انتقال کاتیون آلی افزایش یافته استرس برشی آپیکال در انسان OCT2/MATE1-سلول‌های کلیه سگ مادین-داربی ترانسفکت شده شامل سنجش مژگانی است

برای اطلاعات بیشتر:emily.li@wecistanche.com

آیشواریا جایاگوپال، پل آر بریکمن، پیتر سولر، نیکلاس فرل، ویلیام فیسل، دینا ال. کروتز و شووو روی

گروه های مهندسی زیستی و علوم درمانی (AJ، PS، DLK، SR) و اطفال (PRB)،

دانشگاه کالیفرنیا سان فرانسیسکو (UCSF)، سانفرانسیسکو، کالیفرنیا؛

و گروه پزشکی، بخش نفرولوژی، مرکز پزشکی دانشگاه واندربیلت، نشویل، تنسی (NF, WF)

چکیده

حمل و نقل فعال توسطکلیهلوله های پروگزیمال نقش مهمی در دفع دارو دارند. در طول توسعه دارو، تخمین زده می شودکلیهدفع برای تعیین دوز ضروری است. بیورآکتورهای کلیه که همزادهای فیزیولوژیک کلیه را بازتولید می کنند، مانند تنش برشی ناشی از جریان، ممکن است بهتر از مدل های in vitro فعلی، رفتار دارویی را در داخل بدن پیش بینی کنند. در این مطالعه، ما نقش تنش برشی بر انتقال فعال 4-(4-(دی متیل آمینو)-استیریل)-N-متیل پیریدینیم یدید (ASP plus) توسط سگ مدین داربی را بررسی کردیم.کلیهسلول هاانتقال دهنده های کاتیون آلی انسانی انتقال دهنده کاتیون آلی 2 (OCT2) و پروتئین اکستروژن چند دارویی و سمی 1 (MATE1) را به صورت برون زا بیان می کند. سلول‌هایی که در یک صفحه موازی تحت پرفیوژن مداوم محیط کشت داده شدند، یک تک لایه محکم با مانع بالایی برای اینولین تشکیل دادند. در پاسخ به افزایش سطوح تنش برشی (0.2-2 dynes/cm)، سلول‌ها افزایش متناظری در انتقال ASP plus را نشان دادند که به حداکثر 4.{7}}برابر افزایش در 2 رسید. dynes/cm² در مقایسه با سلول های کشت شده در شرایط استاتیک. این انتقال با ایمی پرامین مهار شد، که نشان می دهد انتقال فعال در شرایط تنش برشی وجود دارد. سلول‌های در معرض تنش برشی 2 dynes/cm² نیز افزایش بیان RNA را در انسان‌های ترانسفکت‌شده و OCT2 درون‌زا (به ترتیب 3.{12}} و 2.{14}} برابر نشان دادند). حذف مژه ها توسط سولفات آمونیوم اثرات برش را بر روی انتقال ASP به علاوه 0.5 dynes/cm² بدون تأثیر بر انتقال ASP به علاوه تحت شرایط استاتیک حذف کرد. این نتایج نشان می دهد که تنش برشی بر انتقال فعال کاتیون های آلی در داخل تأثیر می گذاردکلیهلوله ایسلول های اپیتلیال به شیوه ای وابسته به مژک.

سیستانچ برای عملکرد کلیه مفید است

مقدمه

علیرغم پیشرفت‌های عمده در روش‌های پیش بالینی برای انتخاب داروی بهینه، توسعه دارو یک فرآیند طولانی و پرهزینه باقی می‌ماند که بازدهی بسیار پایینی از موجودیت‌های مولکولی جدید به بازار دارد (واتکینز، 2011). کمبود عمده مدل های پیش بالینی ناتوانی در پیش بینی پاکسازی و سمیت در انسان است. تقریباً 30 درصد از داروهایی که در مطالعات پیش بالینی موفقیت آمیز هستند در نتیجه مقادیر کلیرانس یا سمیت پیش بینی نشده در انسان شکست می خورند (کولا و لندیس، 2004).

کلیه هدف مهمی برای مدل‌سازی کشت سلولی آزمایشگاهی است زیرا مسئول حذف بیش از یک سوم داروها و اکثر متابولیت‌ها است (Morrissey et al., 2013). راکلیهلوله پروگزیمال برای آزمایش دارو در طول توسعه مهم است زیرا بیشتر حمل و نقل فعال داروها را انجام می دهد و به ویژه به آسیب سمی حساس است (Giacominiet al., 2010). راکلیهلولهتک لایه ای از سلول های اپیتلیال با فیلتر در سراسر سطح آپیکال جریان دارد. یک غشای پایه زیر اپیتلیوم لوله ای قرار دارد و مویرگ های اطراف لوله مجاور امکان جذب مجدد آب و سلام را فراهم می کنند. ریزمحیط لوله پروگزیمال، به ویژه تنش برشی سیال و گرادیان های انکوتیک آپیکوبازال، به طور ناقص با تکنیک های کشت سلولی مرسوم بازتولید می شود. بیورآکتورهای سلول های اپیتلیال که فیزیولوژی برجسته در داخل بدن را می گیرند ممکن است دقت پیش بینی های پاکسازی و سمیت ناشی از سنجش های آزمایشگاهی را بهبود بخشند (Pfaller and Gstraunthaler, 1998؛ Astashkina et al., 2012).

