اثرات محافظتی عصبی چهار گلیکوزید فنیل اتانوئید بر H2O2-آپوپتوز القا شده روی سلول‌های PC12 از طریق مسیر Nrf2/ARE

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

Maiquan Li 1، Tao Xu 1، Fei Zhou 1، Mengmeng Wang 1، Huaxin Song 1، Xing Xiao و Baiyi Lu 1،*

1. مقدمه

استرس اکسیداتیو، که عدم تعادل هموستاز آنتی اکسیدانی است، باعث پراکسیداسیون لیپیدی، آسیب به پروتئین و DNA، پیری سلولی و مرگ سلولی می شود. این فرآیند احتمالاً به چندین اختلال عصبی مانند بیماری آلزایمر (AD)، بیماری پارکینسون (PD) و ایسکمی/پرفیوژن مجدد کمک می‌کند [1]. پراکسید هیدروژن (H2O2)، که یکی از گونه های اصلی اکسیژن فعال (ROS) است، شناخته شده است که باعث پراکسیداسیون لیپید و آسیب DNA می شود [2]. علاوه بر این، H2O2 یک منبع درون‌زا از رادیکال‌های آزاد هیدروکسیل است که به سطح پس‌زمینه استرس اکسیداتیو سلولی کمک می‌کند [3،4]. بنابراین، استراتژی‌های درمانی برای جلوگیری از آپوپتوز ناشی از استرس اکسیداتیو ممکن است پتانسیل درمان بیماری‌های نورودژنراتیو را داشته باشد.

فاکتور هسته ای اریتروئید 2-مربوط به فاکتور 2 (Nrf2)، یک عامل رونویسی است که به شدت با استرس اکسیداتیو مرتبط است. فعال سازی Nrf2 باعث رونویسی ژن های آنتی اکسیدانی و سم زدایی متعددی می شود، از جمله هم اکسیژناز{4}} (HO{5}})، NAD(P)H کینون اکسیدوردوکتاز 1، ضد التهاب [13] و تعدیل کننده ایمنی [14] ] فعالیت های زیستی عثمانتوسفرگرانس یک ماده معمولی در چندین غذای آسیایی است و مدت‌هاست که مصرف می‌شده است. ما قبلا نشان دادیم که عصاره گل O.fragrans یادگیری و حافظه فضایی را افزایش می‌دهد، آسیب اکسیداتیو را مهار می‌کند و فعالیت‌های محافظت عصبی را در پیری ناشی از دی گالاکتوز در مدل موش ICR نشان می‌دهد [15]. سالیدروسید، اکتئوزید و ایزواکتئوزید پاسخ اصلی PhGs برای فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره گل O.fragrans هستند [16].

مطالعات روی اثر محافظتی عصبی PhGs نتایج مطلوبی به دست آورده است. سالیدروساید به طور قابل توجهی آپوپتوز سلولی سلول های PC12 را که در MPP پلاس قرار گرفته بودند کاهش داد [17،18]. Acteoside همچنین آپوپتوز ناشی از MPP و استرس اکسیداتیو را در سلول‌های PC12 کاهش داد [19] و آسیب سلولی SH-SY5Y ناشی از A p{6} [20]. اکیناکوزید بر روی آپوپتوز ناشی از فاکتور نکروز تومور-a (TNFa) در سلول‌های SH-SY5Y [21]، سمیت دوپامینرژیک ناشی از MPTP در موش [22]، کشت‌های اولیه آسیب دیده با گلوتامات سلول‌های قشر موش [23] و {19}}آسیب ناشی از OHDA در سلول‌های PC12 [24]. نتایج نشان داد که PhG ها یک اثر محافظت کننده سلولی از خود نشان می دهند و عوامل بالقوه ای برای درمان بیماری های نورودژنراتیو هستند. مطالعات نشان داده اند که خواص آنتی اکسیدانی PhG ها زمینه ساز بسیاری از فعالیت های زیستی دیگر برای این ترکیبات است [25]. با این حال، مطالعات کمی مکانیسم مولکولی PhGs در برابر سمیت اکسیداتیو را بررسی کرده اند.

در مطالعه خود، ما چهار PhG معمولی را به شرح زیر انتخاب کردیم: سالیدروسید (مونوساکاریدهای فنیل اتانوئید)، آکتئوزید (دی ساکاریدهای فنیل اتانوئید)، ایزواکتئوزید (دی ساکاریدهای فنیل اتانوئیدی)، و اکیناکوزید (تری ساکاریدهای فنیل اتانوئید). ما مدلی از مرگ عصبی را با استفاده از سلول‌های PC12 تمایز یافته [26] برای بررسی اثر محافظتی و مکانیسم مولکولی PhGs بر روی مدل سلولی PC12 القایی H2O{3}}به کار بردیم. ما نشان دادیم که PhGs مسیر Nrf2/ARE را با اتصال به پروتئین کلچ مرتبط با ECH 1 (Keap1) فعال می‌کند. این فرآیند باعث افزایش آنزیم های آنتی اکسیدانی و افزایش مقاومت سلول های PC12 در برابر استرس اکسیداتیو شد.

