مهارکننده ASK1 NQDI-1 استرس اکسیداتیو و نورواپوپتوز را از طریق مسیر سیگنالینگ ASK1/p38 و JNK در آسیب زودهنگام مغزی پس از خونریزی زیر عنکبوتیه در موش‌ها کاهش می‌دهد، قسمت 1

خلاصه. استرس اکسیداتیو و نوروپوپتوز فرآیندهای پاتولوژیک کلیدی پس از خونریزی زیر عنکبوتیه (SAH) هستند. مطالعه حاضر اثرات محافظت کننده عصبی ضد اکسیداسیون و ضد آپوپتوز مهارکننده کیناز 1 (ASK1) تنظیم کننده سیگنال آپوپتوز اتیل-2،7-دیوکسو-2،7-دی هیدرو-3H-نفتو(1،2،1،2،) را ارزیابی کرد. 3-de) کینولین1-کربوکسیلات (NQDI-1) در آسیب مغزی اولیه (EBI) به دنبال SAH در مدل موش. در مجموع از 191 موش صحرایی استفاده شد و مدل SAH با استفاده از سوراخ تک رشته ای القا شد. وسترن بلات متعاقبا برای تشخیص سطوح بیان درون زا پروتئین ها استفاده شد. سپس ایمونوفلورسانس برای تایید محلی سازی سلولی عصبی ASK1 مورد استفاده قرار گرفت. عملکرد عصبی کوتاه مدت با استفاده از نمرات اصلاح شده گارسیا و تست تعادل پرتو 24 ساعت پس از SAH ارزیابی شد، در حالی که عملکرد عصبی بلند مدت با استفاده از تست روتارود و تست ماز آبی موریس ارزیابی شد. آپوپتوز سلول های عصبی با رنگ آمیزی TUNEL و استرس اکسیداتیو با رنگ آمیزی دی هیدرواتیدیوم 24 ساعت پس از SAH بررسی شد. سطح بیان پروتئین فسفریله (p-)ASK1 و ASK1 به دنبال SAH افزایش یافت. NQDI-1 یک ساعت پس از SAH به صورت داخل بطنی مغزی تزریق شد و بهبود قابل توجهی در عملکرد عصبی کوتاه مدت و بلند مدت نشان داد و به طور قابل توجهی استرس اکسیداتیو و آپوپتوز عصبی را کاهش داد. تزریق NQDI-1 باعث کاهش قابل توجهی در سطح بیان پروتئین p-ASK1، p-p38، p-JNK، 4 hydroxynonenal و Bax شد و به طور قابل توجهی سطح بیان پروتئین هم اکسیژناز 1 و Bcl-2 را افزایش داد. استفاده از بازدارنده p38 BMS-582949 یا بازدارنده JNK SP600125 منجر به کاهش قابل توجهی در سطح بیان پروتئین p-p38 یا p-JNK، به ترتیب، و کاهش قابل توجه استرس اکسیداتیو و آپوپتوز عصبی شد. با این حال، این مهارکننده‌ها تأثیری بر سطح بیان پروتئین p-ASK1 یا ASK1 نشان ندادند. در نتیجه، درمان با NQDI-1 باعث بهبود عملکرد عصبی و کاهش استرس اکسیداتیو و آپوپتوز عصبی در EBI به دنبال SAH در موش‌ها شد، احتمالاً از طریق مهار فسفوریلاسیون ASK1 و مسیر سیگنال‌دهی ASK1/p38 و JNK. NQDI-1 ممکن است یک عامل بالقوه برای درمان بیماران مبتلا به SAH در نظر گرفته شود.

گلیکوزید سیستانچ همچنین می تواند فعالیت SOD را در بافت های قلب و کبد افزایش دهد و به طور قابل توجهی محتوای لیپوفوسین و MDA را در هر بافت کاهش دهد و به طور موثر رادیکال های مختلف اکسیژن فعال (OH-، H2O2 و غیره) را از بین ببرد و از آسیب DNA ناشی از آن محافظت کند. توسط رادیکال های OH گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید سیستانچ دارای توانایی مهار قوی رادیکال های آزاد، توانایی کاهش بالاتری نسبت به ویتامین C، بهبود فعالیت SOD در سوسپانسیون اسپرم، کاهش محتوای MDA و اثر محافظتی خاصی بر عملکرد غشای اسپرم هستند. پلی ساکاریدهای سیستانچ می توانند فعالیت SOD و GSH-Px را در گلبول های قرمز و بافت ریه موش های آزمایشگاهی مسن ناشی از D-گالاکتوز افزایش دهند و همچنین محتوای MDA و کلاژن را در ریه و پلاسما کاهش دهند و محتوای الاستین را افزایش دهند. اثر پاک کنندگی خوب بر روی DPPH، طولانی شدن زمان هیپوکسی در موش های پیر، بهبود فعالیت SOD در سرم، و به تاخیر انداختن انحطاط فیزیولوژیکی ریه در موش های آزمایشگاهی پیر. و این پتانسیل را دارد که دارویی برای پیشگیری و درمان بیماری های پیری پوست باشد. در عین حال، اکیناکوزید موجود در سیستانچ توانایی قابل توجهی در از بین بردن رادیکال های آزاد DPPH دارد و می تواند گونه های فعال اکسیژن را از بین ببرد، از تخریب کلاژن ناشی از رادیکال های آزاد جلوگیری کند و همچنین اثر ترمیم خوبی بر آسیب آنیون رادیکال آزاد تیمین دارد.