شواهد رو به رشد نشان می دهد که مورفولوژی و عملکرد سلول لوله پروگزیمال می تواند با محیط رشد متفاوت باشد، مانند تخلخل سطح رشد، قرار گرفتن در معرض مایع در هر دو طرف، و/یا تنش برشی سیال. کار قبلی از Essig و Friedlander (2003)، و همچنین از آزمایشگاه ما (Ferrell et al.2010)، نشان داده است که بازآرایی ناشی از جریان مایع لوله ای در اسکلت سلولی اکتین آپیکال سلول های لوله پروگزیمال (Ferrell et al., 2010) . متعاقباً، چندین مطالعه نشان داده‌اند که تنش برشی بر سطوح بیان و محلی‌سازی جذب‌ها و انتقال‌دهنده‌های جریان متعدد، از جمله آنتی‌پورتر سدیم-هیدروژن 3. Na/K-ATPase، ناقل‌های گلوکز، کانال سدیم اپیتلیال و گیرنده‌های اندوسیتوز، مگالین و توبولین تأثیر می‌گذارد. (دوان و همکاران، 2010؛ رغوان و همکاران، 2014؛ یانسن و همکاران.. 2016؛ ارناندز و همکاران، 2018). کار دیگر نشان داده است که جریان برشی در یک سیستم بیوراکتور لوله‌ای جهت‌یابی و کشیده می‌شودکلیهلوله ایسلول ها در امتداد مسیر جریان (ونزاک و همکاران 2018). شواهد آزمایشگاهی نشان می‌دهد که برخی تغییرات در ساختار اسکلت سلولی و عملکرد انتقال احتمالاً به عملکرد حسی مژگان مرتبط است (Overgaard et al.. 2009; Raghavan et al.. 2014). با این حال، مطالعات کمی اثر تنش برشی بر ناقلین دارو در سلول‌های کلیوی را در نظر گرفته‌اند. علاوه بر این، اطلاعات کمی در مورد تأثیر نرخ های برشی مختلف بر عملکرد سلول، به ویژه با قرار گرفتن در معرض تنش برشی پایدار، وجود دارد. اکثر مطالعات نرخ تنش برشی منفرد را در نظر گرفته اند و فقط آزمایش های کوتاه مدت (1-6 ساعت) را انجام داده اند، که تمایز بین اثرات واقعی برش و پاسخ تنش سلولی به تغییرات ناگهانی در ریزمحیط را دشوار می کند (Duan). et al.2010؛ Jang et al2013: Maggiorani et al.2015).

در اینجا، یک بیوراکتور میکروسیال برای بررسی اثر سطوح درجه بندی تنش برشی بر روی استفاده شدکلیهناقل داروی سلول توبول پروگزیمال ناقل کاتیون آلی 2 (OCT2) و پروتئین اکستروژن چند دارویی و سمی 1 (MATE1). ما نشان می‌دهیم که افزایش تنش برشی آپیکال منجر به افزایش انتقال کاتیون‌های آلی و بیان ناقل می‌شود و مژک‌ها در این پاسخ سلولی به تنش برشی نقش دارند.

مواد و روش ها

ساخت و مونتاژ دستگاه. ما قبلاً طراحی خود را برای یک بیوراکتور صفحه موازی منتشر کرده‌ایم که یک مسیر جریان سیال با ارتفاع قابل تنظیم در سراسر سمت آپیکال سلول‌ها و یک مخزن ساکن در سمت پایه ارائه می‌کند (Brakeman et al., 2016). برای کار ارائه شده در اینجا، ما طراحی قبلی خود را برای ایجاد یک دستگاه مالتی پلکس با چهار مسیر جریان مجزا تطبیق دادیم تا امکان آزمایش چهار شرایط بیولوژیکی را به طور همزمان فراهم کند (شکل 1). هر دستگاه از سه لایه تشکیل شده است: یک پایه با یک مخزن آپیکال 5-ml، یک صفحه میانی برای نگه داشتن درج Snapwell (Costar، Corning، Corning، NY) با سطح سلولی 1.12 سانتی متر مربع، و صفحه بالایی حاوی یک مخزن پایه جانبی 1-تا 2-ml. بشقاب ها

از پلی سولفون ماشین کاری شدند تا امکان عقیم سازی با اتوکلاو فراهم شود. واشرهای سیلیکونی برش لیزری با ارتفاع 500- تا 1000- um بین هر مجموعه از صفحات برای آب بندی محفظه های مایع و در سمت آپیکال برای تعیین ارتفاع کانال قرار داده شد. بیوراکتور با استفاده از پیچ مونتاژ شد. مخزن رسانه و تله حباب در ستون ساخته شده بود. ورودی ها و خروجی ها با استفاده از اتصال دهنده های خاردار به لوله سیلیکونی Masterflex LS14 با قطر داخلی 1.{6}} میلی متر (Cole Parmer Lab Supplies، Vernon Hills، IL) متصل شدند. جریان سیال و در نتیجه تنش برشی آپیکال توسط یک پمپ پریستالتیک (کول پارمر) تنظیم و کنترل شد.

کشت و جریان سلولی سلول‌های MDCK ترانسفکت‌شده با یک ناقل خالی یا یک جفت انتقال‌دهنده جذب و خروج (hOCT2/hMATE1) (Konig و همکاران..2{15}}11) توسط دکتر مارتین فروم (ارلانگن، آلمان) ارائه شد و در کشت داده شد. حداقل محیط ضروری با محلول نمک متعادل Earle (UCSF Cell Facility) با 10 درصد سرم جنین گاوی (Gibco، Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA) و 1 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین (UCSF Cell Facility). پانصد میکروگرم در میلی لیتر هیگرومایسین (UCSF Cell Facility) و 100 میلی گرم در ساعت ژنتیکین (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) به محیط سلول های ترانسفکت شده دوگانه اضافه شد. برای آزمایش های جریان، سلول hOCT2/hMATE1 MDCK در قسمت زیرین درج های اسنپول (کورنینگ) با تراکم 300،{11}} سلول/چاه (250،000 سلول/سانتی متر")، در شرایط ایستا تا زمان تلاقی رشد کردند و سپس در جریان محیط آپیکال طی 7 روز از 0.1 به 1-6 میلی‌لیتر در دقیقه افزایش یافت تا اینکه تنش برشی مورد نظر حاصل شد و سپس به مدت 72 ساعت قبل از آزمایش پایدار ماند. سلول‌ها در شرایط ایستا برای مدت زمان مشابه با گروه شاهد رشد کردند. .

