اسید اسکوربیک ایمنی، ضد اکسیداسیون و آپوپتوز را در Abalone Haliotis Discus Hannai Ino تنظیم می کند قسمت 1

خلاصه: مطالعه حاضر به منظور بررسی نقش اسید اسکوربیک (AA) در پاسخ ایمنی، آنتی اکسیداسیون و آپوپتوز در ماهی (Haliotis discus hannai Ino) انجام شد. هفت جیره نیمه خالص شده با سطوح درجه بندی شده AA (0، 50، 100، 200، 500، 1000 و 5000 میلی گرم بر کیلوگرم) به آببالون داده شد (ابتدا وزن: 0.001 ± 12.01 گرم، طول پوسته اولیه: 0.069 ± 48.44 میلی متر) به مدت 100 روز. بقا، نرخ افزایش وزن، و افزایش روزانه در طول پوسته تحت تاثیر AA رژیم غذایی قرار نگرفت. محتوای AA در آبشش، عضله، و غدد گوارشی ماهی آبالون به طور قابل توجهی توسط AA رژیم غذایی افزایش یافت. از نظر ایمنی، AA رژیم غذایی به طور قابل توجهی تعداد کل هموسیت ها، انفجار تنفسی و فعالیت فاگوسیتیک در همولنف و فعالیت لیزوزیم در همولنف بدون سلول (CFH) را بهبود بخشید. در غده گوارشی، مسیرهای سیگنالینگ وابسته به TLR-MyD{20} و TLR-MyD88- توسط مکمل‌های AA رژیم غذایی سرکوب شدند. سطوح mRNA -دفنسین و آرژیناز-I در غده گوارشی توسط AA رژیم غذایی به طور قابل توجهی افزایش یافت. در آبشش، تنها مسیر سیگنالینگ وابسته به TLR-MyD{26}} توسط رژیم غذایی AA برای کاهش التهاب در آبله کاهش یافت. سطح اسطوره سازی 6 در آبشش به طور قابل توجهی توسط AA رژیم غذایی تنظیم شد. پس از عفونت Vibrio parahaemolyticus، مسیر سیگنال دهی TLR در غده گوارشی توسط AA رژیم غذایی سرکوب شد که باعث کاهش التهاب در آبالون شد. از نظر آنتی اکسیداسیون، فعالیت های سوپراکسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز، و همچنین ظرفیت آنتی اکسیدانی کل و کاهش محتوای گلوتاتیون در CFH، همگی به طور قابل توجهی افزایش یافت. محتوای مالون دی آلدئید به طور قابل توجهی توسط AA رژیم غذایی کاهش یافت. ظرفیت آنتی اکسیدانی با راه اندازی مسیر Keap1-Nrf2 در آبالون بهبود یافت. از نظر آپوپتوز، AA رژیم غذایی می تواند توانایی ضد آپوپتوز را از طریق آبشار سیگنال دهی JNK-Bcl-2/Bax در آبالون افزایش دهد. برای نتیجه گیری، AA رژیم غذایی در تنظیم ایمنی، آنتی اکسیداسیون و آپوپتوز در ماهی آبالون نقش داشت.

گلیکوزید سیستانچ همچنین می تواند فعالیت SOD را در بافت های قلب و کبد افزایش دهد و به طور قابل توجهی محتوای لیپوفوسین و MDA را در هر بافت کاهش دهد و به طور موثر رادیکال های مختلف اکسیژن فعال (OH-، H2O2 و غیره) را از بین ببرد و از آسیب DNA ناشی از آن محافظت کند. توسط رادیکال های OH گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید سیستانچ دارای توانایی مهار قوی رادیکال های آزاد، توانایی کاهش بالاتری نسبت به ویتامین C، بهبود فعالیت SOD در سوسپانسیون اسپرم، کاهش محتوای MDA و اثر محافظتی خاصی بر عملکرد غشای اسپرم هستند. پلی ساکاریدهای سیستانچ می توانند فعالیت SOD و GSH-Px را در گلبول های قرمز و بافت ریه موش های آزمایشگاهی مسن ناشی از D-گالاکتوز افزایش دهند و همچنین محتوای MDA و کلاژن را در ریه و پلاسما کاهش دهند و محتوای الاستین را افزایش دهند. اثر پاک کنندگی خوب بر روی DPPH، طولانی شدن زمان هیپوکسی در موش های پیر، بهبود فعالیت SOD در سرم، و به تاخیر انداختن انحطاط فیزیولوژیکی ریه در موش های آزمایشگاهی پیر. و این پتانسیل را دارد که دارویی برای پیشگیری و درمان بیماری های پیری پوست باشد. در عین حال، اکیناکوزید موجود در سیستانچ توانایی قابل توجهی در از بین بردن رادیکال های آزاد DPPH دارد و توانایی حذف گونه های فعال اکسیژن و جلوگیری از تخریب کلاژن ناشی از رادیکال های آزاد را دارد و همچنین اثر ترمیم خوبی بر آسیب آنیون رادیکال آزاد تیمین دارد.

