدت 24 ساعت تیمار شدند. IFN-b و TNF-a با الایزا اندازه گیری شد. (G) IFN-b در BMDC های مشتق شده از موش های ناک اوت نوع وحشی و نیش. BMDCها با 20 میلی‌گرم در میلی‌لیتر cGAMP، 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر هسته، وسیله نقلیه یا MVP معادل mRNA، به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. وسیله نقلیه (DOTAP): با جایگزینی EDOPC با DOTAP تهیه شد. وسیله نقلیه (بدون پروتامین): با حذف پروتامین تهیه می شود. ND: قابل تشخیص نیست. (H) TNF-a در BMDC های مشتق شده از موش های ناک اوت نوع وحشی و Mavs. BMDCها با هسته، وسیله نقلیه یا MVP معادل mRNA 1 میلی گرم در میلی لیتر به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. وسیله نقلیه (DOTAP): با جایگزینی EDOPC با DOTAP تهیه شد. وسیله نقلیه (DOPC): با جایگزینی EDOPC با DOPC تهیه شد. داده ها به صورت میانگین SEM (nZ 3) ارائه می شوند. ***P < 0.005; ****P <0.001; ns، قابل توجه نیست.

شکل 5 پاسخ های ایمنی ضد توموری در موش های ناک اوت استینگ و ماوس. (AeD) کاهش فعال‌سازی سلول‌های DC و T در موش‌های ناک اوت استینگ. هر دو موش ناک اوت نوع وحشی و نیش با MVP محصور شده با mRNA OVA تحت درمان قرار گرفتند و غدد لنفاوی 48 ساعت بعد برای اندازه‌گیری سلول‌های DC و T جمع‌آوری شدند. (EeH) سلول‌های T بیان‌کننده IFN-g را در طحال و غدد لنفاوی موش‌های ناک اوت استینگ کاهش داد. هم تصاویر لکه ها و هم تحلیل های کمی نشان داده شده است. (IeL) هیچ تاثیری بر فعالیت سلول های T در موش های حذفی Mavs ندارد. موش های نوع وحشی و حذفی Mavs با کنترل PBS یا MVP محصور شده با mRNA OVA تحت درمان قرار گرفتند و غدد لنفاوی 48 ساعت بعد برای اندازه گیری سلول های T حافظه CD44þCD8þ (I)، OVA257e{12}MHCI CD8þ مثبت دکسترامر جمع آوری شدند. سلول های T (J) و تعداد سلول های تولید کننده IFN-g (K و L). داده ها به صورت میانگین SEM (n Z 3 یا 5) ارائه می شوند. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0.005; ****P <0.001; ns، قابل توجه نیست.

شکل 6 ایمنی ضد تومور وابسته به نیش. (الف و ب) آنالیز سلول‌های T بیان‌کننده IFN-g در غدد لنفاوی و بافت‌های تومور پس از موش‌های ناک اوت وحشی و استینگ که دارای تومورهای B{5}}OVA بودند با MVP کپسوله‌شده با mRNA OVA تحت درمان قرار گرفتند. موش‌ها در روزهای 3 و 1{13}} تحت درمان قرار گرفتند و غدد لنفاوی و تومورها در روز 15 جمع‌آوری شدند. سلول‌های منفرد با فلوسیتومتری آنالیز شدند. (C) مهار رشد تومور در موش های نوع وحشی و ناک اوت نیش. موش‌ها با کنترل PBS یا MVP در روزهای 3 و 1 تحت درمان قرار گرفتند{15}}. داده ها به صورت میانگین SEM (nZ 5) ارائه می شوند. *P <0.05; ****P <0.001; ns، قابل توجه نیست. (د) نمای شماتیک در مورد تحریک MVP مسیرهای انتقال سیگنال منجر به تولید سیتوکین در DCها. در حالی که تحریک بیان IFN-b منحصراً توسط STING انجام می شود، عوامل متعددی از جمله MAVS وجود دارد که بیان TNF-a و IL{19}}b را واسطه می کند.

منابع

1. El Sahly HM، Baden LR، Essink B، Doblecki-Lewis S، Martin JM، Anderson EJ، و همکاران. اثربخشی واکسن mRNA-1273 SARS-CoV-2 در تکمیل فاز کور. N Engl J Med 2021; 385:1774e85.

2. Moreira Jr ED، Kitchin N، Xu X، Dychter SS، Lockhart S، Gurtman A، و همکاران. ایمنی و اثربخشی دوز سوم واکسن BNT162b2 کووید-19. N Engl J Med 2022؛ 386:1910e21.