ایمونوفلورسانس. سلول ها با 4 درصد پارافورمالدئید (Thermo Fisher Scientific)، نفوذپذیر با 0.1 درصد Triton-Xin PBS (Sigma-Aldrich) و با آلبومین سرم گاوی (Sigma-Aldrich) مسدود شدند. آنها متعاقبا با رقت 1:50 آنتی بادی مونوکلونال موش zonula occludens{9}} نشاندار شده با Alexa 488 (Life Technologies، Carlsbad، CA) یا یک آنتی بادی مونوکلونال استیله-توبولین اولیه موش (Life Technologies) به مدت 60 دقیقه انکوبه شدند. سلول های تیمار شده با آنتی بادی a-tubulin سپس با یک آنتی بادی ثانویه 561 ضد موش بز (Life Technologies) و فالویدین (Thermo Fisher Scientific) برای رنگ آمیزی F-اکتین انکوبه شدند. تصویربرداری با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال طیفی نیکون (توکیو، ژاپن) با یک شی نفتی 40 برابر انجام شد.

عملکرد مانع. اینولین، یک پلیمر 5000 Da، یک نشانگر شناخته شده سرعت فیلتراسیون گلومرولی است و نشانگر نشتی لوله پروگزیمال در داخل بدن است (Sohtell et al, 1983):

اینولین با برچسب FITC (Sigma-Aldrich) به محیط آپیکال اضافه شد و اجازه داده شد تا از طریق دستگاه ها جریان یابد. نمونه‌ها هر 24 ساعت از مخزن پایه جمع‌آوری شد و محتوای اینولین را با استفاده از صفحه‌خوان فلورسانس Genios Pro (Tecan، Mannedorf، سوئیس) تجزیه و تحلیل کردند. عملکرد مانع تک‌لایه سلولی از سطوح اینولین اندازه‌گیری شده در محفظه‌های آپیکال و پایه، همانطور که با معادله 1 توضیح داده شده است، محاسبه شد. اینولین نشت به صورت غلظت در محفظه پایه (اهداکننده) تقسیم بر مساحت سلول پس از 24 ساعت محاسبه شد.

ASP پلاس حمل و نقل. همانطور که قبلاً توضیح داده شد، ژن‌های انتقال‌دهنده با 10 میلی‌مولار Na-butyrate (Sigma-Aldrich) 24 ساعت قبل از آزمایش انتقال القا شدند (Konig et al, 2011). در صورت لزوم، سلول ها با یک مهارکننده (500μM ایمی پرامین یا 1 میلی مولار سایمتیدین (Sigma-Aldrich)) در سمت پایه به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند و سپس 25μM 4-({11}}dimethylamino) اضافه شد. استایریل-N-متیل پیریدینیم (ASP plus) (Life Technologies) و انکوباسیون به مدت 1 ساعت. نمونه ها از محیط های آپیکال و پایه جمع آوری شد. سپس سلول ها با سالین بافر فسفات سرد سه بار شستشو داده شدند و برای اندازه گیری ASP به علاوه تجمع و انتقال لیز شدند. آزمایش‌های حمل و نقل به طور همزمان روی سلول‌های تحت تنش برشی انجام شد و در شرایط استاتیک کشت داده شدند. غلظت ASP پلاس بر روی یک صفحه خوان صفحه فلورسانس Genios Pro (Tecan) در طول موج تحریک 485 نانومتر و طول موج انتشار 590 نانومتر اندازه‌گیری شد.

تعیین کمیت پروتئین سلول ها با بافر لیز 1 درصد SDS{1}} M NaOH در حالی که در طول شب تکان داده شدند، لیز شدند. محتوای پروتئین با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA استاندارد پیرس (Thermo Fisher) اندازه گیری شد. در صورت لزوم، محتوای پروتئین به ناحیه رشد سلولی نرمال شد.

بیان RNA RNA با استفاده از کیت استخراج RNA RNeasy (Qiagen, Hilden, Germany) از سلول ها استخراج شد و cDNA با استفاده از کیت اسکریپت (Bio-Rad, Hercules, CA) تولید شد. cDNA برای تشخیص OCT2 و MATE1 انسان و سگ استفاده شد. سگ P-گلیکوپروتئین (P-GP) با واکنش زنجیره ای پلیمراز رونوشت معکوس کمی با استفاده از روش Tagman و پروب (Applied Biosystems) بر روی ابزار Fast Realtime PCR (Applied Biosystems). پروتئین ریبوزومی S18 (RS{7}}) به عنوان کنترل خانه داری استفاده شد. اثر تنش برشی بر بیان ناقل با استفاده از روش 4ACt با استفاده از سطوح ناقل بیان شده نسبت به RS{9}} تجزیه و تحلیل شد (پیترز و همکاران 2007؛ اشمیتگن و لیواک، 2008). P-GP به عنوان اندازه گیری اثرات کلی تنش برشی بر بیان ناقل استفاده شد.

تسلیم شدن. سلول ها تا محل تلاقی رشد کردند و سپس در غیاب یا حضور 30 ​​میلی مولار سولفات آمونیوم (Fluka AG) به مدت 24 ساعت قبل از اندازه گیری ASP به علاوه انتقال انکوبه شدند (Oxegard et al 2009). وجود گل مژه با تصویربرداری از a-tubulin همانطور که قبلاً در اینجا توضیح داده شد تعیین شد.

