اثرات مفید اکیناکوزید بر کاردیومیوپاتی دیابتی در موش‌های Db/Db دیابتی

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

شیانگ ژانگ و یارونگ هائو

مقدمه

کاردیومیوپاتی دیابتی (DCM) یک عارضه عمده دیابت است، با عوارض بالا و خطر بالای بیماری قلبی عروقی و مرگ و میر در بیماران دیابتی.1 بروز DCM در بیماران با سابقه دیابت بیشتر یا مساوی 5 سال، بیش از 44.4 است. درصد، که پس از 8 سال به 56 درصد افزایش می یابد. 2،3 DCM نوعی کاردیومیوپاتی اولیه است که به صورت ناهنجاری های ساختاری و عملکردی قلب ناشی از آپوپتوز سلولی فیبروز میوکارد و ضایعات میکروواسکولار در بیماران دیابتی بدون بیماری ایسکمیک یا فشار خون قلبی و می تواند باعث ایجاد آریتمی قلبی با شوک با منشاء قلبی و مرگ ناگهانی در نارسایی قلبی شود. به دلیل پاتوژنز پیچیده DCM و تشخیص آن در مراحل پیشرفته، هیچ درمان موثری وجود ندارد. هیپرگلیسمی طولانی مدت منجر به اختلال در متابولیسم گلوکز و لیپید در قلب بیماران دیابتی می شود که منجر به آسیب به سلول های اندوتلیال عروقی و سایر بافت ها می شود و باعث تغییرات پاتولوژیک از جمله هیپرتروفی، نکروز، آپوپتوز و فیبروز بینابینی میوکارد می شود. گلوکز و چربی اختلالات متابولیسم کلیدی برای مکانیسم های پاتولوژیک DCM هستند. بنابراین، کنترل مؤثر متابولیسم انرژی در کاردیومیوسیت ها، یک استراتژی درمانی مهم برای DCM است.

درمان سیستانچ توبولوزاکاردیومیوپاتی دیابتی

تجمع چربی میوکارد در DCM پیشرفت نارسایی قلبی را تشدید می کند. PPAR- یک تنظیم کننده کلیدی ژن های مرتبط مختلف در سیستم اکسیداسیون اسیدهای چرب پراکسیدازهای سلولی، میتوکندری و میکروزوم ها است و در متابولیسم لیپیدها و تنظیم التهاب و ایمنی نقش کلیدی دارد.8 PPAR- متابولیسم لیپید را از طریق میتوکندری و بتا اکسیداسیون اسید چرب پراکسیداز، با واسطه کارنیتین پالمیتوئیل ترانسفراز-I (CPT-I). 9 اکسیداسیون اسیدهای چرب طویل و منشعب10 سنتز و تجمع لیپوپروتئین ها و VLDL را کاهش می دهد. 11 تنظیم غیر مستقیم سنتز اسیدهای صفراوی باعث افزایش دفع کلسترول می شود. و بیان ژن های مرتبط با التهاب را مهار می کند. بیان PPAR در کبد در بیماران مبتلا به بیماری کبد چرب غیر الکلی یا در مدل های حیوانی با مصرف طولانی مدت چربی بالا به طور قابل توجهی کمتر است. Everett و همکاران نشان دادند که سطوح اسیدهای چرب آزاد مرتبط با کبد به طور قابل توجهی افزایش یافته است. در مدل‌های موش PPAR-knockout به دلیل متابولیسم چربی ضعیف، استئاتوز کبد را ترویج می‌کند. این یافته‌ها نشان می‌دهد که PPAR- نقش مهمی در پاتوژنز متابولیسم لیپید ایفا می‌کند.

اکینوزید (ECH) یک ترکیب طبیعی جدا شده از ساقه استسیستانچ توبولوزاماده شیمیایی فعال ECH یک فنیل اتانوئید است که اثرات آنتی اکسیدانی، ضد خستگی، ضد تومور و ضد التهابی را نشان می دهد و می تواند حافظه، محافظت از اعصاب و کبد را بهبود بخشد و تنظیم ایمنی را تقویت کند. db/db موش های دیابتی، مشخص شد که ECH می تواند مقاومت به انسولین را بهبود بخشد، سطح HDL را افزایش دهد و سطوح TG، TC و LDL را کاهش دهد، که نشان می دهد ECH می تواند به طور موثر متابولیسم لیپید دیابتی را بهبود بخشد. می تواند متابولیسم لیپید را با تنظیم mRNA مربوط به انتقال استرول کبدی صفراوی تحت تاثیر قرار دهد

