وزیکول‌های باکتریایی تکثیر ویروس را در ماکروفاژها از طریق محور 4-TRIF TLR مسدود می‌کنند.

خلاصه

باکتری های گرم منفی به طور طبیعی وزیکول های غشایی خارجی (OMVs) در اندازه نانو ترشح می کنند که واسطه های مهم ارتباط و پاتوژنز هستند. جذب OMV توسط سلول های میزبان، سیگنال دهی TLR را از طریق PAMP های انتقال یافته فعال می کند. ماکروفاژهای آلوئولی به عنوان سلول‌های ایمنی مقیم مهم در سطح مشترک بافت هوا قرار دارند، جایی که اولین خط دفاعی در برابر میکروارگانیسم‌ها و ذرات استنشاقی را تشکیل می‌دهند. تا به امروز، اطلاعات کمی در مورد تداخل بین ماکروفاژهای آلوئولی و OMVs از باکتری های بیماری زا وجود دارد. پاسخ ایمنی به OMV ها و مکانیسم های اساسی هنوز مبهم است. در اینجا، ما پاسخ ماکروفاژهای اولیه انسانی به وزیکول‌های باکتریایی (لژیونلا پنوموفیلا، کلبسیلا پنومونیه، اشریشیا کلی، سالمونلا انتریکا، استرپتوکوک پنومونیه) را بررسی کردیم و فعال‌سازی NF-kB قابل مقایسه را در تمام وزیکول‌های آزمایش‌شده مشاهده کردیم. در مقابل، ما یک سیگنال دهی IFN نوع I را با فسفوریلاسیون طولانی مدت STAT1 و القای قوی Mx1 توصیف می کنیم که تکثیر ویروس آنفولانزای A را فقط برای کلبسیلا، E.coli و سالمونلا OMVs مسدود می کند. اثرات ضد ویروسی ناشی از OMV برای OMVs Clear coli بدون اندوتوکسین و OMVs تحت درمان با پلی‌میکسین کمتر مشخص بود. تحریک LPS نمی تواند این وضعیت ضد ویروسی را تقلید کند، در حالی که ناک اوت TRIF آن را لغو کرد. نکته مهم این است که مایع رویی از ماکروفاژهای تحت درمان با OMV یک پاسخ ضد ویروسی را در سلول‌های اپیتلیال آلوئولی (AEC) القا می‌کند که نشان‌دهنده ارتباط بین سلولی ناشی از OMV است. در نهایت، نتایج در یک مدل عفونت ex vivo با بافت اولیه ریه انسان تایید شد. در نتیجه، کلبسیلا، E.coli، و سالمونلا OMVs ایمنی ضد ویروسی را در ماکروفاژها از طریق سیگنال‌دهی TLR{11}برای کاهش تکثیر ویروس در ماکروفاژها، AECs و بافت ریه ایجاد می‌کنند. این باکتری های گرم منفی از طریق OMV ها ایمنی ضد ویروسی را در ریه القا می کنند و تأثیر بالقوه تعیین کننده و فوق العاده ای بر پیامدهای عفونت همزمان باکتریایی و ویروسی دارند.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

کلید واژه ها

وزیکول های خارج سلولی، وزیکول های غشای خارجی، عفونت همزمان باکتریایی و ویروسی، پنومونی، ماکروفاژها، سلول های اپیتلیال آلوئولی، ایمنی ذاتی ضد ویروسی

معرفی

وزیکول های غشای خارجی (OMVs) به طور طبیعی توسط باکتری های گرم منفی آزاد می شوند که قطر آنها تا 300 نانومتر است. باکتری های گرم مثبت به همان اندازه قادر به آزادسازی وزیکول های غشایی (MVs) هستند. در نتیجه بیوژنز، این ساختارهای غشایی دولایه لیپیدی، علاوه بر محتویات پری پلاسمیک، حاوی اجزای اصلی غشای باکتریایی (خارجی) مانند لیپیدها، پروتئین ها و در مورد باکتری های گرم منفی، لیپوپلی ساکاریدها (LPS) هستند. [1]. علاوه بر نقش آنها در ارتباطات باکتریایی، OMV ها با اثرات بیماری زایی و انتقال عوامل بیماریزا، به عنوان مثال VacA از هلیکوباکتر پیلوری، شیگا توکسین از شیگلا دیسانتریا یا ClyA از اشریشیا کلی انتروهموراژیک [2] مرتبط هستند. نشان داده شد که این OMV ها سلول های اپیتلیال و پاسخ های ایمنی را دستکاری می کنند. حضور اندوتوکسین باکتریایی روی سطح OMV همراه با سایر الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن (PAMPs) آنها را به محرک‌های قوی برای سلول‌های ایمنی تبدیل می‌کند، زیرا هنوز می‌توانند توسط گیرنده‌های مربوطه خود شناسایی شوند [3]. درگیر شدن گیرنده‌های Tolllike (TLRs) و گیرنده‌های Nod مانند در سلول‌های ایمنی ذاتی می‌تواند باعث آزادسازی سیتوکین‌های پیش‌التهابی و تنظیم‌کننده ایمنی، از جمله جذب نوتروفیل‌ها یا اختلال در اتصالات محکم در لایه‌های سلول‌های اپیتلیال شود [4]. یکی از انواع مهم سلول های ایمنی ساکن در ریه ماکروفاژهای آلوئولی (AMs) هستند که در سطح مشترک بافت هوا در آلوئول ها قرار دارند. از طریق بلع ذرات استنشاقی، AMs اولین خط دفاعی در برابر میکروارگانیسم‌ها و ذرات توسط فاگوسیتوز و تخریب را نشان می‌دهد. پس از برخورد با پاتوژن، ماکروفاژها آنتی ژن هایی را به سلول های ایمنی تطبیقی ​​ارائه می کنند و سیتوکین های پیش التهابی را آزاد می کنند. بنابراین، آنها می توانند روی سلول های اپیتلیال آلوئولی نوع I و II (AECs) و سایر سلول های ایمنی عمل کنند (پرونده اضافی 1: شکل S1A). AMs را می توان توسط چندین PAMP فعال کرد تا سیگنال دهی درون سلولی و القای الگوهای بیان ژن متمایز را از طریق گیرنده های ایمنی متنوع القا کند [5، 6]، که منجر به سیگنال دهی MyD88 یا TRIF می شود که هر دو به نوبه خود، زیر مجموعه های مختلفی از ژن ها را القا می کنند (فایل اضافی 1). : شکل S1B). علاوه بر این، آنها عملکردهای دیگری را در هموستاز ریوی و پاتوژنز انجام می دهند و آنها را به مرکز سیگنال دهی مرکزی و ارکستراتور در ایمنی ریه تبدیل می کنند. ویروس های آنفلوانزا از خانواده Orthomyxoviridae هستند و باعث عفونت های دستگاه تنفسی فوقانی و تحتانی می شوند که از موارد خفیف تا شدید را شامل می شود. در حالی که بیشتر عفونت‌های فصلی ویروس آنفولانزا خود محدود شونده هستند، برخی از بیماران دچار ذات‌الریه و سندرم زجر تنفسی حاد می‌شوند که تخمین زده می‌شود که منجر به مرگ سالانه 650،{22}} در سراسر جهان شود [7]. ویروس آنفولانزای A (IAV) عمدتاً سلول های اپیتلیال راه هوایی را آلوده کرده و در آن تکثیر می کند. عفونت ویروسی منجر به فعال‌سازی و سیگنال‌دهی گیرنده تشخیص الگو (PRR) از طریق چندین فاکتور رونویسی، یعنی فاکتور هسته‌ای کاپا B (NF-κB) و فاکتور تنظیم‌کننده اینترفرون (IRF)-3/7 می‌شود که نوع I و III را القا می‌کنند. تولید اینترفرون (IFN) این پاسخ برجسته IFN در نتیجه یک "وضعیت ضد ویروسی" سلولی را به صورت خودکار و پاراکرین القا می کند [8]. علاوه بر این، چندین سیتوکین و کموکاین دیگر پس از عفونت ترشح می شوند. این شبکه سیتوکین دفاع میزبان به شدت تنظیم شده، جمعیت سلول های ایمنی را به محل عفونت جذب می کند و پاسخ های ایمنی ذاتی و سازگار را تنظیم می کند [9]. با این حال، IAV همچنین می تواند AM ها را آلوده کند و در نتیجه تعداد AM ها در طول عفونت حاد به شدت کاهش می یابد، که برای رفع عفونت باید دوباره برقرار شود. فعال شدن سلول های ایمنی ذاتی و ترشح سیتوکین های پیش التهابی منجر به جذب سلول های ذاتی اضافی، کنترل عفونت و شروع ترمیم بافت می شود [10، 11]. در اینجا، ما پاسخ ماکروفاژها به وزیکول‌های خارج سلولی باکتریایی و تأثیر آنها بر عفونت IAV بعدی را تجزیه و تحلیل می‌کنیم.

مزایای مکمل سیستانچ-چگونه سیستم ایمنی بدن را تقویت کنیم

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

مواد و روش ها

مواد شیمیایی و آنتی بادی ها

محیط Ham's F12 از GE Healthcare Europe (فرایبورگ، آلمان) تهیه شد. RPMI-1640، DMEM، GlutaMAX، پنی سیلین/استرپتومایسین و FCS از Life Technologies (دارمشتات، آلمان) خریداری شدند. PBS از Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund، آلمان) خریداری شد. Opti-MEM از Thermo Fisher Scientific (فرانکفورت، آلمان) به دست آمد. فوربول 12-میریستات 13-استات (PMA) توسط Sigma-Aldrich Chemie (مونیخ، آلمان) عرضه شد. LPS (سالمونلا مینه سوتا R595، درجه TLR) از Enzo Life Sciences (لوزن، سوئیس) به دست آمد. Pam3CSK4 از Invivogen (سن دیگو، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. مهارکننده JAK روکسولیتینیب از شرکت Biozol Diagnostics Vertrieb GmbH (Eching، آلمان) تهیه شد. پلی میکسین B از Merck Millipore (بیلریکا، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. آنتی بادی ها از Abcam (کمبریج، انگلستان) به دست آمد: Mx1 (ab95926)، نوکلئوپروتئین آنفلوانزا (9G8). سیگنالینگ سلولی (کمبریج، انگلستان): فسفو-IRF-3 (Ser396) (4D4G)، فسفو-TBK-1 (Ser172) (D52C2)، TBK-1 (61223S)، فسفو- STAT1 (Tyr)(58D6), STAT1 (D1K9Y), موس ضد خرگوش (L27A9), IRAK-1 (4359S), phospho-p38 (Tr180/Tyr182)(9211S), p38 (9212S); Thermo Fisher Scientific: ضد موش بز (Alexa for 488); ProteinTech: anti-IRF-3 (66670-1) or Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Germany): -actin (C4)، anti-Mouse (mIgGκBPHRP, sc-516102). سایر مواد شیمیایی کاربردی دارای درجه تحلیلی بوده و از منابع تجاری به دست آمده اند.

