مسیرهای وابسته به گیرنده هیدروکربن آریل و مسیرهای مستقل واسطه اثرات ضد پیری کورکومین قسمت 2

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

2.2.6. کشت EC انسانی اولیه

EC اولیه انسان (Lonza، کلن، آلمان) در محیط کشت پایه اندوتلیال کامل (EBM) (Lonza، کلن، آلمان) همراه با 1 میکروگرم در میلی لیتر هیدروکورتیزون، 12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره مغز گاو، 50 میکروگرم / میلی لیتر جنتامایسین، 10 نانوگرم در میلی لیتر فاکتور رشد اپیدرمی انسانی، و 10 درصد (o/v) سرم جنین گوساله در دمای 37 درجه و 5 درصد CO تا پاساژ سوم. پس از جدا شدن با 0.05 درصد (o/o)Trypsin/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Germany)، سلول ها در ظروف کشت 6 سانتی متری یا صفحات کشت 6 چاهی حداقل به مدت 18 ساعت قبل از ترانسفکشن یا درمان کشت داده شدند.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا کلیک کنید

2.2.7. انتقال گذرا EC

سلول ها همانطور که قبلا توضیح داده شد ترانسفکت شدند [65]. به طور خلاصه، EC با استفاده از معرف SuperFectTransfection (Qiagen، Hilden، آلمان) طبق دستورالعمل سازنده ترانسفکت شد. بیان بیش از حد یا کاهش AhR به ترتیب پس از 24 یا 48 ساعت به دست آمد. راندمان ترانسفکشن پس از بیان بیش از حد تقریباً 40 درصد بود.

2.2.8. سنجش زخم خراش EC

برای بررسی ظرفیت مهاجرت EC، سنجش زخم خراش همانطور که قبلا توضیح داده شد انجام شد [66]. در جزئیات، زخم ها در یک لایه سلولی با یک خراش دهنده سلولی در امتداد یک خط ردیابی قرار گرفتند. پس از آسیب، سلول های غیر چسبیده با شستشوی ملایم خارج شدند.عصاره سالسا سیستانچدرمان کورکومین مستقیماً پس از ایجاد زخم انجام شد. کور-زیره در DMSO حل شد و در غلظت نهایی 7.5 میکرومولار استفاده شد. مهاجرت EC با رنگ آمیزی سلول ها با 5 ug/mL 4'،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Carl Roth، Karlsruhe، آلمان) در PBS به مدت 5 دقیقه پس از تثبیت سلول ها تعیین شد. با 4 درصد (v/v) پارافورمالدئید به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق. تصاویر با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت Zeiss AxioVision Observer D1 (Carl Zeiss، Oberkochen، آلمان)) با بزرگنمایی 200- گرفته شده است. سلول های مهاجرت شده به داخل زخم از خط ردیابی به طور خودکار با استفاده از تابع آنالیز ذرات Image]1.52a]67I پس از جداسازی هسته های همپوشانی شمارش شدند.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

2.2.9. رنگ آمیزی ایمنی EC

EC با 4 درصد (o/v) پارافورمالدئید به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق ثابت شد. پس از نفوذپذیری و انسداد در 0.3 درصد (o/o) Triton-X 100 و 3 درصد (o/u) سرم طبیعی بز در PBS، سلول ها با آنتی بادی خرگوش علیه AhR (1:100، Abcam، کمبریج، انگلستان) یا Nrf2 (کلون D1Z9C، 1:100، Cell Signaling Technology، فرانکفورت، آلمان) رقیق شده در 1 درصد (o/v) سرم طبیعی بز در PBS یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد. سپس سلولها با PBS و با الکسا 594-همراه با IgG ضد خرگوش بز (1:500، Invitrogen، دارمشتات، آلمان) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد.ساقه سیستانچبرای رنگ‌آمیزی اکتین، سلول‌ها با Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:7{4}}، Invitrogen، دارمشتات، آلمان) به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. هسته ها با 0.5 ug/mL DAPI در PBS به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند و سلول ها با ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen، دارمشتات، آلمان) سوار شدند. تصاویر فلورسنت با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت Zeiss AxioVision Observer D1 با بزرگنمایی 400× یا 200× گرفته شد.

2.2.10. qPCR در سلول ها

کل RNA سلولی با ترکیب لیز در TRIzolTM با پردازش پایین دستی با استفاده از کیت کوچک RNeasy (Qiagen (Hilden، آلمان)) مطابق دستورالعمل سازنده جدا شد. سنتز cDNA با استفاده از کیت رونویسی معکوس QuantiTect9 (Qiagen (Hilden، آلمان) با 1 ug RNA طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. سطوح رونوشت نسبی با استفاده از PCR با استفاده از مخلوط اصلی qPCR 2x SYBR③ سبز و چرخاننده حرارتی Rotor-Gene Q (Qiagen (Hilden، آلمان)) تعیین شد. رونوشت پروتئین ریبوزومی L32 (rpl32) به عنوان مرجع استفاده شد و بیان نسبی با روش AC محاسبه شد [68]. از جفت آغازگرهای اینترون پوشاننده زیر استفاده شد: سرمایه (شماره الحاق ژن NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(ژن شماره پیوست NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGGCT3';sod2(شماره الحاق ژن NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC-3';rpl32(شماره الحاق ژن NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC{{ 41}}'.

2.3. موش

2.3.1. خطوط موش و پرورش

زن 8-12-هفته ("جوان") و {{2}ماهه ("پیر") دارای کمبود B6 AHR.{6}}AHRtmlBra/J (اشمیت و همکاران، 1996؛ ارجاع شده) تا اینجا به عنوان AHR-KO) موش ها به صورت هتروزی گوت در مرکز حیوانات IUF پرورش داده شدند. از نوع وحشی لاشه برای کنترل استفاده شد. موش ها پرورش داده شدند و تحت شرایط خاص بدون پاتوژن در یک چرخه 12/12 ساعت روشنایی تاریکی نگهداری شدند و غذای استاندارد (ssniff"MZ, SSNIFF, Soest, Germany) به صورت آزاد دریافت کردند. 2.3.2.qPCR در موش

RNA کل از بافت اندام سه موش WT و سه موش دارای کمبود AHR با TriZol جدا شد. سپس 400 نانوگرم RNA با استفاده از رونویسی معکوس M-MLV (Promega، Madison، WI، USA) و پرایمرهای هگزامر تصادفی رونویسی معکوس شد. سطوح بیان ژن به صورت تکراری برای هر بافت موش روی Rotor-Gene Q (Qiagen، Hilden، آلمان)، در حجم نهایی 15 میکرولیتری، حاوی 7.5 میکرولیتر Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad، Feldkirchen، آلمان) 1 uM از هر آغازگر اندازه گیری شد. 1.5 میکرولیتر cDNA و آب بدون RNase. راندمان پرایمر بین 90 درصد و 146 درصد بود. جدول S2 را برای توالی پرایمر و کارایی مشاهده کنید. سطوح بیان به بیان RPS6 به عنوان یک ژن خانه دار در همان نمونه با استفاده از {{ 14}}روش CT [69].