روی Cistanche Tubulosa کلیک کنید

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

کلید واژه ها: آبلون; اسید اسکوربیک؛ ایمنی ضد اکسیداسیون؛ آپوپتوز

1. معرفی

اسید اسکوربیک (AA)، همچنین به عنوان ویتامین C شناخته می شود، به عنوان یک ریز مغذی ضروری شناخته شده است که به عنوان یک کوفاکتور مرتبط با افزایش فعالیت آنزیم های انسانی متعدد عمل می کند و به پاسخ ایمنی و توسعه سیستم عصبی در انسان کمک می کند [1،2]. ]. با توجه به توانایی محدود AA برای حفظ در ارگانیسم، مصرف منظم و کافی برای جلوگیری از کمبود AA ضروری است. AA در مقادیر کمی از منابع برون زا برای رشد متوسط، فعالیت های فیزیولوژیکی، تولید مثل و سلامت در اکثر پستانداران مورد نیاز است [3-5]. با توجه به عملکردهای ایمنی، AA به حفظ یکپارچگی سد ایمنی و بهبود زخم کمک می کند [1]. این می تواند عملکرد فاگوسیت ها را تقویت کند، مانند بهبود تحرک، کموتاکسی، فاگوسیتوز و کشتار میکروبی [6-9]. مطالعات قبلی اثرات ایمنی مختلف AA را بر روی سلول های B، سلول های T و سلول های NK در پستانداران گزارش کرده اند [10-12]. در همین حال، AA نیز با آپوپتوز مرتبط است. با جلوگیری از Bax (پروتئین X مرتبط با BCL) از آپوپتوز میوکارد جلوگیری می‌کند و توانایی Bcl-2 (تنظیم‌کننده آپوپتوز bcl-2) را برای مهار انتشار سیتوکروم C از میتوکندری به داخل سیتوپلاسم افزایش می‌دهد. و متعاقباً کاسپاز{15}} را کاهش می‌دهد که آغازگر آپوپتوز است [13]. به عنوان یک آنتی اکسیدان طبیعی، AA گونه های فعال اکسیژن (ROS) و گونه های نیتروژن فعال (RNS) را با اعطای الکترون به آنها و جلوگیری از اکسیداسیون سایر ترکیبات کاهش می دهد [14-17]. AA همچنین می‌تواند مولکول‌های ضد اکسیداتیو دیگر مانند گلوتاتیون (GSH)، -کاروتن، اورات و -توکوفرول را فعال کند تا از رادیکال‌های آزاد مربوطه خود بازسازی شوند [18،19].

بر خلاف حیوانات خشکی، گزارش های نسبتا کمی در مورد پاسخ ایمنی و آپوپتوز در حیوانات آبزی وجود دارد. مقادیر مناسب رژیم غذایی AA می تواند رشد، سلامت و مقاومت در برابر استرس را در حیوانات آبزی بهینه کند [20]. اکثر مطالعات در مورد AA در حیوانات آبزی بر برآورد حداقل نیازهای AA برای حداکثر رشد و فرموله کردن یک رژیم غذایی کم هزینه متمرکز است. نیازهای AA در گونه ها، اندازه، رژیم غذایی و شرایط کشاورزی متفاوت است. مقدار توصیه شده AA رژیم غذایی بین 10 تا 10، {5}} میلی گرم بر کیلوگرم است [21]. حداقل نیاز AA جیره برای حمایت از حداکثر نرخ رشد (WG) 53-186 میلی گرم بر کیلوگرم در ماهی تیلاپیا نیل (Oreochromis niloticus)، 1200 میلی گرم بر کیلوگرم در ماهی تن آبی اقیانوس آرام (Thunnus orientalis) و 5000-1000 میلی گرم بر کیلوگرم در ماهی بود. میگو کوروما (Marsupenaeus japonicas) [22-24]. با این حال، WG یا نرخ رشد ویژه (SGR) به طور قابل توجهی تحت تأثیر AA رژیم غذایی در برخی از گونه‌های ماهی، مانند ماهیان خاویاری سیبری (Acipenser baerii)، ماهی قرمز دریایی (Pagrus major) و مارماهی ژاپنی (Anguilla japonica) قرار نگرفت [25-27] ].