روی Anti-aging Cistanche Para Que Serve کلیک کنید

【برای اطلاعات بیشتر: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

کلید واژه ها: خونریزی زیر عنکبوتیه، NQDI-1، کیناز تنظیم کننده سیگنال آپوپتوز 1، استرس اکسیداتیو، آپوپتوز، آسیب اولیه مغزی

معرفی

خونریزی زیر عنکبوتیه (SAH) یک بیماری حاد حاد مغزی است که در اثر جریان خون به فضای زیر عنکبوتیه مغز ایجاد می شود (1). با این حال، در حال حاضر، هیچ داروی موثری برای بهبود آسیب بافت مغز پس از SAH به دنبال پیشگیری از خونریزی مجدد وجود ندارد (2). بنابراین، مطالعات بیشتر در مورد مکانیسم های آسیب مغزی پس از SAH و کشف گزینه های درمانی مناسب برای بهبود پیش آگهی SAH ضروری است.

آسیب زودهنگام مغزی (EBI) به آسیب بافت مغز ثانویه ناشی از اختلالات فیزیولوژیکی متعدد و طیفی از تغییرات پاتولوژیک که در 72 ساعت از شروع SAH رخ می دهد اشاره دارد (3). در مرحله پاسخ حاد به دنبال SAH، آسیب با ورود مقادیر زیادی خون به فضای زیر عنکبوتیه شروع می شود و به دنبال آن یک سری آسیب های پاتولوژیک ایجاد می شود (4). از آنجایی که میتوکندری ها به ویژه در معرض هیپوکسی و آسیب ایسکمیک هستند، اختلال عملکرد میتوکندری یکی از آسیب های پاتولوژیک اولیه است که پس از SAH متحمل می شود (5). تعداد زیادی از گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) آزاد می‌شوند که منجر به افزایش استرس اکسیداتیو و فعال شدن مسیر آپوپتوز میتوکندری می‌شود و باعث آسیب و اختلال در میتوکندری می‌شود (6). بنابراین، روش‌های درمانی که استرس اکسیداتیو و آپوپتوز را کاهش می‌دهند، کلیدی برای بهبود پیش‌آگهی SAH هستند.

کیناز 1 تنظیم کننده سیگنال آپوپتوز (ASK1)، عضوی از خانواده پروتئین 3 کیناز فعال شده با میتوژن (MAP3K)، توسط انواع مختلف استرس سلولی فعال می شود و نقش مهمی در استرس اکسیداتیو و آپوپتوز دارد (7). در کشت های اولیه نورون های هیپوکامپ موش، بازدارنده روکیناز فاسودیل افزایش فسفریله (p-)ASK1 ناشی از آمیلوئید را معکوس می کند، که آپوپتوز عصبی را در بیماری آلزایمر کاهش می دهد (8). با این حال، تا آنجا که ما می‌دانیم، گزینه‌های درمانی که ASK1 را به دنبال SAH هدف قرار می‌دهند، ارزیابی نشده‌اند.

اتیل-2،7-دیوکسو-2،7-دی هیدرو-3H-naphtho(1،2،3-د)کینولین1-کربوکسیلات (NQDI-1) گزارش شده است یک مهارکننده خاص ASK1 است و با استفاده از سنجش کیناز آزمایشگاهی تایید شده است (9،10). مطالعات قبلی گزارش کرده اند که NQDI-1 ممکن است در درمان بیماری های متعدد از طریق مهار فعالیت ASK1 موثر باشد (11،12). NQDI-1 آسیب میتوکندری ناشی از میکروسیستین-LR و آپوپتوز را در سلول های گرانولوزای تخمدان از طریق مهار فعال شدن ASK1 کاهش می دهد (13). علاوه بر این، ایندومتاسین می تواند پاسخ های آبشاری آپوپتوتیک را در سلول های گلیال از طریق فعال سازی ASK1 استرس شبکه آندوپلاسمی القا کند (14). بنابراین، مهارکننده اختصاصی ASK1 NQDI-1 ممکن است اثرات محافظتی عصبی را به دنبال SAH از طریق مهار فعالیت ASK1 اعمال کند. p38 و JNK به عنوان مسیرهای سیگنالینگ پایین دست ASK1 در نظر گرفته می شوند. p38 و JNK فعال شده می توانند انواع زیرلایه ها از جمله فاکتورهای رونویسی هسته ای و همچنین پروتئین کینازها و سایر پروتئین های عملکردی را فعال کنند که منجر به شروع استرس اکسیداتیو و آپوپتوز می شود (15).

فرض بر این بود که مهارکننده ASK1 NQDI-1 اثرات محافظتی عصبی اعمال می‌کند و استرس اکسیداتیو و نوروپوپتوز را از طریق مسیر سیگنالینگ ASK1/p38 و JNK در EBI به دنبال SAH در موش‌ها کاهش می‌دهد.