2.4. In Silico Analyses

مدل سازی همسانی CeAhR LBD

مدل ساختاری C. elegans AhR LBD (بقایای 267-372) با مدل‌سازی همسانی تولید شد. ساختارهای پرتو ایکس حوزه‌های PASB اعضای خانواده bHLH-PAS همولوگ که بالاترین هویت توالی (حدود 20 درصد) را با CeAhR PASB به اشتراک می‌گذارند به عنوان الگو استفاده شد: چرخه‌های خروجی حرکتی شبانه‌روزی kaput (CLOCK، PDB: 4F3L)، پروتئین 3 حاوی دامنه PAS عصبی (NPAS3، PDB: 5SY7)، عوامل القای هیپوکسی 20 (HIF2o، PDB: 3H82،4ZP4،3F1N) و lo (HIFlo، PDB: 4H6J). مدل با MODELLER[70-72] به دست آمد.مزایا و عوارض جانبی cistanche tubulosaمدل بهینه از بین 10 مدل تولید شده بر اساس بهترین DOPE SCORE [73] انتخاب شد. کیفیت مدل ها با استفاده از PROCHECK [74] ارزیابی شد. ساختارهای ثانویه توسط DSSPcont [75] نسبت داده شد. حفره اتصال در LBD های مدل شده با استفاده از سرور CASTp مشخص شد[76]. تجسم مدل ها با استفاده از PYMOL [77] انجام شد.

2.5. تجزیه و تحلیل آماری

در غیر این صورت، تجزیه و تحلیل های آماری در GraphPad Prism (نسخه 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) انجام شد. برای سنجش طول عمر/سلامت، تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از OASIS [53] انجام شد. تجزیه و تحلیل آماری داده های ریزآرایه در R (بنیاد R (وین، اتریش)) انجام شد. نمودارهای جعبه در GraphPad Prism (نسخه 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) ایجاد شدند و میانه (خط)،25-75ام صدک (جعبه) و 10-90صدک را نشان می دهند. (سبیل).

3. نتایج

3.1. کورکومین به روشی وابسته به AhR و مستقل باعث ارتقای طول عمر می شود

از دست دادن ahr-1 باعث ارتقاء سلامت و طول عمر C.elegans در شرایط پایه می‌شود[14] و بر ویژگی‌های مرتبط با سن در پاسخ به تعدیل‌کننده‌های AhR پستانداران، مانند بنزو[a]pyrene (BaP)، UVB تأثیر منفی می‌گذارد. نور و میکروبیوتا [25]. پلی‌فنول‌های غذایی، مانند کور-زیره، گروه مهمی از تعدیل‌کننده‌های AhR پستانداران را با اثرات طولانی‌مدت در C. elegans تشکیل می‌دهند [78,79] و ما اثر افزایش طول عمر کورکومین را برای ahr آن بررسی کردیم{10}} وابستگی کورکومین به طور قابل توجهی طول عمر و سلامتی C. elegans را به روشی وابسته به ahr{12}} افزایش داد (شکل 1A,B). قبلاً نشان داده‌ایم که از دست دادن ahr{14}} همچنین طول عمر را در مدل‌های بیماری هانتینگتون و بیماری پارکینسون افزایش می‌دهد، با بیان بیش از حد عضلانی پلی‌گلوتامین مستعد تجمع (polyQ40) و -synuclein (-syn) به ترتیب، در حالی که در همزمان با افزایش محتوای پروتئینی آنها [25]. جالب توجه است که تیمار کورکومین تعداد دانه‌های polyQ40 و -syn را به همان میزان از دست دادن عملکرد ahr{23}} افزایش داد (شکل 1C). کورکومین همچنین باعث افزایش طول عمر و توانایی حرکتی در این مدل‌های بیماری می‌شود (شکل 1DE)، اما اثرات از دست دادن ahr{26}} و مکمل‌سازی کورکومین در PolyQbackground (شکل 1D) افزودنی بود و عملکردهای محافظتی مستقل AHR{28}}را نشان داد. کورکومین حداقل در این پس زمینه به خطر افتاده.

شکل 1. کورکومین سلامت را به شیوه‌ای{1}}وابسته و مستقل به AHR ارتقا می‌دهد. منحنی های طول عمر (A) و طول عمر (B) نماتدهای wt و ahr{5}} تیمار شده با DMSO یا کورکومین. منحنی‌های بقا داده‌های تلفیقی از 290-300 کرم/شرایط را در 5 آزمایش نشان می‌دهند. آزمون آماری: آزمون log-rank، # معناداری در مقابل DMSO، * اهمیت در مقابل Wt، Bonferronip-value<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 واسطه اثرات ضد پیری کورکومین و کاهش ahr-1