درمان اختلالات نورودژنراتیو:PhG از سیستانچ

2. نتایج

2.1. PhG ها H2O را سرکوب کردند{3}}سمیت سلولی القا شده در سلول های PC12

اثرات سیتوتوکسیک H2O2 و PhGs (0.1،1،5، و 1{21}} 卩g/mL) روی سلول‌های PC12 مورد آزمایش قرار گرفت. نتایج نشان داد که H2O2 باعث از دست دادن زنده ماندن سلول PC12 به روش‌های وابسته به غلظت و زمان می‌شود (شکل 1A). قرار گرفتن سلول‌های PC12 با 2{43}}{45}} H2O2 به مدت 2 ساعت منجر به زنده‌مانی سلولی 57.4 درصد شد. پیش تیمار سلول‌ها با PhGs در 0.1،1، 5 و 10 میکرولیتر بر میلی‌لیتر هیچ تأثیری بر زنده‌مانی سلولی نداشت (شکل 1B) و به طور قابل‌توجهی از سلول‌های PC12 در برابر آسیب ناشی از H2O محافظت می‌کرد. زنده ماندن سلولی به ترتیب 9.549-22.141 درصد، 12.{34}}.289 درصد، 1.{37}}.289 درصد و 3.{40}}.441 درصد، شکل 1C). با این حال، پیش تیمار سالیدروسید (0.1 ^g/mL)، ایزواکتئوزید (0.1، 1، 5، و 10^g/mL)، اکیناکوزید (0.1،1، و 5^g/mL) بر روی سلول های القا شده با HzOz تفاوت معنی داری نشان ندادند. صدمه. پیش تیمار سلول ها با PhG ها همچنین ویژگی مورفولوژیکی ناشی از H2O2 را بهبود بخشید (شکل 1D).

شکل 1.PhG ها سمیت سلولی ناشی از H2O2- را در سلول های PC12 سرکوب کردند. زنده ماندن سلول با روش MTT شناسایی شد. اثر سیتوتوکسیک H2O2 (A) و PhGs (B) در غلظت‌های مختلف بر روی سلول‌های PC12. P سلول‌های PC12 با PhGs (0.1 و 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) به مدت 24 ساعت انکوبه شدند و سپس با 200 pM H2O2 برای 2 ساعت دیگر انکوبه شدند. ساعت پس از حذف PhG ها. (د) مشاهدات مورفولوژیکی. سلول ها پس از درمان با میکروسکوپ فاز-کنتراست (x100)، CK: گروه نرمال، H2O2: گروه تحت درمان با H2O2، HL: گروه تحت درمان با دوز کم سالیدروساید، HH: گروه تحت درمان با دوز بالا سالیدروساید، ML: گروه تحت درمان با دوز کم اکتئوزید مشاهده شدند. MH: گروه تحت درمان با دوز بالا اکتئوزید، IL: گروه تحت درمان با دوز کم ایزواکتئوزید، IH: گروه تحت درمان با دوز بالا ایزواکتئوزید، SL: گروه تحت درمان با دوز پایین اکیناکوزید، SH: گروه تحت درمان با دوز بالا اکیناکوزید. ** p <0.01 در="" مقابل="" گروه="" درمان="" نشده.="" #="" p=""><0.05، در="" مقابل="" گروه="" تحت="" درمان="" با="" h2o2.="" ##="" p=""><0.01، در="" مقابل="" گروه="" تحت="" درمان="" با="">

2.2. PhGs H2O را سرکوب کرد{3}}تجمع درون سلولی ناشی از ROS، پراکسیداسیون لیپیدی (MDA) و افزایش فعالیت‌های سوپراکسید دیسموتاز (SOD) در سلول‌های PC12

قرار گرفتن سلول های PC12 با 2{6}}0 pM H2O2 به مدت 2 ساعت باعث افزایش سطح ROS، محتوای MDA و کاهش فعالیت SOD شد (شکل 2). پیش تیمار PhGs سطح ROS، سالیدروسید و اکتئوزید را کاهش داد و دوز بالای ایزواکتئوزید و پیش تیمار اکیناکوزید به طور قابل توجهی سطح ROS را کاهش داد (01/0p <). پیش="" تیمار="" سالیدروساید="" تأثیری="" بر="" محتوای="" mda="" نشان="" نداد،="" اما="" پیش="" تیمار="" آکتئوزید="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" محتوای="" mda="" را="" کاهش="" داد="" (05/0=""> P). پیش تیمار ایزواکتئوزید و اکیناکوزید به طور قابل توجهی محتوای MDA را به میزان بیشتری کاهش داد.