نشان داده شده است که مکمل AA رژیم غذایی عملکردهای ایمنی مانند فاگوسیتوز و فعالیت لیزوزیم را در بسیاری از گونه های ماهی افزایش می دهد [28-30]. افزایش بقا در معرض قرار گرفتن در معرض پاتوژن (به عنوان مثال، باکتری ها و انگل ها) در تیلاپیا نیل، گربه ماهی آسیایی (Clarias batrachus)، و میگوی سفید اقیانوس آرام (Litopenaeus vannamei) پس از مصرف رژیم غذایی AA گزارش شده است [31-34]. کمبود AA باعث کاهش فعالیت لیزوزیم (LZM)، جزء مکمل 3 (C3) و محتوای C4 در ماهی کپور (Ctenopharyngodon idella) شد [35]. همچنین می تواند سطوح پپتیدهای ضد میکروبی مانند -دفنسین و هپسیدین و سایتوکین های ضد التهابی از جمله اینترلوکین (IL) 4/13A، IL{12}} و فاکتور رشد تبدیل کننده (TGF) 1/2 را کاهش دهد. در حالی که سیتوکین های پیش التهابی، از جمله IL{16}} و فاکتور هسته ای κB (NF-κB) در ماهی کپور علف را تنظیم می کند [35]. علاوه بر این، کمبود AA فاکتور فعال‌سازی پروتئاز آپوپتوز-1، کاسپاز{20}} و کاسپاز-7-9 را افزایش داد تا آپوپتوز سلولی را در ماهی کپور تشدید کند [35،36].

آبالون یکی از مهم ترین گونه های تجاری در راسته نرم تنان Archaeogastropoda است. این حیوان مدل مهمی برای مطالعه زیست‌شناسی اکولوژیکی و تکاملی گاستروپودها (Mollusca) است [37،38]. در میان گونه های پرورشی، آبلون اقیانوس آرام (H. discus hannai Ino) ترجیح داده شده ترین گونه پرورشی در چین است. مای گزارش داد که مکمل غذایی AA از 0 تا 8000 میلی‌گرم بر کیلوگرم تأثیر معنی‌داری بر SGR یا میزان بقا (SR) بچه ماهی جوان نداشت [39]. وو و همکاران گزارش داد که AA رژیم غذایی بر بیان ژن‌های مربوط به پاسخ‌های آنتی اکسیداتیو در غده گوارشی آبالون تأثیر می‌گذارد تا مقاومت استرس آن را بهبود بخشد [40]. علاوه بر این، شیوع بیماری ها می تواند خسارات اقتصادی زیادی را به صنعت آبلون وارد کند [41،42]. نرم تنان فاقد ایمنی تطبیقی ​​هستند و به ایمنی ذاتی متکی هستند [43]. از این رو، مطالعه حاضر با هدف بررسی نقش AA در تنظیم ایمنی، آنتی اکسیداسیون، و آپوپتوز در بالون H. discus hannai انجام شد و دستورالعمل های علمی برای تنظیم سالم فرمولاسیون رژیم غذایی در ماهی آبالون ارائه داد.

2. مواد و روشها

2.1. بیانیه اخلاقی

تمام مراحل مراقبت و جابجایی حیوانات انجام شده در مطالعه حاضر توسط کمیته مراقبت از حیوانات دانشگاه اقیانوس چین تایید شد (تأیید شماره SPXY2020012).

