خلاصه
هدف: این مطالعه به منظور تایید کاربرد عصاره گیاهی مخلوط (MHE) به عنوان یکلوازم آرایشی ضد پیریعنصر با بررسی آنضد پیری پوستفعالیت های in vitro و in vivo. روش بررسی: در این مطالعه MHE را با استفاده از عصارهگیری اولتراسونیک حاوی Forsythiae fructus، Tribuli fructus، Solomon's seal، جینسنگ سیبری، Ponciri Fructus و Ginseng تهیه کردیم. ما بررسی کردیماثر ضد پیری MHE برای پوست در فیبروبلاست های پوستی. اینفعالیت ضد پیریبا سطح سنتز کلاژن نوع I تعیین شد. سطوح mRNA متالوپروتئیناز ماتریکس-1 (MMP1) و مهارکننده بافتی متالوپروتئینازهای 1 (TIMP1) با استفاده از qRT-PCR اندازهگیری شد. سطح پروتئین MMP1 با آنالیز بلات بررسی شد. آزمایشات بالینی رطوبت، کشسانی، بافت و چین و چروک پوست با استفاده از لوازم آرایشی حاوی 1 درصد MHE انجام شد. نتایج: MHE باعث ایجاد دخیل در سنتز پروکلاژن نوع I و بیان mRNA ژن TIMP1 شد. MHE منجر به کاهش سطح mRNA و پروتئین MMP1 شد. علاوه بر این، پس از استفاده پوستی از لوازم آرایشی حاوی 1 درصد MHE، هیدراتاسیون پوست، کشسانی، بافت و پای کلاغی 4 هفته پس از درمان بهبود یافت. نتیجهگیری: MHE با ترویج سنتز کلاژن و سرکوب بیان ژن MMP1 در شرایط آزمایشگاهی، اثر ضد پیری دارد و در داخل بدن اثر بهبود پوست دارد. بنابراین، نشان داده شد که MHE به عنوان یک عنصر آرایشی کاربردی دارای ارزش است.
کلید واژه ها:مراقبت از پوست, ضد پیری, ضد چروک, آرایشی و بهداشتی طبیعی, داروهای گیاهی
مکمل های گیاهی سیستانچ برای ضد پیری
معرفی
پوست عضوی است که با محیط خارجی در تماس است و برای بقای ما حیاتی است و به عنوان مانع اولیه عمل می کند.در برابر حملات خارجیمانند عوامل عفونی و آسیب جسمی؛ علاوه بر این، چندین نقش فیزیولوژیکی مهم را ایفا می کند (اسلومینسکی و همکاران، 2004؛ وولمر و همکاران، 2018). با افزایش سن،عملکرد پوستبه تدریج با تغییرات آتروفیک ناشی از اشعه ماوراء بنفش (UV)، آلودگی و استرس و پیری پوست که با کاهش تعداد سلول های پوست و ضخامت پوست رخ می دهد، بدتر می شود (Farage et al., 2013).
پیری پوسترا می توان به پیری درون زا و پیری اگزوژن تقسیم کرد. پیری درون زا پوست به طور طبیعی در طول زمان بدون توجه به تأثیرات خارجی رخ می دهد. پوستی-اپیدرمیاتصال (DEJ) انسجام ضعیف می شود، و با تمایزاز کراتینوسیت ها، تشکیل چربی کاهش می یابد (Makrantonakiو همکاران., 2007). از سوی دیگر، پیری اگزوژن ناشی از خارجی استعواملی مانند اشعه ماوراء بنفش، اشعه مادون قرمز (IR)، سیگار کشیدن، خوبگرد و غبار و سبک زندگی در این میان، پیری نور ناشی از UV استنفوذ اشعه به پوست و آسیب رساندن به کلاژن و الاستیندر درم در این فرآیند، الیاف الاستیک و کلاژنالیاف پوست تغییر شکل داده و در نتیجه خاصیت ارتجاعی آن کاهش می یابدو افتادگی کلاژن جزء اصلی خارج سلولی استماتریکس و نقش مهمی در تعیین عملکرد بافت دارد.