. داودی اس اف. غلبه بر موانع سلولی برای درمان RNA Nat Biotechnol 2017؛ 35:222e9.

4. Cullis PR، Hope MJ. سیستم های نانوذرات لیپیدی برای توانمندسازی ژن درمانی Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S، Guevara ML، Li Z، Mai J، Ferrari M، Pompa PP، و همکاران. Lipopolyplex ایمنی ضد توموری واکسیناسیون مبتنی بر mRNA را تقویت می کند. بیومتریال 2017؛ 125:81e9.

6. Wang Y، Su HH، Yang Y، Hu Y، Zhang L، Blancafort P، و همکاران. تحویل سیستمیک mRNA اصلاح شده که ویروس هرپس سیمپلکس 1 تیمیدین کیناز را برای ژن درمانی هدفمند سرطان کد می کند. Mol Ther 2013; 21:358e67.

7. Kranz LM، Diken M، Haas H، Kreiter S، Loquai C، رویتر KC، و همکاران. تحویل RNA سیستمیک به سلول های دندریتیک از دفاع ضد ویروسی برای ایمونوتراپی سرطان استفاده می کند. Nature 2016;534:396e401.

8. Meng C، Chen Z، Mai J، Shi Q، Tian S، Hinkle L، و همکاران. واکسن mRNA شبیه ویروس برای درمان سرطان Adv Ther 2021; 4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA vaccines عصر جدید در واکسینولوژی. Nat Rev Drug Discov 2018; 17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, et al. سلول های CAR T در داخل بدن برای درمان آسیب قلبی تولید می شوند. Science 2022; 375:91e6.

11. Esteban I، Pastor-Quinones C، Usero L، Plana M، Garcia F، Leal L. در عصر واکسن‌های mRNA، آیا امیدی برای درمان عملکردی HIV وجود دارد؟ ویروس ها 2021؛ 13:501.

12. Krienke C، Kolb L، Diken E، Streuber M، Kirchhoff S، Bukur T، و همکاران. یک واکسن mRNA غیر التهابی برای درمان آنسفالومیلیت خودایمنی تجربی. Science 2021; 371:145e53.

13. Miao L، Zhang Y، Huang L. mRNA واکسن برای ایمونوتراپی سرطان. مول سرطان 2021؛ 20:41.

14. Van Hoecke L، Verbeke R، Dewitte H، Lentacker I، Vermaelen K، Breckpot K، و همکاران. mRNA در ایمونوتراپی سرطان: فراتر از منبع آنتی ژن مول سرطان 2021؛ 20:48.

15. شاهین یو، درهوانسیان ای، میلر ام، کلوکه بی پی، سیمون پی، لوور ام، و همکاران. واکسن‌های موتانوم RNA شخصی‌شده، ایمنی درمانی چند اختصاصی را در برابر سرطان بسیج می‌کنند. Nature 2017;547:222e6.

16. Sahin U، Oehm P، Derhovanessian E، Jabulowsky RA، Vormehr M، Gold M، و همکاران. یک واکسن RNA باعث ایجاد ایمنی در ملانومای تحت درمان با مهارکننده های ایست بازرسی می شود. Nature 2020; 585:107e12.

17. Hilf N، Kuttruff-Coqui S، Frenzel K، Bukur V، Stevanovic S، Gouttefangeas C، و همکاران. کارآزمایی واکسیناسیون شخصی سازی شده فعال برای گلیوبلاستومای تازه تشخیص داده شده. Nature 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, et al. ایمونوتراپی سرطان واکسن سلولی دندریتیک وسعت و تنوع سلول‌های T نئوآنتی‌ژن خاص ملانوم را افزایش می‌دهد. علوم 2015؛ 348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, et al. واکسن نئوآنتی ژن پاسخ سلول های T داخل توموری را در آزمایش گلیوبلاستوما فاز Ib ایجاد می کند. Nature 2019; 565:234e9.

20. Mai J، Li Z، Xia X، Zhang J، Li J، Liu H، و همکاران. فعال سازی سینرژیک ایمنی ضد تومور توسط یک واکسن درمانی ذرات. Adv Sci 2021; 8:2100166.

21. کوبیاما ک، ایشی کی جی. ایجاد حس ذاتی کمکی واکسن mRNA Nat Immunol 2022؛ 23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, et al. واکسن‌های مبتنی بر RNA پیام‌رسان با فعالیت دوگانه، پاسخ‌های ایمنی تطبیقی ​​وابسته به TLR{4}} متعادلی را القا می‌کنند و فعالیت ضد توموری را ارائه می‌دهند. J Immunother 2011؛ ​​34:1e15.