2.2. رژیم غذایی آزمایشی

رژیم غذایی پایه (AA{{{1{19}}}}}) از ترکیبات خالص شده فرموله شد تا حاوی تقریباً 30 درصد پروتئین رژیم غذایی و 3.5 درصد از لیپیدهای رژیم غذایی باشد (جدول 1). از کازئین (بدون ویتامین) و ژلاتین به عنوان منابع پروتئین استفاده شد و روغن سویا و روغن ماهی منهادن (1:1) به عنوان منابع لیپیدی استفاده شد که می تواند برای حفظ رشد بهینه برای H. discus hannai کافی باشد [44-46] ]. سطوح درجه بندی شده AA (0، 50، 1{27}}، 200، 500، 1000 و 5000 میلی گرم بر کیلوگرم) برای فرموله کردن هفت رژیم غذایی آزمایشی به جیره پایه اضافه شد. AA به شکل ال-آسکوربیل{18}مونوفسفات به جیره‌ها اضافه شد. این رژیم‌ها به ترتیب AA0، AA50، AA100، AA200، AA500، AA1000 و AA5000 تعیین شدند. محتوای آنالیز شده AA در جیره به ترتیب 0.00، 47.31، 78.25، 189.05، 451.73، 919.99 و 4821.17 میلی گرم بر کیلوگرم بود. روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا برای تجزیه و تحلیل محتوای AA رژیم غذایی استفاده شد [40]. پروتئین خام، چربی خام و خاکستر بر اساس روش های استاندارد انجمن شیمیدانان تحلیلی اندازه گیری شد [47].

2.3. تست لیچینگ

شستشوی AA رژیم غذایی به عنوان کارایی حفظ (RE) ارائه شد. جيره هاي آزمايشي با سه تكرار در آب دريا در دماي 5/23 ± 0 ◦C غوطه ور شدند. جیره های غوطه ور شده در زمان تعیین شده (به ترتیب 1، 3، 6 و 12 ساعت) خارج شدند و برای تجزیه و تحلیل محتوای AA لیوفیلیز شدند.

RE ( درصد )=(AA حفظ شده در جیره بعد از غوطه وری)/(AA موجود در جیره قبل از غوطه وری) × 100.

2.4. آزمایش تغذیه

بچه ماهیان آبالون از یک شرکت ماهیگیری در فوژو (فوجیان، چین) تهیه شد و به مدت دو هفته با رژیم غذایی پایه در یک سیستم آب در گردش با مخازن با شرایط آزمایشگاهی سازگار شدند (10{{1{{21) }}}} × 50 × 40 سانتی متر). پس از آن، آبلون‌هایی با اندازه مشابه (وزن اولیه: 0 ± 12.01. 1 گرم، طول پوسته اولیه: 0.069 ± 48.44 میلی‌متر) به طور تصادفی به 21 مخزن (45 آبلون در هر تانک) اختصاص داده شدند. هر سه تانک یک درمان در نظر گرفته شد. همه مخازن در نور کم با پرده های پلاستیکی سیاه نگهداری می شدند. آبالون ها روزی یک بار در ساعت 17:{18}} با دست تغذیه می شدند. مدفوع و رژیم های غذایی نخورده هر روز ساعت 8 صبح حذف می شد. در طول آزمایش تغذیه روزانه 100-، دمای آب 0.5 ± 23.0 ◦C، شوری 30-33 ‰، pH 7.4-7.9 و اکسیژن محلول بیشتر یا مساوی 7.0 میلی گرم در لیتر بود.

2.5. تست چالشی Vibrio Parahaemolyticus

پس از آزمایش تغذیه، پانزده آبالون از هر مخزن برای آزمایش چالش با V. parahaemolyticus بیماریزا استفاده شد. آبالون ها با 1{4}} 0 میکرولیتر V. parahaemolyticus (1.2 × 106 cfu/ml) با تزریق عضلانی در داخل بدن به چالش کشیده شدند. غده گوارشی به ترتیب در 0، 6، 12، 24، 48 و 72 ساعت جمع آوری شد و برای تجزیه و تحلیل qPCR در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیره شد.