آمار. همه آزمایش ها در سه تکرار با حداقل دو تکرار فنی در هر آزمایش انجام شد. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان می شوند و به صورت نمودارهای جعبه و ویسکر ترسیم می شوند. تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه یا دو طرفه جفت نشده و یک مقدار P از<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

نتایج

مورفولوژی سلولی و عملکرد سد. تجزیه و تحلیل اخیر ایمونوفلو از سلول‌هایی که در زیر جریان قرار گرفته‌اند، تشکیل تک لایه یکنواخت را با پروتئین پیوند محکم، zonula occludens{1}} نشان داد که در اتصالات محکم بین سلول‌ها در هر دو شرایط استاتیک و جریان قرار گرفته است (شکل 2، A-C). کمی سازی محتوای پروتئین کل تا 1.{4}}برابر افزایش محتوای پروتئین در هر سانتی متر مربع از تک لایه در پاسخ به تنش برشی نشان داد (شکل 2D). سپس، نفوذپذیری اینولین، نشانگر نشتی لوله پروگزیمال، در سراسر تک لایه را اندازه‌گیری کردیم. دستگاه ها نرخ عملکرد مانع 97.9 درصد 6 1.42 درصد را طی 7 روز کشت تحت حداکثر 2 dynes/cm2 تنش برشی حفظ کردند (شکل 2E)، که منجر به نرخ نشت اینولین نهایی در روز 6 از { {15}}.13-0.69 mg/cm2 در روز.

اثر تنش برشی بر انتقال کاتیون آلی. انتقال ASP plus، یک بستر خودکار فلورسنت OCT2 و MATE1، به مدت 1 ساعت در سطوح مختلف تنش برشی ({4}}) اندازه‌گیری شد.2-2 dynes/cm²). سلول‌های MDCK که به‌طور اگزوژن hOCT2 و hMATE1 را بیان می‌کنند، افزایش 4.{9} برابری در ASP به علاوه انتقال در پاسخ به تنش برشی 2 dynes/cm² نشان دادند که در اندازه‌گیری‌های تجمع سلولی (شکل 3A) و انتقال بین سلولی منعکس شده است (شکل. 3B). اثر تنش برشی بر ASP به علاوه تجمع یا انتقال بین سلولی تحت تنش برشی 0.5 و 2 dynes/cm² مشابه بود. برای تعیین اینکه آیا حمل و نقل فعال ASP پلاس افزایش یافته است، انتقال ASP پلاس توسط سلول‌هایی که در معرض تنش برشی 0 قرار گرفته‌اند، با یا بدون پیش تیمار با 500 میکرومولار ایمی پرامین، یک OCT اندازه‌گیری شد{20} } و MATE{21}}مهارکننده خاص. انتقال ASP پلاس توسط ایمی پرامین 60.3 ± 15.8 درصد تحت شرایط تنش برشی در مقایسه با 47.6 ± 19.7 درصد در شرایط استاتیک مهار شد (شکل 3C).

برای درک بیشتر این مشاهدات، اثر تنش برشی بر بیان OCT2 انسان (ترانسفکت شده)، OCT2 سگ (درون زا)، و سگ P-GP (درون زا) در سلول‌هایی که در معرض سطوح مختلف برش قرار داشتند به مدت 72 ساعت پس از یک آزمایش اندازه‌گیری شد. افزایش آهسته برش در طی 7 روز (شکل 4). در مقایسه با سلول‌های کشت‌شده در شرایط استاتیک، سلول‌های MDCK در معرض برش، افزایش بیان OCT2 انسان ترانسفکت شده و درون‌زا (به ترتیب تا 3.{9}} و 2.{11}} برابر) را نشان دادند، بدون اینکه تأثیر معنی‌داری داشته باشند. در بیان MATE1 ترانسفکت شده یا P-GP درون زا.

نقش سیلیا در پاسخ به برشی. تصویربرداری نشان داد که سلول‌های MDCK دو ترانسفکت شده، مژک‌ها را در هر دو شرایط ساکن و جریان بیان می‌کنند (شکل 5، A و E). قرار گرفتن سلول ها در معرض 3{12}} میلی مولار سولفات آمونیوم به مدت 24 ساعت باعث از بین رفتن کامل مژک ها شد (شکل 5، C و G). نکته مهم این است که deciliation هیچ تاثیر فاحشی بر اتصالات غشای سلولی نداشت، همانطور که با تصویربرداری از F-اکتین اندازه‌گیری شد، که پروتئین‌های اتصال محکم را در اتصالات غشای سلولی در سلول‌های اپیتلیال لنگر می‌اندازد (شکل 5.D و HD (Stevenson و Begg. اگرچه مقداری ضخیم شدن رنگ آمیزی F-اکتین در این تصاویر وجود دارد، اما این یک یافته ثابت نبود، و بنابراین ما این اثر را اندازه گیری نکردیم. ریزش اثری بر انتقال توسط سلول های کشت شده در شرایط ایستا نداشت، اما به طور کامل انجام شد. اثرات تنش برشی بر روی ASP به علاوه انتقال در سلول‌هایی که در معرض 0.5 dynes/cm² برش قرار داشتند را حذف کرد (شکل 6).

بحث

کلیه نقش اصلی را در دفع داروها در بدن انسان ایفا می کند. تقلید دقیق از پیچیدگی فیزیولوژی کلیه برای آزمایش دارو در شرایط آزمایشگاهی، به ویژه با توجه به جریان مایع، مهم است. نشان داده شده است که تنش برشی ناشی از جریان سیال بر مورفولوژی سلول و ناقلان یون در شرایط آزمایشگاهی تأثیر می گذارد، اما اطلاعات کمی در مورد اثرات آن بر ناقلین دارو وجود دارد (Duan et al., 2010; Ferrell et al., 2012; Jansen et al., 2016). . علاوه بر این، اکثر مطالعات قبلی فقط اثر برش کوتاه مدت (1-6 ساعت) را اندازه‌گیری کرده‌اند، که بعید است اثرات تنش برشی را از سایر پاسخ‌های تنش سلولی به طور کامل جدا کند (Duan et al.. 2010; Jang et al. 2013؛ Maggiorani و همکاران.. 2015. در این مطالعات، ما بر روی اثرات تنش برشی پایدار (7 روز) از جریان سیال بر حمل و نقل دارو متمرکز شدیم تا تنش برشی پایدار تجربه شده توسط را بهتر تقلید کنیم.کلیهلوله ایسلول ها در داخل بدن

درک چگونگی واکنش ناقلین دارو به تنش برشی پایدار می‌تواند پیش‌بینی‌های in vitro حمل و نقل دارو در داخل بدن توسط کلیه را بهبود بخشد. طراحی دقیق مدل‌های آزمایشگاهی کلیه ممکن است آزمایش‌های بالینی را استاندارد کرده و میزان شکست دارو را کاهش دهد.