مواد و روش ها

حیوانات آزمایشی.آزمایش‌های حیوانی توسط کمیته اخلاق حیوانات آزمایشی دانشگاه مرکزی جنوب تأیید شد (تصویب شماره 2019sydw0104). در مجموع 191 موش صحرایی نر نژاد Sprague-Dawley (SD) با وزن 280-320 گرم در دمای ثابت (21-23 درجه سانتیگراد) و رطوبت (45-50 درصد) با چرخه نور/تاریکی 12/12 ساعت نگهداری شدند. و دسترسی رایگان به آب و غذا داشت. تمام آزمایش‌های حیوانی بر اساس دستورالعمل‌های Animal Research: Reporting In Vivo Experiments (16) انجام شد و توسط راهنمای مؤسسه ملی بهداشت (NIH) برای مراقبت و استفاده از حیوانات (17) انجام شد. زمانی که موش‌ها به نقطه زمانی تعیین‌شده از پیش تعیین‌شده آزمایش رسیدند یا معیارهای خاصی را برای اتانازی (از دست دادن کامل اشتها به مدت 24 ساعت یا کم اشتهایی (50 درصد کمتر از حد طبیعی) به مدت 3 روز، ناتوانی در خوردن یا نوشیدن ارزیابی کردند، یا به عنوان نزدیک به مرگ (رفتار آسیب‌رسان به خود، وضعیت غیرعادی، دیسترس تنفسی و غیره)]، موش‌ها در دستگاه اتانازی دی اکسید کربن با نرخ جابجایی حجمی CO2 روی 30 درصد در دقیقه قرار گرفتند (18). مرگ با قطع تنفس و ضربان قلب و گشاد شدن مردمک تایید شد. لاشه همه موش‌ها برای دفع محیط‌زیست بسته‌بندی و منجمد شد.

مدل SAH. The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >8 با ارزیابی نمره درجه بندی SAH برای برآوردن نیازهای تجربی و به عنوان یک مدل موفق در نظر گرفته شد. روش برای گروه شم شبیه به روش گروه SAH بود، با این استثنا که سیم پرولین 4-0 دیواره شریان را سوراخ نکرد. تنفس، ضربان قلب، رنگ پوست و رفلکس پدال هر 5 دقیقه در طول مراحل بهبودی جراحی و بیهوشی کنترل شد. از این تعداد، 23 موش مردند و 8 موش از مطالعه حذف شدند، و این مرگ و میر و حذف توسط موش های جدید با مدل SAH تکمیل شد.

شدت SAH.شدت SAH با استفاده از امتیاز درجه بندی SAH 24 ساعت پس از SAH (20) ارزیابی شد. سمت شکمی بافت مغز به 6 ناحیه تقسیم شد که هر کدام بسته به میزان لخته خون و میزان تیرگی عروق خونی دارای رتبه 0-3 هستند: نمره 0 نشان دهنده عدم وجود لخته است. 1 نشان دهنده مقدار کمی لخته، 2 نشان دهنده مقدار متوسط ​​لخته است اما عروق بزرگ در پایه جمجمه هنوز قابل شناسایی هستند و 3 نشان دهنده مقدار زیادی لخته و عروق غیرقابل شناسایی در پایه جمجمه است. شش نمره منطقه ای برای محاسبه یک نمره کل (0-18)، که در آن نمرات بالاتر نشان دهنده خونریزی شدیدتر بود، جمع شد. موش‌هایی با نمره کل نمره SAH کمتر یا مساوی 8 به عنوان دارای SAH خفیف در نظر گرفته شدند، از آزمایش‌های بعدی حذف شدند و با موش‌های جدید مدل‌سازی شده جایگزین شدند.

تجویز دارو.برای اینکه بتوان غلظت دارو در بافت مغز را مستقل از کبد و سایر عوامل با دقت بیشتری تنظیم کرد، siRNA ها و NQDI-1 با تزریق داخل بطنی مغزی تجویز شدند (21). پس از بیهوشی (القاء، ایزوفلوران 3 درصد، نگهداری، ایزوفلوران 2 درصد)، موش ها بر روی دستگاه استریوتاکسیک مغز ثابت شدند. ریزانژکتور در 1.{5}} خلفی، 1.5 سمت راست و 3.3 میلی متر عمق به برگما ثابت شد. siRNA ASK1 (cat. No. 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) یا Scr siRNA کنترل (cat. No. 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) در 5 میکرولیتر آب استریل یونیزه شده بدون نوکلئاز با غلظتی از حل شد. 500 pmol و 48 ساعت قبل از SAH تجویز شد. توالی های siRNA ASK1 به شرح زیر بودند: Sense 5'-CGG CAGACAUUGUUAUCAAtt-3' و آنتی سنس 5'-UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc-3'. غلظت دارو و دوزهای گزارش شده در مطالعه مشابه (22) و حلالیت NQDI-1 برای تعیین غلظت مورد استفاده در مطالعه حاضر استفاده شد. سه دوز NQDI-1 (1، 3 و 10 میکروگرم بر کیلوگرم؛ Selleck Chemicals) یا محلول وسیله نقلیه در حجم کل 5 میکرولیتر در موش، 1 ساعت پس از SAH تزریق شد. BMS-582949 (100 mg/kg؛ Selleck Chemicals)، SP600125 (30 mg/kg؛ Selleck Chemicals) و محلول‌های وسیله نقلیه می‌توانند از سد خونی مغزی عبور کنند و 1 ساعت پس از SAH به صورت داخل صفاقی تجویز شدند (23،24).