23. Kariko K، Buckstein M، Ni H، Weissman D. سرکوب تشخیص RNA توسط گیرنده های Toll مانند: تاثیر اصلاح نوکلئوزیدی و منشاء تکاملی RNA. مصونیت 2005؛ 23:165e75.

24. Tahtinen S، Tong AJ، Himmels P، Oh J، Paler-Martinez A، Kim L، و همکاران. IL-1 و IL-1ra تنظیم‌کننده‌های کلیدی پاسخ التهابی به واکسن‌های RNA هستند. Nat Immunol 2022؛ 23:532e42.

25. لی سی، لی آ، گریگوریان ال، آروناچلام PS، اسکات MKD، تریسال ام، و همکاران. مکانیسم های ایمنی ذاتی و تطبیقی ​​به واکسن PfizerBioNTech BNT162b2. Nat Immunol 2022؛ 23:543e55.

26. LoPresti ST، Arral ML، Chaudhary N، Whitehead KA. جایگزینی لیپیدهای کمکی با جایگزین‌های باردار در نانوذرات لیپیدی، تحویل mRNA هدفمند به طحال و ریه‌ها را تسهیل می‌کند. J Control Release 2022; 345:819e31.

27. Charbe NB، Amnerkar ND، Ramesh B، Tambuwala MM، Bakshi HA، Aljabali AAA، و همکاران. RNA مداخله گر کوچک برای درمان سرطان: غلبه بر موانع در زایمان Acta Pharm Sin B 2020; 10:2075e109.

28. Fuertes MB، Woo SR، Burnett B، Fu YX، Gajewski TF. پاسخ اینترفرون نوع I و حس ایمنی ذاتی سرطان. Trends Immunol 2013؛ 34:67e73.

29. Harding SM، Benci JL، Irianto J، Discher DE، Minn AJ، Greenberg RA. پیشرفت میتوزی به دنبال آسیب DNA، تشخیص الگو را در ریزهسته ها امکان پذیر می کند. Nature 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, et al. آسیب DNA، سیستم اینترفرون نوع I را از طریق سنسور DNA سیتوزولی STING آغاز می کند تا ایمنی ذاتی ضد میکروبی را تقویت کند. مصونیت 2015؛ 42:332e43.

31. ژانگ زی، یوان بی، بائو ام، لو ان، کیم تی، لیو ی جی. هلیکاز DDX41 DNA درون سلولی با واسطه آداپتور STING را در سلول های دندریتیک حس می کند. Nat Immunol 2011؛ ​​12:959e65.

32. Sivick KE، Desbien AL، Glickman LH، Reiner GL، Corrales L، Surh NH، و همکاران. میزان فعال‌سازی STING درمانی، ایمنی ضد توموری با واسطه سلول‌های CD8þ را تعیین می‌کند. Cell Rep 2018; 25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S، Nguyen JB، Modis Y. مکانیسم های تشخیص الگو و سیگنال دهی RIG-I و MDA5. Front Immunol 2014؛ 5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, et al. واکسن‌های سرطانی با فرمولاسیون آگونیست STING می‌توانند تومورهای مستقر مقاوم به محاصره PD-1 را درمان کنند. Sci Transl Med 2015; 7: 283ra52.

35. Corrales L، Glickman LH، McWhirter SM، Kanne DB، Sivick KE، Katibah GE، و همکاران. فعال سازی مستقیم STING در ریزمحیط تومور منجر به پسرفت و ایمنی تومور قوی و سیستمیک می شود. Cell Rep 2015; 11:1018e30.

36. Miao L، Li L، Huang Y، Delcassian D، Chahal J، Han J، و همکاران. تحویل واکسن‌های mRNA با لیپیدهای هتروسیکلیک، کارایی ضد تومور را با فعال‌سازی سلول‌های ایمنی با واسطه STING افزایش می‌دهد. Nat Biotechnol 2019؛ 37:1174e85.

37. Luo M، Wang H، Wang Z، Cai H، Lu Z، Li Y، و همکاران. یک نانو واکسن فعال کننده STING برای ایمونوتراپی سرطان. Nat Nanotechnol 2017; 12:648e54.

38. وانگ ال، کوینوا آر، پریخ اچ، مک دونالد آر.سی. فعالیت ترانسفکشن مخلوط های دوتایی مشتقات فسفاتیدیل کولین جایگزین شده با کاتیونی: هسته آبگریز به شدت خواص فیزیکی و کارایی تحویل DNA را تعدیل می کند. Biophys J 2006; 91:3692e706.