در این کار، یک بیوراکتور میکروسیال صفحه موازی برای تعیین اثرات تنش برشی پایدار بر انتقال کاتیون‌های آلی توسط OCT2 و MATE1 درکلیهلولهخط تلفن. چندین رده سلولی برای این مطالعات در نظر گرفته شد، از جمله رده‌های سلولی انسانی مانند سلول‌های لوله پروگزیمال انسانی از گروه Hopfer (Orosz et al, 2004) و RPTECs (CRL{1}}: American Type Culture Collection, Manassas, VA)( ویزر و همکاران، 2008)، اما سلول های hOCT2/hMATE1 MDCK دو ترانسفکت شده به دلایل متعدد مناسب ترین انتخاب برای این مطالعه در نظر گرفته شدند. اول، سلول‌های MDCK پیوسته قوی به درج‌های transwell نشان می‌دهند که به آن‌ها اجازه می‌دهد در برابر استرس اولیه جریان سیال مقاومت کنند. دوم، این سلول‌ها تک لایه‌های محکمی را تشکیل می‌دهند، که از نشتی جلوگیری می‌کند و برای مطالعه انتقال بین سلولی بسترهای نشانگر ضروری است. در نهایت، بیان برون‌زای ناقل‌ها امکان تشخیص بهتر انتقال فعال و اثر اغتشاش‌ها را فراهم می‌کند.

سلول‌هایی که در زیر جریان قرار می‌گیرند، یک تک‌لایه هم‌آهنگ را تشکیل می‌دهند و یک پروتئین پیوند محکم را در حاشیه سلول قرار می‌دهند. آنها همچنین عملکرد مانع بالایی را که با نفوذپذیری اینولین اندازه گیری می شود، حفظ کردند. توانایی سلول های اپیتلیال برای تشکیل تک لایه ای که از نشت مایعات و پروتئین جلوگیری می کند برای عملکرد مناسب توبول بسیار مهم است. در اینجا، نشت از طریق سلول های MDCK کمتر از 1 ug/cm² در روز و به طور قابل توجهی کمتر از سلول های انسانی بود. ما قبلاً نشان داده‌ایم که تک‌لایه‌های سلولی کلیه انسان 10-20 ug/cm² در روز نشت اینولین دارند (Brakeman و همکاران، 2016)، که این نتیجه را تایید می‌کند که سلول‌های hOCT2/hMATE1 MDCK یک تک لایه قوی تشکیل می‌دهند.

انتقال ASP plus در سلول‌های hOCT2/hMATE1 MDCK که در معرض سطوح مختلف تنش برشی به مدت 72 ساعت در مقایسه با کنترل‌های استاتیک قرار داشتند، به طور قابل‌توجهی افزایش یافت. ASP plus توسط OCT2 (SLC22A2) جذب می شود و توسط MATE1 (SLC47A1)، دو انتقال دهنده کاتیون آلی که به طور هماهنگ برای تسهیل کار می کنند، ترشح می شود.کلیهترشح داروهای رایج مانند متفورمین و سیس پلاتین (Biermann et al.2006; Wittwer et al.2013). اثرات مشابهی از تنش برشی برای انتقال دهنده های یون لوله پروگزیمال گزارش شده است. افزایش جذب آلبومین، بازجذب یون، و بیان و عملکرد مگالین و توبولین در پاسخ به افزایش تنش برشی گزارش شده است (Overgaard et al.. 2009; Duan et al. 2010: Ferrell et al.. 2012: Raghavan et al., 2014). قرارگیری در معرضکلیهسلول‌های لوله پروگزیمال نسبت به تنش برشی نیز با کاهش آپوپتوز و بهبودی سریع‌تر از سمیت حاد سیس پلاتین و افزایش مهار انتقال آنیون آلی همراه است (Jang et al.2{1}}13). از آنجایی که تنش برشی ناشی از جریان مایع به طور مداوم در لوله پروگزیمال وجود دارد، این یافته‌ها در مجموع از استفاده از سیستم‌های مدل فیزیولوژیکی بیشتر در شرایط آزمایشگاهی برای پیش‌بینی وضعیت کلیوی و سمیت دارو حمایت می‌کنند. قابل ذکر است که تفاوت معنی داری در عملکرد ناقل بین 0.5 و 2.{6}} dynes/cm² تنش برشی وجود ندارد. مطالعات قبلی توسط Essig و Friedlander (2003) نشان داده بود که حداقل سطح برش 0.17 dynes/cm2 برای ایجاد تغییر در مورفولوژی سلول مورد نیاز است، و مطالعات دیگر اثرات آن را بر روی فیزیولوژی تا 1 dyne/cm² (دوان و همکاران، 2010). این اولین مطالعه ای است که به بررسی اثرات طیفی از سطوح تنش برشی بالاتر و پایدار بر عملکرد ناقل های داروی کلیوی می پردازد، و این امکان وجود دارد که میزان تفاوت بیولوژیکی بین 0.5 و 2.0 dynes/cm² تنش برشی که ما انجام دادیم. ارزیابی به اندازه کافی بزرگ نبود تا امکان شناسایی تفاوت بین این سطوح تنش برشی در سنجش ما را فراهم کند. اگرچه تحقیقات بیشتر مورد نیاز است، نتایج ما شرایط مورد نیاز برای مدل‌های مرتبط فیزیولوژیکی و اثرات افزایش سطوح تنش برشی ناشی از این بیماری را بر مدیریت داروی کلیوی روشن می‌کند.