عملکرد عصبی کوتاه مدتامتیاز گارسیای اصلاح شده و امتیاز تعادل پرتو برای ارزیابی عملکرد عصبی کوتاه مدت 24 ساعت پس از SAH استفاده شد. امتیاز اصلاح شده گارسیا به شش دسته تقسیم شد: حرکت داوطلبانه، حرکت ارادی اندام، کشش جلوی پا، توانایی بالا رفتن، پاسخ‌های حسی تنی، و پاسخ شاخک، که هر کدام به صورت جداگانه امتیازدهی شده و جمع‌بندی شده‌اند تا امتیاز کلی از 3 تا 18 به دست آید. (25). نمرات بالاتر برای نشان دادن عملکرد عصبی بهتر در نظر گرفته شد. برای امتیاز تعادل پرتو، موش‌ها به مدت 1 دقیقه روی یک تیر قرار گرفتند و امتیازی از 0-4 بر اساس مسافت طی شده ارزیابی شد (26). نمرات بالاتر برای نشان دادن عملکرد عصبی بهتر در نظر گرفته شد.

عملکرد عصبی طولانی مدت.آزمایش‌های پیش‌سازگاری روتارود روی موش‌ها با استفاده از همان سرعت و شتاب اولیه قبل از مدل‌سازی SAH انجام شد. موش ها برای تست روتارود در روزهای 7، 14 و 21 پس از SAH (27) روی دستگاه تست میله چرخان Rotamex (Columbus Instruments) قرار گرفتند. ابتدا سرعت روتارود اولیه روی 5 دور در دقیقه و شتاب 2 دور در 5 ثانیه تنظیم شد. پس از پوشیدن موش‌ها، تأخیر سقوط موش‌ها ثبت شد. سپس موش ها به مدت 1 ساعت استراحت کردند. در نهایت، تأخیر سقوط موش‌ها با سرعت اولیه 5 دور در دقیقه و شتاب 2 دور در 5 ثانیه دوباره آزمایش شد. تأخیر پاییز طولانی تر برای نشان دادن هماهنگی حرکتی بهتر در موش در نظر گرفته شد. در هفته چهارم پس از مدل‌سازی SAH، از آزمون ماز آبی موریس برای ارزیابی حافظه یادگیری و جهت‌گیری فضایی موش‌ها استفاده شد (27). تمرین یادگیری شنا و یافتن سکوی واقع در زیر سطح آب از روز اول تا پنجم در هفته چهارم (روزهای 28 تا 33 پس از سحر) انجام شد و مسیر شنا، تأخیر فرار و مسافت شنا ثبت شد. در روز پایانی، سکو برای آزمایش برداشته شد و مسیر شنا، مسافت شنا و مدت ربع کاوشگر به مدت 60 ثانیه ثبت شد.

در صورت رنگ آمیزیپس از پرفیوژن متوالی سالین 4 درجه سانتی گراد و 4 درجه سانتی گراد، 4 درصد پارافورمالدئید از قلب برای خارج کردن خون از بافت مغز، بافت مغز سالم به دست آمد. پس از آبگیری با گرادیان ساکارز، بافت مغز به بخش های 10 میکرومتری در موقعیت تاجی بریده شد و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شد. رنگ آمیزی IF برای ارزیابی هم محلی سازی ASK1 با سلول های عصبی استفاده شد. مقاطع بافت منجمد با استفاده از سرم الاغ 5 درصد (شماره گربه G1217-5ML؛ Wuhan Service Technology Co., Ltd.) به مدت 2 ساعت در دمای اتاق مسدود شد و یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد با آنتی بادی های اولیه به شرح زیر انکوبه شد: Anti-ASK1 (موش؛ 1:200؛ شماره گربه 67072-1-Ig؛ ProteinTech Group, Inc.)، anti-NeuN (خرگوش؛ 1:200؛ شماره گربه 26975-1-AP؛ ProteinTech Group, Inc.) ، مولکول آداپتور اتصال دهنده کلسیم ضد یونیزه-1 (Iba-1؛ خرگوش؛ 1:200؛ cat. No. 10904-1-AP؛ ProteinTech Group, Inc.) و پروتئین اسیدی فیبریلاری ضد گلیال (GFAP؛ مرغ ؛ 1:200؛ شماره گربه ab4674؛ Abcam). سپس بخش‌های بافت به مدت 2 ساعت در دمای اتاق با آنتی‌بادی‌های ثانویه فلورسنت مربوطه به شرح زیر انکوبه شدند: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H + L) (شماره گربه 715-585-150؛ 1:500). ؛ Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H plus L) (شماره گربه 711-545-152؛ 1:500؛ Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) و Alexa4 F88 AffiniPure Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H به علاوه L) (شماره گربه 703-545-155؛ 1:500؛ Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). متعاقبا، آنها برای هسته های سلولی با استفاده از 2 میکروگرم بر میلی لیتر DAPI (شماره گربه G1012-100ML؛ Wuhan Service Technology Co., Ltd.) به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند. مقاطع با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس Olympus BX53 (Olympus Corporation) ارزیابی و تصاویر گرفته شد.