در میان انواع مختلف کلاژن، کلاژن نوع 1 حدود 75-80 درصد از کل کلاژن را تشکیل می دهد (لاندو، 2007؛ لاول و همکاران، 1987؛ میس و همکاران، 1988). زمانی که پوست در معرضاشعه ماوراء بنفش برای مدت طولانی، رادیکال های آزاد تولید می شود. اینها رایگانرادیکالها بیان ماتریکس متالوپروتئیناز را تحریک میکنند-1(MMP1) که باعث تخریب کلاژن و مهار کلاژن می شودسنتز که خاصیت ارتجاعی پوست را کاهش می دهد و منجر به ایجاد چین و چروک می شود.بنابراین برای پیشگیری و بهبود چین و چروک های پوستی ناشی ازبا افزایش سن، لازم است ماده ای ایجاد شود که باعث تقویت آن شودتولید کلاژن و مهار بیان و فعالیتMMP1 (Wlaschekو همکاران., 2001).
پیری پوستارتباط تنگاتنگی با کیفیت زندگی دارد. از آنجایی که پوست قابل مشاهده ترین اندام است، ما را از روند پیری آگاه می کند (بینیک و همکاران، 2013). تلاش های مختلفی در زمینه های پزشکی، دارویی و آرایشی و بهداشتی در حال انجام است.جلوگیری و بهبود پیری پوست. اینتوسعه مواد ضد پیرییکی از مهم ترین راهکارهای ضد پیری است.
ما عصاره های گیاهی را با استفاده از استخراج اولتراسونیک برای تولید مواد ضد پیری جدید حاوی Forsythiae fructus، Tribuli fructus، Solomon's seal، جینسنگ سیبری، Ponciri fructus و Ginseng آماده کرده ایم.
شش داروی گیاهی از گیاهان با اثرات مختلف پزشکی و پوستی انتخاب شد. Forsythiae fructus، میوه خشک Forsythia suspense (خانواده Oleaceae)، معروف به Lian Qiaoدر چین، اولین بار در Shennong Bencao Jing، یک ثبت شدتک نگاری معتبر در مورد طب سنتی چینی (TCM)(دونگو همکاران.، 2017). از آن به عنوان پاک کننده حرارت وسم زدایی TCM برای درمان بیماری های عفونی، مانندنفریت حاد، اریسیپل و زخم (وانگو همکاران، 2018). این استبه طور گسترده در کلینیک ها به عنوان یک دارو یا نسخه ترکیبی استفاده می شود.فارماکولوژی مدرن نشان داده است که انواع مختلفی از آن داردفعالیت های زیستی، از جمله ضد التهاب، ضد باکتری، ضدویروسی، آنتی اکسیدان، ضد تومور، ضد دیابت، ضد چربی خون،ضد آلوپسی ضد آندروژن، ضد استفراغ، ضد پیری و ضدفعالیت های چاقی و محافظت کننده عصبی، محافظ کبدی واثرات شل کننده عروق (Dongو همکاران.، 2017). علاوه بر این بوده استگزارش کرد کهForsythiae fructusدارای سفیدی پوست، ضددرماتیت آتوپیک و اثرات ضد پیری. به گفته تایوانپایگاه داده نسخه سراسری،فورسیتیا فروکتوسبوده استشامل 10 گیاه برتر که بیشتر برای درمان آتوپیک استفاده می شوددرماتیت (15.9 درصد)، کهیر (11.