یکی از محدودیت‌های روش‌های تجربی ما این است که ما فقط به انتقال در pH 7.4 با استفاده از محیط‌هایی با pH 7.4 در هر دو سمت آپیکال و پایه پرداختیم که روش‌های تجربی قبلاً برای سلول‌های hOCT2/hMATE1 MDCK را تقلید می‌کنند (Konig et al.. 2011). شیب pH آپیکال به پایه می تواند بر عملکرد OCT2 و MATE1 تأثیر بگذارد و معمولاً یک گرادیان pH در شرایط فیزیولوژیکی وجود دارد (Muller et al., 2013). بنابراین، روش‌های ما توانایی ما را برای ارزیابی برهم‌کنش بین گرادیان pH آپیکال تا پایه و تنش برشی بر روی عملکرد OCT2 و MATE1 محدود کردند. از آنجایی که ما از یک pHof7.4 ثابت در تمام شرایط تجربی استفاده کردیم، این فقدان گرادیان pH بعید است که بر یافته‌های ما تأثیر بگذارد، اما به طور بالقوه کاربرد یافته‌های ما را در انتقال OCT2 و MATE1 در حضور شیب pH آپیکال به پایه محدود می‌کند.

به طور شگفت انگیزی، بیان mRNA انسان ترانسفکت شده و OCT2 درون زا در سلول هایی که در معرض تمام سطوح تنش برشی قرار داشتند در مقایسه با گروه کنترل استاتیک افزایش یافت. این تنظیم مثبت بیان ناقل خاص بود، بدون هیچ اثر قابل اندازه گیری بر بیان P-GP درون زا یا MATE1 ترانسفکت شده. تنظیم مثبت بیان ناقل بینشی در مورد مکانیسم پشت افزایش انتقال می دهد و ممکن است نتیجه افزایش پایداری mRNA یا افزایش رونویسی mRNA باشد. جالب است بدانید که هر دو انتقال دهنده ترانسفکت شده و درون زا تنظیم مثبت شدند، که غیرمنتظره است زیرا OCT2 ترانسفکت شده تحت یک پروموتر سیتومگالوویروس بیان شد و نباید در معرض مکانیسم های تنظیمی بیان ژن درون زا قرار گیرد. اگرچه شگفت آور است، اما این مشاهده بی سابقه نیست. اثر مشابهی بر روی سلول‌های لوله پروگزیمال ترانسفکت شده OAT1 که در معرض پرفیوژن قرار گرفته‌اند گزارش شده است، اما مکانیسم افزایش بیان نامشخص است (Jansen et al., 2016). در مطالعه دیگری مشخص شد که سیگنال دهی Nrf2 در افزایش بیان MATE{7}K درون زا در پاسخ به تنش برشی نقش دارد (Fukuda et al., 2017). مطالعه بیشتر در این مورد ضروری است و موضوع تحقیقات آینده خواهد بود.

ما همچنین تشخیص دادیم که معرفی جریان برشی آپیکال باعث افزایش محتوای پروتئین در هر سانتی‌متر مربع سلول می‌شود. این اثر برای هر دو 0.5 و 2dynes/cm² برش یکسان بود، مشابه اثری که برای بیان mRNA و انتقال ASP به علاوه مشاهده می‌شود. شواهدی وجود دارد که نشان می دهد تنش برشی باعث بلندتر شدن قد می شودکلیهسلول های اپیتلیال، که منجر به حجم بیشتری از سلول ها در هر سانتی متر مربع و در نتیجه افزایش احتمالی پروتئین در هر سانتی متر مربع می شود. با این حال، این پدیده که قبلاً منتشر شده بود، تنها یک مشاهده جزئی در حجم وسیع‌تری از داده‌ها بود و اندازه‌گیری نشده بود (Long et al., 2017). افزایش پروتئین کل در سلول های رشد یافته در حضور جریان برشی آپیکال ممکن است نشان دهنده محتوای پروتئین طبیعی برای سالم باشد.کلیهلوله ایسلول های اپیتلیال که تنها با قرار گرفتن سلول ها در معرض جریان برشی آپیکال به دست می آیند. بنابراین، سطوح پایین‌تر محتوای پروتئین در سلول‌های رشد یافته در کشت استاتیک ممکن است نشان‌دهنده یک وضعیت سلولی غیرطبیعی باشد که می‌تواند از نظر بالینی در شرایط جریان پایین فیلتر آپیکال مانند آسیب حاد کلیه رخ دهد. این پدیده مستحق مطالعه بیشتر است.