رنگ آمیزی دی هیدرواتیدیوم (DHE).رنگ آمیزی DHE برای ارزیابی استرس اکسیداتیو مغز انجام شد (28). مقاطع بافت مغز منجمد با 2 میکرومول در لیتر DHE (Thermo Fisher Scientific, Inc.) در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند. پس از رنگ آمیزی هسته سلولی با استفاده از 2 میکروگرم بر میلی لیتر DAPI به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق، مقاطع با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس Olympus BX53 مورد ارزیابی قرار گرفتند. در مجموع شش بخش از هر بافت مغز به طور تصادفی انتخاب شد و شش ناحیه در هر بخش به طور تصادفی برای تصویربرداری انتخاب شد. تعداد سلول های DHE مثبت با استفاده از نرم افزار ImageJ 1.4 (موسسه ملی بهداشت) شمارش شد و میانگین محاسبه شد و به عنوان درصدهای نهایی برای هر بخش بافت مغز در نظر گرفته شد.

رنگ آمیزی TUNEL.برای ارزیابی درصد نورون های آپوپتوز از رنگ آمیزی TUNEL استفاده شد (29). مقاطع بافت منجمد با استفاده از سرم الاغ 5 درصد به مدت 2 ساعت در دمای اتاق مسدود شد و یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد با آنتی بادی اولیه anti-NeuN انکوبه شد (خرگوش؛ 1:200؛ گربه شماره 26975-1-AP؛ ProteinTech Group, Inc. .). سپس مقاطع بافتی با آنتی بادی ثانویه فلورسنت Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L) (شماره گربه 711-545-152؛ 1:500؛ Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc) انکوبه شدند. در دمای اتاق. رنگ آمیزی TUNEL با استفاده از کیت One Step TUNEL Apoptosis Assay (شماره Cat. C1090؛ موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) طبق پروتکل سازنده انجام شد. در نهایت، مقاطع بافتی برای هسته سلولی با استفاده از 2 میکروگرم بر میلی لیتر DAPI به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند. انتخاب تصادفی مکان‌های شمارش TUNEL و محاسبه نورون‌های TUNEL مثبت برای هر بخش با استفاده از روش فوق برای شمارش DHE انجام شد.

وسترن بلات (WB).WB برای نیمه کمی کردن سطح بیان پروتئین استفاده شد. پس از پرفیوژن سالین 4 درجه سانتی گراد از قلب برای خارج کردن خون از بافت مغز، بافت مغز سالم به دست آمد. مطالعات قبلی گزارش کرده‌اند که مدل SAH که از طریق سوراخ‌های اندوواسکولار سمت چپ ایجاد می‌شود، منجر به درجه‌ای از سوگیری نسبت به رویدادهای خونریزی می‌شود و می‌تواند از نظر آسیب به بافت سمت چپ مغز نسبتاً شدید باشد (30). بنابراین، بافت مغز سمت چپ برای ارزیابی آسیب پاتولوژیک به دنبال مدل‌سازی SAH استفاده شد. پروتئین های بافت مغز با استفاده از محلول لیز RIPA (گروه شماره P0013B؛ موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) مطابق پروتکل سازنده استخراج شد. غلظت پروتئین نمونه ها با سنجش BCA (شماره گربه P0012؛ موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) تعیین شد و متعاقباً با افزودن مقادیر مختلف آب دوبار مقطر به 5 میکروگرم در میکرولیتر تنظیم شد. 5 میکرولیتر از نمونه های پروتئین 5 میکروگرم بر میکرولیتر به هر خط اضافه شد و این نمونه های پروتئینی با الکتروفورز SDS-PAGE روی ژل های 10 درصد جدا شدند و به غشاهای PVDF منتقل شدند. غشاها به مدت 2 ساعت در دمای اتاق با استفاده از شیرخشک بدون چربی 5 درصد (شماره گربه P0216-300g؛ موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) مسدود شدند. غشاها یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد با آنتی بادی های اولیه به شرح زیر انکوبه شدند: Anti-p-ASK1 (Ser-83; 1:1،{17}}؛ Cat. no. MA5-28020; Thermo Fisher Scientific, Inc. .)، anti-ASK1 (1:1،000؛ cat. no. 8662; Cell Signaling Technology, Inc.)، anti-p‑p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1 ,000؛ cat. no. 9216; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-p38 MAPK (1:1,000; cat. no. 8690; Cell Signaling Technology, Inc.)، پروتئین کیناز فعال شده با استرس فسفات/Jun-amino-terminal kinase (phospho-SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185; 1,{40}}؛ cat. no. 9255; Cell Signal Technology, Inc.), anti-SAPK/JNK (JNK; 1:1,000; cat. no. 9252; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-4 hydroxynonenal (4-HNE; 1:1 ,000؛ شماره گربه ab46545؛ Abcam)، ضد هِم اکسیژناز 1 (HO‑1؛ 1:1،000؛ شماره گربه 82206؛ Cell Signaling Technology, Inc.)، anti-Bcl-2 (1:1،000؛ cat. no. 26593-1-AP; ProteinTech Group, Inc.), anti-Bax (1,1000; cat. no. 60267-1-Ig؛ ProteinTech Group, Inc.) و آنتی-اکتین (1:2،000؛ cat. no. 4970; Cell Signaling Technology, Inc.). پس از آن انکوباسیون با آنتی بادی‌های ثانویه کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انجام شد: IgG-HRP ضد موش بز (گروه شماره sc-2005؛ 1:5،{80}}؛ بیوتکنولوژی سانتا کروز , Inc.) یا IgG-HRP ضد خرگوش بز (شماره گربه sc-2004؛ 1:5000؛ Santa Cruz Biotechnology, Inc.)، و باندهای خاص با استفاده از کیت ECL (شماره گربه P0018AS; موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) و با استفاده از سیستم UVP Che Studio PLUS (Analytik Jena GmbH) تصویربرداری شده است. تجزیه و تحلیل نسبی چگالی باندهای WB با استفاده از نرم افزار ImageJ 1.4 (NIH) انجام شد و سطح بیان پروتئین در برابر اکتین نرمال شد.