مطالعات قبلی نشان داده‌اند که ECH بیان TGF- و ژن‌های پایین‌دست آن را برای بهبود فیبروز کلیوی در موش‌های db/db تنظیم می‌کند. برای کشف مکانیسم‌های مولکولی بالقوه آن، ما از موش‌های db/db به‌عنوان مدل بیماری DCM استفاده کردیم و مکانیسم(های) تنظیمی ECH را بر روی پروتئین‌هایی که اختلالات متابولیسم گلوکز و لیپید، استرس اکسیداتیو و آپوپتوز در کاردیومیوسیت‌ها را کنترل می‌کنند، بررسی کردیم. هدف ما ارائه یک مبنای نظری برای درمان موثر DCM بود.

سیستانچ توبولوزا

مواد و روش ها

مواد شیمیایی و معرف ها

پودر ECH (94 درصد خلوص شناسایی شده توسط HPLC، دسته شماره 190906) (مکمل شکل 1) از شرکت علوم پزشکی شانگهای (شانگهای، چین) به دست آمد. ECH در آب تا 2 میلی گرم بر میلی لیتر حل شد و در دمای 4 درجه در تاریکی نگهداری شد. ECH در دوز 100-500 mg/kg·d تجویز شد و به طور قابل توجهی کاهش یافت.

گلوکز خون و سطوح چربی خون بهبود یافته است. 18 ECH اثرات هیپوگلیسمی و ضد هیپرلیپیدمیک وابسته به دوز را نشان داد.

حیوانات تجربی و درمان

آزمایش‌های حیوانی مطابق با دستورالعمل‌های مؤسسه ملی بهداشت (NIH Pub. No 85-23، تجدید نظر شده در سال 1996) انجام شد. پروتکل‌ها توسط کمیته اخلاق حیوانات آزمایشگاهی و مرکز تغذیه حیوانات بیمارستان رنمین دانشگاه ووهان (ووهان، چین، شماره 20190517) تأیید شد. موش‌های نر بالغ C57BLKS/J db/db و موش‌های db/m (درجه SPF) از دانشگاه نانجینگ-موسسه تحقیقات زیست‌پزشکی نانجینگ (نانجینگ، جمهوری خلق چین، شماره: SCXK (Sue) 2018-0001) خریداری شدند. حیوانات در مرکز حیوانات بیمارستان رنمین (ووهان، جمهوری خلق چین) در دمای اتاق (20 درجه)، رطوبت نسبی 50 درصد -60 درصد و در معرض نور 12- ساعت در قفس قرار گرفتند. چرخه تاریکی تغذیه تطبیقی ​​به مدت 1 ساعت انجام شد و هیچ داروی کاهنده قند خون تجویز نشد.

پس از قرنطینه، موش‌های db/db به‌طور تصادفی به گروه مدل دیابت (گروه db/db، n{{0}})، گروه درمان ECH (db/db به علاوه گروه ECH، n=11 قرار گرفتند. ) یا گروه کنترل db/m (db/m، n=9). در هفته هشتم، موش‌های گروه‌های db/db و db/m 0.05 میلی‌لیتر به ازای 10 گرم وزن بدن به مدت 10 هفته، در حالی که موش‌های گروه db/db به‌علاوه ECH 300 میلی‌گرم بر (کیلوگرم در روز) خوراکی تجویز شدند.

ECH بر اساس وزن بدن به مدت 10 هفته. وزن بدن سه گروه موش به صورت هفتگی بررسی شد و تغذیه، نوشیدن و فعالیت مورد ارزیابی قرار گرفت. هنگامی که موش ها به مدت 8 ساعت ناشتا بودند، هر 2 هفته یک بار نمونه خون (~50 لیتر) از انتهای دم با دستگاه قند سنج و کاغذ آزمایش (جانسون و جانسون، نیوبرانزویک، نیوجرسی، ایالات متحده آمریکا) برای تعیین سطح گلوکز خون گرفته شد. . پس از 10 هفته مداخله، موش ها با تزریق داخل صفاقی 2 درصد سدیم پنتوباربیتال (شرکت Shanghai Harvest، شانگهای، جمهوری خلق چین) (100mg/kg) بیهوش شدند. خون پس از وارد کردن سوزن مویرگی جمع آوری شد و سرم به سرعت جدا شد و در دمای 80- درجه برای تجزیه و تحلیل ذخیره شد. پس از پرفیوژن قلبی با PBS سرد برای خارج کردن خون، PBS آزاد با کاغذ صافی حذف شد. بافت قلب جدا و وزن شد و وزن خشک قلب اندازه گیری شد. شکم موش ها تراشیده شد، شکم پس از ضدعفونی الکل (70 درصد) باز شد و بافت چربی زیر جلدی شکم به سرعت برداشته شد و وزن آن مرطوب شد. استخوان درشت نی موش ها جدا و اندازه گیری شد. هیپرتروفی قلب از طریق نسبت وزن قلب به طول تیبیا (HW/TL) (mg/mm) ارزیابی شد. بافت های قلب با 4 درصد پارافورمالدئید (بیوتکنولوژی گوگل، ووهان، جمهوری خلق چین) تثبیت شدند و بیوپسی برای نظارت بر مورفولوژی بافت میوکارد انجام شد. بافت قلبی باقیمانده به مدت 1 ساعت در نیتروژن مایع قرار داده شد و قبل از RT-PCR و وسترن بلات در دمای 80- درجه نگهداری شد.