در جستجوی عوامل موثر پایین‌دستی ممکن{0}}کورکومین وابسته به ahr، رویکردهای هدفمند و بی‌طرفانه را در پیش گرفتیم. ما بیان ژن‌های هدف کلاسیک AhR پستانداران را بررسی کردیم و بر روی ژن‌های Cyp تمرکز کردیم زیرا کورکومین بیان CyplA1 و CyplB1 را در سلول‌های پستانداران تغییر می‌دهد [80،81]. با این حال، کمی سازی 47 cyps مختلف در C.elegans توسط PCR نیمه کمی بلادرنگ (qPCR) نشان داد که تنها cyp{8}}B1 به طور قابل توجهی با کاهش ahr{11}} یا توسط کورکومین تنظیم شده است. به روشی وابسته به ahr-1-(شکل S1A-B)، در حالی که سه cyps دیگر (یعنی cyp{15}}A5، cyp{17}}A8 و cyp{19}}A1) بودند تنها در غیاب ahr توسط کورکومین افزایش می‌یابد-1(شکل S1). این داده‌ها، همراه با سایر آثار [25،82]، نشان می‌دهند که احتمالاً cyps اهداف اصلی CeAhR نیستند. این نیز توسط تجزیه و تحلیل رونویسی ما در جهش‌یافته‌های نوع وحشی و ahr-1 پشتیبانی می‌شود. در واقع، مطابق با نقش AHR{27}} در تعیین نورون [37،38،40،41]، تغییرات بیان ژن بین جهش‌های نوع وحشی و ahr{33}} غنی‌سازی در فرآیندهای مرتبط با رشد عصبی را نشان داد. و تمایز و بدون تغییر عمده در ژن‌های سم‌زدایی کلاسیک (شکل 2A). تجزیه و تحلیل qPCR برخی از ژن‌های با تنظیم بالا و پایین بین ahr-1(Jul45) و نوع وحشی (atf{40}} بیشتر وابستگی آنها به ahr{60}}در شرایط پایه (شکل 2B) را تایید کرد، اما نه UVB [25] و نه کورکومین (شکل 2C) به طور قابل توجهی بر بیان این ژن ها تأثیر نداشتند. ما تعجب کردیم که آیا تغییرات بیانی در این ژن ها به طور تکاملی حفظ شده است یا خیر و بیان آنها را در بافت های مختلف (به عنوان مثال، مغز، کبد، روده و خون) از نوع وحشی 8- و 18-ماهگی ارزیابی کردیم. موش های AhR KO. برخی از ژن‌ها تمایل به افزایش بیان را در موش‌های جوان (atf{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{-)))/5.5. همولوگ‌ها. مشاهده شد (شکل S2). این نتایج منعکس کننده تفاوت های احتمالی گونه های خاص یا فعالیت رونویسی AhR وابسته به بافت در پستانداران است که توسط تجزیه و تحلیل رونویسی کل حیوانات در C. elegans نادیده گرفته شده است. بررسی کامل ژن‌های متفاوت بیان‌شده بین C. elegans نوع وحشی و ahr{77}}(Jul45) نشان داد که بیان بسیاری از این ژن‌ها در C.elegans در طول پیری و توسط تعدیل‌کننده‌های AhR پستانداران رژیم غذایی تحت تأثیر قرار می‌گیرد. به عنوان مثال، کورستین و رسوراترول)[25]، بنابراین نقش AHR{80}} را در بیان ژن تعدیل‌شده با پلی فنل نشان می‌دهد. مطابق با این سناریو، داده‌های ریزآرایه نشان داد که بیشتر ژن‌هایی که به طور متفاوت در درمان کورکومین بیان می‌شوند، در واقع به روشی وابسته به ahr تنظیم می‌شوند (شکل 2D؛ جدول 1).عصاره cistanche tubulosaاز 47 ژن تغییر یافته توسط کورکومین در نوع وحشی (43 ژن با تنظیم بالا و 4 تا پایین)، تنها 5 ژن توسط کورکومین در ahr-1(ju145) القا شدند. در بین ژن‌های تنظیم‌شده توسط کورکومین به روشی وابسته به AHR، آنزیم‌های فاز Il بودند و جالب اینکه برخی از آنها (ugt{10}} و ugt-29) در یک جهت توسط کورکومین تنظیم می‌شدند. orby loss of ahr{12}} (جدول 1). بنابراین، ما بیان آن‌ها و ugt‌های اضافی (ugt-45 و ugt-57) را بررسی کردیم که در هنگام اعمال یک تحلیل آماری محدودتر که برای مقایسه‌های چندگانه تصحیح نشده بودند، متفاوت بیان شدند. از بین ژن‌های مورد بررسی، ugt{16}} در ahr{17}}(ijul45) و با درمان کورکومین افزایش یافت (شکل 3A,B). ما همچنین تغییراتی را در بیان برخی از ژن‌های سم‌زدایی بین نوع وحشی و موش های AhR KO به روشی وابسته به بافت. بیان افتراقی این ژن ها در مغز بالاتر بود، جایی که Ugt2a3 (ugt-9 و ugt-29 در C.elegans) پایین بود- و Hpgds (gst-4 در C. elegans) تنظیم شده بود (شکل S3A). هیچ تغییری در بیان هیچ یک از ژن‌های آزمایش‌شده در نمونه‌های کبد موش‌ها وجود نداشت (شکل S3B). مطابق با داده‌های C,elegans، همولوگ موش ugt{31} Ugt3a2 تمایل به بیان بیش از حد در موش را نشان داد. روده موش Ahr KO (شکل S3C). به طور قابل‌توجهی، ugt-45 RNAi از اثرات سودمند بر طول عمر و سلامت ناشی از کاهش کورکومین (شکل 3C,D) یا ahr-1 (شکل 3E,F) جلوگیری کرد که نشان می‌دهد این دو مداخله ممکن است به به طور مشترک سیگنال های پایین دست را مدوله می کنند تا فعالیت ضد پیری خود را استخراج کنند.

شکل 2. ژن هایی که به طور متفاوت توسط کورکومین تنظیم می شوند، در درجه اول به روشی وابسته به ahr تنظیم می شوند. (B, C) بیان قوی‌ترین ژن‌های تنظیم‌شده پایین و بالا بین wt و ahr{5}} [25] توسط qPCR در wt در مقابل ahr-1(B) و DMSO-vs ارزیابی شد. . نماتدهای تیمار شده با کورکومین (C). نمودارهای جعبه داده های 3 آزمایش را نشان می دهد. این عبارت نسبت به wt تیمار شده با DMSO (خط چین) نشان داده شده است. آزمون آماری:{12}}way ANOVA با آزمون مقایسه چندگانه توکی،*p-value<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

شکل 3.ugt-45 برای افزایش طول عمر جهش‌یافته‌های کورکومین و ahr-1 مورد نیاز است. (A, B) بیان ژن توسط qPCR در wt در مقابل ahr{3}}(A) و DMSO- در مقابل نماتدهای wt تیمار شده با کورکومین (B) ارزیابی شد. نمودارهای جعبه داده های 3 آزمایش را نشان می دهد. این عبارت نسبت به wt تیمار شده با DMSO نشان داده شده است (به صورت خط چین نشان داده شده است). آزمون آماری: 2-Way ANOVA با آزمون مقایسه‌های چندگانه Sidak، *p-value<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 و کورکومین به طور مستقل در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می کنند

خواص مفید پلی فنل ها اغلب به توانایی آنها در محافظت در برابر گونه های فعال اکسیژن (ROS) نسبت داده می شود|83،84]. از آنجایی که AhR در فرآیندهای ناشی از استرس اکسیداتیو [85-87] درگیر است، ما نمی‌دانیم که آیا کورکومین ممکن است بر فیزیولوژی حیوانات از طریق پاسخ‌های آنتی‌اکسیدانی تنظیم‌شده با AhR تأثیر بگذارد. ما مشاهده کردیم که جهش‌های ahr{5}} میتوکندری (mt)ROS بیشتری تولید می‌کنند و پتانسیل غشای میتوکندری کاهش یافته‌اند (شکل 4A,B)، دو پارامتر مرتبط با طول عمر [88،89]. در حالی که مطابق با پارادایم mitohormesis ahr{10}}(Jul45) mtROS کمی بیشتر تولید می‌کند و بیشتر عمر می‌کنند، این حیوانات نسبت به نوع وحشی به استرس اکسیداتیو حساس‌تر بودند. به طور خاص، اثرات مخرب ناشی از جوگلون و H2O2 بر روی پریدن، تحرک و بقای حیوانات در ahr{14}}(Jul45) به طور قابل توجهی قوی‌تر از نوع وحشی بود (شکل 4C-F). این داده‌ها نشان می‌دهند که کاهش AHR{18}} اثرات متیک حرکتی مفیدی در شرایط پایه دارد، در حالی که وجود آن برای محافظت از استرس اکسیداتیو مورد نیاز است، بنابراین دو پارامتر مرتبط با سن، یعنی طول عمر و مقاومت در برابر استرس، اغلب مرتبط هستند. در عوض، کورکومین به طور قابل‌توجهی مقاومت H، O، و ژوگلون را در جهش‌های نوع وحشی و ahr{21}} بهبود بخشید (شکل 4E,F)، که نشان می‌دهد کورکومین یک پاسخ آنتی‌اکسیدانی مستقل را برمی‌انگیزد. مطابق با تنظیم نامرتبط طول عمر و مقاومت در برابر استرس اکسیداتیو، خاموش کردن ugt{24}} بر حساسیت به استرس اکسیداتیو چه برای جهش‌یافته‌ها-1 یا حیوانات تحت درمان با کورکومین تأثیری نداشت (شکل 4G).بررسی cistanche tubulosaبنابراین، کورکومین از طریق ahr-1 و ugt-45 اثرات افزایش طول عمر دارد، اما از طریق مکانیسم‌های مستقل ahr-1- در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می‌کند.