{3}}.4 درصد) و آکنه (22.3 درصد)(دونگو همکاران., 2017). Forsythiae fructusحاوی ساپونین است,فلاونوئیدها،و آلکالوئیدها و اسید اولئانولیک که مفید استعمل فارماکولوژیک علاوه بر این، حاوی آرکتیژنین وmatairesinol. به عنوان مواد تشکیل دهنده فعال فیزیولوژیکی پوست، آنهامهارکنندههای تیروزیناز هستند که بر متابولیسم ملانین اثر میگذارندمسیر القا شده توسط -هورمون محرک ملانوسیت ( -MSH)و به عنوان مواد سفید کننده آرایشی توجه را به خود جلب می کنند(یانگ و چو، 2011).میوه فروکتوس، که میوه خشک آن استخارخاسکیL، فارماکولوژیک گزارش شده استفعالیت های بهبود عملکرد جنسی، پیشگیری و درمانبیماری های قلبی عروقی و بهبود محافظت عصبی وحافظه همچنین دارای ضد دیابت، ضد التهاب واثرات آنتی اکسیدانی (Chhatreو همکاران.، 2014). میوه فروکتوسعصاره حاوی مقادیر زیادی دیوسژنین، تیگوژین، مختلف استساپونین ها و غیره این ساپونین ها مهمترین فعال زیستی هستنداجزای مسئول اثرات بیولوژیکی مختلف ماننداثر تقویت کننده جنسی، اثر ضد فشار خون و محافظتیاثر در برابر آسیب ایسکمی خونرسانی مجدد و ضد سرطان،فعالیت های ضد باکتریایی و ضد قارچی (Chhatreو همکاران., 2014).
سایر ترکیبات شامل فوروستانول و ساپونین اسپیروستانول، پلی ساکاریدها، گلیکوزیدهای فلاونوئید، آلکالوئیدها و آمیدها هستند. علاوه بر این، در برابر درماتیت آتوپیک در موش صحرایی موثر است و دارای اثرات ضد التهابی است (Chhatre et al., 2014). گزارش شده است که اثر ضد پیری عصاره Tribuli fructus تولید پروکلاژن و الاستین نوع I را در سلولهای HS68 افزایش میدهد، تجمع چربی سلولهای چربی را افزایش میدهد و در نهایت چین و چروکها و خاصیت ارتجاعی پوست را بهبود میبخشد (Kim et al., 2016). ). جینسینگ سیبری (Acanthopanax senticosus) درختچه ای خزان کننده است که به همراه جینسنگ و جینسنگ وحشی به خانواده اوگا تعلق دارد. جینسینگ سیبری شباهت های زیادی با جینسنگ دارد و به عنوان یک داروی گیاهی برای سکته مغزی، فشار خون بالا و دیابت استفاده می شود. عصاره جینسینگ سیبری برای مدت طولانی در طب شرقی مورد استفاده قرار می گرفته است و تا همین اواخر در مطالعات مختلف نتایج دارویی و فیزیولوژیکی گزارش شده است. اجزای جینسنگ سیبری که تا کنون شناسایی شده اند عبارتند از: Eleuthero sides A, B, C, D, E, I, K, L, and M و سسامین، کییزانوسید، کافئیک اسید، اسید کلروژنیک، کامپسترول، ویتامین ها و مواد معدنی (پارک) و همکاران، 2010).