جلیقه ها به داشتن نقش های حسی مکانیکی در لوله پروگزیمال شناخته شده اند (Raghavan and Weisz,2{14}}16). بنابراین، برای تعیین اینکه آیا آنها نقش مهمی در افزایش انتقال با واسطه OCT2 و MATE گزارش شده در اینجا دارند یا خیر، تأثیر حذف مژک بر عملکرد ناقل اندازه‌گیری شد. محاصره کامل افزایش وابسته به برش در ASP به علاوه حمل و نقل با حذف مژک در مطالعات ما مشابه اثری است که در مطالعات Raghavan و همکارانش یافت شد. (2{16}}14)، که در پاسخ به جریان مایع، یک دخیل وابسته به مژک در اندوسیتوز نشان داد. سولفات آمونیوم احتمالاً اثرات نامشخص دیگری بر رفتار و عملکرد سلول دارد که ممکن است به طور غیر مستقیم بر انتقال املاح تأثیر بگذارد. علیرغم اثرات احتمالی خارج از هدف، این روش کاهش نقش سنجش مژگانی را در حرکت املاح آلی با واسطه انتقال دهنده آزمایش می کند. مکانیسم سیگنال دهی بین پروتئین های حسی مکانیکی در مژک و ناقل در حال حاضر ناشناخته است. یک فرضیه این است که عملکرد ناقل کاتیون های آلی با انتقال یون تغییر یافته تغییر می کند. از بین بردن مژک ها برای تغییر تحرک املاح در سلول های لوله پروگزیمال، به ویژه با کاهش Nat/K پلاس شناخته شده است. مکان یابی غشای ATPase و اصلاح حمل و نقل پاراسلولی (Overgaard et al., 2009). ممکن است که این منجر به تغییرات در عملکرد MATE1 شود، یک ضد پورت وابسته به گرادیان H. فرضیه دیگر این است که سنجش تنش برشی بر بیان ناقلان کاتیون آلی تأثیر می گذارد. تنش برشی عملکرد MATE{11}K را از طریق سیگنال دهی Nrf2 تعدیل می کند (Fukuda و همکاران، 2017). سایر ناقلان کاتیون آلی ممکن است به تنش برشی پاسخ مشابهی بدهند که با برداشتن مژک‌های حسی مکانیکی از بین می‌رود. بسیاری از این ناشناخته است و نیاز به مطالعه بیشتر دارد. جالب توجه است، حذف مژک تأثیر قابل توجهی بر انتقال ASP به علاوه سلول‌های در معرض 0.2 dynes/cm² تنش برشی نداشت، اما اثر قوی هنگامی مشاهده شد که تنش برشی به 0.5 dynes/cm2 افزایش یافت. این نشان می دهد که مژک ها سطح تنش برشی آستانه را حس می کنند. به نوبه خود، تغییرات سیگنال مژگان در بیان و عملکرد ناقل قبل از اثرات قابل اندازه گیری بر روی حمل و نقل مورد انتظار است. به طور کلی، وابستگی انتقال کاتیون آلی به حس مژگانی تنش برشی، بینشی را در مورد مسیر سیگنال دهی حسی مکانیکی درگیر و حداقل سطح تنشی که ممکن است برای ایجاد یک پاسخ قوی به برش لازم باشد، فراهم می‌کند.

به طور خلاصه، این داده‌ها نشان می‌دهند که تنش برشی ناشی از جریان سیال تأثیر قابل‌توجهی بر عملکرد و بیان ناقل کاتیون آلی در سلول‌های MDCK دارد. علاوه بر این، دخیل حمل و نقل کاتیون آلی وابسته به حضور مژه بود. ما پیشنهاد می‌کنیم که تنش برشی آپیکال جزء مهمی از هر مدل‌سازی آزمایشگاهی استکلیهلوله ایسلول‌ها و احتمالاً جزء مهمی در مدل‌سازی کلیرانس ترشحی کلیه و سمیت کلیوی داروها هستند. مکانیسم خاصی که توسط آن سیگنال‌های تنش مکانیکی فعالیت و بیان ناقل را افزایش می‌دهند هنوز نامشخص است و نیاز به مطالعه بیشتر دارد.

منابع

Astashkina A, Mann B, and Grainger DW (2012) یک ارزیابی انتقادی از مدل‌های کشت سلولی آزمایشگاهی برای غربالگری و سمیت دارویی با کارایی بالا. Pharmacol Ther 134:82-106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E, and Ciarimboli G (2006) خصوصیات مکانیزم های تنظیمی و حالات ناقل کاتیون آلی انسانی 2. Am J Physiol Cell Physiol 290:C1521-C1531.

Brakeman P، Miao S، Cheng J، Lee CZ، Roy S، Fissell WH و Ferrell N (2016) یک بیوراکتور میکروسیالی مدولار با توان عملیاتی بهبود یافته برای ارزیابی سلول های اپیتلیال کلیوی پلاریزه. Biomicrofluidics 10:064106.

Duan Y، Weinstein AM، Weinbaum S و Wang T (2010) تغییرات ناشی از تنش برشی محلی سازی و بیان ناقل غشایی در سلول های لوله پروگزیمال موش. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T، Udwan K، Chassot A، Martin PY، and Feraille E (2018) نفرکتومی اتحادیه و تنش برشی مایع آپیکال، فراوانی ENaC را در جمع‌آوری سلول‌های اصلی مجرای کاهش می‌دهد. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763-F772.

Essig M and Friedlander G (2003) تنش برشی لوله ای و فنوتیپ سلول های لوله پروگزیمال کلیه. J Am Soc Nephrol 14 (ضمیمه 1): S33–S35.

Ferrell N، Desai RR، Fleischman AJ، Roy S، Humes HD و Fissell WH (2010) یک بیوراکتور میکروسیال با الکترودهای اندازه گیری مقاومت الکتریکی ترانس اپیتلیال (TEER) یکپارچه برای ارزیابی سلول های اپیتلیال کلیوی. Biotechn Bioeng 107:707-716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT, and Fissell WH (2012) مدیریت آلبومین توسط سلولهای اپیتلیال لوله کلیوی در یک بیوراکتور میکروسیالی. Biotechnol Bioeng 109:797-803.

Ferrell N، Ricci KB، Desai RR، Groszek J، Marmerstein JT و Fissell WH (2012) یک بیوراکتور میکروسیال برای مطالعات سلول های اپیتلیال تحت تنش برشی مایع. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y، Kaishima M، Ohnishi T، Tohyama K، Chisaki I، Nakayama Y، Ogasawara-Shimizu M، and Kawamata Y (2017) تنش برشی سیال بیان MATE{2}}K را از طریق فعال‌سازی مسیر Nrf2 تحریک می‌کند. Biochem Biophys Res Commun 484:358-364.