طراحی تجربی

تغییرات بیان و محلی سازی سلولی ASK1 به دنبال SAH. در مجموع 36 موش صحرایی به طور تصادفی به شش گروه (n=6/گروه) به شرح زیر تقسیم شدند: i) شم عمل شده (شم)، ii) 3 ساعت پس از SAH، iii) 6 ساعت پس از SAH، IV ) 12 ساعت پس از سحر، v) 24 ساعت پس از سحر و vi) 72 ساعت پس از سحر. WB برای ارزیابی تغییرات در سطح بیان پروتئین ASK1 درون زا و p-ASK1 استفاده شد. در مجموع 4 موش دیگر به گروه‌های شم (n{11}}) و 24 ساعته SAH (n=2) تقسیم شدند و از رنگ‌آمیزی IF برای ارزیابی هم‌محلی‌سازی ASK1 استفاده شد.

اثرات درمانی مهارکننده ASK1 NQDI-1 بر عملکرد عصبی کوتاه مدت و بلندمدت پس از SAH. در مجموع 3 0 موش صحرایی به 5 گروه (n=6/گروه) به شرح زیر تقسیم شدند: i) شم، ii) SAH پلاس وسیله نقلیه، iii) SAH به اضافه 1.0 میکروگرم. /kg NQDI‑1، iv) SAH به علاوه 3.0 میکروگرم/کیلوگرم NQDI-1 و v) SAH به علاوه 10.0 میکروگرم/کیلوگرم NQDI-1. نمرات اصلاح شده گارسیا و تعادل پرتو برای ارزیابی عملکرد عصبی کوتاه مدت 24 ساعت پس از SAH استفاده شد. بر اساس میزان بهبود عصبی کوتاه‌مدت، 3.0 میکروگرم بر کیلوگرم NQDI-1 به عنوان مناسب‌ترین گروه دوز ارزیابی شد و این دوز NQDI-1 در آزمایش‌های بعدی استفاده شد. در مجموع 30 موش صحرایی به 3 گروه (n{21}}) به شرح زیر تقسیم شدند: i) شم، ii) SAH پلاس وسیله نقلیه، و iii) SAH به علاوه NQDI-1. آزمایش روتارود برای ارزیابی عملکرد عصبی طولانی مدت در روزهای 7، 14 و 21 پس از SAH، و آزمایش ماز آبی موریس در هفته 4 پس از SAH برای ارزیابی عملکرد عصبی طولانی مدت انجام شد.

اثرات درمانی مهارکننده ASK1 NQDI-1 بر استرس اکسیداتیو و آپوپتوز. در مجموع 12 موش به 3 گروه (n=4/گروه) به شرح زیر تقسیم شدند: i) شم، ii) SAH پلاس وسیله نقلیه، و iii) SAH به علاوه NQDI-1. رنگ آمیزی (THE) برای ارزیابی استرس اکسیداتیو و رنگ آمیزی TUNEL برای ارزیابی آپوپتوز عصبی 24 ساعت پس از SAH استفاده شد.

نقش مسیر سیگنالینگ ASK1/p38 و JNK در اثرات درمانی NQDI-1. در مجموع 48 موش به 8 گروه (n=6/گروه) به شرح زیر تقسیم شدند: i) شم، ii) SAH، iii) SAH پلاس وسیله نقلیه، iv) SAH به علاوه NQDI-1، v) SAH به علاوه درهم (Scr) تداخل کوتاه (si)RNA، vi) SAH به اضافه siRNA ASK1، vii) SAH به علاوه BMS‑582949 و viii) گروه SAH به علاوه SP600125. ASK1 siRNA، مهارکننده p38 BMS-582949، و بازدارنده JNK SP600125 برای ارزیابی اینکه آیا ASK1، p38، و JNK در اثرات محافظت عصبی NQDI-1 دخیل هستند، تزریق شدند.