حاوی ساپونین های تری ترپنوئید، لیگنان ها، کومارین ها وفلاونوئیدهاکه در میان آنها ترکیبات فنلی به عنوان فعال ترین اجزا در نظر گرفته می شوند (Huang et al., 2011). گزارش های زیادی در مورد تاثیر عصاره جینسینگ سیبری بر روی پوست وجود دارد.اثر ضد چروک,اثر آنتی اکسیدانی,سنتز کلاژنو فعالیت مهاری کلاژناز در برابر پیری نوری گزارش شده است (پارک و همکاران، 2010). گزارش شده است که عصاره جینسنگ سیبری سنتز کلاژن نوع IV را تنظیم می کند، بر ظرفیت تکثیر سلول های بنیادی اپیدرم تاثیر می گذارد و اپیدرم را ضخیم می کند (چوی و همکاران، 2016). مهر سلیمان ریزومی از Polygonatum odoratum (مترادف: P.officinale) است که اثر مقوی دارد و برای درمان نارسایی قلبی و دیابت در طب شرقی استفاده می شود. مهر سلیمان ضد چرخه و ضد سرفه است; تنش قلب را تسکین می دهد و ادرارآور، انرژی زا، کاهنده قند خون، آرام بخش و مقوی است. از آن برای درمان بیماری های ریوی، از جمله سل و اختلالات گوارشی استفاده می شود (هارون و همکاران، 2012). علاوه بر این، به طور گسترده ای در درمان اختلالات خونی استفاده می شود. اثرات مفیدی بر مجاری کلیه دارد و از سفیدی مو، مشکلات بینایی، سرگیجه و کرم حلقوی جلوگیری می کند. مقوی اعصاب است و در درمان دیابت استفاده می شود (Haroon et al., 2012). فوک سلیمان دارای محتوای فنل بالا و فعالیت آنتی اکسیدانی است. هوموایزوفلانون های حاصل از مهر و موم Solomon از تشکیل محصولات نهایی گلیکوزیلاسیون پیشرفته جلوگیری می کند. مهر و موم Solomon یک فعالیت تنظیمی قوی سیستم ایمنی روده و توانایی القای تمایز استئوکلاست و آپوپتوز ناشی از لکتین را نشان داده است. در مورد عصاره برگ P. odoratum، عملکرد ترمیم زخم به عنوان نمونه گزارش شده است (فتحی و همکاران، 2014). Ponciri fructus immatures میوه نارس Poncirus trifoliata Rafinesque، متعلق به خانواده Rutaceae است (یونگ و همکاران، 2016). اخیراً اثرات ضد التهابی و ضد حساسیت گزارش شده است و اثر عصاره سیلت چربی برای القای آپوپتوز سلول های سرطانی گزارش شده است (لی و همکاران، 2008). Ponciri fructus در درمان درماتیت آتوپیک موثر شناخته شده است. از طریق استفاده پوستی عصاره Ponciri fructus، اثرات آن بر درماتیتیدهای آتوپیک، مانند هیپرکراتوز اپیدرمی، ادم پوستی و سیتوکین ها گزارش شده است. به طور خاص، کاهش قابل توجهی در خارش، تعداد ماست سل ها، تولید IgE و بیان فاکتور رشد عصبی گزارش شده است. عصاره Ponciri fructus اثر ضد التهابی موثری را در برابر درماتیت آتوپیک و اثر ضد خارش با تنظیم مکانیسم های ایمنی نشان داده است. علاوه بر این، تجویز خوراکی عصاره Ponciri fructus برای درمان و پیشگیری از بیماری های آلرژیک مفید شناخته شده است (Hwang et al., 1997). جینسینگ یک داروی گیاهی سنتی پرکاربرد با فعالیت های چند منظوره است. جینسینگ برای فعالیت های ضد التهابی، آنتی اکسیدانی، ضد توموری و ضد پیری آن استفاده شده است (چوی، 2008؛ کیم و کو، 2020). مطالعات زیادی در مورد اثربخشی جینسینگ بر روی پوست انجام شده است (He et al., 2018). در میان آنها، گزارش های زیادی در مورد ساپونین ها و جین سنوزیدها وجود دارد که ترکیبات نماینده جینسینگ هستند. ساپونین ها ترکیباتی هستند که به طور گسترده در اکثر گیاهان یافت می شوند و به اشکال مختلف وجود دارند. ساپونین ها می توانند فعالیت های بیولوژیکی مختلف مانند همولیز و عملکردهای ضد باکتریایی، ضد ویروسی و آنتی اکسیدانی را تسریع کنند. علاوه بر این، ساپونین ها دارای خواص ضد التهابی هستند که می توانند تورم و التهاب پوست را کاهش دهند. جین سنوزیدها اینترلوکین (IL) را افزایش میدهند، یکی از سایتوکاینهای التهابی شناخته شده برای ترویج رگزایی و القای فاکتور رشد و تجمع اندوتلیال عروقی.در محل سوختگی پوست در موش اثر آنها در حذف ماکروفاژها از زخم های پوستی و بهبود زخم نیز گزارش شده است (Kim et al., 2011).