2.6. مجموعه نمونه

در پایان کارآزمایی تغذیه، آببالون ها قبل از شمارش و وزن به مدت سه روز ناشتا بودند. همه آبالون ها قبل از نمونه برداری با اتیل الکل 5 درصد بیهوش شدند. همولنف از چهار آبالون در هر مخزن برای تجزیه و تحلیل تعداد کل هموسیت (THC)، انفجار تنفسی (RB)، و فعالیت فاگوسیتی (PA) جمع آوری شد. برای تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیم در همولنف بدون سلول (CFH)، همولنف از ده آبلون دیگر در هر مخزن جمع‌آوری شد و به مدت 10 دقیقه (3000 × گرم در دمای 4 درجه سانتیگراد) سانتریفیوژ شد. CFH تا زمان استفاده در دمای -80 درجه سانتیگراد ذخیره شد. غده هاضمه، آبشش، ماهیچه و گوشته از ده بالون همولنف گرفته شده در هر مخزن نمونه برداری شد و تا زمان استفاده در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد.

2.7. محتوای اسید اسکوربیک

محتوای AA در CFH، ماهیچه، گوشته، آبشش و غده گوارشی با استفاده از کیت سنجش آسکوربات کاهش دهنده آهن (BioVision، Milpitas، CA، USA) شناسایی شد. CFH را می توان مستقیماً برای اندازه گیری محتوای AA طبق دستورالعمل سازنده استفاده کرد. نمونه‌های 0.1 گرمی عضله، گوشته، آبشش و غده گوارشی در 1 میلی‌لیتر آب مقطر از قبل سرد شده همگن شدند. محتوای AA با جذب در طول موج 593 نانومتر اندازه‌گیری شد.

2.8. پارامترهای ایمنی در همولنف

همولنف با استفاده از حجم مساوی از ضد انعقاد از پیش خنک شده (100 میلی مول در لیتر EDTA Na2، 450 میلی مول در لیتر NaCl، 10 میلی مول در لیتر KCl، 10 میلی مول در لیتر KCl، 10 میلی مول در لیتر HEPES، pH 7.3، 850 میلی مول در لیتر مول در کیلوگرم) به طور کامل مخلوط شد. همولنف را رقیق کنید

THC با استفاده از هموسیتومتر زیر میکروسکوپ (CX31، OLYMPUS، توکیو، ژاپن) شمارش شد.

کاهش نیتروبلو تترازولیوم (NBT) در هموسیت ها، که می تواند با فعالیت RB نشان داده شود، با توجه به روش های اندرسون و همکاران، با برخی تغییرات اندازه گیری شد [48]. به طور خلاصه، همولنف با استفاده از ضد انعقاد روی 5×1{12}}6 سلول در میلی لیتر تنظیم شد و در دمای 3000× گرم در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب سلولی با 100 میکرولیتر 1 میکروگرم بر میلی لیتر PMA (فوربول میریستات استات، سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده) رنگ آمیزی شد و توسط DMSO (دی متیل سولفوکسید، سولاربیو، پکن، چین) و در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. 30 دقیقه. پس از انکوباسیون، 100 میکرولیتر از 0.3 درصد NBT حل شده توسط محلول نمک متعادل هنک (Solarbio، پکن، چین) به سلول ها اضافه شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه قبل از سانتریفیوژ (560 × گرم در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه) انکوبه شد. . مایع رویی به آرامی خارج شد و واکنش با استفاده از 200 میکرولیتر متانول به مدت 10 دقیقه پایان یافت. پس از آن، سلول قبل از خشک شدن در هوا، سه بار با متانول 70 درصد (v/v) شستشو شد. بلور آبی فرمازان با استفاده از 120 میکرولیتر KOH 2 مولار و 140 میکرولیتر DMSO حل شد. چگالی نوری (OD) در یک اسپکتروفتومتر در طول موج 630 نانومتر در برابر یک خالی KOH/DMSO خوانده شد.

PA همولنف به دنبال روش های توصیف شده قبلی Xue و همکاران تعیین شد. [49]. به طور خلاصه، 50 میکرولیتر همولنف رقیق شده روی یک لام شیشه ای قرار داده شد و در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه برای افزایش چسبندگی انکوبه شد. سپس 50 میکرولیتر مخمر (ساکارومایسس سرویزیه) با 106×1 سلول در میلی لیتر قبل از انکوباسیون (25 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه) به تک لایه هموسیت اضافه شد. لام دو بار به آرامی با نمک بافر فسفات استریل شده (PBS) شسته شد و به مدت 5 دقیقه با متانول تثبیت شد. سپس لام به مدت 20 دقیقه با محلول گیمسا رنگ آمیزی شد. سلول ها در زیر یک لنز غوطه وری روغن شمارش شدند. نرخ فاگوسیتوز نشان دهنده فعالیت فاگوسیتی بود.