3.4. Nrf2/SKN{3}} اثرات کورکومین مستقل از AhR را واسطه می‌کند

برای ارزیابی بیشتر تداخل AhR-کورکومین در ویژگی‌های مرتبط با سن، ظرفیت مهاجرت در EC اولیه انسان را اندازه‌گیری کردیم - نشانه‌ای برای عملکرد کشتی، که با افزایش سن کاهش می‌یابد [90] و با فعال‌سازی AhR کاهش می‌یابد [14]. در راستای فعالیت ضد پیری سرکوب ahr-1 و کورکومین، بیان بیش از حد AhR به طور قابل توجهی مهار شد، در حالی که کورکومین ظرفیت مهاجرت EC اولیه انسان را افزایش داد (شکل 5A). شایان ذکر است، القای توانایی مهاجرت توسط کورکومین در سلول های انتقال یافته با ناقل خالی یا AhR قابل مقایسه بود (شکل 5A). با این حال، مهاجرت سلول‌های تیمار شده با کورکومین به‌طور قابل‌توجهی با بیان بیش از حد AhR کاهش یافت: کورکومین در سلول‌های انتقال‌یافته خالی تا 60 سلول مهاجرت‌شده در هر میدان توان بالا را القا می‌کند، در حالی که در سلول‌های AhR تنها تا 25 سلول در هر میدان توان بالا (شکل) 5A). این داده‌ها نشان می‌دهند که اثر مهاجرتی کورکومین توسط مکانیسم‌های مستقل از AhR تعدیل می‌شود، اما احتمالاً با کاهش فعالیت AhR نیز تعدیل می‌شود. بعداً توزیع AhR درون سلولی و بیان cVpal را در EC انسانی تیمار شده با کورکومین تعیین کردیم، کورکومین بر جابجایی هسته‌ای AhR (شکل 5B) یا بیان سیپل (شکل 5C) تأثیری نداشت. در جستجوی مسیرهای تعدیل‌شده توسط کورکومین به شیوه‌ای مستقل از AhR، به پروفایل‌های رونویسی نماتد بازگشتیم تا فاکتورهای رونویسی تنظیم‌کننده ژن‌هایی را که به طور قابل‌توجهی با از دست دادن ahr{23}} یا با درمان کورکومین در حیوانات نوع وحشی تعدیل شده‌اند، پیدا کنیم (جدول 1). ). این در جستجوی silico فاکتور رونویسی ردوکس SKN-1، ارتولوگ Nrf2 انسانی (فاکتور هسته‌ای اریتروئید 2-مربوط به فاکتور 2) را شناسایی کرد، که فعال‌سازی آن توسط کورکومین [91] اغلب به‌عنوان یک واسطه احتمالی گزارش می‌شود. فعالیت آنتی اکسیدانی آن [92،93]. بر این اساس، نمونه اولیه ژن وابسته به C.elegans Nrf2/SKN، gst{36}}، در جهش یافته alhr-1 [25] بیش از حد بیان می‌شود و توسط کورکومین در نوع وحشی و حتی بیشتر القا می‌شود. در ahr{40}} جهش یافته (شکل 5D). علاوه بر این، کورکومین تثبیت و جابجایی هسته‌ای Nrf2 را در EC اولیه انسان افزایش داد (شکل 5E) و بیان سوپراکسید دیسموتاز منگنز (Sod2) - یک ژن هدف کلاسیک Nrf2 - - را در سلول‌های ترانسفکت شده با یک ناقل خالی یا در سلول‌هایی القا کرد که در آنها AhR توسط shRNA خاموش می شود (شکل 5F). فقدان القای Sod2 توسط AhR shRNA در EC ممکن است به دلیل کاهش جزئی (50 درصد) در بیان باشد (شکل S3D)، که ممکن است برای فعال شدن Nrf2 یا فاکتور رونویسی اضافی (TF) کافی نباشد. در C.elegans، ممکن است با القای gst-4 [94] پس از تخلیه کامل AhR موافق باشد. جالب توجه است که Hpgds، همولوگ C.elegans gst{53}}، به طور قابل توجهی در مغز موش‌های AhR KO افزایش یافته است (شکل S3A) اما هدف Nrf2 نیست. شواهد بیشتر برای سیگنال‌دهی مستقل احتمالی Nrf2/SKN{57}} فعال شده توسط کاهش ahr{58}} این است که فعال‌سازی gst-4 توسط کورکومین کاملاً توسط پوست-7 RNAi سرکوب می‌شود. نوع وحشی C.elegans، در حالی که جهش‌یافته‌های ahr-1 همچنان Gst-4 را با وجود کاهش-1 پوست القا می‌کنند (شکل 5G، H). با این حال، RNAi پوست، مقاومت استرس اکسیداتیو را در هر دو نوع وحشی و ahr{67}}(ju145) کاهش داد (شکل 5I). بطور غیرمنتظره، خاموش کردن پوست بر مقاومت ژوگلون حیوانات تحت درمان با کورکومین تأثیری نداشت (شکل 5 I). داده‌های ما سناریوی پیچیده‌ای را نشان می‌دهد که به موجب آن کورکومین ویژگی‌های مختلف ضد پیری را با تکیه بر سیگنال‌های وابسته به AhR یا مستقل از AhR، اما وابسته به سیگنال‌های Nrf2/SKN{77}(و اضافی) ترویج می‌کند.

شکل 4. AHR{1}} و کورکومین به طور مستقل در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می کنند. (الف) تصاویر نماینده (سمت چپ) و کمیت شدت DSRed (راست) در نماتدهای wt یا ahr{3}} آغشته به MitoSOX. نمودارهای جعبه داده‌های تلفیقی از 129-135 کرم‌ها/شرایط را در 3 آزمایش نشان می‌دهند. (B) پتانسیل غشای میتوکندری با رنگ آمیزی TRME در نماتدهای سنین مشخص شده ارزیابی شد. تصاویر نماینده (سمت چپ) و کمیت فلورسانس TMRE (راست) ارائه شده است. نمودارهای جعبه داده‌های تلفیقی از 3 آزمایش را نشان می‌دهند. (C, D) فعالیت پمپاژ حلقی (C) و تحرک (D) موتانت‌های wt و ahr{7}} پس از تیمار H2O2. نمودارهای جعبه داده‌های تلفیقی از 39-54(C) یا 35-36 worms/condition (D) را در 3-4آزمایش‌ها نشان می‌دهند.*p-value<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