هدف از این مطالعه، روشن کردن اثر ضد پیری پوست عصاره گیاهی مخلوط (MHE) در شرایط آزمایشگاهی و درون تنی بود.
مواد و روش ها
1. ارزیابی اثربخشی آزمایشگاهی
1) آماده سازی MHE
میوه خشک Forsythia suspense، میوه خشک Tribulus Terrestris L.، جینسنگ سیبری (Acanthopanax senticosus (Eleuthero) Root)، مهر سلیمان (Rhizome و ریشه Polygonatum Officinale)، میوه Poncirus Trifoliataxaginsque,Pananaxgins. از بازار محلی خریداری شده است. بر اساس نظریه "یین یانگ" و "پنج عنصر" طب سنتی چینی (TCM)، Forsythia suspensa، Tribulus terrestris L. و Poncirus trifoliata Rafinesque مربوط به "یانگ" و جینسنگ سیبری، جینسنگ و مهر سلیمان مربوط به "یین" انتخاب شد. شش گیاه دارویی دوباره به ویژگی های مربوط به پنج عنصر (چوب، آتش، آب، فلز یا طلا، و زمین یا خاک) تقسیم شدند. این گیاهان دارویی با نسبت یکسانی برای تعادل هر عنصر مخلوط شدند و Poncirus trifoliata و جینسنگ مربوط به زمین با عناصر دیگر ترکیب شدند تا با نسبتها مطابقت داشته باشند (جدول 1). شش گیاه دارویی با استفاده از فراصوت (20 کیلوهرتز، 2 ساعت) در اتانول 30 درصد استخراج شدند. پس از تغلیظ با اواپراتور دوار، 30 درصد (v/v) بوتیلن گلیکول اضافه شد و محلول رقیق شد تا عصاره ای حاوی 1 درصد محتوای جامد تهیه شود.
جدول 1. ترکیب گیاهان مخلوط
2) کشت سلولی و معرف
سلولهای فیبروبلاست اولیه انسان (HDFn) از PromoCell (فیبروبلاستهای پوستی طبیعی پوست انسان جوان ختنهگاه، C{0}}؛ PromoCell، آلمان) بهدست آمدند. کشت سلولی با Dulbeccoگلوکز متوسط بالا Eagle (DMEM high glucose, SH30243.01, Hyclone, Cytiva) حاوی 10 درصد (v/v) سرم جنین گاوی (FBS, SH30084.03, Hyclone) و 1 درصد آنتی بیوتیکعوامل ضد قارچ (Anti-anti، 15240-062، Gibco، USA) در دمای 37 درجه در انکوباتور CO2 5 درصد کشت داده شدند.
3) سنجش بقای سلولی (آزمایش MTT)
سنجش MTT زنده ماندن سلول را اندازه گیری کرد و سمیت سلولی MHE را تعیین کرد. سلولها با اندازه 103×5 سلول در چاهک روی یک صفحه چاهک کاشته شدند و به مدت 24 ساعت در زیر کشت سلولی کشت شدند.شرایط سپس، محیط را دور انداختیم، سلول ها را با محلول سالین بافر فسفات (PBS, 21-040-CV; Corning, USA) شستیم، سلول ها را در محیط های جدید بدون سرم قرار دادیم، وسلول ها را با غلظت های {{0}} درمان کرد.01، 0.025، {{10}}.05. 0.10، 0.25، 0.50، 0.75، و 1.{15}} درصد از نمونه ها، و سلول ها به مدت 24 و 48 ساعت انکوبه شدند. سپس 100 میکرولیتر محلول MTT اضافه کردیم({0}}.5 درصد، 3-(4،5-دی متیل تیازول-2-یل)-2، 5 دی فنیل-2H تترازولیوم بروماید) به هر یک خوب و سلول ها را به مدت 2 ساعت دیگر انکوبه کنید. پس از حذف محیط کشت، 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکسید 100 درصد (DMSO) اضافه کردیم، سلول ها را به مدت 10 دقیقه تکان دادیم و جذب را در 590 نانومتر با دستگاه میکروپلیت ریدر (میکروپلیت خوان Epoch 2، BioTek، ایالات متحده آمریکا) اندازه گیری کردیم.