شکل 2.PhG ها تجمع ROS و MDA را مسدود کردند و فعالیت SOD را در سلول های PC12 افزایش دادند. سلول‌های PC12 با PhGs (0.1 و 10 4 گرم در میلی‌لیتر) به مدت 24 ساعت انکوبه شدند و سپس با 200 |^M H2O2 برای دیگری انکوبه شدند. 2 ساعت پس از حذف PhGs. (الف) PhG ها تجمع ROS و MDA را مسدود کردند. (ب) PhG ها تجمع MDA را مسدود می کنند. (C) PhGs فعالیت SOD را افزایش داد. CK: گروه نرمال، مدل: گروه تحت درمان با H2O2، سالیدروساید: گروه تحت درمان با سالیدروسید، آکتئوزید: گروه تحت درمان با آکتئوزید، ایزواکتئوزید: گروه تحت درمان با ایزواکتئوزید، اکیناکوزید: گروه تحت درمان با اکیناکوزید. ** p < 0.01="" در="" مقابل="" گروه="" درمان="" نشده.="" #="" p=""><0.05، در="" مقابل="" گروه="" تحت="" درمان="" با="" h2o2،="" ##="" p=""><0.01، در="" مقابل="" گروه="" تحت="" درمان="" با="">

2.3. PhGs H2O را معکوس کرد2-آپوپتوز القا شده در سلولهای PC12

تیمار H2O2 (200 |1M) به مدت 2 ساعت به طور قابل توجهی آپوپتوز را در سلول‌های PC12 با نرخ آپوپتوز کلی تا 16.02 درصد افزایش داد (شکل 3). با این حال، پیش تیمار با PhGs (0.1 و 10 میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 24 ساعت، میزان آپوپتوز را به صورت وابسته به غلظت کاهش داد (01/0p <). سالیدروسید،="" آکتئوزید،="" ایزواکتئوزید="" و="" اکیناکوزید="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" درصد="" آپوپتوز="" سلولی="" را="" 4="" کاهش="" دادند.="" 1.530-7.510="" درصد،="" به="">

شکل 3. PhG ها آپوپتوز ناشی از H2O{1}} را در سلول های PC12 معکوس کردند. سلول‌های PC12 با PhGs (0.1 و 1{14}} 卩g/mL) به مدت 24 ساعت انکوبه شدند و سپس با 200 pM H2O2 به مدت 2 ساعت دیگر انکوبه شدند. PhG ها حذف شدند. سپس آپوپتوز توسط فلوسیتومتری با استفاده از پروب فلورسنت PI/FITC اندازه گیری شد. CK: گروه نرمال، مدل: گروه تحت درمان با H2O2، سالیدروساید: گروه تحت درمان با سالیدروسید، آکتئوزید: گروه تحت درمان با آکتئوزید، ایزواکتئوزید: گروه تحت درمان با ایزواکتئوزید، اکیناکوزید: گروه تحت درمان با اکیناکوزید. ** p <0.01 در="" مقابل="" گروه="" درمان="" نشده.="" ##="" p=""><0.01، در="" مقابل="" گروه="" تحت="" درمان="" با="">

2.4. PhGs H2O را معکوس کرد2-کاهش بیان پروتئین ناشی از HO-1، NQO1، GCLC و GCLM

HO{{0}}، NQO1 و گلوتامات سیستئین لیگاز (GCL) آنزیم های آنتی اکسیدانی سلولی مهم هستند و HO{3}}، NQO1 و زیر واحدهای کاتالیزوری یا اصلاح کننده GCL (GCLC یا GCLM) هستند. Nrf{5}}ژن های پایین دست را تنظیم می کند [27]. بیان پروتئین HO{7}}، NQO1، GCLC و GCLM پس از درمان مشاهده شد. تفاوت آشکاری بین بیان پروتئین HO{9}} و NQO1 با یا بدون H2O2 (شکل 6A-C) مشاهده شد (p < 0.01).="" phgs="" (0.1="" و="" 10="" p^g/ml)="" کاهش="" تنظیم="" بیان="" پروتئین="" ناشی="" از="" h2o2-="" را="" معکوس="" کردند="" (به="" جز="" سالیدروسید="" در="" {{32}="" }.1="" pg/ml)،="" nqo1="" (به="" جز="" اکتئوزید="" در="" 0.1="" pg/ml)="" (p="">< {{4{42}}}}.01).="" h2o2="" همچنین="" بیان="" پروتئین="" gclc="" و="" gclm="" را="" کاهش="" داد="" (p="">< 0.05)="" (شکل="" 6a,d,e).="" phgs="" (0.1="" و="" 1{{0="" pg/ml)="" کاهش="" h2o{39}}القای="" کاهش="" بیان="" پروتئین="" gclc="" (به="" جز="" اکیناکوزید="" در="" pg/ml="" 0.1)="" (p=""><0.01) و="" gclm="" را="" معکوس="" کرد.="" (به="" جز="" سالیدروسید="" در="" 0.1="" pg/ml)="" (p=""><0.01). سپس،="" از="" مهارکننده‌های="" شیمیایی="" ho="" برای="" ارزیابی="" بیشتر="" نقش="" آنزیم‌های="" آنتی‌اکسیدان="" در="" تنظیم="" حفاظت="" از="" phgs="" در="" برابر="" سمیت="" سلولی="" ناشی="" از="" h2o="" استفاده="" شد.="" phgs="" (0.1="" و="" 10="" pg/ml)="" از="" سمیت="" سلولی="" ناشی="" از="" h2o="" جلوگیری="" کرد،="" اما="" چنین="" اثر="" محافظتی="" توسط="" مهارکننده="" ho{56}}="" znpp="" (0.01="">< p)="" در="" 20="" pm="" معکوس="" شد="" (شکل="" 6f،="" p=""><0.01)>