شکل 5. کورکومین Nrf2/SKN-1 را مستقل از سنجش زخم خراش AhR فعال می‌کند. AhR انسانی پانل بالایی: تصاویر نماینده; خط چین نشان دهنده شروع مهاجرت است. نوار مقیاس: 100 um. پانل پایین: کمی سازی; نمودارهای جعبه داده‌های 4-6آزمایش‌ها را نشان می‌دهند. آزمون آماری:1-way ANOVA،*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. کورکومین و پرواکسیدان‌ها اثرات متضادی بر فعالیت AHR-1 نشان می‌دهند

مطابق با اثر ضد پیری کاهش بیان/فعالیت Ah، داده‌های ما نشان می‌دهد که کورکومین ممکن است طول عمر C.elegans را با سرکوب مسیرهای تنظیم‌شده AHR از طریق کاهش بیان/فعالیت AHR{2}} افزایش دهد. در مسیرهای سیگنالینگ پایین دست مشترک از این رو، ما سعی کردیم فعالیت AHR{3}} را در C.elegans تعیین کنیم، اما تلاش‌های متعددی برای ارزیابی بیان AHR-1 و محلی‌سازی درون سلولی با استفاده از آنتی‌بادی‌ها (در برابر AhR پستانداران یا آنتی‌بادی‌های سفارشی‌شده علیه CeAhR) یا برچسب‌گذاری شده با فلورسنت انجام شد. خبرنگاران (OP562، UL1709، ZG93) شواهد معناداری ارائه نکردند. با توجه به اینکه AHR{9}} به XREها در شرایط آزمایشگاهی [35] متصل می‌شود، فکر کردیم از بیان ژن مبتنی بر XRE به عنوان بازخوانی برای فعالیت AHR{12}} استفاده کنیم. بنابراین، ما به سلول‌های Cos7 مشتق از میمون روی آوردیم، که AhR درون‌زا را بیان نمی‌کنند و بنابراین فعالیت AhR درون‌زا را نشان نمی‌دهند [95،96] و می‌توانند برای نظارت بر القای لوسیفراز مبتنی بر XRE به‌عنوان بازخوانی برای AHR مورد سوء استفاده قرار گیرند{18}} فعالیت (لاریگوت و همکاران؛ ارائه شده همراه با این مطالعه). هنگامی که سلول‌های Cos7 با ناقل‌هایی که C.elegans AhR/alr{21}}، ARNT/aha{22}}، و یک پروموتر حاوی XRE همراه با لوسیفراز ژن CYPIA1 انسانی را بیان می‌کنند، ترانسفکت شدند [64] AHR{ {27}} در شرایط پایه (تحت درمان با خودرو) فعالیت کم نشان داد. قابل توجه، درمان با کورکومین یا سایر مواد مغذی که پیری سالم را در C.elegans ترویج می‌کنند، مانند لوتئین [97] و رسوراترول [98،99]، به طور قابل‌توجهی فعالیت AHR{32}} را سرکوب کرد (شکل 6A-C). در عوض، BaP و لفلونوماید، فعال‌کننده‌های AhR شناخته شده در پستانداران، بر فعالیت AHR{35}} (شکل 6A,B) در غلظت‌هایی که استفاده کردیم، تأثیری نداشتند. قابل‌توجه، فعالیت AHR{37}} در سلول‌های Cos7 ترانسفکت شده با ناقلی که الل ahr{39}}(jul45) را به جای آلل نوع وحشی (شکل 6A-C) بیان می‌کند، لغو شد، که نشان می‌دهد jul45 یک حقیقت است. آلل از دست دادن عملکرد و اینکه شدت لوسیفراز اندازه گیری شده به دلیل عملکردی AHR است{47}}.

سپس به دنبال بررسی این بودیم که آیا کورکومین با اتصال مستقیم یا مدولاسیون غیرمستقیم فعالیت AHR{0}} را کاهش می‌دهد. تا به امروز، هیچ لیگاندی از C.elegans AHR-1 شناسایی نشده است، و از آنجایی که هیچ اطلاعاتی در مورد LBD آن وجود ندارد، ما یک تجزیه و تحلیل در سیلیکون برای توصیف آن انجام دادیم. دو ایزوفرم AHR-1، la و 1b، تراز شدند و اگرچه از نظر طول متفاوت بودند، اما توالی دامنه PASB آنها یکسان است. سپس این توالی با دامنه PASB مگس سرکه و دو AhR از مهره‌دارانی که قبلاً مدل‌های ساختاری برای آنها تولید شده بود، یعنی موش (Mus musculus)[100] و گورخرماهی (Danio rerio) [101] (شکل) تراز شد. 6D). هم‌ترازی تفاوت‌های واضحی را بین گونه‌ها با ویژگی اصلی حذف‌های توالی بی مهرگان در متغیرترین منطقه در حوزه PAS نشان داد که مربوط به منطقه انعطاف‌پذیر است، از جمله بسته‌های مارپیچ (مارپیچ‌های C، D، E) و حلقه‌های کوتاه اتصال. این عناصر (شکل 6D,E). این حذف ها می تواند فضای موجود در حفره اتصال این AhR ها را کاهش دهد. سپس یک مدل سه بعدی از AHR-1 PASB با مدل‌سازی همسانی تولید کردیم. این مدل چین‌های PAS معمولی را ارائه می‌کند، اما با مارپیچ Do کوتاه‌تر در مقایسه با سایر AhR‌ها. با این حال، حفره داخلی دارای برخی از ویژگی های است. حاوی بقایای آبگریز بیشتری است و توسط چند زنجیره جانبی داخلی به نصف کوتاه شده است. به طور خاص، H365 و H274 روبرو هستند و می توانند یک پیوند هیدروژنی در وسط حفره ایجاد کنند. علاوه بر این، زنجیره های جانبی Y332، L363 و L302 می توانند حفره را مسدود کنند و فضای داخلی موجود برای لیگاندها را کاهش دهند (شکل 6E). این حفره کوچک و کوتاه به احتمال زیاد اجازه اتصال لیگاندهای بزرگ (مانند کورکومین TCDDor) را نمی دهد. مشابه مدل ساختاری AHR{16}}، مدلی از zfAhRla گورخرماهی نشان داد که حفره LBD در مقایسه با پارالوگ‌های پیوند TCDD zfAhR1b و zfAhR2 کوتاه شده است [101]. لیگاندهای کوچک و انعطاف پذیر، مانند leflunomide، zfAhRla را متصل و فعال می کنند، اما غلظت leflunomide که ما آزمایش کردیم، AHR{21}} را در سیستم سلولی Cos7 ما فعال نکرد (شکل 6B). سپس به این فکر کردیم که آیا جهش در اسیدهای آمینه مسئول حفره کوچک LBD ممکن است به لیگاندهای کلاسیک اجازه دهد تا CeAhR را فعال کنند. باقیمانده CeAhR L363 (شکل 6D) مربوط به A375 در mAhRb-Iand V375 در مادرید است، و این باقیمانده تأثیر عمده ای بر اتصال لیگاند دارد [102]. به طور مشابه، T386 از zfAhRla (شکل 6D)، مطابق با A375 در mAhRb{33}} و A386 در zfAhR1b و zfAhR2، به عدم اتصال TCDD به zfAhRla کمک می‌کند و هنگامی که به آلانین جهش داده می‌شود، زمانی که TCD296 است HH296 را نیز بازیابی می‌کند. معرفی شد [101]. اسید آمینه Y296 در حال حاضر یک هیستیدین در C.elegans (H274) است. بنابراین، ما فقط لوسین را در موقعیت L363 در وکتور CeAhR به یک آلانین (L363A) جهش دادیم (شکل 6D,E که با یک فلش نشان داده شده است). علاوه بر این، ما هیستیدین نزدیک را در موقعیت H365 به گلوتامین (H365Q) جهش دادیم، که Q377 در موش است (شکل 6D، E نشان داده شده با یک فلش) زیرا احتمالاً پیوند هیدروژنی با H274 تشکیل می دهد و ممکن است به حفره کوچک AHR کمک کند. {49}} (شکل 6E). سپس آزمایش کردیم که آیا لیگاندهای AhR پستانداران بر فعالیت AHR{51}} زمانی که L363 و H365 جهش می‌یابند تأثیر می‌گذارند یا خیر. با این حال، این تغییرات، به جای بازگرداندن پاسخ به لیگاندهای بیگانه بیگانه مانند گورخرماهی [101]، حتی فعالیت پایه AHR{55}}، مشابه آلل ju145 را لغو کرد (شکل 6F). این نتایج تفاوت‌های واضحی را بین LBD‌های C.elegans و گورخرماهی نشان می‌دهد، اما نشان می‌دهد که LBD برای فعالیت پایه AHR{58}} اساسی است. همراه با مطالعات قبلی [35،38،82]، نتایج ما نشان می‌دهد که AHR{62}} بعید است در پاسخ فعالسازی کلاسیک ناشی از بیگانه‌بیوتیک دخالت داشته باشد، که بنابراین ممکن است به AHR مربوط نباشد-1- پیری فیزیولوژیکی در عوض، ترکیبات مشتق شده از گیاه ممکن است حداقل تا حدی از طریق سرکوب مسیرهای تعدیل‌شده AHR، اثرات حفاظت‌شده را اعمال کنند. مدل سه‌بعدی ما نشان می‌دهد که کورکومین فعالیت AHR{68}} را با اتصال LBD خود تعدیل نمی‌کند. بنابراین، سرکوب فعالیت AHR-1 توسط کورکومین می تواند به دلیل اثر آنتی اکسیدانی آن باشد. مطابق با این احتمال، و افزایش حساسیت جهش‌یافته‌های C.elegans ahr{70}} به استرس اکسیداتیو، متوجه شدیم که فعالیت AHR{71} در واقع توسط عوامل القاکننده ROS افزایش می‌یابد. به عبارت دیگر، سلول‌های Cos7 تحت درمان با پرواکسیدانت روتنون، فعالیت AhR را در هنگام ترانسفکت شدن با C.elegans یا AhR موشی نشان دادند، اما نه زمانی که با آلل jul45 یا آلل با جهش LBD ترانسفکت شدند (شکل 6G,H).