4) اندازه گیری تولید پروکلاژن نوع I
غلظت پروکلاژن نوع I در محیط کشت سلولی با استفاده از کیت ELISA تجاری موجود (Procollagen type I C-peptide EIA Kit, MK101, TaKaRa) اندازه گیری شد.Bio، ژاپن) طبق دستورالعمل سازنده. هر نمونه در سه تکرار مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
5) اندازه گیری سطوح بیان mRNA با استفاده از روش کمی
واکنش زنجیرهای پلیمراز بلادرنگ (qRT PCR) سلولها با سرعت 1×1{7}}5 سلول در چاه روی صفحات {3} چاه کاشته شدند. سلول های HDFn به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. سپس سلول ها با گلوکز بالا DMEM بدون FBS به مدت 24 ساعت هماهنگ شدند. محیط با محیط های بدون سرم جایگزین شد و با غلظت های 0 تیمار شد. به مدت 24 و 48 ساعت استخراج RNA با سلولهای HDFn با استفاده از کیت استخراج RNA (TaKaRa MiniBEST Universal RNA استخراج کیت، 9767A، Takara Bio، ایالات متحده آمریکا) انجام شد و نمونهها طبق پروتکلهای سازنده خالصسازی شدند. RNA جدا شده (1 میکروگرم) با استفاده از کیت معرف TR (Kit معرف PrimeScriptTM RT with gDNA Eraser، RR047A، Takara Bio، USA) در cDNA سنتز شد. با استفاده از SYRB Green Realtime PCR Master Mix (Power SYBRTM Green PCR Master Mix, 4367659, Applied BiosystemsTM, USA) و QuantStudioTM 3 (QuanStudioTM 3 Real-Time PCR, A28132, Thermo Fisher Scientific, USA) real- thermo Fisher Scientific, USA سطوح بیان ژن با ژن خانه داری گلیسرآلدئید 3-فسفات دهیدروژناز (GAPDH) استاندارد شد. پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول 2 ارائه شده است. آزمایش ها در سه تکرار مستقل انجام شد. تجزیه و تحلیل منحنی ذوببرای هر مجموعه پرایمر انجام شد.
6) آنالیز وسترن بلات
لیزهای پروتئینی از سلول های فیبروبلاست با یک بافر لیز استخراج شد (EzRIPA Lysis Kit، WSE{0}}؛ ATTO Corporation، ژاپن). برای تعیین کمیت پروتئین ها از روش برادفورد استفاده شد.مقادیر مساوی از پروتئین ها با بافر نمونه 5X (TLP{1}}، TransLab، کره) مخلوط و در دمای 99 درجه به مدت 10 دقیقه دناتوره شدند. پروتئین ها توسط 10 درصد SDS-PAGE در ولتاژ 150 ولت به مدت 150 دقیقه جدا شده و به غشاهای PVDF (Clear Blot Membrane, 3322546, ATTO Corporation, Japan) منتقل شدند. غشاها با 0.5 درصد آلبومین سرم گاوی (BSA, A{11}}G; Sigma) به مدت 1 ساعت مسدود شدند و با سالین بافر Tris که شامل Tween{14}} (10X TBS با Tween 30, TR{) بود، شسته شدند. {17}}؛ Biosesang، کره) سه بار. سپس غشاها با آنتی بادیهای اولیه علیه MMP انکوبه شدند کره) در دمای 4 درجه یک شبه. پس از شستشو، غشاها با آنتی بادی ضد IgG ترب پراکسیداز (HRP) (Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody, #7074; Cell Signaling Technology, USA) به عنوان آنتی بادی ثانویه تحت درمان قرار گرفتند. به مدت 1 ساعت تشخیص نورتابی شیمیایی با استفاده از معرف تشخیص وسترن بلات ECL Prime (GE Healthcare، USA) و ATTO WSE{34}} LuminoGraph (شرکت ATTO، ژاپن) انجام شد. برای تجزیه و تحلیل کمی، تصاویر گرفته شده با Image آنالیز شدند. نرم افزار (CS Analyser 4، ATTO Corporation، ژاپن).
7) تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از GraphPad Prism نسخه 3.03 برای ویندوز (نرم افزار GraphPad، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. نتایج به عنوان میانگین ± انحراف معیار 3 آزمایش ارائه شده است. جفت نشدهاز آزمون t-student و مقادیر p استفاده شد<0.05 were considered statistically significant.
2. ارزیابی اثربخشی in vivo
1) معرف ها و محصولات آرایشی و بهداشتی
محصولات آزمایشی لوسیون پوست، کرم اسانس و کرم دور چشم بودند. آن کرم ها حاوی 1 درصد MHE به عنوان ماده فعال نشان داده شده در جدول 3 بودند.
2) شرکت کنندگان انسانی
همه داوطلبان با هدف و محتوای آزمون موافقت کردند و قبل از شروع آزمون، فرم های رضایت نامه کتبی آگاهانه را امضا کردند. آنها مجاز به استفاده از هیچ محصول مراقبت از پوست دیگری نبودند و محصولات آزمایشی به ترتیب کرم پوست-چشم (فقط روی پای کلاغ) - کرم-لوسیون اسانس روی صورت استفاده شد. این مطالعه بر اساس دستورالعملهای اعلامیه هلسینکی انجام شد و توسط هیئت بازبینی نهادی موسسه ملی سیاستهای اخلاق زیستی کره (#P{3}}) تأیید شد.
3) تست اثربخشی
21 آزمودنی زن بین 45 تا 55 سال (میانگین ± انحراف معیار 2±81/50.{6}}) سال با پوست نرمال در این مطالعه شرکت کردند. محصولات آزمایش دو بار در روز (صبح و عصر) به مدت 4 هفته استفاده شد. شرکت کنندگان هر 2 هفته یک بار از مرکز تحقیقات بازدید می کردند و محل های آزمایش در آزمایشگاه اندازه گیری می شد که دمای محیط و رطوبت نسبی به ترتیب 2±22 درجه و 5±50 درصد حفظ شد. شرکت کنندگان پس از شستن صورت خود به مدت 20 دقیقه در آزمایشگاه عادت کردند و از نظر هیدراتاسیون پوست، خاصیت ارتجاعی، بافت و پای کلاغی مورد ارزیابی قرار گرفتند. هیدراتاسیون پوست با استفاده از Corneometer® CM825 (C plus K electronic GmbH، کلن، آلمان) اندازه گیری شد. خاصیت ارتجاعی با استفاده از Cutometer® MPA 580 (C plus K electronic GmbH، کلن، آلمان)، و بافت و پای کلاغ با استفاده از DermaTOP 3D-HE (EOTECH SAS، فرانسوی) اندازهگیری شد.
4) ارزیابی عوارض جانبی پوست
عوارض جانبی در هر مراجعه با پرسشنامه و مشاهده بررسی شد. در ارزیابی، پارامترهای ذهنی به عنوان خارش، سوزش، غلغلک، سوزش، سوزش،سفتی و سفت شدن، و پارامترهای هدف به عنوان اریتم، ادم، پوسته، و پاپول طبقه بندی شدند.
5) تجزیه و تحلیل آماری
داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل شدند. اهمیت آماری تفاوت بین نقاط زمانی با استفاده از تجزیه و تحلیل اندازه گیری های مکرر تعیین شد. یک مقدار p<0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد. نرخ تغییر (درصد) از مقدار پایه به صورت زیر محاسبه شد:
نرخ تغییر=((پس از درمان-پایه)/پایه)×100 درصد