کشت باکتری و آماده سازی OMV/MV

سویه L. pneumophila Corby wildtype همانطور که قبلا توضیح داده شد استفاده شد [12]. K. pneumoniae (#7{14}}0721/MGH78578)، E.coli (#25922)، و سرووار S. enterica Typhimurium (#14028) از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (Rockville، MD، ایالات متحده آمریکا) به دست آمدند. ClearColi™ BL21 از BioCat GmbH (هایدلبرگ، آلمان) بود. S. pneumoniae D39 Δcps با مهربانی توسط Sven Hammerschmidt ارائه شد. باکتری ها یک شبه روی صفحات آگار رشد کردند (MacConkey: Kp، Ec، Sal؛ LB: Clear coli، صفحات خون آگار: Sp) و سپس برای تلقیح محیط های مایع (LB: Kp، Ec، Sal، Clear coli؛ THY: Sp) استفاده شدند. . باکتری ها تا مرحله لگاریتمی پایانی در دمای 37 درجه تحت تکان دادن ثابت رشد کردند (MaxQ 6{19}}، Thermo Fisher Scientific، کارلسروهه، آلمان؛ به جز Sp). سپس کشت های باکتریایی سه بار چرخانده شدند (4500×g، 15 دقیقه، 4 درجه؛ Multifuge X3R، Thermo Fisher Scientific). باکتری های باقی مانده با فیلتراسیون استریل از طریق منافذ 0.22 میکرومتر حذف شدند. مایع رویی با فیلترهای برش وزن مولکولی 100 کیلو دالتون (Merck KGaA، دارمشتات، آلمان) تغلیظ شد و وزیکول ها با اولتراسانتریفیوژ یا کروماتوگرافی حذف اندازه (SEC) خالص شدند. برای اولتراسانتریفیوژ، مایع رویی در 100000 × گرم، 3 ساعت و 4 درجه اولتراسانتریفیوژ شد. پس از شستشوی گلوله OMV/MV به دست آمده با PBS استریل، اولتراسانتریفیوژ تکرار شد و گلوله وزیکول در PBS استریل حل شد. محتوای پروتئین توسط کیت سنجش پروتئین Pierce BCA طبق دستورالعمل سازنده (Thermo Fisher Scientific) تعیین شد و از مقادیر مساوی پروتئین برای آزمایشات تحریک استفاده شد. برای SEC، مایع رویی تا 500 میکرولیتر تغلیظ شد و بر روی ستون‌های اصلی/70 نانومتری Gen 2 (IZON Science LTD، لیون، فرانسه)، که طبق پروتکل سازنده با 10 میلی‌لیتر PBS از قبل شسته شدند، بارگذاری شد. وزیکول ها با استفاده از PBS استریل شسته شدند و بخش های 500 میکرولیتری جمع آوری شد. وزیکول ها در فراکسیون های 7-12 شسته شدند که توسط نانو فلوسیتومتری (nFCM؛ NanoFCM Co., Ltd، ناتینگهام، انگلستان) تعیین شد. فراکسیون های حاوی وزیکول با استفاده از فیلترهای برش وزن مولکولی (Merck KGaA) به 200-400 میکرولیتر متمرکز شدند. غلظت وزیکول تمام آماده‌سازی‌ها توسط nFCM تعیین شد و مقادیر مساوی از وزیکول‌ها برای آزمایش‌های تحریک استفاده شد. آماده‌سازی OMV/MV هر دو روش خالص‌سازی برای آلودگی باکتری‌ها با آبکاری و ذخیره‌سازی در مقادیر جزئی در درجه -20 بررسی شد.

Nfc

برای nFCM یک نانو آنالایزر، (NanoFCM Co., Ltd، ناتینگهام، انگلستان) مجهز به لیزر 488 نانومتری با 200 نانومتر مهره‌های پلی استایرن (NanoFCM Co.) با غلظت مشخصی کالیبره شد. 2.08×10^8 ذرات در میلی لیتر و همچنین به عنوان مرجع برای غلظت ذرات استفاده می شود. علاوه بر این، دانه‌های سیلیکا monodisperse (NanoFCM Co.) در چهار اندازه مختلف به عنوان استاندارد مرجع اندازه برای کالیبره کردن اندازه وزیکول‌ها استفاده شد. تازه فیلتر شده (0.1 میکرومتر) 1×PBS به عنوان سیگنال پس زمینه تجزیه و تحلیل شد و از اندازه گیری های دیگر کم شد. هر هیستوگرام توزیع یا نمودار نقطه ای از داده های جمع آوری شده به مدت 1 دقیقه با فشار نمونه 1 کیلو پاسکال استخراج شد. نمونه‌های OMV با فیلتر (0.1 میکرومتر) 1×PBS رقیق شدند که منجر به تعداد ذرات در محدوده بهینه 2500-12،{17}} رویداد شد. غلظت و توزیع اندازه ذرات با استفاده از نرم افزار nFCM (NF Profession V1.08) محاسبه شد.

میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)

شبکه های مسی پوشش داده شده با کربن (مش 400) با تخلیه درخشش هیدروفیلیز شدند (PELCO easiGlow، تد پلا، ایالات متحده). پنج میکرولیتر از نمونه ها بر روی شبکه های هیدروفیل شده اعمال شد و پس از یک مرحله شستشوی کوتاه با آب مقطر دو برابر با 2% (w/v) اورانیل استات رنگ آمیزی شد. نمونه ها با میکروسکوپ الکترونی عبوری JEOL JEM{3}} با استفاده از ولتاژ شتاب 120 کیلو ولت آنالیز شدند. تصاویر با دوربین CCD F214 FastScan (TVIPS، Gauting، آلمان) به دست آمد.

cistanche tubulosa - سیستم ایمنی را بهبود می بخشد

کشت سلولی

رده های سلولی انسانی (THP{0}}، A549، BEAS2B، Calu-3، HCC827) از مجموعه کشت نوع آمریکایی به دست آمد. سلول های مادین داربی سگ کلیه II (MDCK II) از ECACC-Sigma-Aldrich (دارمشتات، آلمان) خریداری شد. سلول های THP{8}} Dual™ (Dual) و THP-1 Dual™ TRIF-KO (TRIF-/-) ​​از Invivogen اروپا (تولوز، فرانسه) به دست آمدند. سلول ها در Ham's F12، DMEM یا RPMI{12}} تکمیل شده با 1 میلی مولار پیروات سدیم، 2 میلی مولار گلوتامین و همچنین 10 درصد FCS گرما فعال شده در شرایط کشت سلولی کشت شدند. سلول‌های THP{16}} Dual™ در RPMI{17}} تکمیل‌شده با 1٪ پنی‌سیلین/استرپتومایسین، 2 میلی‌مولار گلوتامین، 10 درصد FCS غیرفعال‌شده با حرارت، 100 میکروگرم در میلی‌لیتر Normocin™ و 25 میلی‌مولار بافر HEPES کشت شدند. سلول‌های THP-1، Dual و TRIF-/- در سلول‌های ماکروفاژ مانند با افزودن 20 نانومولار PMA به مدت 24 ساعت تمایز یافتند.

شبیه سازی Mx1 در وکتور SparQ

توالی کدکننده Mx1 از cDNA THP-1 توسط Phusion PCR با استفاده از DNA پلیمراز Phusion High-Fidelity (New England Biolabs, Ipswich, USA) مطابق دستورالعمل سازنده تولید شد. با ادغام توالی کدکننده HA به پرایمر معکوس، یک HAtag اضافه شد (معنا: 5'-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGAC-3'، ضد حس: 5'-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTAGTAGTAGTAGGTAGGTAGTAGTAGGTAGTAGTAGTAGGTAGGTAGGTAGTAGTAGGTAGTAGGTAGTAGGTAGGTAGTAGTAGGTAGTAGTAGGTAGTAGTAGTG قطعه PCR و همچنین وکتور SparQ (Addgene، Watertown، ایالات متحده آمریکا) با آنزیم های محدود کننده BstbI و NotI (Thermo Fisher Scientific) هضم شدند و با T4 DNA Ligase (New England Biolabs) به وکتور SparQ متصل شدند.

انتقال سلول های HEK293T و تولید لنتی ویروس

سلول های HEK293T با وکتور SparQ رقیق شده در Opti-MEM حاوی توالی برای Mx1 و یک توالی GFP، ناقل بسته بندی ویروسی psPAX2 و پلاسمید پوششی pVSV-G (Addgene) با لیپوفکتامین 2 ترانسفکت شدند (Ther8}0). Fisher Scientific) طبق پروتکل سازنده. لنتی ویروس تولید شد و مایع رویی حاوی ویروس هر روز به مدت 72 ساعت جمع آوری شد. مایع رویی با استفاده از فیلتر 0.45 میکرومتری فیلتر شد و سلول‌های THP{10}} تبدیل شدند (به زیر مراجعه کنید). یک بردار SparQ خالی بدون دنباله Mx1 برای انتقال سلول‌ها برای تولید یک خط سلولی کنترل مربوطه (VC{12}}کنترل برداری) استفاده شد.

انتقال سلول های THP-1

سلول‌های THP{0}} با لنتی ویروس از مایع رویی فیلتر شده کشت سلولی HEK293T انتقال داده شدند (به بالا مراجعه کنید). پلی‌برن (4 میکروگرم بر میلی‌لیتر، سیگما آلدریچ) برای بهبود کارایی انتقال اضافه شد. سلول ها تا شش روز انکوبه شدند. سلول های GFP مثبت توسط فلوسایتومتری مرتب شدند.

جداسازی و تمایز BDMs

مونوسیت‌های انسانی از اهداکنندگان سالم با انتخاب مغناطیسی CD14 مثبت از سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی جدا شده و در حضور 1% AB سرم انسانی به ماکروفاژهای مشتق از خون (BDM) تمایز داده شدند.