به طور کلی، در حالی که فعال سازی CeAhR در اوایل زندگی در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می کند، کاهش بیان آن با پیری مقابله می کند و اثر ضد پیری مفید کورکومین را واسطه می کند (شکل 7). بنابراین کورکومین ممکن است به تعادل فعال‌سازی TF ردوکس به روشی وابسته به زمان و زمینه کمک کند و به طور مستقیم از طریق اثر آنتی اکسیدانی آن و/یا از طریق فعال‌سازی Nrf2/SKN{5}} (یا TF دیگر)، که ممکن است همزمان، سرکوب AhR را مورد حمایت قرار دهد. واسطه فعالیت ضد پیری کورکومین است.

شکل 6. کورکومین و پرواکسیدان ها اثرات متضادی بر فعالیت AHR{2}} دارند. (AC) ارزیابی فعالیت AHR{4}} پس از درمان با ترکیبات نشان‌داده‌شده در سلول‌های Cos7 ترانسفکت شده با wt AHR-1(wt) یا AHR-1 حامل جهش نقطه‌ای ju145 (ju145) و AHA{10}} و همچنین یک لوسیفراز القایی با XRE. نمودارهای جعبه داده‌های 3-5آزمایش‌ها.* p-value را نشان می‌دهند<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

شکل 7. مدل پیشنهادی مسیر سیگنالینگ AHR-1 در پاسخ C.elegan به پرو و ​​آنتی اکسیدان ها. در شرایط "عادی" (پانل میانی)، AHR{3}} توسط ROS داخل سلولی فعال می شود. این منجر به ریزش چپرون ها از سیتوزولی AHR-1 و متعاقب آن جابجایی هسته ای AHR-1 می شود. در هسته، AHR-1 یک هترودایمر با انتقال دهنده هسته ای AHR تشکیل می دهد (AHA{ {7}}) و به XREهای ژنهای هدف متصل می شود که به نوبه خود منجر به کاهش سطح ROS داخل سلولی می شود. در این شرایط، از دست دادن عملکرد ahr{8}} منجر به افزایش طول عمر می شود. در حضور آنتی اکسیدان ها (پانل سمت چپ)، غلظت ROS درون سلولی کم است که منجر به AHR{9}} ساکن در سیتوپلاسم، محدود شده توسط کوفاکتورهای آن می شود. مهار فعالیت پایه AHR{10}} منجر به افزایش طول عمر می‌شود. در حضور پرواکسیدان‌ها (پانل سمت راست) AHR{12}} توسط ROS بیش از حد فعال می‌شود که منجر به جابجایی هسته‌ای آن، تشکیل هترودایمر AHR{13}}AHA{14}} و شروع رونویسی ژن هدف در ahr-1 KO، کاهش سم‌زدایی ROS از طریق ژن‌های هدف القایی AHR{16}}به تجمع ROS منجر می‌شود و ahr-1 KO را مستعد می‌کند.

4. بحث

AhR در ابتدا در پستانداران به دلیل فعالیت پاسخ بیگانه بیگانه ناشی از اتصال سموم محیطی یا لیگاندهای درون زا در پستانداران کشف شد، اما تعدیل کننده هایی که به اتصال لیگاندی متکی نیستند نیز وجود دارند اما بسیار کمتر مورد بررسی قرار می گیرند. C.elegans یک ارگانیسم مدل منحصر به فرد را برای بررسی فعالیت های AhR مستقل از پاسخ بیگانه بیگانه کلاسیک آن نشان می دهد زیرا CeAhR به لیگاندهای AhR نمونه اولیه متصل نمی شود [35،39]. با استفاده از این مدل، ما یک تابع حفظ‌شده تکاملی برای AhR در فرآیند پیری شناسایی کردیم [14] و نشان دادیم که برخی از تعدیل‌کننده‌های AhR پستانداران (یعنی باکتری‌ها، Bal و UVB) پارامترهای پیری را از طریق AHR{3}} در یک روشی وابسته به زمینه [25]. در اینجا، ما یافته‌های قبلی خود را با بررسی مکانیکی بیشتری از ویژگی‌های پیری تنظیم‌شده با AhR در بین گونه‌ها توسط کورکومین پلی‌فنل رژیمی دنبال کردیم. آنالیزهای ترکیبی in vivo، in vitro و in silico ما یک سناریوی جدید و پیچیده را نشان داد: در حالی که کورکومین ویژگی‌های ضد پیری را در نماتدها و EC اولیه انسان حداقل تا حدی به روشی وابسته به AhR ترویج می‌کند، اثرات آنتی‌اکسیدانی آن در هر دو گونه متکی است. در مکانیزم‌های مستقل از AhR اما عمدتاً Nrf2/SKN{11}} وابسته.