تحلیل آماری. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شد و داده های تجربی WB در 6 تکرار مستقل و رنگ آمیزی DHE و رنگ آمیزی TUNEL به عنوان 4 تکرار مستقل به دست آمد. داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 17 (SPSS, Inc.) تجزیه و تحلیل شد. داده‌های حاصل از آزمایش ماز آبی موریس با استفاده از ANOVA ترکیبی / ANOVA اندازه‌گیری‌های مکرر دو طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی LSD مورد ارزیابی قرار گرفت. داده‌های حاصل از آزمایش‌های باقی‌مانده برای توزیع نرمال با استفاده از آزمون توزیع نرمال Shapiro-Wilk و سپس ANOVA یک طرفه و سپس آزمون مقایسه چندگانه تعقیبی Tukey مورد آزمایش قرار گرفتند. نمودارها با استفاده از GraphPad Prism 7 (نرم افزار GraphPad, Inc.) رسم شدند. پ<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

نتایج

مرگ و میر و شدت SAH. در مجموع از 191 موش صحرایی SD در مطالعه حاضر استفاده شد که 8 موش فقط به دلیل SAH خفیف (نمره درجه بندی SAH کمتر یا مساوی 8) از مطالعه خارج شدند. از موش های SD مورد استفاده در آزمایش ها، 34 موش در گروه شم و 149 موش تحت مدل سازی SAH قرار گرفتند. هیچ موش در گروه ساختگی تلف نشد. با این حال، 23 موش به دنبال مدل سازی SAH مردند (نرخ مرگ و میر 15.4 درصد) (جدول SI-V). در مقایسه با گروه شم، لخته‌ها در فضای زیر عنکبوتیه عمدتاً در نزدیکی حلقه ویلیس و در دو طرف شریان بازیلار به دنبال مدل‌سازی SAH قرار داشتند (شکل 1A). نمره درجه بندی SAH 24 ساعت پس از مدل سازی SAH تفاوت معنی داری در شدت خونریزی بین همه گروه های غیر شم و تفاوت معنی داری بین گروه های شم و همه گروه های غیر شم نشان نداد (شکل 1B).

تغییرات بیان پروتئین و محلی سازی سلولی ASK1 به دنبال SAH. سطح بیان پروتئین ASK1 افزایش یافت و در 24 ساعت در مغز به دنبال SAH به اوج رسید (شکل 1C و D). با این حال، نسبت بیان پروتئین p-ASK1/ASK1 تفاوت معنی داری نشان نداد (شکل 1C و E). محلی سازی سلولی ASK1 با نورون های NeuN مثبت، میکروگلیاهای Iba-1 مثبت و آستروسیت های GFAP مثبت در هر دو گروه شم و SAH 24 ساعت نشان داده شد (شکل 1F-H).

مهارکننده ASK1 NQDI-1 عملکردهای عصبی کوتاه مدت را 24 ساعت پس از SAH بهبود می بخشد. NQDI-1 (1، 3، و 10 میکروگرم/کیلوگرم) 1 ساعت پس از SAH به صورت داخل بطنی مغزی تزریق شد. موش‌هایی که تحت مدل‌سازی SAH قرار گرفتند، 24 ساعت پس از مدل‌سازی SAH، نمرات گارسیا و تعادل پرتو اصلاح‌شده به‌طور قابل‌توجهی پایین‌تر بود. با این حال، هر سه دوز NQDI-1 منجر به بهبود جزئی قابل توجهی در عملکرد عصبی کوتاه مدت شد (شکل 2A و B). نمرات گارسیای اصلاح شده در گروه SAH به علاوه NQDI-1 (3.{16}} میکروگرم/کیلوگرم) در مقایسه با گروه SAH به علاوه NQDI-1 (1.{19}} میکروگرم/کیلوگرم) به طور قابل‌توجهی بالاتر بود. با این حال، هیچ تفاوت آماری معنی‌داری در مقایسه با گروه SAH به علاوه NQDI-1 (10.0 میکروگرم/کیلوگرم) نشان داده نشد (شکل 2A و B)، که نشان می‌دهد افزایش بیشتر غلظت NQDI-1 به دنبال SAH باعث بهبود بیشتر در عملکرد عصبی کوتاه مدت نمی شود. بنابراین، NQDI-1 (3.0 میکروگرم بر کیلوگرم) به عنوان غلظت بهینه موثر در نظر گرفته شد و در آزمایش‌های بعدی مورد استفاده قرار گرفت.

مهارکننده ASK1 NQDI-1 عملکردهای عصبی طولانی مدت را پس از SAH بهبود می بخشد. با استفاده از سرعت های شروع 5 یا 10 دور در دقیقه برای تست روتارود، تأخیر سقوط در گروه خودرو SAH پلاس در مقایسه با گروه شم به طور قابل توجهی کاهش یافت، در حالی که تأخیر سقوط پس از تزریق داخل بطنی NQDI-1 در مقایسه با وسیله نقلیه SAH پلاس به طور قابل توجهی طولانی شد. گروه (شکل 2C و D). علاوه بر این، در طی روزهای 1 تا 5 مرحله تمرینی آزمایش ماز آبی موریس در هفته 4 پس از SAH، گروه SAH به علاوه وسیله نقلیه تاخیر فرار و فاصله شنا به طور قابل توجهی در مقایسه با گروه شم بیشتر نشان داد، در حالی که درمان NQDI-1 نشان داد کاهش قابل توجهی در مقایسه با گروه خودرو SAH به علاوه (شکل 2E-G). در مرحله آزمایش با حذف سکوی مدور زیر آب، تفاوت معنی داری در سرعت شنا بین سه گروه مشاهده نشد (شکل 2H). مدت زمان ربع کاوشگر در گروه وسیله نقلیه SAH به علاوه در مقایسه با گروه خودرو به طور قابل توجهی کوتاهتر بود و درمان NQDI-1 به طور قابل توجهی زمان اکتشاف را در مقایسه با گروه خودرو SAH پلاس طولانی کرد (شکل 2 I).