2.5. بیان Keap1 و تجزیه و تحلیل اتصال مولکولی

تحت شرایط فیزیولوژیکی، Keap1 با اتصال به دامنه Neh2 Nrf2 و هدف قرار دادن Nrf2 به لیگاز یوبیکوئیتین E3 مبتنی بر Cul برای یوبی کوئیتیناسیون و تخریب بعدی توسط پروتئازوم 26S به عنوان یک پروتئین سرکوبگر Nrf2 عمل می کند [28]. ظرفیت اتصال به Keap1 PhGs با تجزیه و تحلیل اتصال مولکولی برای بررسی مکانیسم تحت اثر آنتی اکسیدانی آنها ارزیابی شد.

اثر آنتی اکسیدانی: سیستانچPhGs

3. بحث

ما محافظت عصبی PhGها را در سمیت سلولی ناشی از H2O2 در سلول‌های PC12 بررسی کردیم. نتایج نشان می دهد که پیش تیمار PhGs به طور قابل توجهی سمیت سلولی ناشی از HzOz را سرکوب کرد، سطح ROS داخل سلولی را کاهش داد، سطح آنزیم های آنتی اکسیدانی داخل سلولی را بهبود بخشید و در نهایت سمیت سلولی ناشی از H2O{6}} را در سلول های PC12 معکوس کرد. علاوه بر این، PhGs فعال‌سازی رونویسی Nrf2 را افزایش داد، کاهش بیان پروتئین HO{10}}، NQO1، GCLC و GCLM ناشی از HzOz را معکوس کرد. علاوه بر این، PhGs تعامل بالقوه با محل اتصال Nrf2 در پروتئین Keap1 نشان داد.

در آسیب سلولی PC12 ناشی از H2O، پراکسیداسیون لیپیدی، که به تخریب اکسیداتیو لیپید اشاره دارد، نفوذپذیری غشاها را افزایش داد و منجر به آسیب سلولی شد [29]. تشکیل MDA به طور گسترده ای به عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدی استفاده می شود [30]. H2O2 تولید ROS را افزایش داد و آنزیم های دفاعی آنتی اکسیدانی مانند SOD، کاتالاز و GPx را از بین برد. این فرآیند منجر به استرس اکسیداتیو [31] می شود که نقش کلیدی در ایجاد و پیشرفت اکثر اختلالات عصبی دارد. مطابق با مطالعات قبلی، ما افزایش سطح ROS، کاهش آنزیم های آنتی اکسیدانی داخل سلولی و افزایش آپوپتوز سلول های PC12 را پس از درمان H2O2 مشاهده کردیم. پیش تیمار PhGs به طور قابل توجهی افزایش ناشی از HzOz در ROS داخل سلولی را کاهش داد، آنزیم های آنتی اکسیدانی داخل سلولی را بهبود بخشید و در نهایت سمیت سلولی ناشی از HzOz را در سلول های PC12 معکوس کرد.

کوانگ و همکاران [32] گزارش کردند که اکیناکوزید یک اثر محافظتی عصبی قابل توجهی بر سمیت سلولی ناشی از H2O{2} در سلول‌های PC12 از طریق مسیر آپوپتوز میتوکندری نشان داد. در این مطالعه، ما دریافتیم که اکیناکوزید، سالیدروسید، اکتئوزید و ایزواکتئوزید با افزایش فعالیت آنتی اکسیدانی سلول‌های PC12 اثرات محافظتی عصبی از خود نشان دادند، زیرا فعال‌سازی رونویسی Nrf2 را افزایش دادند و بیان پروتئین پایین‌دستی HO{6}، NQO1 را افزایش دادند. GCLC و GCLM. مطالعات متعدد به وضوح نشان داده‌اند که فعال‌سازی ژن‌های هدف Nrf2، به‌ویژه HO{9}} در آستروسیت‌ها و نورون‌ها به شدت در برابر التهاب، آسیب اکسیداتیو و مرگ سلولی محافظت می‌کند. گزارش شده است که سیستم HO{10}} در سیستم عصبی مرکزی بسیار فعال است و مدولاسیون آن ظاهراً نقش مهمی در پاتوژنز اختلالات عصبی دارد [33]. مطالعات اخیر همچنین نقش Nrf2 را در پیشرفت و خطر PD [9] و Keap1 به عنوان یک هدف کارآمد برای فعال سازی مجدد Nrf2 در AD [34] روشن کرده است. نتایج شواهد جدیدی را برای Nrf2 به عنوان یک هدف درمانی در بیماری‌های نورودژنراتیو تایید می‌کند.

تجزیه و تحلیل اتصال مولکولی نشان داد که PhG ها می توانند به Keap1 با ظرفیت های اتصال زیر متصل شوند: echinacoside > isoacteoside > acteoside > salidroside. مطابق با این نتایج، پیش تیمار PhGs منجر به جابجایی هسته ای Nrf2، با بیان Nrf2 زیر در هسته شد: echinacoside > isoacteoside * acteoside > salidroside. ما فرض کردیم که تعداد گلیکوزیدها بر حالت اتصال احتمالی PhGs و Keap1 تأثیر می‌گذارد و حالت اتصال بیشتر باعث آزاد شدن Nrf2 از Keap1 می‌شود. این فرآیند منجر به فعال شدن Nrf2 و ژن های پایین دست شد و در نهایت از سلول های PC12 در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از H2O{9} محافظت می کند.

اثرات محافظتی عصبی سیستانچPhGs

4. مواد و روش ها

4.1. ترکیبات شیمیایی و معرف ها

سالیدروسید (شماره CAS {{0}})، اکتئوزید (شماره CAS 61276-17-3)، ایزواکتئوزید (شماره CAS 61303-13-7) و اکیناکوزید (شماره CAS {{3}) }) از شرکت بیوتکنولوژی YYuanye (شانگهای، چین) خریداری شد. PhGs در PBS حل شد تا محلول ذخیره 10 میلی گرم در میلی لیتر تولید شود که در درجه {5}} ذخیره شد. H2O2 از علاءالدین® (شانگهای، چین) خریداری شد. سرم RPMI متوسط ​​و جنین گاوی از Hyclone (Logan، UT، ایالات متحده آمریکا) و 0.5 درصد تریپسین EDTA، پنی سیلین و استرپتومایسین از Keyi (Hangzhou، چین) خریداری شد. کیت های تشخیصی MDA، SOD، MTT و DCFH-DA از موسسه بیوتکنولوژی Beyotime (نانجینگ، جیانگ سو، چین) خریداری شدند. کیت رنگ آمیزی دوگانه Annexin V-FITC/PI از Solarbio Life Sciences (پکن، چین) خریداری شد. آنتی بادی های Nrf2، هیستون H3، Keap1، HO{16}}، NQO1، GCLC، GCLM و p-اکتین، ضد پراکسید ترب کوهی موش (HRP) IgG، و ضد خرگوش-HRP-IgG از Abcam خریداری شد. (لندن، انگلستان). مهارکننده های HO-1 و ZnPP از شرکت شیمیایی سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. RNAiso Plus، کیت معرف PrimeScript™RT با پاک کن gDNA، و SYBR® Premix Ex Taq™ II از تاکارا (شیگا، ژاپن) خریداری شد. Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent از Thermo Fisher Scientific (Waltham, UK) خریداری شد. توالی siRNA Nrf2 به شرح زیر بود: جلو، CCGAAUUACAGUGUCUUAA. و معکوس، UUAAGACACUGUAAUUCGG. در همین حال، توالی siRNA کنترل به شرح زیر بود: جلو، UUCUCCGAACGUGUCACGU. و معکوس، ACGUGACACGUUCGGAGAA.

4.2. کشت سلولی

خط فئوکروموسیتومای آدرنال موش (سلولهای PC12) از موسسه بیوشیمی و زیست شناسی سلولی، SIBS، (CAS، شانگهای، چین) به دست آمد. سلول ها در RPMI{1}} (Hyclone) حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (Hyclone)، 100 U/mL پنی سیلین و 0.1 میلی گرم در میلی لیتر استرپتومایسین در دمای 37 درجه با 5 درصد CO2 نگهداری شدند. یک روز در میان رسانه عوض می شد.

4.3. سنجش زنده ماندن سلولی

سلول‌های PC12 در صفحات چاهک با ابعاد 2×104 سلول در چاهک کاشته شدند. پس از اتصال، سلول ها با یا بدون بازدارنده به مدت 20 دقیقه پیش انکوبه شدند، با یا بدون PhGs به مدت 24 ساعت انکوبه شدند و سپس با H2O2 برای 2 ساعت دیگر پس از حذف PhG ها انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، سلول ها با mg/ml 5 MTT به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه تیمار شدند و محیط ها با دقت خارج شدند. بلورهای فورمازان که توسط سلول‌های زنده‌مانده تشکیل شده بودند در 150 rL DMSO حل شدند تا رنگ آبی تولید کنند [35] و جذب در 570 نانومتر روی صفحه‌خوان اندازه‌گیری شد. گروه شاهد از همان غلظت محیط با DMSO به تنهایی استفاده کردند. زنده ماندن سلولی به عنوان درصد کنترل نرمال شد.

غلظت PhGs ({0}}.1،1،5، و 10 Rg/mL) بسته به تجزیه و تحلیل سمیت سلولی PhGs و اثر محافظت سلولی گزارش شده اکیناکوزید انتخاب شد [32]. بر اساس این گزارش، هیچ اثر سمیت سلولی کمتر از Rg/mL 10 نشان داده نشده است، و گزارش شده است که اکیناکوزید اثر محافظتی سلولی را در مدل سلولی آسیب دیده با HzOz نشان می دهد.

4.4. سنجش آپوپتوز

آپوپتوز با کیت رنگ آمیزی دوگانه Annexin V-FITC/PI (Solarbio) تشخیص داده شد. سلول‌های PC12 در 6-صفحه‌های چاهک در ابعاد 2×1{5}}5 سلول در چاه کاشته شدند. پس از اتصال، سلول ها با PhGs (0.1 و Rg/mL 10) به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و پس از حذف PhG ها به مدت 2 ساعت دیگر با H2O2 انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، سلول ها در PBS سرد شسته شدند، دو بار با سرعت 1500 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند و در 500 rL بافر اتصال مجدد معلق شدند. Annexin V (5 rL) و پروپیدیوم یدید دارای برچسب FITC.

اختصارات

زیرواحد کاتالیزوری گلوتامات-سیستئین لیگاز-GCLC

GCLM گلوتامات-سیستئین لیگاز-زیر واحد اصلاح کننده کاتالیزوری

پراکسید هیدروژن H2O2

HO{0}} هم اکسیژناز 1

پروتئین ارتباطی Keap1 Kelch ECH 1

NQO1 NAD(P)H کینون اکسیدوردوکتاز 1

فاکتور هسته ای Nrf2 اریتروئید 2-مربوط به فاکتور 2

سالیدروسید، آکتئوزید، ایزواکتئوزید و اکیناکوزید PhGs

گونه های اکسیژن فعال ROS

پروتوپورفیرین روی ZnPP

عصاره Cistanche deserticola: PHG سیستانچ

منابع

1. Sun, AY; چن، YM استرس اکسیداتیو و اختلالات عصبی. جی. بیومد. علمی 1998، 5، 401-414. [CrossRef] [PubMed]

2. ماهشواری، ع. میکرو، MM؛ آگاروال، ا. شارما، RK; Nandan، D. مسیرهای درگیر در آپوپتوز سلول زایای بیضه ناشی از H2O2 در شرایط آزمایشگاهی. FEBS J. 2009,276, 870-881. [CrossRef] [PubMed]

3. هالیول، ب. گونه های فعال اکسیژن و سیستم عصبی مرکزی. جی. نوروشیم. 1992، 59، 1609-1623. [CrossRef] [PubMed]

4. ریچاردسون، جی اس. Subbarao، KV; Ang، LC در مورد نقش احتمالی پراکسیداسیون رادیکال آزاد ناشی از آهن در دژنراسیون عصبی در بیماری آلزایمر. ان آکادمی نیویورک علمی 1992، 648، 326-327. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhang، DD مطالعات مکانیکی مسیر سیگنالینگ Nrf2-Keap1. دارو متاب. Rev. 2006, 38, 769-789. [CrossRef] [PubMed]

6. ایتو، ک. تانگ، KI; یاماموتو، M. مکانیسم مولکولی فعال کننده Nrf2-مسیر Keap1 در تنظیم پاسخ تطبیقی ​​به الکتروفیل ها. رادیک آزاد. Biol. پزشکی 2004، 36، 1208-1213. [CrossRef] [PubMed]

7. Kong، AN; اووور، ای. یو، آر. هبار، وی. چن، سی. هو، آر. Mandlekar، S. القای آنزیم های بیگانه بیگانه توسط مسیر نقشه کیناز و عنصر پاسخ آنتی اکسیدانی یا الکتروفیل (ARE/EpRE). دارو متاب. Rev. 2001, 33, 255-271. [CrossRef] [PubMed]

8. بوئندیا، آی. میچالسکا، پی. ناوارو، ای. گامیرو، آی. اژه، ج. Leon, R. Nrf2-مسیر ARE: یک هدف نوظهور در برابر استرس اکسیداتیو و التهاب عصبی در بیماری‌های نورودژنراتیو. داروسازی آنجا 2016، 157، 84-104. [CrossRef] [PubMed]

9. اسکیبینسکی، جی. هوانگ، وی. آندو، دی.م. داوب، ا. لی، AK; راویسانکار، ا. مودان، س. Finucane، MM; Shabby، BA; Finkbeiner, S. Nrf2 با تعدیل پروتئوستاز، LRRK2- و تخریب عصبی ناشی از a-synuclein را کاهش می‌دهد. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 2016, 114, 1165-1170. [CrossRef] [PubMed]

10. خیمنز، سی. Riguera، R. گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید در گیاهان: ساختار و فعالیت بیولوژیکی. نات. تولید Rep. 1994, 11, 591-606. [CrossRef] [PubMed]

11. گئورگیف، م. علیپیوا، ک. اورهان، من. آبراشف، ر. دنف، پ. Angelova, M. فعالیت های مهاری آنتی اکسیدانی و کولین استراز Verbascum xanthophoeniceum Griseb. و گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی آن. مواد شیمیایی مواد غذایی 2011، 128، 100-105. [CrossRef] [PubMed]

12. لی، ن. وانگ، جی. ما، جی. گو، ز. جیانگ، سی. یو، ال. فو، X. اثرات محافظت عصبی ازCistanches Herbaدرمان بیماران مبتلا به آلزایمر متوسط. مکمل مبتنی بر Evid. جایگزین. پزشکی 2015, 2015,103985. [CrossRef] [PubMed]

13. لیو، ی.ال. او، WJ; مو، ال. شی، MF; زو، YY; پان، اس. لی، XR؛ Xu، QM; Yang, SL فعالیت های ضد میکروبی، ضد التهابی و سم شناسی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از Monochasma savatieri Franch. ماکسیم سابق J. Ethnopharmacol. 2013,149، 431-437. [CrossRef] [PubMed]

14. دونگ، کیو. یائو، جی. Fang, JN; Ding, K. خصوصیات ساختاری و فعالیت ایمونولوژیکی دو پلی ساکارید قابل استخراج در آب سرد ازCistanche deserticola YC Ma. کربوهیدرات. Res. 2007، 342، 1343-1349. [CrossRef] [PubMed]

15. Xiong، L. مائو، اس. لو، بی. یانگ، جی. ژو، اف. هو، ی. جیانگ، ی. شن، سی. Zhao، Y. Osmanthusfragrans عصاره گل و اکتئوزید محافظت در برابر پیری ناشی از دی گالاکتوز در مدل موش ICR. جی. مد. Food 2016, 19, 54-61. [CrossRef] [PubMed]

16. جیانگ، ی. مائو، اس. هوانگ، دبلیو. لو، بی. کای، ز. ژو، اف. لی، ام. لو، تی. Zhao، Y. Phenylethanoid Glycoside Profiles and Antioxidant Activity of Osmanthusfragrans Lour. گل توسط UPLC/PDA/MS و مدل هضم شبیه سازی شده. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2016، 64، 2459-2466. [CrossRef] [PubMed]

17. لی، ایکس. بله، X. لی، ایکس. سان، ایکس. لیانگ، کیو. تائو، ال. کانگ، ایکس. Chen, J. Salidroside با مهار مسیر NO از آپوپتوز ناشی از MPP پلاس در سلولهای PC12 محافظت می کند. Brain Res. 2011،1382، 9-18. [CrossRef] [PubMed]

18. ژانگ، ال. دینگ، دبلیو. سان، اچ. ژو، Q. هوانگ، جی. لی، ایکس. زی، ی. Chen, J. Salidroside از سلول‌های PC12 در برابر آپوپتوز ناشی از MPP پلاس از طریق فعال‌سازی مسیر PI3K/Akt محافظت می‌کند. مواد شیمیایی مواد غذایی سموم 2012، 50، 2591-2597. [CrossRef] [PubMed]

19. شنگ، جی کیو; ژانگ، جی آر؛ Pu، XP؛ ما، جی. Li, CL اثر محافظتی ورباسکوزید بر سمیت عصبی ناشی از یونهای فنیل پیریدینیم 1-متیل-4- در سلولهای PC12. یورو J. Pharmacol. 2002، 451، 119-124. [CrossRef]

20. وانگ، اچ. خو، ی. یان، جی. ژائو، ایکس. سان، ایکس. ژانگ، ی. گوا، جی. Zhu, C. Acteoside از سلول های نوروبلاستوم انسانی SH-SY5Y در برابر آسیب سلولی ناشی از بتا آمیلوئید محافظت می کند. Brain Res. 2009، 1283، 139-147. [CrossRef] [PubMed]

21. Min، D. جین، YZ; یونگ، جی. ژنگ، BL; یائو، HW Echinacoside سلول های عصبی SHSY5Y را از آپوپتوز ناشی از TNFa نجات می دهد. چانه. داروسازی گاو نر 2005، 505، 11-18.

22. ژائو، کیو. گائو، جی پی؛ لی، دبلیو دبلیو; Cai، DF نوروتروفیک و اثرات نجات عصبی اکیناکوزید در مدل موش MPTP تحت حاد بیماری پارکینسون. Brain Res. 2010،1346، 224-236. [CrossRef] [PubMed]

23. Koo, KA; سونگ، SH; پارک، جی اچ. کیم، SH; لی، کی. Kim, YC فعالیت‌های محافظ عصبی در شرایط آزمایشگاهی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از کالیکارپا دیکوتوما. Planta Med. 2005، 71، 778-780. [CrossRef] [PubMed]

24. لیو، YG; لی، ایکس. شیونگ، سی. یو، بی. Pu، X. بله، مشتقات گلیکوزید فنیل اتانوئید مصنوعی XS به عنوان عوامل بالقوه محافظت کننده عصبی. یورو جی. مد. شیمی. 2015، 95، 313-323. [CrossRef] [PubMed]

25. فو، جی. پانگ، اچ. وونگ، YH گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی طبیعی: سرنخ های بالقوه برای درمان های جدید. Curr. پزشکی شیمی. 2008، 15، 2592-2613. [CrossRef] [PubMed]