اکوکاردیوگرافی

سونوگرافی (VisualSonics، Toronto، ON، کانادا) برای اندازه گیری های اکوکاردیوگرافی در پایان آزمایش انجام شد. موش ها با تزریق داخل صفاقی کلرال هیدرات 30 میلی گرم بر کیلوگرم به مدت نیم ساعت بیهوش شدند، 21 تراشیده شدند تا ناحیه قفسه سینه نمایان شود و روی صفحه صاف ثابت شود. قطر سیستولیک بطن چپ (DVDs)، قطر دیاستولیک LV (LVD)، کسر جهشی LV (EF)، و کوتاه شدن کسری بطن چپ (FS) تعیین شد.

پارامترهای متابولیک و بیوشیمیایی

در 18 هفتگی، نمونه های خون در دمای 4 درجه به مدت 20 دقیقه برای جمع آوری سرم سانتریفیوژ شد. یک آنالایزر بیوشیمیایی توتال خودکار (ADVID2400، توکیو، ژاپن) برای تشخیص کلسترول تام (TC)، تری گلیسیرید (TG)، اسیدهای چرب آزاد (FFAs)، لیپوپروتئین-کلسترول با چگالی بالا (HDL-c) و چگالی کم استفاده شد. لیپوپروتئین کلسترول (LDL-c) در سرم.

ضد اکسیداسیون : سیستانچ توبولوزا

شاخص اکسیداسیون و سطوح آنتی اکسیدانی

بافت میوکارد بطن چپ تازه (50 میلی گرم) از هر گروه به دست آمد. سطوح SOD، GSH-px، و MDA در سلول های میوکارد با استفاده از کیت های تجاری (موسسه مهندسی زیستی نانجینگ جیانگ چنگ، چین) تعیین شد.

رنگ آمیزی تریکروم، تونل و سودان II ناحیه بطن چپ بافت میوکارد هر گروه از موش ها به مدت 24 ساعت در پارافورمالدئید 4 درصد تثبیت شد، با پارافین جاسازی شد، برش داده شد و رنگ آمیزی HE صورت گرفت. تغییرات پاتولوژیک و مورفولوژیکی فیبرهای میوکارد هر گروه از موش ها در زیر میکروسکوپ نوری (JEOL، توکیو، ژاپن) مشاهده شد. آپوپتوز میوسیت قلبی با روش تونل (شماره 11684817910، Roche، ایالات متحده آمریکا) شناسایی شد. بافت قلب با پارافورمالدئید پیش تیمار شده، جاسازی شده و برش داده شد. مقاطع با زایلن I (شانگهای، جمهوری خلق چین) (20 دقیقه) - زایلن II (20 دقیقه) - اتانول بی آب I (10 دقیقه) - اتانول بی آب II (10 دقیقه) -95 درصد الکل (5 دقیقه) شسته شدند. 14}} درصد الکل (5 دقیقه)-80 درصد الکل (5 دقیقه) -70 درصد الکل (5 دقیقه) و آب مقطر. برش ها با تکان دادن خشک شدند و از حلقه های برس هیستوشیمیایی برای جلوگیری از اتلاف مایع استفاده شد. پروتئاز K به حلقه ها اضافه شد تا بافت را بپوشاند. پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه به مدت 15 دقیقه، لام ها در PBS (pH 7.4) قرار گرفتند و در شیکر رنگبری (سه بار به مدت 5 دقیقه) شسته شدند. معرف های 1 (TdT) و 2 (dUTP) به نسبت 1:9 مخلوط شدند و به پوشش داخلی بافت اضافه شدند. مخلوط ها در حمام آب در دمای 37 درجه به مدت 60 دقیقه انکوبه شدند. مقدار کمی آب برای حفظ رطوبت اضافه شد. اسلایدها در PBS و رنگ آمیزی DAPI (آسپن بیولوژیکی، ووهان، جمهوری خلق چین) در تاریکی به مدت 5 دقیقه شستشو داده شدند. اسلایدها در PBS شسته شدند و با استفاده از یک عامل خاموش کننده ضد فلورسانس نصب شدند. مقاطع با میکروسکوپ فلورسنت مشاهده و تصویربرداری شدند. رنگ آمیزی سودان II برای مشاهده تجمع چربی در میوسیت های قلبی استفاده شد. بافت‌های بطن چپ در پارافورمالدئید 10 درصد به مدت 30 دقیقه تثبیت شدند، با سودان قرمز II (Gefen، شانگهای، جمهوری خلق چین) در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه رنگ‌آمیزی شدند، با 75 درصد الکل رنگ‌آمیزی شدند و مجدداً به مدت 15 دقیقه در PBS رنگ‌آمیزی شدند. . نسبت فیبروز میوکارد به کل مساحت در مقاطع تری کروم رنگ آمیزی شده ماسون با استفاده از نرم افزار کمی Image-Pro Plus تعیین شد. اسلایدها با استفاده از ژلاتین گلیسیرین سوار شدند و با میکروسکوپ تصویربرداری شدند.