مهارکننده ASK1 NQDI-1 استرس اکسیداتیو و آپوپتوز عصبی را 24 ساعت پس از SAH کاهش می دهد. سطح استرس اکسیداتیو با استفاده از رنگ‌آمیزی DHE و نسبت نورون‌های آپوپتوز با استفاده از درصد نورون‌های TUNEL مثبت 24 ساعت پس از SAH اندازه‌گیری شد. درصد سلول های DHE مثبت در گروه SAH به علاوه وسیله نقلیه در مقایسه با گروه شم به طور قابل توجهی بالاتر بود و درمان NQDI-1 به طور قابل توجهی این میزان را در مقایسه با گروه SAH به علاوه وسیله نقلیه کاهش داد (شکل 3A و). درصد نورون های TUNEL مثبت در گروه SAH به علاوه وسیله نقلیه در مقایسه با گروه شم به طور قابل توجهی بالاتر بود. با این حال، درصد نورون‌های TUNEL مثبت به‌دنبال درمان با NQDI-1 در مقایسه با گروه وسیله نقلیه SAH پلاس (شکل 3B و D) به‌طور قابل‌توجهی کاهش یافت.

ASK1 siRNA، BMS-582949، و SP600125 عملکردهای عصبی کوتاه مدت را 24 ساعت پس از SAH بهبود می بخشند. در مقایسه با گروه SAH plus Scr siRNA یا SAH plus گروه خودرو، تجویز ASK1 siRNA، BMS‑582949 یا SP600125 بهبود قابل توجهی را در امتیاز گارسیا اصلاح شده و تعادل پرتو نشان داد (شکل 4A و B).

NQDI-1 استرس اکسیداتیو و آپوپتوز را پس از SAH از طریق کاهش فسفوریلاسیون ASK1، p38 و JNK کاهش می دهد. سطح بیان پروتئین ASK1، p-p38، p-JNK، 4-HNE، HO-1، Bax، و Bcl-2 بعد از SAH در مقایسه با گروه شم به طور قابل توجهی بالاتر بود. با این حال، نسبت p-ASK1/ASK1 تفاوت معنی داری نداشت (شکل 5A-M). تزریق وسیله نقلیه یا Scr siRNA تفاوت معنی داری در سطوح بیان پروتئین در مقایسه با گروه SAH ایجاد نکرد. در مقایسه با گروه SAH پلاس، درمان با استفاده از NQDI-1 باعث کاهش قابل توجهی در سطوح بیان پروتئین p-ASK1/ASK1، p-p38، p-JNK، 4-HNE و Bax شد، در حالی که سطح بیان پروتئین HO ‑1 و Bcl‑2 به طور قابل توجهی افزایش یافت. در مقایسه با گروه SAH به علاوه Scr siRNA، سطح بیان پروتئین ASK1 به طور قابل توجهی پس از تزریق siRNA ASK1 کاهش یافت. درمان با ASK1 siRNA همچنین منجر به کاهش قابل توجهی در سطح بیان پروتئین p-p38، p-JNK، 4-HNE، و Bax و افزایش قابل توجهی در بیان HO-1 و Bcl-2 در مقایسه با SAH به علاوه Scr siRNA شد. گروه

مهارکننده p38 BMS-582949 سطوح بیان پروتئین p-p38 را کاهش می دهد اما بر سطح بیان پروتئین p-ASK1، ASK1 یا p-JNK تأثیر نمی گذارد. درمان با مهارکننده p38 BMS-582949 کاهش قابل توجهی را در سطوح بیان پروتئین p-p38، 4-HNE، و Bax نشان داد و همچنین بیان پروتئین HO-1 و Bcl-2 را به طور قابل توجهی در مقایسه با گروه SAH پلاس افزایش داد. با این حال، سطح بیان پروتئین ASK1، p-ASK1/ASK1 و p-JNK تفاوت معنی داری نشان نداد (شکل 6A-M). مهارکننده JNK SP600125 سطح بیان پروتئین p-JNK را کاهش می دهد اما بر سطح بیان پروتئین p-ASK1، ASK1 یا p-p38 تأثیر نمی گذارد. درمان با بازدارنده JNK SP600125 باعث کاهش قابل توجهی در سطوح بیان پروتئین p-JNK، 4-HNE، و Bax و افزایش قابل توجهی در سطح بیان پروتئین HO-1 و Bcl-2 در مقایسه با گروه SAH پلاس شد. با این حال، سطح بیان پروتئین ASK1، p-ASK1/ASK1، و p-p38 به طور قابل توجهی تغییر نکرد (شکل 7A-M).

【برای اطلاعات بیشتر: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】