تحریک OMV/MV ماکروفاژها

ماکروفاژهای اولیه انسانی یا سلول‌های تمایز یافته THP{0}} با OMV/MVs خالص (هر میکروگرم در میلی‌لیتر برای وزیکول‌های خالص‌شده از طریق اولتراسانتریفیوژ و تعداد وزیکول (MOV) 1،{3}} برای SEC خالص‌سازی شده انکوبه شدند. وزیکول ها) تا 20 ساعت در محیط کامل. استفاده از مهارکننده اضافی 1 ساعت قبل از درمان وزیکول انجام شد. ماکروفاژهای تحریک‌شده با Te یا برای جداسازی پروتئین یا RNA یا آزمایش‌های عفونت بعدی مورد استفاده قرار گرفتند. مایع رویی حاوی سیتوکین به‌دست‌آمده برای آنالیز ELISA یا LDH یا فیلتر استریل استفاده شد و برای تحریک سلول‌های اپیتلیال استفاده شد.

تصفیه ویروس و تیتراسیون ویروس

همانطور که قبلا توضیح داده شد، خالص سازی ویروس و تیتراسیون ویروس در سلول های MDCK II انجام شد [14]. همانطور که قبلا توضیح داده شد، تیتر ویروس با روش پلاک تعیین شد [15]. به طور خلاصه، سلول‌های همرو MDCK II با یک ویروس رقیق‌شده سریال یا مایع رویی بافت (در محیط کشت MDCK II بدون FCS) آلوده شدند. ویروس به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه به سلولها جذب شد. ده، تلقیح با محیط تازه (به همراه 1 میکروگرم در میلی لیتر تریپسین تیمار شده با TPCK (برای IAV) و 1% Avicel® PH-101 (سیگما آلدریچ)) جایگزین شد. سلول‌های MDCK II با کریستال ویولت رنگ‌آمیزی شدند یا سلول‌های آلوده به ویروس با آنتی‌بادی اولیه (1:2،{11}}) (نوکلئوپروتئین A ضد آنفلوانزای موش، MCA400، Bio-Rad، آلمان) و آنتی‌بادی ثانویه رنگ‌آمیزی شدند. 1:4، 000) (Goat Anti-Mouse IgGHRP, 170–6516, Bio-Rad, Germany) برای سنجش پلاک. پلاک ها به صورت دستی شمارش و به صورت واحدهای تشکیل دهنده پلاک (pfu) در هر میلی لیتر بیان شدند.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی

ابتلا به ویروس

پس از 20 ساعت قبل از تحریک با وزیکول های باکتریایی یا مایع رویی حاوی سیتوکین، سلول ها با IAV یا ویروس استوماتیت تاولی (VSV) آلوده شدند. ماکروفاژها با H1N1 (A/WSN/33) یا VSV آلوده شدند، در حالی که سلول‌های اپیتلیال با H1N1 (A/Hamburg/2009/PDM) هر دو در محیط‌های تازه بدون FCS آلوده شدند. پس از 1 ساعت تلقیح، ویروس آزاد حذف شد و محیط با محیط حاوی TPCK-تریپسین برای IAV یا محیط خالی برای VSV جایگزین شد. سلول ها تا 48 ساعت انکوبه شدند تا امکان تکثیر چند حلقه ای فراهم شود.

تهیه PCLS انسانی

بافت ریه از بیمارانی که به دلیل سرطان ریه در دانشکده پزشکی هانوفر (MHH، هانوفر، آلمان) تحت برداشتن لوب قرار گرفتند، به دست آمد. تنها بافتی از بخش‌های عاری از بیماری از نظر ماکروسکوپی و میکروسکوپی از ریه برای آزمایش‌ها استفاده شد. برش‌های ریه با برش دقیق انسانی (PCLS) همانطور که قبلاً توضیح داده شد آماده شدند [16]. دو برش بافت در هر چاهک در یک صفحه 24-چاهی تحت شرایط غوطه‌وری (DMEM/F12 همراه با 1% پنی‌سیلین/استرپتومایسین) در دمای 37 درجه، CO2 5% در طول شب کشت داده شد.

عفونت IAV PCLS

PCLS با 1 میکروگرم در میلی لیتر OMVهای خالص شده از L. pneumophila یا K. pneumoniae رقیق شده در DMEM/F12 همراه با 1٪ پنی سیلین/استرپتومایسین در دمای 37 درجه، CO2 5٪ به مدت 2 ساعت تحریک شد. محیط حذف شد و PCLS با 25،{8}} pfu/چاه در 250 میکرولیتر ویروس آنفلوانزا A/California/04/2009 (H1N1pdm) تلقیح شد. PCLS در دمای 35 درجه انکوبه شد و هر 15 دقیقه در طول تلقیح تکان داده شد تا عفونت ویروسی همگن ایجاد شود. پس از آن، تلقیح دور انداخته شد و با DMEM/F12 همراه با 1% پنی سیلین/استرپتومایسین جایگزین شد. پس از انکوباسیون به مدت 48 ساعت، مایع رویی برای تشخیص ویروس، انتشار LDH و کمی سازی سیتوکین جمع آوری شد. نمونه‌ها برای اندازه‌گیری سیتوکین با کوکتل مهارکننده پروتئاز 0.2٪ (P1860، سیگما-آلدریچ، مونیخ، آلمان) تکمیل شدند و تا زمان تجزیه و تحلیل در دمای 80 درجه نگهداری شدند. PCLS منجمد شد و در دمای 80 درجه تا زمان خالص سازی RNA همانطور که قبلا توضیح داده شد نگهداری شد [17].

LDH

سنجش آزادسازی LDH طبق دستورالعمل سازنده با استفاده از کیت سنجش سمیت سلولی Pierce™ LDH که از Roche (مانهایم، آلمان) یا کیت تشخیص سمیت سلولی (LDH) (Roche، Merck) تهیه شده بود، انجام شد. جذب با استفاده از میکروپلیت خوان بی نهایت F200Pro (Tecan، Männedorf، سوئیس) اندازه گیری شد.

الایزا

سیتوکین‌های CXCL8/IL-8، CXCL10/IP-10 و IL-1 از رویی بدون سلول با استفاده از کیت‌های تجاری ELISA (سیستم‌های تحقیق و توسعه، ویزبادن، آلمان) با توجه به تولیدکننده اندازه‌گیری شدند. دستورالعمل ها.

سنجش QUANTI-blue™

برای تعیین فعالیت گزارشگر SEAP در رویی کشت سلولی از THP{0}} Dual™ و سلولهای TRIF-/- مربوطه، سنجش QUANTI-Blue™ طبق پروتکل سازنده انجام شد. به طور خلاصه، مایع رویی کشت سلولی پس از تحریک سلول‌ها با OMV جمع‌آوری شد. ابتدا محلول QUANTI-Blue™ و مایع رویی کشت سلولی در یک صفحه چاهی با کف چربی توزیع شد. پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه به مدت 150 دقیقه، چگالی نوری در 630 نانومتر در دستگاه میکروپلیت خوان Infinite F200Pro تعیین شد.

سنجش QUANTI-luc™

برای تعیین فعالیت گزارشگر لوسیا لوسیفراز در رویی کشت سلولی از سلول‌های THP{{0}} Dual™ و مربوطه TRIF-/-، سنجش QUANTI-Luc™ طبق پروتکل سازنده انجام شد. به طور خلاصه، مایع رویی کشت سلولی در یک صفحه چاهی با ته چربی سفید (BRAND GmbH & Co. KG، Wertheim، آلمان) توزیع شد. محلول سنجش QUANTI-Luc™ اضافه شد و اندازه‌گیری لومینسانس بلافاصله با زمان خواندن 0.1 ثانیه در یک میکروپلیت خوان بی‌نهایت F200Pro انجام شد.

وسترن بلات

برای تعیین بیان پروتئین یا فسفوریلاسیون، وسترن بلات همانطور که قبلا توضیح داده شد انجام شد [18].

آماده سازی RNA و PCR در زمان واقعی

برای تجزیه و تحلیل بیان ژن، جداسازی RNA با استخراج فنل-کلروفرم انجام شد و رونویسی معکوس همانطور که قبلا توضیح داده شد [12] انجام شد. سپس PCR زمان واقعی کمی در ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) با Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs) و جفت پرایمر خاص انجام شد. با استفاده از روش 2-ΔΔCT [19]، القای x برابر محاسبه شد و نتایج به سلول های کنترل مربوطه نرمال شد. 18S: fwd: 5′-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3′، برگردان: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3′ CXCL8: fwd: 5′-ACTGAGAGTGATTGATTGAGAG TGGAC-3}}5′-CACCACTCAAT {20}}' IFI44: fwd: 5'-TATCCAGACAGAGAGCAGCTACC-3'، برگردان: 5'-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3' IFIT1: fwd: 5'-ATGCAGGAAGAACATGACAACC'{31}: ′-TCTGGACACTCCATTCTATAGCG-3′ IFNA1: fwd: 5′-ACAGGAGGACCTTGATGCTC-3′، برگردان: 5′-TCTGCTGGATCAGCTCATGG-3′ IFNB: fwd: fwd: ACTAGACCCTTGATGCTC , دور: 5′-TGTCCTTGAGGCAGTATTCAAG-3′ IL1B: fwd: 5′-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3′، دور: 5′-CAGGTCCTGGAAGGAGGAGCACTTC{{54}′fWGGCAGTGCACTTC{{54}'-{GAGGCAGTC{54}'-{GAGGCAGT 58}}′, rev: 5′-CACCATTTCTCCAGGGGGCAT-3′ Mx1: fwd: 5′-GGGCTTTGGAATTCTGTGGC-3′, rev: 5′-CCTTGGAATGGTGGCTGGGT{{68} fwd: -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3'، دور: 5'-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3' RPS18: fwd: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3'، دور: 5'-GATCACTACCAG'

ایمونوفلورسانس

سلول‌های THP{{{{0}} روی ورقه‌های پوششی با افزودن 20 نانومولار PMA متمایز شدند و با OMVs/MVs به مدت 2{16}} ساعت انکوبه شدند. سلول‌ها متعاقباً به مدت 4 ساعت با H1N1 (A/WSN/33؛ تعدد عفونت (MOI) 0.1) آلوده شدند. پس از 15 دقیقه تثبیت با 3 درصد پارافورمالدئید، لام ها سه بار با PBS شسته و با 2/0 درصد تریتون X{13}} در TBS (10 دقیقه، دمای اتاق) نفوذ پذیر شدند. پس از مسدود کردن (1% BSA در TBS/0.2% تریتون X{18}})، سلول‌ها با آنتی‌بادی -NP (1:250، در محلول مسدودکننده) انکوبه شدند. آنتی بادی ثانویه (1:1000) همراه با DAPI (1:2000) به مدت 1 ساعت در تاریکی انکوبه شد. پوشش های نصب شده روی میکروسکوپ فلورسانس (AxioVision، Zeiss، Jena، آلمان) آنالیز شدند.

بیانیه اخلاقی

آزمایش‌ها با برش‌های بافت ریه انسان توسط کمیته اخلاق دانشکده پزشکی هانوفر (MHH، هانوفر، آلمان) تأیید شد و با کد اخلاق انجمن پزشکی جهانی (شماره 2701–2015) مطابقت دارد. همه بیماران یا نزدیکان آنها رضایت آگاهانه کتبی برای استفاده از بافت ریه برای تحقیق دادند. کلیه اهداکنندگان خون رضایت کتبی آگاهانه دادند (شماره تاییدیه اخلاق: 17/161).

شکل 1 مشخصه وزیکول های باکتریایی و پاسخ در ماکروفاژهای انسانی. جداسازی وزیکول‌های خارج سلولی باکتریایی از پروتئین‌های آزاد از طریق کروماتوگرافی حذف اندازه از رویی‌های مختلف باکتریایی (Legionella pneumophila (Lp)، کلبسیلا پنومونیه (Kp)، Escherichia coli (Ec)، سالمونلا انتریکا سرووار Typhimurium (Stifimurium (Stifimurium) و Sp. ). غلظت وزیکول در هر بخش توسط نانو فلوسیتومتری (nFCM) و پروتئین ها با BCA تعیین شد. B توزیع اندازه وزیکول OMV/MVهای خالص شده توسط NFC تعیین شد. تصاویر C TEM از OMV/MVهای خالص شده. نوار مقیاس=50 نانومتر. BDM های D-G با OMVs/MVs (هر میکروگرم در میلی لیتر) از باکتری های مختلف تحریک شدند یا برای کنترل تا 48 ساعت بدون درمان رها شدند. انتشار D CXCL8 توسط ELISA تعیین شد و بر حسب ng/mL نشان داده شد. بیان IL1B (E) و IL12B (F) با qPCR تعیین شد، نتایج به RPS18 نرمال می‌شوند و نسبت به سلول‌های کنترل درمان نشده نشان داده می‌شوند. G پس از 1 ساعت انکوباسیون با وزیکول های باکتریایی، بیان و فسفوریلاسیون IRAK{10}}، p38 و TBK{12}} با وسترن بلات تعیین شد. نتایج نماینده چهار تکرار مستقل بیولوژیکی نشان داده شده است. میله ها مقادیر میانگین + SEM را از سه آزمایش مستقل (B) تا چهار (D-F) نشان می دهند. آمار: 2-way ANOVA (DF); *پ<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4

آمار

داده ها به عنوان مقادیر میانگین + SEM برای حداقل سه آزمایش بیولوژیکی مستقل نشان داده شده است. Prism 6.{6}}7 (GraphPad، La Jolla، USA) استفاده شد. آزمون های ANOVA یک یا دو طرفه برای نمونه های جفت نشده انجام شد. مقادیر P کمتر یا مساوی 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد. اگر غیر از این مشخص نشده باشد، آزمایش ها در مقابل کنترل مربوطه (*) انجام شد.

در دسترس بودن داده ها و مواد

تمامی داده های تولید یا تحلیل شده در این مطالعه در این مقاله و فایل تکمیلی آن گنجانده شده است.

نتایج

فعال سازی پیش التهابی ماکروفاژها توسط OMVs/MVs

برای آزمایش پاسخ ایمنی ذاتی ماکروفاژهای مشتق از خون اولیه انسان (BDM) به OMVs/MVs از باکتری‌های مختلف، وزیکول‌های لژیونلا پنوموفیلا (Lp)، کلبسیلا پنومونیه (Kp)، اشریشیا کلی (Ec)، سالمونلا انتریکا سرووار Typhimurium ) و استرپتوکوک پنومونیه (Sp) از طریق کروماتوگرافی رد اندازه (SEC) جداسازی شدند. فراکسیون ها برای تعداد وزیکول ها توسط نانو فلوسیتومتری (nFCM) و برای حضور پروتئین ها توسط BCA (شکل 1A) آنالیز شدند. وزیکول‌های کسری 7-12 ادغام شدند و برای آزمایش‌ها مورد استفاده قرار گرفتند. OMVs/MV ها نمایه توزیع اندازه قابل مقایسه داشتند (شکل 1B)، در اندازه متوسط ​​تفاوتی نداشتند (پرونده اضافی 1: شکل S2A)، به طور مساوی متمرکز شدند (پرونده اضافی 1: شکل S2B)، و توسط الکترون عبوری مشاهده شدند. میکروسکوپ (TEM؛ شکل 1C). BDMs با OMVs/MVs تا 48 ساعت تحریک شدند، که مربوط به غلظت وزیکول برابر باکتری های مختلف است (فایل اضافی 1: شکل S2C). انکوباسیون BDMs با وزیکول ها سیتوتوکسیک نبود (فایل اضافی 1: شکل S2D). OMVs/MVs به طور گسترده بیان و رهاسازی CXCL8 را از ماکروفاژها القا کردند (پرونده اضافی 1: شکل S3A و 1D)، در حالی که القای mRNA IL1B و IL12B وابسته به زمان و گونه بود (شکل 1E+F). انتشار IL{25}} وابسته به گونه‌ای بود که وزیکول‌های باکتریایی از آن جدا شده بودند (پرونده اضافی 1: شکل S3B). اگرچه فسفوریلاسیون p38 در BDM ها پس از 1 ساعت انکوباسیون وزیکول قابل مقایسه بود، اما فقط OMV های ناشی از تخریب IRAK{32}} ناشی از باکتری های گرم منفی و فسفوریلاسیون TBK-1 اما نه MVs از گرم مثبت (شکل 1G و فایل اضافی 1: S4A-D).

شکل 2 وزیکول های خارج سلولی باکتری پاسخ اینترفرون نوع I را در BDM ها فعال می کنند. BDMs با OMVs/MVs (هر میکروگرم در میلی لیتر) از باکتری‌های مختلف تحریک شدند یا به عنوان شاهد درمان نشدند. فسفوریلاسیون و بیان IRF{2}} پس از 1 ساعت انکوباسیون OMV/MV توسط Western Blot تعیین شد. نتیجه نمایندگی از سه تکرار مستقل بیولوژیکی نشان داده شده است. بیان IFNA1 (B)، IFNB (C)، IFIT1 (E) و IFI44 (F) با qPCR اندازه‌گیری شد، نتایج به RPS18 نرمال می‌شوند و نسبت به سلول‌های کنترل تیمار نشده نشان داده می‌شوند. D فسفوریلاسیون STAT1 با وسترن بلات پس از 2 ساعت تحریک OMV/MV تعیین شد. نتیجه نماینده چهار تکرار مستقل بیولوژیکی نشان داده شده است. فسفوریلاسیون G STAT1 و بیان Mx1 با وسترن بلات پس از 20 ساعت تحریک وزیکول باکتریایی تعیین شد. نتایج نماینده چهار تکرار مستقل بیولوژیکی به تصویر کشیده شده است. میله ها مقادیر میانگین + SEM را از چهار آزمایش مستقل نشان می دهند. آمار: 2-way ANOVA; *پ<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4

علاوه بر فعال سازی NF-kB و AP{1}} و اهداف پایین دست آنها، سیگنال دهی PRR می تواند به فعال سازی IRF منجر شود. بنابراین، فسفوریلاسیون IRF{2}} تعیین شد. Kp/Ec/SalOMVs فسفوریلاسیون IRF-3 را در BDM ها افزایش داد (شکل 2A)، که منجر به بیان IFN I (شکل 2B+C)، فسفوریلاسیون پایین دست STAT1 (شکل 2D و فایل اضافی 1) شد: S4E) و القای ژن های تحریک شده با اینترفرون (ISGs؛ IFIT1، IFI44 و Mx1؛ شکل 2E-G). از آنجایی که رویدادهای فسفوریلاسیون معمولاً کوتاه مدت هستند و نقش مهمی در روشن و روشن کردن آبشارهای سیگنالینگ ایمنی دارند، فسفوریلاسیون STAT1 نیز 20 ساعت پس از افزودن Kp/Ec/SalOMVs مورد بررسی قرار گرفت (شکل 2G و فایل اضافی 1: S4F+G). آزمایش‌ها نشان داد که OMV‌ها نه تنها سیگنال‌های التهابی را در ماکروفاژها فعال می‌کنند، بلکه سیگنال‌های ضد ویروسی نیز القا می‌شوند.

OMV قبل از جوجه کشی تکثیر IAV را در ماکروفاژها تغییر می دهد

Mx1 یک عامل ضد ویروسی شناخته شده مهار کننده تکثیر IAV [20] است که با درمان Kp/Ec/SalOMV ماکروفاژها بیان شد. بنابراین ما فرض کردیم که پیش‌درمان OMV تکثیر ویروسی را تغییر می‌دهد. آزمایش‌های عفونت IAV در سلول‌های THP{4} انجام شد که سطوح مشابه Mx1 را در تیمار Kp/Ec/SalOMV بر روی سطوح mRNA و پروتئین بیان می‌کنند (فایل اضافی 1: شکل S5A+B) و فسفوریلاسیون STAT1 را القا می‌کنند. ، در حالی که کل پروتئین STAT1 ثابت می ماند (پرونده اضافی 1: شکل S5C)، با یک سویه H1N1 (A/WSN/33) که در ماکروفاژها آلوده و تکثیر می شود [21]. پیش‌تحریک سلول‌های THP{18}} با LpOMV/SpMV باعث افزایش تکرار IAV 24 ساعت پس از عفونت (pi) در مقایسه با شاهد آلوده (–-) شد، در حالی که قبل از درمان با Mx{23}} OMV های القاکننده (Kp) /Ec/Sal) تکثیر IAV را مسدود کرد (شکل 3A). در حالی که آگونیست TLR2/1 قبل از درمان Pam3CSK4 می تواند اثر مشاهده شده با LpOMV/SpMV را تقلید کند، که هر دوی آن ها از طریق TLR2/1 سیگنال می دهند [12, 22, 23]، LPS محلول به عنوان آگونیست TLR4 Kp/Ec را تولید نمی کند. جلوه /SalOMV (فایل اضافی 1: شکل S5D). تفاوت در بار IAV پس از پیش درمان نیز می تواند با رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس در برابر نوکلئوپروتئین ویروسی (NP) مشاهده شود (شکل 3B). پیش تیمار Kp/Ec/SalOMV تکثیر IAV را مسدود کرد و ناحیه NP مثبت به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 3C). این را نمی توان پس از پیش درمان LpOMV/SpMV مشاهده کرد. برای بررسی اینکه آیا القای Mx1 برای تکثیر IAV مسدود شده مشاهده شده کافی است، Mx1 به طور پایدار در ماکروفاژهای THP{46}} بیش از حد بیان شد (جنس) برای تقلید از پیش تحریک OMV (پرونده اضافی 1: شکل S5E). عفونت IAV سلول‌های Mx1oex منجر به کاهش ناحیه ایمونوفلورسنت NP مثبت 4 ساعت پی (شکل 3D) و کاهش تکثیر ویروسی 6 ساعت پی در مقایسه با کنترل ناقل خالی (VC) (شکل 3E) شد، اگرچه به مقدار کمتری وسعت در مقایسه با پیش تحریک OMV (شکل 3A). در نتیجه، Kp/Ec/SalOMV ماکروفاژها را به شیوه ای کلاسیک پیش التهابی فعال کرد و ژن های ضد ویروسی را القا کرد که منجر به فعال شدن گیرنده IFN/ (IFNAR)، فسفوریلاسیون پایین دست STAT1 و بیان Mx1 شد که می تواند مستقیماً با تکثیر IAV تداخل کند. شکل 4A). برای تایید اهمیت سیگنال دهی JAK/STAT برای القای مشاهده شده پاسخ ضد ویروسی، یک مهارکننده JAK (JAKi) قبل از تحریک وزیکول استفاده شد. مهار JAK بیان CXCL8 ناشی از Kp/SalOMV را تغییر نداد (شکل 4B)، اما به طور قابل توجهی Mx1 را در mRNA (شکل 4C) و سطح پروتئین را حتی با عفونت IAV کاهش داد (شکل 4D و فایل اضافی 1: S6A). بر این اساس، JAKi محاصره تکثیر ویروسی ناشی از OMV را معکوس کرد (شکل 4E).

شکل 3 Mx1-القای OMVs، تکثیر ویروس آنفولانزای A را در سلول‌های THP-1 مسدود می‌کند. یک تکثیر ویروس آنفولانزای A در سلول‌های THP{3}} تمایز یافته. سلول ها یا با OMVs/MVs (هر یک میکروگرم در میلی لیتر) از قبل تیمار شدند یا برای کنترل بدون تیمار رها شدند (-). پس از 2{11}} ساعت قبل از درمان، سلول‌ها با A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) به مدت 24 و 48 ساعت آلوده شدند. تکرار IAV توسط qPCR در برابر IAV-NP نرمال شده به 18S تعیین شد. مقادیر میانگین±SEM از سه تا پنج آزمایش مستقل نشان داده شده است. B سلول‌های تمایز یافته THP{17}} با OMVs/MVs (هر کدام 1 میکروگرم در میلی‌لیتر) پیش تیمار شدند یا برای کنترل درمان نشده رها شدند (-). پس از 20 ساعت قبل از جوجه کشی، سلول ها به مدت 4 ساعت با A/WSN/33 (H1N1) (MOI 0.1) آلوده شدند. پس از تثبیت، سلول ها با آنتی بادی NP آنفلوانزا (زرد) و DAPI (آبی) رنگ آمیزی شدند. یک نتیجه نماینده از چهار آزمایش مستقل بیولوژیکی نشان داده شده است. C تعیین کمیت ناحیه NP مثبت (NP+) از (B). میله ها مقادیر میانگین چهار آزمایش مستقل + SEM را نشان می دهند. سلول‌های D THP{31}} که به‌طور پایدار Mx1 (Mx1oex) و سلول‌های کنترل ناقل خالی (VC) را بیان می‌کنند، به مدت 4 ساعت با ویروس آنفلوانزا A/WSN/33 (H1N1) (MOI 0.1) آلوده شدند. پس از تثبیت و رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس با NP-influenza، ناحیه NP+ کمی‌سازی شد و نسبت به سلول‌های VC نشان داده می‌شود. میله ها مقادیر میانگین چهار آزمایش مستقل + SEM را نشان می دهند. سلول های E Mx1oex و VC به مدت 6 ساعت با A/WSN/33 (H1N1) (MOI 0.001) آلوده شدند. تکثیر ویروس با سنجش پلاک تعیین شد و نتایج به صورت واحدهای تشکیل دهنده پلاک (pfu) در هر میلی لیتر نشان داده شد. میله ها مقادیر میانگین + SEM چهار آزمایش مستقل را نشان می دهند. آمار: 2-way ANOVA (A)، 1-way ANOVA (C)، آزمون t unpaired (D+E); *پ<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5

پاسخ ضد ویروسی به OMV ها وابسته به TLR4-TRIF است

برای شناسایی PRR درگیر، آگونیست های ایمنی تجاری به تنهایی یا در ترکیب با LPS برای تقلید OMVs استفاده شدند. با این حال، هیچ القای آینه‌ای Mx1 با KpOMV مشاهده نشد (فایل اضافی 1: شکل S7)، که نشان‌دهنده فعال‌سازی متفاوت و طولانی‌مدت ماکروفاژها توسط OMVها به دلیل ترکیب لیگاند یا نمایش فضایی آنها به PRRها است. گیرنده های ایمنی درگیر بیشتر توسط سلول های گزارشگر THP{3}} برای سیگنال دهی NF-kB- و IRF ارزیابی شدند (شکل 5A). پس از تیمار KpOMV، سلول‌های THP{8}} بیان پروتئین Mx1 را به‌طور قابل‌توجهی افزایش دادند (شکل 5B و فایل اضافی 1: S6B)، که در سلول‌های دارای کمبود TRIF (TRIF-/-) ​​THP{13}} گم شد. شکل 5B و فایل اضافی 1: S6B). همین امر برای گزارشگر IRF (شکل 5C) مشاهده شد، در حالی که فعال سازی گزارشگر NF-κB و القای CXCL8 در هر دو سلول THP-1 و TRIF-/- پس از تحریک بالا بود (شکل 5D+E). بیان ژن وابسته به STAT IFIT1، IFI44، و Mx1 بر تحریک KpOMV در سلول های گزارشگر THP{27}} القا شد (شکل 5E)، در حالی که در سلول های TRIF-/- به همان اندازه تحریک شده به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 5E). عفونت اضافی IAV بعد از پیش تحریک منجر به کاهش تکثیر ویروسی شد، در حالی که حذف TRIF تکثیر IAV را نجات داد (شکل 5F). برای بررسی اینکه آیا KpOMV ها باعث ایجاد یک پاسخ ضد ویروسی کلی در ماکروفاژها می‌شوند، سلول‌ها با ویروس استوماتیت تاولی (VSV) آلوده شدند، که در سلول‌های کنترل تکثیر می‌شود، اما در سلول‌های پیش‌درمان‌شده با KpOMV مسدود شده بود و می‌توان با حذف TRIF نیز نجات داد (شکل 2). 5G). از آنجایی که شناسایی LPS از طریق TLR4 برای اندوسیتوز و فعال سازی TRIF ضروری است، LPS روی سطح OMV توسط آنتی بیوتیک لیپوپپتیدی پلی میکسین B (PB) خنثی شد و منجر به کاهش 50 درصدی القای Mx1 شد (شکل 6A+B و فایل اضافی 1). : S6C)، اما تفاوت معنی داری در رونویسی CXCL8 وابسته به NF-kB وجود ندارد (شکل 6C). تکثیر ویروسی با پیش تحریک KpOMV+PB تا سطح پایه نجات یافت (شکل 6D). از آنجایی که مهار شناسایی LPS توسط PB برای مسدود کردن کامل Mx1 کافی نبود، OMV ها از کلیر کلیر عاری از اندوتوکسین (Cc) جدا شدند و برای پیش تحریک مورد استفاده قرار گرفتند. Cc یک لیپید A تغییر یافته را بیان می کند و نمی تواند یک کمپلکس TLR4/MD2 فعال شده را القا کند [24]. CcOMV ها Mx1 را القا نکردند (شکل 6A+B و فایل اضافی 1: S6C) و تکثیر IAV را در ماکروفاژها کاهش ندادند (شکل 6D). به خوبی شناخته شده است که جداسازی وزیکول های خارج سلولی از طریق اولتراسانتریفیوژ دیفرانسیل منجر به جداسازی همزمان آلاینده ها (به عنوان مثال پروتئین ها یا زائده های سلولی باکتریایی) در کنار وزیکول ها می شود. مطابق با دستورالعمل‌های MISEV2018 [25]، آزمایش‌های کلیدی با OMV‌های جدا شده از طریق ترکیبی از اولترافیلتراسیون (UF) و کروماتوگرافی حذف اندازه (SEC) تکرار شد. تحریک سلولهای گزارشگر THP{64}} با KpOMVهای خالص شده با UF-SEC منجر به القای Mx1 (پرونده اضافی 1: شکل S8A) و گزارشگر IRF (شکل S8B) شد، در حالی که در TRIF-/- ماکروفاژها از بین رفت. فایل اضافی 1: شکل S8A+B). تکثیر IAV در سلول های از پیش تیمار شده با KpOMV مسدود شد و پس از حذف TRIF نجات یافت (فایل اضافی 1: شکل S8C). فعالیت گزارشگر NF-kB بدون توجه به وضعیت TRIF سلول ها توسط KpOMV ها القا شد (فایل اضافی 1: شکل S8D).

شکل 4 مهار سیگنال دهی JAK تکثیر ویروس آنفولانزای A را در ماکروفاژها نجات می دهد. یک OMV سیگنال دهی TRIF-IRF را در ماکروفاژها فعال می کند، که به نوبه خود باعث بیان IFN و آزادسازی آن با سیگنال دهی IFNAR بعدی می شود. IFNAR از طریق JAK/STAT سیگنال می دهد و بیان ISG ها را القا می کند که یکی از آنها Mx1 است. این منجر به بلوک تکرار IAV می شود. سلول‌های B–E THP-1 قبل از افزودن OMVs (1 میکروگرم در میلی‌لیتر؛ Kp/Sal) به مدت 20 میکرومولار مهارکننده JAK (JAKi) به مدت 1 ساعت از قبل انکوبه شدند. }} ساعت بیان B-C CXCL8 (B) و Mx1 (C) توسط qPCR تعیین شد و نتایج به RPS18 نرمال می‌شوند و نسبت به شاهد درمان‌نشده نشان داده می‌شوند. میله ها مقادیر میانگین سه تا چهار آزمایش مستقل + SEM را نشان می دهند. سلول های D + E OMV از قبل درمان شده علاوه بر این با IAV (MOI 0.001) آلوده شدند. وسترن بلات بیان پروتئین Mx1 را در 0-3 ساعت پس از عفونت نشان می دهد (pi). E تکثیر ویروس با روش پلاک 24 ساعت پس از عفونت تعیین شد. میله ها مقادیر میانگین چهار آزمایش مستقل + SEM را نشان می دهند. آمار: 1-way ANOVA (B+C+E); *پ<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4

شکل 5 OMV ها سیگنال دهی ضد ویروسی را در ماکروفاژها از طریق TRIF القا می کنند. یک سلول گزارشگر دوگانه THP{1}} بیان آلکالین فسفاتاز جنینی ترشح شده (SEAP) را پس از فعال شدن مسیر NF-kB و بیان و ترشح لوسیا لوسیفراز پس از فعال شدن مسیر IRF القا می کند. علاوه بر این، TRIF (نوارهای خاکستری) متمایز شدند و متعاقباً با سلول‌های -/- تحریک شدند که یک ضربه پایدار از مولکول آداپتور TRIF دارند. (BF) سلول‌های گزارشگر THP-1 (=دوگانه؛ میله‌های سیاه) و سلول‌های TRIF-/- KpOMV (1 میکروگرم/میلی‌لیتر) به مدت 20 ساعت یا برای کنترل بدون درمان رها می‌شوند. پس از زمان مشخص شده، مایع رویی، RNA و/یا پروتئین ها جمع آوری شد. تصویر نماینده وسترن بلات B از بیان پروتئین Mx1. فعالیت گزارشگر C+D لوسیا (C) و فعالیت گزارشگر SEAP (D) در مایع رویی کشت سلولی تعیین شد. از همان مایع رویی برای تعیین فعالیت هر دو گزارشگر استفاده شد. E بیان mRNA نسبی برای ژن‌های هدف وابسته به STAT و NF-kB (از بالا به پایین: IFIT1، IFI44، Mx1، CXCL8) با qPCR تعیین شد و نتایج به RPS18 نرمال‌سازی شدند و نسبت به کنترل دوگانه تحریک‌نشده نشان داده شدند. تغییرات فولد log2 تبدیل شد. سلول ها علاوه بر این با A/WSN/33 (H1N1) (MOI 0.1) به مدت 24 ساعت (F) یا VSV (MOI 0.1) به مدت 12 ساعت (G) آلوده شدند. تکثیر ویروس با استفاده از روش پلاک تعیین شد. میله‌ها مقادیر میانگین چهار (C-F) تا fve (G) آزمایش مستقل + SEM را نشان می‌دهند. آمار: 2-way ANOVA (C–G); *پ<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5

شکل 6 بیان Mx1 ناشی از OMV پس از مهار LPS از بین می رود. سلول های THP-1 به مدت 2{18}} ساعت با OMVs (1 میکروگرم در میلی لیتر؛ Kp یا Clear coli (Cc)) به تنهایی یا در ترکیب با 20 میکروگرم در میلی لیتر پلی میکسین B (PB) یا بدون درمان رها شدند انکوبه شدند. برای کنترل بیان پروتئین Mx1 توسط وسترن بلات تعیین شد. یک نتیجه نماینده از سه آزمایش بیولوژیکی مستقل نشان داده شده است. بیان Mx1 B و CXCL8 C توسط qPCR تعیین شد. میله ها مقادیر میانگین چهار آزمایش مستقل + SEM را نشان می دهند. سلول‌های D THP{11}} به مدت 20 ساعت با OMVs (1 میکروگرم در میلی‌لیتر؛ Kp یا Cc) به تنهایی یا در ترکیب با 20 میکروگرم در میلی‌لیتر PB یا بدون درمان برای کنترل رها شدند و سپس با A/WSN/33 آلوده شدند. (H1N1) (MOI 0.001). تکثیر ویروس با روش پلاک 24 ساعت پس از آلودگی تعیین شد. میله ها مقادیر میانگین چهار آزمایش مستقل + SEM را نشان می دهند. آمار: 1-way ANOVA B–D; *پ<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4

اثر بازدارنده تکرار IAV OMVها به AECها قابل انتقال است

از آنجایی که ماکروفاژها نوع سلول اصلی برای تکثیر IAV در ریه نیستند و از آنجایی که IFN I نیز پاراکرین عمل می کند، قابلیت انتقال اثر تکرار IAV به AEC ها مورد آزمایش قرار گرفت، زیرا این سلول ها، بر خلاف ماکروفاژها، مستقیماً به OMVs/MVs پاسخ نمی دهند. فایل اضافی 1: شکل S9). مایع رویی (SN) از ماکروفاژهای تیمار شده با KpOMV، Mx1 را در سلول های A549 القا کرد، برخلاف LpOMV-SN (شکل 7A)، در حالی که CXCL8 پس از هر دو القا شد (شکل 7B). KpOMVSN تکثیر ویروسی را کاهش داد (شکل 7C)، که مطابق با آزمایشات ماکروفاژها و الگوی القای Mx1 بود. برای تأیید وابستگی اثر محدودکننده IAV مشاهده شده به سیگنال دهی JAK/STAT، KpOMV-SN با JAKi ترکیب شد، القایی Mx1 را در درمان KpOMV-SN مسدود کرد (شکل 7A) و تکرار IAV را بازیابی کرد (شکل 7C). برای تقلید از تنظیم پیچیده فرآیندهای ایمنی در ریه، عفونت IAV ex vivo برش‌های ریه با برش دقیق انسان (PCLS) راه‌اندازی شد. Lp/KpOMVها برای PCLS سیتوتوکسیک نبودند (شکل 8A) و ترکیبی از پیش تحریک OMV و عفونت IAV منجر به القای Mx1 (شکل 8B) و انتشار CXCL10 (شکل 8C) شد. KpOMV ها اما نه LpOMV ها به طور قابل توجهی تکرار IAV را در PCLS کاهش دادند (شکل 8D). اثرات مشاهده شده توسط عفونت با IAV غیرفعال شده UV از بین رفت (شکل 8A-C). یافته‌های ما منجر به مدلی از التهاب ریه می‌شود که در آن AMs با القای IFN I به OMVs از باکتری‌های گرم منفی پاسخ می‌دهد و پاسخ‌های ضد ویروسی را به صورت اتوکرین در AMs و به صورت پاراکرین در AECs در شرایط آزمایشگاهی و در یک مدل PCLS ex vivo ایجاد می‌کند. (شکل 8E).

شکل 7 آنفولانزا A اثر مهار کننده تکثیر ویروس OMV ها به AEC ها قابل انتقال است. سلول‌های THP{2}} با LpOMV یا KpOMV به مدت 20 ساعت انکوبه شدند یا برای کنترل بدون درمان رها شدند. مایع رویی (SN) استریل فیلتر شد و برای پیش تحریک سلول های A549 به مدت 2{19}} ساعت به تنهایی یا در ترکیب با 10 میکرومولار JAKi استفاده شد. بیان A+B Mx1 (A) و CXCL8 B با استفاده از qPCR در نقطه زمانی آلودگی (0 ساعت پی) تعیین شد. میله ها مقادیر میانگین چهار آزمایش مستقل + SEM نرمال شده به سلول های کنترل نشده را نشان می دهند. C سلول های A549 از قبل تیمار شده به مدت 24 ساعت با ویروس آنفولانزای A/Hamburg/5/2009 (H1N1pdm) (MOI 0.01) نیز آلوده شدند. تکثیر ویروس با استفاده از روش پلاک تعیین شد. میله ها مقادیر میانگین چهار آزمایش مستقل + SEM هستند. آمار: 1-way ANOVA; **پ<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4

بحث

ما دریافتیم که وزیکول‌های باکتری‌های مختلف سیگنال‌های دیفرانسیل را در ماکروفاژها القا می‌کنند که می‌تواند تکثیر IAV را در عفونت بعدی محدود کند. مطابق با ادبیات، OMV های جدا شده از Lp، Kp، Ec، و Sal، و MVs از Sp از نظر اندازه قابل مقایسه بودند [26-28]. ماکروفاژهای انکوبه شده با وزیکول های باکتریایی سمیت سلولی نشان ندادند [29، 30]، اما یک پاسخ پیش التهابی را القا کردند. همه وزیکول‌ها باعث فسفوریلاسیون p38 و آزادسازی CXCL8 و IL{7}} از ماکروفاژهای اولیه انسانی شدند، در حالی که تفاوت‌هایی در القای IFN I و سیگنال‌دهی پایین‌دست آنها وجود داشت. ما و دیگران قبلاً نشان داده‌ایم که سیگنال‌های LpOMVs از طریق TLR2 [12، 22] و همچنین SpMVs یک الگوی فعال‌سازی متمایز را در ماکروفاژها القا می‌کنند [31]. LpOMVs/SpMVs ژن‌های هدف NF-kB پیش‌التهابی را فعال می‌کنند، همانطور که برای باکتری‌های منشأ توضیح داده شد [12، 22، 31]. با این حال، شناخت Kp/Ec/SalOMVs، علاوه بر ژن‌های هدف NF-kB، القای فسفوریلاسیون IRF{18}} با بیان پایین‌دستی IFNB و فسفوریلاسیون طولانی‌مدت STAT1 همراه با القای ISGs را برانگیخت، که استدلال برای فعال بودن دارد. سیگنالینگ IFNAR-JAK/STAT. OMV ها LPS را روی سطح خود حمل می کنند، اما ظرفیت پیش التهابی OMV ها را نمی توان با LPS خالص تقلید کرد. ما و دیگران مشاهده کردیم که ماکروفاژها در مقایسه با همان مقدار LPS خالص به OMV حساس تر هستند [32، 33]. OMV ها حاوی مجموعه ای از آگونیست های ایمنی هستند که برای القای یک پاسخ ایمنی قوی مورد نیاز هستند [32]. آگونیست های تجاری TLR و RIG-I به تنهایی یا در ترکیب با LPS نمی توانند اثر را تقلید کنند. قبل از این نشان داده شده بود که لیپوزوم های بارگذاری شده با LPS باعث فعال شدن طولانی تر TRIF-IRF{29}} در ماکروفاژها در مقایسه با LPS آزاد می شوند [34]. با استفاده از TRIF-/- ماکروفاژها، وابستگی القای ISG را به این مولکول آداپتور نشان دادیم. علاوه بر این، CcOMVs بدون اندوتوکسین یا OMVs همراه با LPSmasking PB برای لغو پاسخ ماکروفاژها کافی بود. این نشان دهنده شناسایی OMV ها از طریق TLR4 با اندوسیتوز بعدی و سیگنال دهی TRIF است. بر این اساس، Kp/Ec/SalOMVs قادر به القای فعال‌سازی پیش‌التهابی ماکروفاژها از طریق TLR4 بودند که منجر به سیگنال‌دهی MyD88 و بیان ژن وابسته به NF-kB و همچنین سیگنال‌دهی TRIF با پاسخ IFN I می‌شود. این مطابق با ادبیاتی است که نشان می دهد TLR4 و TRIF با هم برای ایمنی زایی نایسریا مننژیتیدیس OMVs در موش مورد نیاز هستند [35]. از آنجایی که IFN های نوع I تنظیم کننده اصلی پاسخ های ضد ویروسی هستند، ما فرض کردیم که تشخیص Kp/Ec/SalOMVs روی تکثیر IAV تأثیر می گذارد. ما نشان دادیم که ماکروفاژها به طور موثر تکثیر IAV و VSV را پس از پیش‌درمان‌های OMV فعال‌کننده TRIF مسدود کردند، در حالی که TRIF-/- تکثیر ویروسی را نجات داد. برای تعیین دقیق تأثیر بر سیگنال دهی IFNAR، مهار JAK1/2 همراه با OMVs، القای Mx1 وابسته به STAT را با موفقیت مسدود کرد و تکثیر ویروسی را در ماکروفاژها نجات داد. ترکیب KpOMVs با PB یا استفاده از CcOMV های عاری از اندوتوکسین، تکثیر IAV را در ماکروفاژها کاهش نداد، زیرا آنها قادر به القای ژن های ضد ویروسی نیستند. از آنجایی که آماده‌سازی‌های وزیکول خارج سلولی به‌دست‌آمده از اولتراسانتریفیوژ حاوی پروتئین آزاد و پیوست‌های سلولی باکتریایی در کنار وزیکول‌ها هستند، آماده‌سازی OMV علاوه بر این از طریق ترکیبی از اولترافیلتراسیون و کروماتوگرافی حذف اندازه تولید شد [25].