نتایج

اثرات ECH بر موش های Db/Db

موش های گروه db/db پلی فاژی و پلی اوری آشکار را نشان دادند. اندازه بدن نیز به طور قابل توجهی بزرگتر از اندازه موش های db/m بود. وزن بدن در گروه db/db به طور قابل توجهی نسبت به گروه db/m افزایش یافت (شکل 1A؛ **p<0.01). body="" weights="" of="" the="" db/db="" +="" ech="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" of="" the="" db/="" db="" group="" after="" 10="" weeks="" of="" ech="" treatment="" (figure="" 1a;=""><0.05). at="" week="" 15,="" the="" difference="" in="" body="" weight="" of="" each="" group="" gradually="" appeared="" after="" ech="" intervention.="" the="" abdominal="" fat="" thickness="" of="" mice="" in="" the="" db/db="" group="" was="" higher="" than="" those="" in="" the="" db/m="" group="" (figure="" 2b;=""><0.01). ech,="" therefore,="" improves="" obesity="" in="" db/db="" mice,="" the="" specific="" mechanisms="" of="" which="" require="" further="">

سطح گلوکز خون ناشتا به صورت هفتگی ارزیابی شد. همانطور که در شکل 1B نشان داده شده است، در مقایسه با موش های db/m، سطح گلوکز خون ناشتا در موش های db/db به طور قابل توجهی با افزایش سن افزایش یافت و هیپرگلیسمی آشکاری را نشان داد (شکل 1B؛ *p<0.01). over="" a="" 10="" week="" period,="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/db="" and="" db/db="" +="" ech="" group="" increased,="" whilst="" glucose="" levels="" in="" the="" db/m="" group="" remained="" stable.="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/="" db="" +="" ech="" group="" were="" slower="" than="" those="" of="" the="" db/db="" group="" (figure="" 1b;=""><0.01), suggesting="" that="" ech="" markedly="" improved="" hyperglycemia="" in="" db/db="" diabetic="" mice.="" we="" speculated="" that="" ech="" could="" promote="" the="" synthesis="" of="" liver="" glycogen="" and="" inhibited="" the="" activity="" of="" α-glucosidase="" to="" suppressed="" glucose="" transport="" in="" the="" small="" intestine,="" significantly="" contributing="" to="">