26. گرین، لس آنجلس; Tischler، AS ایجاد یک خط کلونال نورآدرنرژیک از سلول های فئوکروموسیتوم آدرنال موش صحرایی که به فاکتور رشد عصبی پاسخ می دهند. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 1976, 73, 2424-2428. [CrossRef] [PubMed]

27. لیانگ، QN; شنگ، YC; جیانگ، پی. جی، LL; Xia، YY; حداقل، ی. Wang, ZT تفاوت سیستم آنتی اکسیدانی گلوتاتیون در کبد موش های تازه از شیر گرفته و جوان و دخالت آن در سمیت کبدی ناشی از ایزولین. قوس. سموم 2011، 85، 1267-1279. [CrossRef] [PubMed]

28. کوبایاشی، ع. کانگ، م. اوکاوا، اچ. اوتسوجی، م. Zenke، Y; چیبا، تی. ایگاراشی، ک. یاماموتو، M. سنسور استرس اکسیداتیو Keap1 به عنوان یک آداپتور برای Cul3-بر اساس E3 Ligase برای تنظیم تخریب پروتئازومی Nrf2 عمل می‌کند. مول. سلول. Biol. 2004،24، 7130-7139. [CrossRef] [PubMed]

29. کورنلیوس، سی. کروپی، آر. Calabrese، V; گرازیانو، آ. میلون، پی. پنیسی، جی. رادک، ز. Calabrese، EJ; Cuzzocrea، S. آسیب مغزی تروماتیک: استرس اکسیداتیو و محافظت عصبی. آنتی اکسیدان سیگنال ردوکس 2013، 19، 836-853. [CrossRef] [PubMed]

30. هو، ز. لو، دبلیو. سان، ایکس. هائو، اس. ژانگ، ی. خو، اف. وانگ، ز. Liu, B. سالین غنی از هیدروژن از آسیب اکسیداتیو و نقایص شناختی پس از آسیب خفیف مغزی محافظت می کند. Brain Res. گاو نر 2012، 88، 560-565. [CrossRef] [PubMed]

31. انصاری، م. رابرتز، KN; Scheff، SW دوره زمانی استرس اکسیداتیو ناشی از کوفتگی و پروتئین‌های سیناپسی در قشر در یک مدل موش TBI. J. Neurotrauma 2008, 25, 513-526. [CrossRef] [PubMed]

32. کوانگ، آر. سان، ی. یوان، دبلیو. لی، ال. ژنگ، X. اثرات حفاظتی اکیناکوزید، یکی از گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید، بر سمیت سلولی ناشی از H2O2- در سلول‌های PC12. Planta Med. 2009، 75، 1499-1504. [CrossRef] [PubMed]

33. اسکاپاگنینی، جی. واستو، اس. آبراهام، NG; کاروسو، سی. زلا، دی. فابیو، جی. تعدیل مسیر Nrf2/ARE توسط پلی فنول های غذایی: یک استراتژی محافظت کننده عصبی تغذیه برای اختلالات شناختی و عصبی. مول. نوروبیول. 2011، 44، 192-201. [CrossRef] [PubMed]

34. کر، ف. سوفولادساکین، او. ایوانوف، دی. گاتلیف، جی. گومز، پی بی. برتراند، HC; مارتینز، پی. کالارد، آر. اسنورن، آی. Cochem، HM Direct Keap{1}}اختلال Nrf2 به عنوان یک هدف درمانی بالقوه برای بیماری آلزایمر. PLoS Genet. 2017, 13, e1006593. [CrossRef] [PubMed]

35. Hansen, MB; نیلسن، SE; برگ، ک. بررسی مجدد و توسعه بیشتر یک روش رنگرزی دقیق و سریع برای اندازه گیری رشد سلولی/کشتن سلولی. J. Immunol. Methods 1989, 119, 203-210. [CrossRef]

36. مطبوعات، ج. غربالگری مجازی در کشف مواد مخدر. Crc Press: Boca Raton، FL، USA، 2005.

37. Muege, I.; مارتین، YC; Hajduk، PJ; Fesik، SW ارزیابی امتیازدهی PMF در اتصال لیگاندهای ضعیف به پروتئین اتصال FK506. جی. مد. شیمی. 1999، 42، 2498-2503. [CrossRef] [PubMed]

38. کونتز، شناسه; بلنی، جی.ام. Oatley، SJ; لنگریج، آر. فرین، TE یک رویکرد هندسی به برهمکنش‌های ماکرومولکول-لیگاند. جی. مول. Biol. 1982،161، 269-288. [CrossRef]

39. MD، E. موری، CW; اتون، TR; پائولینی، جی وی. Mee، RP توابع امتیازدهی تجربی: I. توسعه یک تابع امتیازدهی تجربی سریع برای تخمین میل اتصال لیگاندها در مجتمع‌های گیرنده. J. Comput.-Aided Mol. دس 1997،11،425-445.

© 2018 توسط نویسندگان. دارنده مجوز MDPI، بازل، سوئیس. این مقاله یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت شرایط و ضوابط مجوز Creative Commons Attribution (CC BY) (http:ZZcreativecommons.org/licenses/byZ4.0Z) توزیع شده است.