ما برای اولین بار نشان دادیم که کورکومین پیری فیزیولوژیکی C.elegans را به روشی وابسته به AHR{0}}به تاخیر می‌اندازد. در جستجوی عوامل موثر پایین‌دستی کورکومین وابسته به ahr{1}، ما از رویکردهای هدفمند و بی‌طرفانه استفاده کردیم و دریافتیم که اکثر ژن‌های تنظیم‌شده متفاوت در درمان کورکومین به شیوه‌ای وابسته به AHR{2}}تنظیم می‌شوند. علاوه بر این، بسیاری از این ژن‌ها الگوی بیان مشابهی را در حیواناتی که AHR{3}}تهی‌شده و تحت درمان با کورکومین قرار می‌دهند، نشان می‌دهند، که نشان می‌دهد کورکومین از طریق سرکوب فعالیت AHR{5}} باعث افزایش طول عمر می‌شود. با کمال تعجب، نه آنالیز هدفمند و نه آنالیز رونویسی نقش مهمی را برای ژنهای هدف کلاسیک AhR مانند فنجانها نشان ندادند، که در عوض مشخص شد که تا حد زیادی در نورونها بیان نشده است (لاریگوت و همکاران؛ ارائه شده همراه با این مطالعه). جالب توجه است، این یافته‌ها ممکن است نشان دهد که رونویسی کل حیوانات ممکن است اثرات خاص نورونی AhR را بپوشاند، در این مورد خاص از طریق ژن‌های cps. ما دریافتیم که در بین ژن‌های بیان شده متفاوت، بسیاری از آن‌ها به آنزیم‌های سم‌زدایی فاز II، مانند روده{10}} تعلق دارند که هم با کاهش ahr{11}} (و هم در مغز موش‌های AhR KO) افزایش یافته است. و درمان کورکومین برای افزایش طول عمر آنها. درعوض، درمان کورکومین و کاهش{12}} ahr، بیان آنزیم سم‌زدایی فاز II دیگر، GST{15}} را از طریق مکانیسم‌های مختلف افزایش داد: اولی متکی است، در حالی که دومی عمدتاً مستقل از Nrf2/ است. SKN{17}}، یک TF ردوکس کلاسیک القا کننده GST{18}} بر استرس اکسیداتیو در C.elegans [103]. علاوه بر این، در حالی که کورکومین پاسخ‌های وابسته به Nrf2/SKN را در C.elegans (بیان GST{22}}) و EC اولیه انسان (بیان Sod2 و ظرفیت مهاجرت) القا می‌کند، همچنین از C.eleans در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می‌کند. به روشی مستقل از SKN{24}}. در C.elegans، کورکومین نمی‌تواند طول عمر را در جهش‌یافته‌های بسیار بیمار-1(zu67) [104] افزایش دهد، در حالی که GST{28}} را می‌توان به شیوه‌ای مستقل از SKN با سیگنال‌دهی EGF القا کرد. [94] و تداخل بین مسیر EGF و AhR در پستانداران گزارش شد [105].

جالب توجه است، و برخلاف سویه نوع وحشی، ما یک اثر مستقل AHR{1}}کورکومین بر طول عمر در مدل‌های نماتد برای بیماری هانتینگتون و پارکینسون را مشاهده کردیم. در این سویه‌ها، تیمار کورکومین تعداد توده‌های پروتئینی را به همان میزان کمبود AHR-1 افزایش داد، که نشان‌دهنده اثر محافظتی خود تجمع پروتئین و/یا فعال‌سازی کورکومین مسیرهایی است که در برابر تجمع پروتئین مستقل از hr-1 خالی شدن. تأثیر کورکومین بر تجمع پروتئین بحث برانگیز است: نشان داده شد که تشکیل فیبریل را مهار می کند، اما همچنین گونه های پیش فیبریلار/الیگومری پروتئین های آمیلوئیدوژن را متصل می کند، در نتیجه تجمع آنها را تسریع می کند و سمیت عصبی کلی را کاهش می دهد [106]. شایان ذکر است، کافئین، که همچنین در برابر ویژگی‌های پیری قلبی عروقی محافظت می‌کند [66،107]، همچنین از فلج ناشی از A بدون کاهش دانه‌های A اما از طریق فعال‌سازی مسیر وابسته Nrf2/SKN{10}} محافظت می‌کند [108]. ارزیابی اینکه آیا اثر محافظتی ناشی از کورکومین یا تمام کاهش{12} در مدل‌های بیماری C.elegans توسط مکانیسم‌هایی که حذف گونه‌های الیگومری/پیش فیبریلار را به توده‌های کمتر سمی و/یا با واسطه می‌کنند، مهم است. فعال سازی مکانیسم های دیگر، مانند Nrf2/SKN{15}}، که ممکن است همزمان در برابر سمیت پروتئوتوکسیک محافظت کند. شایان ذکر است، آنزیم‌های سم‌زدایی ممکن است حاوی XRE و ARE (عنصرهای پاسخ‌دهنده آنتی‌اکسیدانی) باشند، و یک تعامل بین سیگنال‌های تنظیم‌شده Nrf2/ARE و AhR/XRE شرح داده شده است [109]. بنابراین جالب است که توضیح دهیم که چگونه کورکومین اثرات مختلف ضد پیری مفید خود را از طریق تعادل بین Nrf2 و سیگنال دهی تنظیم شده با AhR ترویج می کند.