Giacomini KM، Huang SM، Tweedie DJ، Benet LZ، Brouwer KLR، Chu X، Dahlin A، Evers R، Fischer V، Hillgren KM، و همکاران. کنسرسیوم حمل و نقل بین المللی (2010) حمل و نقل غشایی در توسعه دارو. Nat Rev Drug Discov 9: 215-236.

Jang KJ، Mehr AP، Hamilton GA، McPartlin LA، Chung S، Suh KY، and Ingber DE (2013) لوله پروگزیمال کلیه انسان روی یک تراشه برای انتقال دارو و ارزیابی سمیت کلیوی. Integr Biol 5:1119-1129.

Jansen J، Fedecostante M، Wilmer MJ، Peters JG، Kreuser UM، van den Broek PH، Mensink RA، Boltje TJ، Stamatialis D، Wetzels JF، و همکاران. (2016) لوله های کلیه مهندسی زیستی به طور موثر سموم اورمیک را دفع می کنند. Sci Rep 6:26715.

Kola I and Landis J (2004) آیا صنعت داروسازی می تواند نرخ فرسایش را کاهش دهد؟ Nat Rev Drug Discov 3:711-715.

König J، Zolk O، Singer K، Hoffmann C و Fromm MF (2011) سلول‌های MDCK دو ترانسفکت‌شده که OCT1/MATE1 یا OCT2/MATE1 انسانی را بیان می‌کنند: عوامل تعیین‌کننده جذب و انتقال بین سلولی کاتیون‌های آلی. Br J Pharmacol 163:546-555.

Long KR، Shipman KE، Rbaibi Y، Menshikova EV، Ritov VB، Eshbach ML، Jiang Y، Jackson EK، Baty CJ و Weisz OA (2017) اندوسیتوز آپیکال لوله پروگزیمال توسط تنش برشی مایع از طریق یک مسیر وابسته به mTOR تعدیل می‌شود. Mol Biol Cell 28:2508-2517.

Maggiorani D، Dissard R، Belloy M، Saulnier-Blache JS، Casemayou A، Ducasse L، Grès S، Bellière J، Caubet C، Bascands JL، و همکاران. (2015) تغییر سازماندهی اپیتلیال ناشی از استرس برشی در سلول های لوله کلیوی انسان. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L, and Giacomini KM (2013) ناقلان کلیه در توسعه دارو. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503-529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K, and Fromm MF (2013) نقش ناقل کاتیون آلی OCT2 و پروتئین های اکستروژن چند دارو و سم MATE1 و MATE{3}} K برای انتقال و تعاملات دارویی لامیوودین ضد ویروسی. Biochem Pharmacol 86:808-815.

Orosz DE، Woost PG، Kolb RJ، Finesilver MB، Jin W، Frisa PS، Choo CK، Yau CF، Chan KW، Resnick MI، و همکاران. (2004) پتانسیل رشد، جاودانگی و تمایز سلول های توبول پروگزیمال انسان بالغ طبیعی. In vitro Cell Dev Biol Anim 40:22-34.

Overgaard CE، Sanzone KM، Spiczka KS، Sheff DR، Sandra A، and Yeaman C (2009) Deciliation با بازسازی چشمگیر اتصالات سلول های اپیتلیال و حوزه های سطحی همراه است. Mol Biol Cell 20:102-113.

Peters IR، Peeters D، Helps CR و Day MJ (2007) توسعه و کاربرد سنجش‌های ژن مرجع چندگانه (خانه‌دار) برای عادی‌سازی دقیق مطالعات بیان ژن سگ‌ها. Vet Immunol Immunopathol 117:55-66.

Pfaller W and Gstraunthaler G (1998) آزمایش سمیت کلیوی در شرایط آزمایشگاهی{1}}آنچه می دانیم و آنچه باید بدانیم. چشم انداز سلامت محیط 106 (ضمیمه 2): 559-569.

Raghavan V، Rbaibi Y، Pastor-Soler NM، Carattino MD، and Weisz OA (2014) تنظیم وابسته به تنش برشی اندوسیتوز آپیکال در سلول های توبول پروگزیمال کلیه با واسطه مژک های اولیه. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506-8511.

Raghavan V and Weisz OA (2016) تشخیص نقش حسی مکانیکی در تنظیم عملکرد لوله پروگزیمال. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1-F5.

Schmittgen TD and Livak KJ (2008) تجزیه و تحلیل داده های PCR بلادرنگ با روش مقایسه ای C(T). Nat Protoc 3:1101-1108.

Sohtell M, Karlmark B, and Ulfendahl H (1983) FITC-inulin به عنوان نشانگر توبول کلیه در موش صحرایی. Acta Physiol Scand 119:313-316.

استیونسون BR و Begg DA (1994) اثرات وابسته به غلظت سیتوکالاسین D بر اتصالات محکم و رشته های اکتین در سلول های اپیتلیال MDCK. J Cell Sci 107: 367-375.

Venzac B، Madoun R، Benarab T، Monnier S، Cayrac F، Myram S، Leconte L، Amblad F، Viovy JL، Descroix S، و همکاران. (2018) مهندسی لوله های کوچک با تغییر قطر برای مطالعه سازماندهی سلول های کلیه. Biomicrofluidics 12: 024114.

Watkins PB (2011) علوم ایمنی دارویی و گلوگاه در توسعه دارو. Clin Pharmacol Ther 89:788-790.

Wieser M، Stadler G، Jennings P، Streubel B، Pfaller W، Ambros P، Riedl C، Katinger H، Grillari J و Grillari-Voglauer R (2008) hTERT به تنهایی سلول های اپیتلیال توبول های پروگزیمال کلیه را جاودانه می کند بدون اینکه ویژگی های عملکردی آنها تغییر کند. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y, and Giacomini KM (2013) کشف مهارکننده های اکستروژن چند دارویی و سموم 1 (MATE1, SLC47A1) قوی از طریق پروفایل داروهای تجویزی و مدل سازی محاسباتی. J Med Chem 56:781-795.