2.9. پارامترهای بیوشیمیایی در CFH

فعالیت آنزیم های ضد اکسیداتیو (مانند SOD، کاتالاز (CAT) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPX))، ظرفیت آنتی اکسیدانی کل (T-AOC) و محتوای مالون دی آلدئید (MDA) و GSH در CFH با استفاده از کیت های سنجش تجاری (موسسه مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ، کاتالوگ: T-AOC، A015-2-1؛ SOD، A001-3-2؛ CAT، A007- 1-1؛ GSH، A006-2-1؛ GPX ، A005-1-2؛ MDA، A003-1-2). T-AOC بر اساس تولید ABTS سبز (2، 20 -azino-bis (3-اتیل بنزوتیازولین-6-اسید سولفونیک)) در هنگام اکسید شدن ABTS بود. SOD، GSH، و GPX به ترتیب با جذب در 450 نانومتر، 405 نانومتر و 421 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر فرابنفش (Ultrospec 2100 pro, Biochrom, Holliston, MA, USA) اندازه‌گیری شدند. CAT و MDA با استفاده از روش‌های مولیبدات آمونیوم و TBA (تیوباربیتوریک اسید) تعیین شدند [50،51].

فعالیت LZM و محتوای C3 و C4 در CFH با استفاده از کیت‌های سنجش تجاری (موسسه مهندسی زیستی Nanjing Jiancheng، نانجینگ، چین. کاتالوگ: LZM, A050-1-1؛ C3, E{4}}؛ C4 اندازه‌گیری شد. ، E033-1-1). LZM با عبور در 530 نانومتر اندازه‌گیری شد. C3 و C4 در 340 نانومتر تعیین شد.

2.10. استخراج RNA کل و PCR کمی در زمان واقعی

RNA کل از غده گوارشی و آبشش با استفاده از کیت جداسازی RNA کل بافت (Vazyme، نانجینگ، چین) و معرف TRIZol (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) به دنبال دستورالعمل های سازنده استخراج شد. غلظت و خلوص RNA کل استخراج شده با استفاده از نانودراپ 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) تعیین شد. DNA مکمل (cDNA) با استفاده از کیت رونویسی معکوس (PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser، تاکارا، ژاپن) سنتز شد.

همه پرایمرها با استفاده از Primer Premier 6 طراحی شدند.0 (جدول تکمیلی S1) و توسط Sangon Biotech (شانگهای، چین) سنتز شدند. واکنش تقویت در حجم کل 25 میکرولیتر، حاوی 0.5 میکرولیتر پرایمرهای فوروارد و معکوس، 12.5 میکرولیتر 2× SYBR Green Realtime Master Mix (Vazyme)، 1 میکرولیتر cDNA و 10.5 میکرولیتر انجام شد. از ddH2O استریل شده. شرایط ترموسایکلینگ زیر برای تعیین پروفایل بیان برای هر ژن مورد استفاده قرار گرفت: ◦95 برای 30 ثانیه. 40 چرخه 95 ◦C برای 10 ثانیه و 60 ◦C برای 30 ثانیه. با انکوباسیون بعدی در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه، 60 درجه سانتیگراد برای 1 دقیقه و 95 درجه سانتیگراد برای 1 ثانیه برای تشخیص فلورسانس. سطح بیان ژن هدف به سطح ترکیبی از دو ژن مرجع پایدار (-actin و gapdh) نرمال شد که با استفاده از geNorm و NormFinder اعتبارسنجی شدند [52،53]. بیان ژن نسبی با استفاده از روش 2-∆∆CT [54] محاسبه شد.