رویکردهای ترکیبی ما نشان داد که کورکومین فعالیت AHR-1 را مهار می‌کند. در پستانداران، پیشنهاد شد که اثر مهاری کورکومین AhR با اتصال مستقیم LBD [110] یا مهار پروتئین کیناز C که AhR را فسفریله می‌کند، واسطه می‌شود [79]. مطالعه دیگری نشان داد که فعالیت رونویسی AhR به وضعیت ردوکس سلولی و ساختار کروماتین بستگی دارد که هر دو تحت تأثیر کورکومین هستند [111]. در حالی که AHR{4}} TCDD را متصل نمی‌کند، به XRE در شرایط آزمایشگاهی متصل می‌شود[36]، اما مطالعات سیستماتیک، پرداختن به پتانسیل هیدروکربن‌های پلی آروماتیک یا سایر لیگاندهای AhR پستانداران برای تعدیل AHR-1، اساساً به دلیل وجود ندارد. فقدان ابزار مناسب برای ارزیابی آن. مطالعات ما تلاش می‌کند این شکاف را پر کند و از سلول‌های Cos7 بیان‌کننده AHR{8}} همراه با سنجش‌های لوسیفراز (لاریگوت و همکاران؛ ارائه شده همراه با این مطالعه) بهره‌برداری کند و در مدل‌سازی سیلیکو C. elegans LBD نشان داد که کورکومین AHR را سرکوب می‌کند. فعالیت -1، اما احتمالاً نه با اتصال مستقیم LBD. سنجش آزمایشگاهی مورد استفاده در مطالعه ما تأیید کرد که CeAhR از طریق سیگنال‌دهی بیگانه‌بیوتیک‌های کلاسیک فعال نمی‌شود. با این حال، فعالیت های ناشی از اتصال AhR به توالی های DNA غیر از XRE "کلاسیک" موجود در CYP1A1 مانند XRE پاسخگو به پلی فنل (کوئرستین) موجود در PON1 را آشکار نمی کند [112,113]. رنگ‌آمیزی ایمنی در EC اولیه انسان نیز بر ضد انتقال هسته‌ای AhR القاء کننده کورکومین بحث می‌کند، که همراه با اثر ترویجی ظرفیت مهاجرت در سلول‌های دارای بیان بیش از حد AhR، ممکن است نشان‌دهنده این باشد که کورکومین فعالیت AhR را سرکوب می‌کند.

ما پیشنهاد می‌کنیم که اثر مهاری کورکومین، به‌جای تکیه بر اتصال AhR، شامل توانایی آنتی‌اکسیدانی آن می‌شود، که ممکن است در واقع با فعال‌سازی Nrf2/SKN{1}} مرتبط باشد یا حتی به آن بستگی داشته باشد. AhR پستانداران توسط ROS از طریق اصلاح اکسیداتیو مستقل از LBD [85] فعال می‌شود، اما داده‌های ما نشان می‌دهد که القای فعالیت AHR{4}} توسط روتنون پرواکسیدان نیازمند LBD است. یک مکانیسم غیرمستقیم فعال‌سازی AhR با واسطه ROS، تشکیل لیگاند قوی AhR FICZ است[114]. با این حال، FICZ یک مولکول مسطح بزرگ است که، طبق مدل سیلیکونی ما، با AHR-1 LBD مطابقت ندارد. در حالی که مکانیسم دقیقی که توسط آن فعالیت AHR{9}} توسط ROS ترویج می‌شود و توسط کورکومین مهار می‌شود (از طریق خاموش کردن مستقیم ROS یا به طور غیرمستقیم از طریق فعال‌سازی Nrf2 یا سایر ژن‌های تنظیم‌کننده آنتی‌اکسیدان) هنوز مشخص نیست، این به شدت توسط ما پشتیبانی می‌شود. یافته‌ها: AHR{11}} توسط روتنون فعال می‌شود، و جهش‌های ahr{12}} mtROS بیشتری نشان می‌دهند، پتانسیل غشای میتوکندری کاهش یافته و به H، O، و juglone و همچنین به UVB و BaP حساس‌تر هستند [25] ، که هر دو ROS را تولید می کنند[115,116]. در این زمینه، جالب است بدانید که جهش‌یافته‌های ahr{16}} تغییرات خفیفی در عملکردهای میتوکندریایی نشان می‌دهند که شبیه عملکردهای میتوهورمسیس است [117. این نشان می‌دهد که تمام-1 کاهش (و کورکومین احتمالی با مهار AHR{19}}) ممکن است از طریق استرس خفیف میتوکندری، طول عمر را افزایش دهد، که مشخص است از طریق ژن‌های سم‌زدایی که به طور مشابه در دیگری تعدیل شده‌اند، طول عمر C.elegan را افزایش می‌دهد. {20}} جهش یافته [118,119]. علاوه بر این، اینکه آیا Nrf2/SKN-1 و میتوکندری نقشی در تعدیل فعالیت AHR-1 در درمان کورکومین ایفا می‌کنند، احتمال جالبی است که هنوز تأیید نشده است.

به طور کلی، با بهره‌گیری از ویژگی‌های متعدد ارائه‌شده توسط نماتد C.elegans برای مطالعات in vivo، ما پیشنهاد می‌کنیم که عملکرد اجدادی AhR ممکن است در تنظیم آنزیم‌های فاز-ll مربوط به آنتی‌اکسیدان به جای پاسخ‌های بیگانه‌بیوتیک باشد. برخلاف اثرات مضر ناشی از سطوح بالای ROS، اثرات مفید ناشی از کمبود AhR ممکن است با استرس خفیف میتوکندری و/یا تولید خفیف ROS (mitohormesis)، که همچنین بر Nrf2/SKN{4}} متکی هستند، واسطه شوند. ما همچنین شواهد قوی برای تعامل بین کورکومین و AhR ارائه می دهیم. مهار کورکومین از سیگنال دهی AhR به طور تکاملی حفظ می شود و احتمالاً با اتصال به AhR LBD انجام نمی شود، بلکه از طریق خواص مهار ROS کورکومین یا فعال سازی Nrf2/SKN-1 انجام می شود. مسیر سیگنالینگ Nrf2 در واقع می تواند توسط کورکومین به روش های مختلف فعال شود [91]. در نهایت، داده‌های ما نشان داد که کورکومین اثرات ضد پیری را نیز به‌صورت مستقل در C.elegans (افزایش بیان GST و مقاومت به استرس اکسیداتیو) و EC اولیه انسان (افزایش بیان Sod2 و ظرفیت مهاجرت) افزایش می‌دهد. )، که همچنین می تواند اثرات افزایشی کورکومین و از دست دادن عملکرد AHR{14}} را بر روی سلامت حیوانات بیان کننده polyQ توضیح دهد.

5. نتیجه گیری ها

در نتیجه، از طریق ترکیبی اصلی از رویکردهای in silico، vitro و in vivo، ما نشان دادیم که در حالی که فعال‌سازی CeAhR از استرس اکسیداتیو در اوایل زندگی محافظت می‌کند، کاهش بیان آن با پیری مقابله می‌کند و اثر ضد پیری مفید کورکومین را واسطه می‌کند (شکل 7). . بنابراین کورکومین ممکن است به متعادل کردن فعالیت فاکتورهای رونویسی مختلف درگیر در پاسخ‌های سم‌زدایی/آنتی اکسیدانی (سرکوب AhR و فعال کردن Nrf2) در شرایطی که تغییر می‌کنند (افزایش AhR و کاهش Nrf2/SKN-1)، مانند افزایش سن یا اختلالات مرتبط با سن کار ما سطح پیچیدگی بیشتری را به فعالیت‌های چند منظوره و زمینه خاص AhR می‌افزاید، با پیامدهای مهمی بر سلامت و طول عمر ارگانیسم‌ها. علاوه بر این، با استفاده از سیستم نماتد برای کشف و بررسی عملکردهای اجدادی AhR، که کمتر در پستانداران شناسایی می شوند، دری را برای مطالعات اضافی باز می کند.

این مقاله از Antioxidants 2022, 11, 613 استخراج شده است. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants