بر اساس فارماکولوژی شبکه و آزمایش های حیوانی برای بررسی اثر گلیکوزید فنیل اتانوئید سیستانچ توبولوزا بر اثر نفروپاتی دیابتی

چکیده: هدف بررسی تأثیرسیستانچگلیکوزیدهای فنیل اتانول(CPhGs) روشن استبیماری کلیه دیابتی(DKD) بر اساس فارماکولوژی شبکه و آزمایش های حیوانی. روش ها برای تجزیه و تحلیل از روش UHPLC-QE-MS استفاده شداجزای شیمیایی CPhGs. پایگاه داده های TCMSP و Swiss Target Prediction برای نمایش اجزای اصلی استفاده شد. برای به دست آوردن اهداف مرتبط با DKD از پایگاه های OMIM و GeneCards استفاده شد. پس از به دست آوردن اهداف مشترک، از وب سایت STRING برای ساخت یک شبکه تعامل پروتئین استفاده شد. پایگاه داده DAVID برای GO، تحلیل مسیر KEGG و نرم افزار Cytoscape برای ساخت شبکه "CphGs core component-target-pathway" استفاده شد. ده موش به‌طور تصادفی به‌عنوان گروه نرمال انتخاب شدند و موش‌های باقی‌مانده با غذای با قند و چربی بالا تغذیه شدند و یک تزریق داخل صفاقی STZ برای ایجاد مدل DKD داده شد. آنها به گروه مدل، گروه داپاگلیفلوزین (1 میلی گرم/کیلوگرم) و CPhGs با دوز بالا و متوسط ​​و کم تقسیم شدند (500، 25{{4{48}}}}، 125 گروه mg/kg)، 10 حیوان در هر گروه، مداخله دارویی به مدت 6 هفته، شرایط عمومی مشاهده شد، وزن بدن تعیین شد و قند خون هر هفته آزمایش شد. ادرار 24 ساعت پس از آخرین دوز جمع آوری شد. شناسایی 24-ساعت کل پروتئین ادرار (24-UTP)؛ خون را از آئورت شکمی جمع آوری کنید و آن را قربانی کنید، سرم را جدا کنید و نیتروژن اوره (BUN)، اسید اوریک (UA)، کلسترول تام (TC)، تری گلیسیرید (TG) و فشار خون بالا را تشخیص دهید. سطوح لیپوپروتئین با چگالی بالا (HDL) و لیپوپروتئین با چگالی کم (LDL)، رنگ‌آمیزی HE و رنگ‌آمیزی ماسون برای مشاهده تغییرات پاتولوژیک در بافت کلیه، الایزا برای تشخیص IL سرم، IL{17} استفاده شد. } و سطوح TNF- و وسترن بلات برای تشخیص بافت کلیه استفاده شد. بیان پروتئین JAK2، p-JAK2، STAT3، p STAT3، SOCS3. ResultsA در مجموع 699 جزء با فناوری UHPLC-QE-MS شناسایی شد. پس از غربالگری، 16 جزء اصلی CPhGs و 323 هدف مرتبط به دست آمد. CPhGs و DKD 99 هدف مشترک داشتند. اهداف کلیدی STAT3، SRC، EGFR و غیره بودند. تجزیه و تحلیل مسیر KEGG 151 مسیر سیگنالینگ را غربال کرد، که نشان داد مسیر سیگنالینگ IL{33}}، ​​مسیر سیگنالینگ PI3K/Akt، مسیر سیگنالینگ TNF و غیره ممکن است نقش کلیدی در درمان DKD توسط CPhGs CPhGها می‌توانند وزن بدن موش‌های DKD را افزایش دهند (01/0≥P)، مصرف آب را کاهش دهند (01/0≥P)، متابولیسم گلوکز و لیپید را تنظیم کنند، سطوح {39}UTP و BUN را کاهش دهند (01/0≥ P) و بافت کلیه را بهبود بخشند. . آسیب پاتولوژیک بیان پروتئین p-JAK2/JAK2 و p-STAT3/STAT3 را در بافت کلیه کاهش داد (01/0≥ P) و بیان پروتئین SOCS3 را افزایش داد (01/0≥ P). نتیجه گیری CPhGها در DKD از طریق چندین مؤلفه، اهداف متعدد و مسیرهای متعدد، احتمالاً با مهار JAK2/ مداخله می کنند.

مسیر سیگنالینگ STAT3

کلید واژه ها: گلیکوزید فنیل اتانول سیستانچ; نفروپاتی دیابتی; UHPLC-QE-MS؛ فارماکولوژی شبکه؛ آزمایش حیوانی؛ مسیر سیگنالینگ JAK2/STAT3

چه مدت طول می کشد تا سیستانچ برای بیماران کلیوی کار کند؟

بیماری کلیه دیابتی (DKD)به عنوان یکی از مهم ترین عوارض میکروواسکولار دیابت، نه تنها عامل اولیه منجر به آن می باشدبیماری مزمن کلیویبلکه علت اصلی بیماری کلیوی مرحله نهایی (ESRD) در سراسر جهان است. دلیل [1-2]. درمان بالینی DKD عمدتاً شامل کنترل قند خون، فشار خون و چربی‌های خون، و ثانیاً محافظت از عملکرد کلیه، اجتناب از استفاده از داروهای نفروتوکسیک و بهبود سبک زندگی است [3-4]. با این حال، به دلیل پاتوژنز پیچیده DKD و فقدان اهداف مداخله ای خاص، گزینه های درمانی فعلی دارای محدودیت هایی هستند و موثر نیستند. بروز DKD در مرحله پایانی هنوز در حال افزایش است. بنابراین، یافتن داروهای طبیعی موثر از اهمیت بالایی برخوردار است.

Cistanche Deserticola Y. سی. مادر یاسیستانش سی.ساقه های گوشتی خشک شده ازCistanche tubulosa (Schenk) Wightبا برگ های فلس دار [5] برای اولین بار در "Shen Nong's Materia Medica" ثبت شد و به عنوان درجه برتر فهرست شد. آنها به عنوان "جنسینگ صحرا" شناخته می شوند [6]. آنها شیرین، شور و گرم هستند. به مریدین های کلیه و روده بزرگ باز می گردد و دارای اثرات تغذیه کننده یانگ کلیه، تامین کننده جوهر و خون، مرطوب کننده روده ها و ملین است. تحقیقات نشان می دهد که گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید (CPhGs) یکی از مواد فعال اصلی آن هستند و مسئول توسعه آن هستند.

مبنای مادی برای اعمال اثرات دارویی؛ عصاره گیاه سیستانچ دارای اثرات ضد دیابتی [7-8]، ضد سرطان کبد [9]، محافظت از کلیه [10-11]، محافظت کننده عصبی [12-13] و سایر اثرات دارویی است، اما در حال حاضر، CPhGs در درمان DKD موثر نیستند. اثرات و مکانیسم آن نامشخص است.

این مطالعه از روش‌های فارماکولوژی شبکه و اتصال مولکولی [14] استفاده کرد، CPhGs را به عنوان هدف تحقیق، پیش‌بینی و تجزیه و تحلیل مواد فعال اصلی و اهداف بالقوه آن برای درمان DKD، و سپس ایجاد ترکیبی از استرپتوزوسین (STZ) مدل موش DKD تغذیه شده با خوراک لیپیدی به عنوان موضوع تحقیق in vivo، برای ارائه مرجع برای گسترش بالینی و کاربرد درمان‌های مرتبط و تحقیقات بیشتر در مورد مکانیسم اثر استفاده شد.

1 ماده

1.1 حیوانات

70-موش‌های نر SD هفته‌ای با سطح SPF، وزن بدن (20±240) گرم، از مرکز آزمایشی حیوانات دانشگاه پزشکی سین‌کیانگ خریداری شدند [مجوز استفاده از حیوانات آزمایشی شماره مجوز SYXK (جدید) {{4} }]، در حیوانات به مدت 1 هفته در دمای (2±22) درجه، رطوبت نسبی 50٪ تا 70٪ و یک چرخه نور و تاریکی متناوب 12 ساعت در 12 ساعت پرورش داده شدند. این آزمایش توسط کمیته اخلاق حیوانات مرکز حیوانات آزمایشی پزشکی دانشگاه پزشکی سین کیانگ (شماره اخلاق IACUC{12}}) تأیید شد.

1.2 معرف ها و داروها

CPhGs (batch number 201610, purity >80٪ توسط Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozin (شماره دسته NB2248) از AstraZeneca، انگلستان خریداری شد. خوراک پرشکر و پرچرب (Cat. No. Boaigang-B1135DM) و STZ (Batch No. 2021110307) از Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd. خریداری شد. میکروآلبومین ادرار (شماره دسته ای 20220611)، نیتروژن اوره (شماره دسته ای 20220626)، اسید اوریک (شماره دسته ای 20220613)، کلسترول تام (شماره دسته ای 20220615)، تری گلیسیرید (تعداد دسته ای 2020-4061) و لیپوپروتئین با چگالی کم (بچ شماره 20220615) از موسسه مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ خریداری شد. اینترلوکین-6 (IL-6، شماره لات JL20896)، اینترلوکین-1 (IL-1، شماره لات JL20884) و فاکتور نکروز تومور- (TNF-، شماره لات 13202 ) از شرکت بیوتکنولوژی شانگهای جیانگلای خریداری شد. آنتی بادی پلی کلونال خرگوش JAK2 (تعداد لات 22v9316)، آنتی بادی پلی کلونال خرگوش p-JAK2 (شماره لات 78g9360)، آنتی بادی پلی کلونال خرگوش STAT3 (شماره لات 15x8824)، آنتی بادی پلی کلونال خرگوش p-STAT3 (تعداد لات 74m1478 آنتی بادی پلی کلونال خرگوش) شماره 31d4841) همه از Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd. خریداری شدند. آنتی بادی پلی کلونال ضد خرگوش IgG بز با برچسب HRP (شماره دسته 20000758) از شرکت بیوتکنولوژی ووهان میتاکا خریداری شد. آنتی بادی مونوکلونال خرگوش اکتین (شماره دسته ای AC230205001)، بافر لیز RIPA (شماره دسته ای 20220416)، کیت های تعیین غلظت پروتئین BCA (شماره دسته 20230401) از Beijing Solebao Technology Co., Ltd خریداری شد.

1. 3 ابزار

کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده بالا، طیف سنج جرمی با وضوح بالا Q Exactive Focus، سانتریفیوژ Heraeus Fresco17، میکروپلیت خوان اتوماتیک FC (Thermo Fisher Scientific, USA). آسیاب JXFSTPRP{3}} (شانگهای Jingxin Technology Co., Ltd.); کنتور آب خالص مینگچه D24 UV (شرکت مرک میلیپور آلمان); ستون ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7μm, 2.1mm×100mm) (American Waters Company); گلوکز سنج Accu Chek Performa (شرکت روچه سوئیس); Cryostat CM1850UV، میکروسکوپ فلورسانس عمودی DM300 (شرکت لایکا، آلمان)؛ GL{13}}ورتکس متر B (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); ترازوی تحلیلی الکترونیکی (شرکت بیو راد، ایالات متحده آمریکا).

2 روش

2. 1 تجزیه و تحلیل UHPLC-QE-MS

2.1.1 تهیه محلول آزمایش

100 میلی گرم CPhG را وزن کنید، 500 میکرولیتر متانول 80% اضافه کنید، 30 ثانیه گرداب کنید، 1 ساعت در حمام آب یخ فراصوت کنید، بگذارید 1 ساعت در -40 درجه بماند، در دمای 4 درجه سانتریفیوژ کنید. ، 12 000 r/min به مدت 15 دقیقه، مایع رویی را آسپیره کنید، 0. از یک غشای ریز متخلخل 22 میکرومتر فیلتر کنید و در یخچال -80 درجه نگهداری کنید.

2.1.2 شرایط کروماتوگرافی

ستون ACQUITY UPLC BEH C18 (1. 7 میکرومتر، 2. 1 میلی متر × 100 میلی متر); فاز متحرک استونیتریل (A) -1% اسید فرمیک (B)، شستشوی گرادیان (0 ~ 11 دقیقه، 15٪ ~ 75٪ A؛ 11 تا 12 دقیقه، 75٪ تا 98٪ A؛ 12 تا 14 دقیقه، 98% A; 14 تا 14. 1 دقیقه، 98% تا 15% A 14. 1 تا 15 دقیقه، 15% A. میزان جریان حجمی 0 . 5 میلی لیتر در دقیقه؛ دمای ستون 35 درجه؛ حجم تزریق 5 میکرولیتر

2.1.3 شرایط طیف سنجی جرمی

اسکن کامل ddMS2 حالت اسکن کامل. نرخ جریان حجم گاز غلاف 45 arb; سرعت جریان حجم گاز کمکی 15 arb; دمای مویرگی 4{9}}0 درجه ; انرژی برخورد در حالت NCE 15% ~ 30% ~ 45% چرخه. ولتاژ پاشش ± 4. 0 کیلو ولت.

2.2 تحقیقات فارماکولوژی شبکه

2. 2. 1 CPhGs

غربالگری هدف جزء: اجزای شیمیایی تجزیه و تحلیل شده توسط UHPLC-QE-MS را بر اساس محتوای نسبی مرتب کنید و مواردی را که ساختار شیمیایی آنها هنوز مشخص نشده است حذف کنید. برای بدست آوردن پارامترهای فارماکوکینتیک هر عنصر، شماره سریال InChIKey اجزای غربال شده را در پایگاه داده TCMSP وارد کنید. بر اساس شرایط فراهمی زیستی خوراکی (OB) > 30٪ و شباهت دارویی (DL) > 0.18، داوطلبانی که شرایط لازم را داشته باشند غربالگری خواهند شد. برای پیش بینی هدف، شماره SMILES هر جزء را در پایگاه داده پیش بینی هدف سوئیس وارد کنید و هدف جزء شیمیایی CPhGs را بدست آورید.

2. 2. 2 DKD

غربالگری هدف بیماری از "نفروپاتی دیابتی" به عنوان عبارت جستجو برای جستجوی اهداف بیماری در پایگاه های داده OMIM، GeneCards و NCBI استفاده کنید.

2. 2. 3 ساخت شبکه جزء-هدف-بیماری

اهداف متقابل مؤلفه‌ها و بیماری‌های CPhGs از طریق نقشه‌برداری نرم‌افزار R به‌دست آمدند و از نرم‌افزار Cytoscape 3.7.2 برای ساختن یک سیستم شبکه مولفه-هدف استفاده شد که در آن پلاگین تجزیه و تحلیل اهداف اصلی را شناسایی کرد.

2. 2. 4 ساخت شبکه تعامل پروتئین-پروتئین (PPI)

پروتئین‌های هدف تقاطع اجزا و بیماری‌ها را در پایگاه داده STRING وارد کنید، یک شبکه تعامل پروتئین-پروتئین (PPI) بسازید، پروتئین‌های بدون گره‌های متصل در شبکه را حذف کنید و سطح اطمینان کمترین امتیاز تعامل پروتئین را روی {{1} تنظیم کنید. }.700. یک شبکه PPI بسازید، نتایج فرمت TSV آن را دانلود کنید، آنها را به نرم افزار Cytoscape 3.7.2 وارد کنید و از افزونه تجزیه و تحلیل برای اهداف اصلی صفحه نمایش استفاده کنید.

2. 2. 5 GO، تجزیه و تحلیل KEGG

از بخش حاشیه نویسی عملکردی در پایگاه داده DAVID برای انجام تجزیه و تحلیل غنی سازی در اهداف تقاطع بیماری های جزء استفاده کنید. ابتدا پارامترهای تجزیه و تحلیل را تنظیم کنید، هدف تقاطع را در کادر فهرست ژن وارد کنید، نماد رسمی ژن را به عنوان شناسه هدف انتخاب کنید، فهرست ژن را به عنوان نوع داده انتخاب کنید (نوع فهرست) و "Homo Sapiens (گونه ها)" را به عنوان منبع هدف (گونه ها). Race)"، تجزیه و تحلیل را پس از تایید پارامترهای تجزیه و تحلیل شروع کنید، نتایج تجزیه و تحلیل GO و KEGG را بدست آورید و سپس از پلت فرم ترسیم آنلاین ImageGP برای ترسیم نمودار حباب نتایج تجزیه و تحلیل KEGG و GO استفاده کنید. نرم افزار Cytoscape 3.7.2 مولفه را می سازد. تصویر شبکه هدف-مسیر.

2. 2. 6 اتصال مولکولی

ابتدا نمودار ساختار سه بعدی ماده فعال را با فرمت SDF از پایگاه PubChem دانلود کنید، سپس نمودار ساختار سه بعدی هدف تقاطع را با فرمت PDB از پایگاه جهانی پروتئین ایالات متحده (PDB) دانلود و در نهایت در CB-Dock بارگذاری کنید. وب سایت برای اتصال مولکولی. ترکیبات داکینگ غالب را غربال کنید و آنها را با Pymol تجسم کنید.

2.3 آزمایش بر روی حیوانات

2.3.1 مدل سازی، گروه بندی و تجویز دارو

10 موش صحرایی به‌طور تصادفی به‌عنوان گروه عادی انتخاب و با خوراک معمولی تغذیه شدند و موش‌های باقی‌مانده با خوراک پرقند و پرچرب تغذیه شدند. پس از 6 هفته، یک بار تزریق داخل صفاقی 30 mg/kg STZ (0.1 mmol/L STZ محلول در pH 4.5 بافر سدیم سیترات) داده شد و 72 ساعت بعد، خون از ورید دم گرفته شد. برای تشخیص قند خون ناشتا (FBG). اگر FBG بزرگتر یا مساوی 16.7mmol/L باشد، مدل دیابت با موفقیت ایجاد شد [15]. ادامه آنها به مدت 2 هفته با غذای پرقند و پرچرب تغذیه شدند. مدل‌سازی DKD بر اساس مثبت بودن گلوکز ادرار و 24-ساعت پروتئین کل ادرار ({18}}UTP) بیشتر یا مساوی 20 میلی‌گرم، موفق بود. از میان آنها، 3 نفر در طول فرآیند مدل سازی جان خود را از دست دادند و 7 نفر ناموفق بودند. ، در مجموع 50 مورد موفق بودند. موش هایی که با موفقیت مدل سازی شدند به طور تصادفی به گروه مدل، گروه داپاگلیفلوزین (1 میلی گرم بر کیلوگرم)، و CPhGs با دوز بالا، متوسط ​​و کم (500، 250، 125 میلی گرم بر کیلوگرم) تقسیم شدند. هر گروه تجویز به صورت داخل معده تجویز شد. به موش‌های گروه نرمال و گروه مدل، داروهای مربوطه داده شد، و به موش‌های گروه نرمال و گروه مدل، همان مقدار نرمال سالین با گاواژ، یک بار در روز به مدت 6 هفته داده شد. در طول دوره تجویز، به موش‌ها در هر گروه به جز گروه معمولی غذای پرچرب داده شد.

2.3.2 تشخیص اندیکاتور بیوشیمیایی

پس از 6 هفته مداخله CPhG، 24-ساعت ادرار از موش‌ها جمع‌آوری شد و 24-ساعت پروتئین کل ادرار (24-UTP) اندازه‌گیری شد. خون از ورید دم ناشتا برای تشخیص سطوح FBG جمع آوری شد. خون از آئورت شکمی، 4 درجه، 1500 دور در دقیقه جمع آوری شد. به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید تا سرم جدا شود و نیتروژن اوره سرم تشخیص داده شود.

سطح BUN)، اسید اوریک (UA)، کلسترول تام (TC)، تری گلیسیرید (TG)، لیپوپروتئین با چگالی بالا (HDL)، لیپوپروتئین با چگالی کم (لیپوپروتئین با چگالی کم LDL).

2.3.3 مشاهده مورفولوژی پاتولوژیک بافت کلیه

موش ها با پنتوباربیتال سدیم بیهوش و قربانی شدند. کلیه ها کنده شدند، وزن شدند، با 4% پارافورمالدئید تثبیت شدند، خشک شدند، شفاف شدند، در موم غوطه ور شدند، جاسازی شدند و برای رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (HE) برش داده شدند.

پس از رنگ‌آمیزی ماسون، مورفولوژی بافت زیر میکروسکوپ مشاهده شد و از نرم‌افزار Image-Pro Plus 6.{2}} برای آنالیز چگالی نوری یکپارچه و تعیین کمیت ناحیه فیبر کلاژن نسبی استفاده شد.

2. 3. 4 الایزا

این روش برای تشخیص سطوح فاکتورهای التهابی سرمی در موش‌های صحرایی مورد استفاده قرار گرفت. سطوح IL-6، IL-1 و TNF- طبق دستورالعمل کیت شناسایی شد.

2. 3. 5 روش وسترن بلات برای تشخیص بیان پروتئین مرتبط

بافت کلیه موش صحرایی گرفته شد، لیز RIPA برای استخراج پروتئین کل اضافه شد و غلظت با روش BCA تعیین شد.

پس از الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید، انتقال به غشای PVDF و پس از مسدود شدن، JAK2 (1: 2000)، p-JAK2 (1: 1000)، STAT3 (1: 2000)، p -STAT3 (1:2000)، آنتی بادی های SOCS3 (1:2000)، -اکتین (1:2000)، در 4 درجه یک شبه انکوبه می شوند، آنتی بادی ثانویه IgG نشاندار HRP (1:5000) را اضافه می کنند و در دمای اتاق به مدت 1 ساعت انکوبه می کنند، با کیت الکترولومینسانس ساخته شده، در معرض قرار می گیرند. توسط تصویرگر ژل پروتئین، با استفاده از نرم افزار Image J

تجزیه و تحلیل کمی قطعات با استفاده از -اکتین به عنوان مرجع داخلی، نسبت مقدار خاکستری نوار هدف و باند مرجع داخلی بیان پروتئین نسبی است.

2.4 تجزیه و تحلیل آماری

داده ها توسط نرم افزار SPSS 25.{1}} پردازش و داده ها به صورت (x±s) بیان شد. برای مقایسه بین گروه ها از تحلیل واریانس یک طرفه استفاده شد. پ<0.05 indicates that the difference is statistically significant.