2.11. وسترن بلات

پروتئین کل غده گوارشی و آبشش با استفاده از روش RIPA (Solarbio) [55] با کوکتل های مهارکننده پروتئاز و فسفاتاز (روش، بازل، سوئیس) استخراج شد. طبق دستورالعمل، پروتئین هسته ای غده گوارشی و آبشش با استفاده از کیت استخراج پروتئین هسته ای و سیتوپلاسمی (بیوتیم، شانگهای، چین) استخراج شد. غلظت پروتئین با استفاده از کیت کمی پروتئین BCA (Vazyme، نانجینگ، چین) اندازه‌گیری شد و تمام نمونه‌های پروتئین با استفاده از یک معرف RIPA به غلظت معادل 1.5 میکروگرم بر میکرولیتر رقیق شدند. نمونه‌های پروتئینی از غده گوارشی و آبشش با استفاده از SDS-PAGE جدا شدند و متعاقباً به غشای PVDF .45 میکرومتر 0 منتقل شدند. PVDF با استفاده از 5 درصد شیر خشک بدون چربی (Beyotime، شانگهای، چین) در آماده سازی برای TBST در دمای اتاق به مدت 1 ساعت مسدود شد. غشاء سه بار با TBST قبل از انکوباسیون با استفاده از آنتی بادی اولیه در طول شب در دمای 4◦C در 60 دور در دقیقه شسته شد. پس از آن، غشای انکوبه شده سه بار با TBST شسته شد و با استفاده از آنتی بادی ثانویه کونژوگه ترب کوهی ترب کوهی بز ضد خرگوش (بیوتیم، شانگهای، چین) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. غشاء PVDF با استفاده از کیت نورتابی شیمیایی ECL (Vazyme، نانجینگ، چین) مشاهده شد. GAPDH (1:500، AB-P-R001، Goodhere Biotechnology، Hangzhou، چین) و Lamin B (1:500، WL01775، Wanleibio، Shenyang، چین) به عنوان پروتئین مرجع استفاده شدند. آنتی بادی های هدف اولیه عبارت بودند از پاسخ اولیه تمایز میلوئیدی 88 (MyD88، 1:500، WL02494، Wanleibio، Shenyang، چین)، کیناز N ترمینال c-Jun (JNK، 1:500، WL01295، Wanleibio، Shenyang، چین)، بالغ -IL{32}} (1:500, WL00891, Wanleibio, Shenyang, China), NF-κB p65 (1:500, WL01980, Wanleibio, Shenyang, China), پروتئین مرتبط با ECH کلچ مانند 1 (Keap1, 1 :1000، WL03285، Wanleibio، Shenyang، چین) و cleaved-caspase3 (1:500، WL02117، Wanleibio، Shenyang، چین). کمی سازی وسترن بلات با استفاده از ImageJ محاسبه شد (نسخه 1.53، وین راسبند و همکاران، موسسه ملی بهداشت، Bethesda، MD، ایالات متحده).

2.12. محاسبات و تجزیه و تحلیل آماری

برای تجزیه و تحلیل آماری از نرم افزار SPSS 24 (IBM, Armonk, NY, USA) استفاده شد. آنالیز واریانس یک طرفه با آزمون چند دامنه ای توکی برای تشخیص تفاوت های آماری بین این گروه ها در سطح معناداری 05/0 0 استفاده شد. تمام داده ها به صورت میانگین ± SE (خطای استاندارد) بیان شد.

SR، WGR (نرخ افزایش وزن)، و DISL (افزایش روزانه در طول پوسته) به صورت زیر محاسبه شد:

SR ( درصد )=(تعداد بالون زنده مانده/تعداد آبلون اولیه) × 100;

WGR ( درصد )=[(وزن نهایی (گرم) - وزن اولیه (گرم))/وزن اولیه (گرم)] × 100;

DISL (μm/day)=[طول پوسته نهایی (mm) - طول پوسته اولیه (mm)]/روز × 1000.

3. نتایج

3.1. کارایی حفظ اسید اسکوربیک در رژیم غذایی

RE AA رژیم غذایی در فواصل مختلف غوطه ور در آب دریا در شکل تکمیلی S1 نشان داده شده است. به طور کلی، RE AA در جیره با مدت زمان غوطه وری در آب دریا کاهش یافت. در طول آزمایش تغذیه، جیره تقریباً 12 ساعت در آب دریا باقی ماند. بنابراین، آزمایش شستشو به مدت 12 ساعت در آب دریا در شرایط تغذیه یکسان به طول انجامید. پس از 3 ساعت غوطه وری، RE AA در جیره ها از 95.25 درصد تا 97.43 درصد متغیر بود. RE از AA در بیش از 95 درصد در 6 ساعت غوطه وری حفظ شد. پس از غوطه ور شدن به مدت 12 ساعت، RE AA در AA50، AA100، AA200، AA500، AA1000، و AA5000 به ترتیب 89.78 درصد، 90.88 درصد، 89.38 درصد، 91.03 درصد، 91.03 درصد، 2،8، 87 و 4.4 درصد بود.

3.2. عملکرد رشد و توزیع اسید اسکوربیک در بافت

The SR and growth performance of abalone-fed gradient levels of AA supplementation are shown in Table 2. The SR (%), WGR (%), and DISL (µm/day) were not significantly affected by dietary AA levels (p>0.05). SR بین 80.74 درصد و 88.15 درصد متغیر بود و WGR و DISL به ترتیب از 29.32 درصد تا 31.52 درصد و 17.92 تا 20.01 میکرومتر در روز متغیر بودند.

The AA distribution in tissues, including CFH, muscle, mantle, gill, and digestive gland, is shown in Figure 1. No significant differences in AA content in CFH and mantle of abalone after dietary AA were observed (p>0.05). محتوای AA در CFH و گوشته به ترتیب از 2.89 میکروگرم در میلی لیتر تا 4.52 میکروگرم در میلی لیتر و 81.63 میکروگرم بر گرم تا 103.08 میکروگرم بر گرم بود. محتوای AA ماهیچه، آبشش و غده گوارشی به طور قابل توجهی افزایش یافت (ص<0.05) and reached their peak at the AA5000 group. The AA content in the muscle, gill, and digestive gland was 64.88–128.20 µg/g, 308.98–382.19 µg/g, and 130.08–206.09 µg/g, respectively.

3.3. پارامترهای ایمنی همولنف

THC، RB و PA همولنف در جدول 3 ارائه شده است. THC به طور قابل توجهی با افزایش AA رژیم غذایی افزایش یافته است، از 1.07 × 107 × 1.65 × 107 سلول / میلی لیتر، و در گروه AA1000 به اوج خود رسید.

RB در هموسیت آبالون به طور قابل توجهی افزایش یافت و در گروه AA10{{10}}{{20}} به بالاترین حد خود رسید (0 0.35 سلول OD630/107·mL-1). همانطور که مکمل AA رژیم غذایی از 189.05 میلی گرم بر کیلوگرم به 919.99 میلی گرم بر کیلوگرم افزایش یافت، RB به طور قابل توجهی از 0.20 سلول OD630/107·mL-1 به 0.35 OD630/107 سلول·mL-1 افزایش یافت (p <0.05). AA رژیم غذایی می تواند بر PA در هموسیت های آبالون تأثیر بگذارد (05/0p<). PA آبالون در گروه AA1000 و AA5000 به طور معنی داری بیشتر از گروه AA0، AA50 و AA100 بود و در گروه AA5000 به حداکثر خود (48.92 درصد) رسید.

پارامترهای مربوط به ایمنی در CFH آبالون، از جمله محتوای LZM، C3 و C4، در جدول 4 ارائه شده است. فعالیت LZM به طور قابل توجهی افزایش یافته است (p < 0.{{10} }5) و بالاترین سطوح را در گروه AA1000 به دست آورد که فعالیت آن 56.25 U/mL بود. داده ها هیچ اثر معنی داری را برای محتوای C3 در بین تمام تیمارها نشان نداد (05/0p>). با این حال، محتوای C3 با مکمل AA رژیم غذایی افزایش باقی مانده است. محتوای C4 به طور قابل توجهی تحت تاثیر AA رژیم غذایی قرار نگرفت (05/0p>).

3.4. پارامترهای ضد اکسیداتیو در CFH

فعالیت های آنزیم ضد اکسیداتیو در CFH آببالون حاوی SOD، CAT، و GPX، و همچنین ظرفیت T-AOC و محتوای MDA و GSH در جدول 5 نشان داده شده است. و GPX و T-AOC و محتویات GSH و MDA. فعالیت‌های SOD، CAT، و GPX، و محتوای T-AOC و GSH به طور قابل‌توجهی تنظیم مثبت شد (p < 0.05)، در حالی که محتوای MDA به طور قابل‌توجهی در abalone کاهش یافت (p <0.05). ). تفاوت معنی داری در این پارامترهای آنتی اکسیدانی در CFH آبالون بین گروه های AA1000 و AA5000 مشاهده نشد.

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】