گیاه چینی سیستانچ - ضد تومور

آماده‌سازی وزیکول خالص به‌دست‌آمده به همان اندازه قادر به القای سیگنال‌دهی TRIF-IRF با القای پایین دستی Mx1 و مسدود کردن تکثیر ویروسی با استدلال برای اثر مستقیم وزیکول بود. اگرچه دستگاه های خودپرداز اولین خط دفاعی در ریه هستند، اما اکثریت عفونت و تکثیر IAV در ریه انسان در AEC ها انجام می شود [36]. بنابراین، AEC ها با OMVs تحریک شدند، اما آنها مانند ماکروفاژها به تحریک پاسخ ندادند. فقط رده سلولی اپیتلیال برونش BEAS2B با بیان CXCL8 پاسخ داد، اما فاقد القای Mx1 بود. از آنجایی که می‌توانیم یک بیان ژن ضد ویروسی را بسته به TLR4 و TRIF در ماکروفاژها نشان دهیم، فرض می‌کنیم که چهار رده سلولی اپیتلیال آزمایش‌شده TLR4 را به اندازه ماکروفاژها بیان نمی‌کنند و آن‌ها نتوانستند OMVs را با فعال‌سازی TLR4 اندوسیتوز کنند. این مطابق با ادبیاتی است که نشان می‌دهد AECهای ایزوله انسانی مانند AMهای جفت شده به LPS پاسخ نمی‌دهند [37]. همانطور که ما وضعیت ضد ویروسی را پس از انکوباسیون OMV به IFN I مرتبط کردیم، از مایع رویی ماکروفاژهای تحریک شده با OMV برای پیش تحریک AECها استفاده کردیم. محیط شرطی شده ماکروفاژهای تحریک‌شده با KpOMV، بر خلاف تحریک مستقیم وزیکول، بیان Mx1 را در این سلول‌ها القا کرد و تکرار IAV را در آزمایش‌های عفونت بعدی کاهش داد. مایع رویی از ماکروفاژهای تحت درمان با LpOMV CXCL8 را در سلول های اپیتلیال القا کرد اما باعث القای Mx1 و تغییر در تکثیر ویروسی نشد. برای نسبت دادن اثر مشاهده‌شده با محیط‌های شرطی‌شده به IFN I، مایع رویی با یک مهارکننده JAK1/2 ترکیب شد و القای Mx1 را مسدود کرد و تأثیری بر تکثیر ویروسی نداشت. از آنجایی که تأثیر متقابل انواع سلول های مختلف در ریه انسان پیچیده تر است و نمی توان آن را به طور کامل توسط رسانه های شرطی تقلید کرد، ما رویکرد خود را به بخش های زنده بافت ریه دیستال انسان گسترش دادیم، که به طور گسترده برای مطالعات بر روی تعاملات میزبان و پاتوژن از جمله استفاده شده است. ویروس آنفولانزا و عفونت های باکتریایی [38-41]. برخلاف مدل‌های in vitro استفاده شده، بافت ریه انسان ex vivo معماری سه‌بعدی ریه را حفظ می‌کند و اجازه تعامل فیزیولوژیکی بین انواع سلول‌های ساکن در ریه را می‌دهد، با این حال، امکان هجوم سلول‌های ایمنی به کار گرفته‌شده بیشتر را ندارد. عفونت متوالی PCLS تحریک‌شده با KpOMV با IAV، بار ویروسی را در مقایسه با گروه‌های کنترل نشده کاهش داد. از آنجایی که تمام AEC های آزمایش شده در شرایط آزمایشگاهی به تحریک مستقیم وزیکول باکتریایی پاسخ ندادند، ما فرض می کنیم که در این مدل ex vivo، AMs نوع سلول پاسخ دهنده غالب هستند. از آنجایی که یک ایزوله آنفولانزا برای عفونت بعدی انتخاب شد که به طور انحصاری در AEC ها را آلوده و تکثیر می کند، می توان فرض کرد که این یک اثر ضد ویروسی پاراکرین است که از AM ها منشا گرفته و به AEC ها منتقل می شود. بر اساس داده‌های به‌دست‌آمده در اینجا، ما مدل زیر را پیشنهاد می‌کنیم (شکل 8E): OMV‌های باکتری‌های گرم منفی می‌توانند ماکروفاژهای انسانی را به روشی کلاسیک پیش التهابی فعال کرده و آنها را از طریق TLR4 و TRIF پس از اندوسیتوز موفقیت‌آمیز پرایم کنند. وزیکول ها انتشار IFN I به نوبه خود می تواند ماکروفاژها و/یا AEC ها را از طریق سیگنالینگ IFNAR و JAK/STAT ضد ویروسی کند. عفونت بعدی این سلول‌ها باعث کاهش Mx{31}}در بار ویروسی می‌شود. از آنجایی که ما به AM های اولیه انسانی دسترسی نداشتیم، آزمایش ها با استفاده از BDM های انسانی به عنوان مدل انجام شد. با در نظر گرفتن منشاء رشدی و پرایمینگ مختلف این ماکروفاژها، می توان تصور کرد که AMها در مقایسه با BDM ها پاسخ پیش التهابی ضعیف تری از خود نشان داده باشند. وزیکول‌های باکتریایی قبلاً در استراتژی‌های واکسیناسیون علیه پاتوژن‌های مختلف القاکننده ذات‌الریه استفاده می‌شوند (در [42] بررسی شده است). از این رو، OMV ها نه تنها ابزاری برای استراتژی های بالقوه واکسیناسیون سیستمیک علیه باکتری های میزبان خود هستند، بلکه می توانند به صورت محلی برای مبارزه با عفونت های ویروسی با فعال کردن سلول های ایمنی ذاتی ساکن استفاده شوند. مطالعات آتی in vivo برای آزمایش اینکه آیا این یافته‌های in vitro برای سایر پاتوژن‌های ویروسی قابل اجرا هستند یا خیر، مورد نیاز است. علاوه بر این، لازم به ذکر است که یک پاسخ احتمالی اندوتوکسیک باید به طور جدی نظارت شود تا از پاسخ های ایمنی اغراق آمیز در داخل بدن جلوگیری شود. القای IFN نوع I باید به شدت کنترل شود، زیرا در افراد سالم نشان داده شد که استنشاق آگونیست TLR7 در ابتدا پس از اولین دوز به خوبی تحمل می شد، اما منجر به افزایش پاسخ TNF- و IFN I و علائم مشابه آنفلوانزا شد. ، پس از دوز دوم [43]. برای مبارزه با اثرات نامطلوب، ممکن است به نسخه های اصلاح شده ژنتیکی OMV ها نیاز باشد که باعث ایجاد پاسخ ایمنی متعادل و دستیابی به کاربرد خوب می شود. روی هم رفته، ما در اینجا مدلی ارائه می کنیم که چگونه OMV ها می توانند سیگنال های ضد ویروسی را در ماکروفاژهای انسانی القا کنند و چگونه می توان از آن برای جلوگیری از تکرار IAV استفاده کرد.

شکل 8 KpOMV تکثیر ویروس آنفولانزای A را در برش های دقیق ریه انسان کاهش می دهد. PCLS انسان با 1 میکروگرم در میلی لیتر OMVs (Lp/Kp) به مدت 20 ساعت انکوبه شد و سپس به مدت 48 ساعت با آنفولانزای A/California/04/2009 (H1N1pdm) آلوده شد. غیرفعال سازی UV ویروس به عنوان یک کنترل عمل می کند. سمیت سلولی با تعیین کمیت LDH آزاد شده از PCLS تعیین شد و در مقایسه با لیز کل در درصد نشان داده شد. بیان B Mx1 با qPCR اندازه گیری شد و نسبت به RPS18 و PCLS کنترل درمان نشده ارائه می شود. انتشار CXCL10 توسط ELISA تعیین شد و بر حسب ng/mL نشان داده شد. تکثیر ویروس با استفاده از روش پلاک تعیین شد و در pfu/ml نشان داده شد. میله ها مقادیر میانگین سه تا پنج تکرار بیولوژیکی + SEM را نشان می دهند. E مدل پیشنهادی برای القای ایمنی ضد ویروسی OMVs در ریه. آمار: 1-way ANOVA (AC), Friedman-test (D); *پ<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5

منابع

1. Kulp A، Kuehn MJ. عملکردهای بیولوژیکی و بیوژنز وزیکول های غشای خارجی باکتریایی ترشح شده Annu Rev Microbiol. 2010؛ 64:163-84.

2. الیس TN، Kuehn MJ. نقش ویروس زایی و تعدیل کننده ایمنی وزیکول های غشای خارجی باکتری Microbiol Mol Biol Rev. 2010؛ 74 (1): 81-94.

3. Giordano NP، Cian MB، Dalebroux ZD. ترشح چربی غشای خارجی و پاسخ ایمنی ذاتی به باکتری های گرم منفی. ایمنی را آلوده کند. 2020. https://doi.org/10.1128/IAI.00920-19.

4. Mancini F، و همکاران. واکسن های OMV و نقش آگونیست های TLR در پاسخ ایمنی Int J Mol Sci. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21124416.

5. هو جی، کریستمن جی دبلیو. سرمقاله: ماکروفاژهای آلوئولی در التهاب ریه و رفع. جلو ایمونول. 2019؛ 10:2275.

6. Grassin-Delyle S, et al. نقش گیرنده های مشابه در تولید سیتوکین ها توسط ماکروفاژهای ریه انسان J Innate Immun. 2020؛ 12 (1): 63-73.

7. برگه اطلاعات آنفلوانزا (فصلی). 2018; https://www.who.int/news-room/ fact-sheets/detail/influenza-(فصلی)

8. کروتا اس، و همکاران. اینترفرون‌های نوع I و III حلقه‌های تقویتی اضافی را برای القای امضای رونویسی در اپیتلیوم مجاری هوایی آلوده به آنفولانزا هدایت می‌کنند. PLoS Pathog. 2013؛ 9 (11): e1003773.

9. Bals R، Hiemstra PS. ایمنی ذاتی در ریه: چگونه سلول های اپیتلیال با پاتوژن های تنفسی مبارزه می کنند. Eur Respir J. 2004؛ 23 (2): 327-33.

10. هلفت ج، و همکاران. سلول های دندریتیک متقاطع CD103+ از عفونت ویروس آنفولانزا محافظت می شوند. جی کلین سرمایه گذاری. 2012؛ 122 (11): 4037-47.

11. Ghoneim HE، Thomas PG، McCullers JA. کاهش ماکروفاژهای آلوئولی در طول عفونت آنفولانزا، سوپرعفونت باکتریایی را تسهیل می کند. جی ایمونول. 2013؛ 191 (3): 1250-9.

12. یونگ آل، و همکاران. وزیکول های غشای خارجی مشتق از لژیونلا پنوموفیلا تکثیر باکتری را در ماکروفاژها ترویج می کنند. PLoS Pathog. 2016؛ 12 (4): e1005592.

13. Lindhauer NS، و همکاران. فعالیت ضد باکتریایی Tribolium castaneum defen-sin در مدل عفونت آزمایشگاهی استرپتوکوک پنومونیه. بیماری زاست. 2019؛ 10 (1): 902-9.

14. Danov O, et al. دود سیگار بر جمعیت سلول های دندریتیک، عملکرد سد اپیتلیال و پاسخ ایمنی به عفونت ویروسی با H1N1 تأثیر می گذارد. فرانت مد. 2020. https://doi.org/10.3389/fmed.2020.571003.

15. Matrosovich M، و همکاران. محیط پوششی جدید با ویسکوزیته پایین برای سنجش پلاک ویروسی. Virol J. 2006؛ 3:63. 16. Neuhaus V و همکاران. ارزیابی اثرات سیتوتوکسیک و تعدیل‌کننده ایمنی مواد در برش‌های ریه با برش دقیق انسان. J Vis Exp. 2018. https://doi.org/10.3791/57042. 17. نیهوف ام، و همکاران. جداسازی RNA از برش‌های ریه با برش دقیق (PCLS) از گونه‌های مختلف. یادداشت های BMC Res. 2017؛ 10 (1): 121.

18. شولز سی، و همکاران. ماکروفاژهای مشتق شده از THP، سلول‌های اپیتلیال ریه را به لژیونلا پنوموفیلا کم‌پاسخ می‌دهند - یک مطالعه زیست‌شناسی سیستمی. Sci Rep. 2017; 7 (1): 11988.

19. Livak KJ، Schmittgen TD. تجزیه و تحلیل داده های بیان ژن نسبی با استفاده از PCR کمی زمان واقعی و روش 2 (--Delta C(T)). مواد و روش ها. 2001؛ 25 (4): 402-8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.

20. هالر او و همکاران. Mx GTPases: ماشین‌های ضد ویروسی شبه دینامین با ایمنی ذاتی. Trends Microbiol. 2015؛ 23 (3): 154-63. 21. آناستازیا ام، و همکاران. انتهای C پروتئین NS1 ویروس آنفولانزا A/WSN/1933(H1N1) پاسخ‌های ضد ویروسی را در ماکروفاژها و موش‌های آلوده انسانی تعدیل می‌کند. جی ژنر ویرول. 2015؛ 96 (8): 2086-91.

22. Jager J, et al. ادغام وزیکول های غشای خارجی لژیونلا پنوموفیلا با سیستم های غشای یوکاریوتی مکانیسمی برای رساندن عوامل بیماری زا به غشای سلول میزبان است. میکروبیول سلولی 2015؛ 17 (5): 607-20.

23. Lammers AJ، و همکاران. نقش TLR2 در پاسخ میزبان به پنومونی پنوموکوکی در غیاب طحال. BMC Infect Dis. 2012. https://doi. org/10.1186/1471-2334-12-139.

24. مامت یو و همکاران. تولید پروتئین بدون اندوتوکسین - فناوری ClearColi™. روش‌های Nat 2013؛ 10:916.

25. Théry C، et al. حداقل اطلاعات برای مطالعات وزیکول های خارج سلولی 2018 (MISEV2018): بیانیه موضع انجمن بین المللی وزیکول های خارج سلولی و به روز رسانی دستورالعمل های MISEV2014. J Extracell Vesicles. 2018؛ 7 (1): 1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018. 1535750. 26. Bonnington KE، Kuehn MJ. تولید وزیکول غشای خارجی بازسازی lps و نگهداری غشای خارجی در سالمونلا را در طول انتقال محیطی تسهیل می کند. MBio. 2016. https://doi.org/10.1128/mBio. 01532-16.

27. جاسم ر و همکاران. تجزیه و تحلیل لیپیدومی وزیکول های غشای خارجی از جدایه های بالینی حساس به پلی میکسین و مقاوم به کلبسیلا پنومونیه. Int J Mol Sci. 2018. https://doi.org/10.3390/ijms19082356.

28. Olaya-Abril A, et al. خصوصیات وزیکول های محافظتی مشتق از غشای خارج سلولی تولید شده توسط استرپتوکوک پنومونیه جی پروتئومیکس. 2014؛ 106:46-60.

29. Kuhn T, Koch M, Fuhrmann G. Probiomimetics- میکروذرات جدید تقلید کننده لاکتوباسیلوس اثرات ضد التهابی و محافظت کننده از سد را در مدل های دستگاه گوارش نشان می دهند. کم اهمیت. 2020؛ 16 (40): e2003158.

30. Mehanny M، و همکاران. وزیکول های غشای خارج سلولی استرپتوکوک به سرعت توسط سلول های ایمنی درونی شده و آزادسازی سیتوکین خود را تغییر می دهند. جلو ایمونول. 2020؛ 11:80.

31. ولگرز سی و همکاران. نقش تعدیل کننده ایمنی برای وزیکول های غشایی آزاد شده توسط ماکروفاژهای THP-1 و پاتوژن های تنفسی در طول عفونت ماکروفاژها. BMC Microbiol. 2017؛ 17 (1): 216.

32. Ellis TN، Leiman SA، Kuehn MJ. وزیکول های غشایی بیرونی تولید شده به طور طبیعی از سودوموناس آئروژینوزا از طریق حس ترکیبی اجزای لیپوپلی ساکارید و پروتئین، یک پاسخ ایمنی ذاتی قوی ایجاد می کنند. ایمنی را آلوده کند. 2010؛ 78 (9): 3822-31.

33. Alaniz RC، و همکاران. وزیکول های غشایی فاکسیمیل های ایمنی زا از سالمونلا تیفی موریوم هستند که به طور قوی سلول های دندریتیک، پاسخ های سلول های B و T اولیه را فعال می کنند و ایمنی محافظ را در داخل بدن تحریک می کنند. جی ایمونول. 2007؛ 179 (11): 7692-701.

34. Watanabe S، Kumazawa Y، Inoue J. لیپوپلی ساکارید لیپوزومال مسیر سیگنالینگ وابسته به TRIF را مستقل از CD14 آغاز می کند. PLoS ONE. 2013؛ 8 (4): e60078.

35. Fransen F, et al. اثر افتراقی TLR2 و TLR4 بر پاسخ ایمنی پس از ایمن سازی با واکسن علیه نایسریا منینژیتیدیس یا Bordetella pertussis. PLoS ONE. 2010؛ 5 (12): e15692.

36. Travanty E, et al. حساسیت های متفاوت سلول های اولیه ریه انسان به ویروس های آنفلوانزا H1N1 جی ویرول. 2015؛ 89 (23): 11935-44.

37. مبارک رضی الله عنه و همکاران. مقایسه پاسخ های پیش و ضد التهابی در سلول های اپیتلیال اولیه راه هوایی انسان و ماکروفاژهای آلوئولی. Respir Res. 2018؛ 19 (1): 126.

38. Wu W و همکاران. پاسخ ایمنی ذاتی به عفونت ویروس اینفونزا H3N2 و H1N1 در یک مدل کشت اندام ریه انسان. ویروس شناسی 2010؛ 396 (2): 178-88.

39. Wu W، et al. ویروس آنفلوانزا A(H1N1)pdm09 پاسخ‌های ضد ویروسی ذاتی ناشی از RIG-I را در ریه انسان سرکوب می‌کند. PLoS ONE. 2012؛ 7 (11): e49856.

40. دلگادو-اورتگا ام، و همکاران. پاسخ ایمنی ذاتی به یک زیرگروه H3N2 ویروس آنفلوانزای خوکی در سلول‌های نای خوک تازه متولد شده، ماکروفاژهای آلوئولی و برش‌های دقیق ریه. Vet Res. 2014؛ 45:42.

41. Kolbe U، و همکاران. القای اولیه سیتوکین بر روی عفونت سودوموناس آئروژینوزا در برش‌های ریه موش با برش دقیق به حس زنده‌مانی باکتری بستگی دارد. جلو ایمونول. 2020. https://doi.org/10.3389/fmmu. 2020.598636.

42. یونگ آل، و همکاران. نقش بالینی وزیکول های خارج سلولی میزبان و مشتق از باکتری در پنومونی Adv Drug Deliv Rev. 2021. https://doi.org/10. 1016/j.addr.2021.05.021.

43. دلانی اس، و همکاران. تحمل در انسان به دنبال دوز استنشاقی آگونیست انتخابی TLR7، AZD8848. BMJ Open Respir Res. 2016؛ 3 (1): e000113.