بحث

کاردیومیوپاتی دیابتی به طور کلی به چهار مرحله تقسیم می شود. در مرحله اول، توده بطن چپ افزایش یافت، اختلال عملکرد دیاستولیک و کسر جهشی (EF) طبیعی بود. حتی از نظر بالینی بدون علامت، فیبروز میوکارد افزایش یافت، پر شدن دیاستولیک اولیه کاهش یافت و فشار انتهای دیاستولیک بطن چپ افزایش یافت.22 مرحله دوم با افزایش توده بطن چپ، ضخیم شدن دیواره بطن، اختلال عملکرد سیستولیک و دیاستولیک مشخص می شود (EF).<50%), mild="" cardiac="" dilatation.="" in="" the="" third="" stage,="" diastolic="" dysfunction="" and="" arterial="" hypertension="" contribute="" to="" systolic="" dysfunction="" and="" microangiopathy.="" stage="" iv,="" moderate-severe="" systolic="" dysfunction,="" cardiac="" dilatation,="" fibrosis,="" and="" microvascular="" and="" macrovascular="" lesions="" cause="" severe="" and="" irreversible="" changes="" in="" heart="" tissue="" ultimately.26="" myocardial="" cell="" apoptosis,="" necrosis,="" hypertrophy,="" and="" fibrosis="" increase="" leading="" to="" disorders="" of="" diastolic="" and="" systolic="" functioning.6,27="" this="" eventually="" develops="" into="" ischemic="" heart="" disease="" and="" heart="" failure.28="" in="" this="" study,="" blood="" glucose="" and="" serum="" lipid="" levels="" of="" db/db="" mice="" significantly="" increased="" in="" the="" db/db="" group.="" symptoms="" of="" obesity="" were="" also="" observed,="" including="" body="" weight="" changes="" and="" increases="" in="" the="" rate="" of="" hw/tl="" compared="" to="" the="" db/m="" group.="" he="" staining="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" of="" the="" heart="" showed="" obvious="" pathological="" changes="" in="" the="" cardiac="" myocytes="" of="" the="" db/db="" group,="" including="" hypertrophy="" and="" necrosis,="" disordered="" cardiac="" myocytes,="" and="" high="" levels="" of="" extracellular="" matrix="" deposition.="" these="" data="" indicate="" that="" db/db="" mice="" exhibit="" early="" dcm="" under="" long-term="">

ATP منبع اصلی انرژی برای قلب است. انرژی قلبی توسط اکسیداسیون و تجزیه FA، که حدود 70 درصد از انرژی قلب را تشکیل می دهد، تامین می شود. باقیمانده توسط کربوهیدرات هایی مانند گلوکز و اسید لاکتیک تامین می شود.30 قلب های دیابتی در معرض افزایش مصرف انرژی و عدم تعادل در ظرفیت میوکارد، نشان دهنده علت اصلی اختلالات متابولیک میوکارد، از جمله کاهش متابولیسم گلوکز و افزایش متابولیسم FA است. این منجر به افزایش جذب FA و اکسیداسیون می شود که منجر به تجمع چربی و تشکیل مواد چربی سمی می شود که مستقیماً منجر به ضایعات DCM می شود.

نتیجه گیری

در موش‌های db/db مبتلا به میوکارد دیابتی، متابولیسم گلوکز و لیپید تنظیم نمی‌شود که منجر به افزایش سطح استرس اکسیداتیو و آپوپتوز می‌شود. این مطالعه تأیید کرد که ECH می تواند به طور قابل توجهی هیپرگلیسمی طولانی مدت را در موش های db/db از طریق سیگنال دهی PPAR/M-CPT-1/GLUT-4 کاهش دهد. در همین حال، ECH استرس اکسیداتیو را بهبود بخشید و آپوپتوز میوکارد را در موش‌های db/db DCM مهار کرد، که ممکن است به بهبود متابولیسم انرژی مرتبط باشد. در حالی که مکانیسم های اساسی حاکم بر این اثرات کشف نشدند، این یافته ها جهت جدیدی را برای درمان DCM و نقش محافظتی ECH در بهبود آسیب میوکارد ارائه می دهند.

منابع

1. Bauters C، Lamblin N، Mc Fadden EP، Van Belle E، Millaire A، de

Groote P. تأثیر دیابت بر خطر و پیامد نارسایی قلبی. دیابت قلبی عروقی. 2003؛ 1 (8): 1-2. doi:10.1186/{7}}

2. تیت ام، دی جی گریو، ریچی آر.اچ. آیا درمان های هدفمند برای کاردیومیوپاتی دیابتی در افق است؟ Clin Sci. 2017؛ 131 (10): 897-915. doi: 10.1042/CS20160491

3. Khan H، Anker SD، Januzzi JJ، و همکاران. اپیدمیولوژی نارسایی قلبی در بیماران دیابتی بدون بیماری عروق کرونر قلب جی کارت شکست. 2019؛ 25 (2): 78–86. doi:10.1016/j.cardfail.2018.10.015

4. شیلا ک، پاتل ب. پلی مورفیسم ژن CTGF 945-G/C با عوارض قلبی یا کلیوی در افراد مبتلا به دیابت نوع 2 مرتبط نیست. دیابت قلبی عروقی. 2012؛ 1 (11): 42.