اثرات مفید فراکسیون گلیکوزید فنیل اتانوئید کل جدا شده از گیاه سیستانش دسرتیکولا بر ریزساختار استخوان در موش های صحرایی تخمدان برداشته شده

1. معرفی

پوکی استخوان پس از یائسگی، که در آن از هر 3 زن بالای 50 سال، 1 نفر از آن رنج می برد، در حال تبدیل شدن به یک خطر اصلی سلامتی است که بیش از 200 میلیون زن را در سراسر جهان تحت تاثیر قرار می دهد [1]. در یائسگی، کاهش شدید سطح استروژن معمولاً منجر به تحلیل استخوان بیش از حد ناشی از افزایش استئوکلاستوژنز می شود. سپس، تعادل بین تشکیل استخوان ناشی از استئوبلاست و تحلیل استخوان ناشی از استئوکلاست مختل می شود و تسریع می شود.تحلیل استخواندر نهایت باعث پوکی استخوان و حتی شکستگی لگن یا ستون فقرات شد [2]. اعتقاد بر این بود که تمایز استئوکلاست زمانی آغاز می شود که فعال کننده گیرنده فاکتور هسته ای کاپا B (RANK) به RANKL، لیگاند RANK متصل شود. با این حال، ترکیب RANK به RANKL نمی‌تواند فعال شود مگر اینکه فاکتور 6 مرتبط با گیرنده فاکتور نکروز تومور پروتئینی (TRAF6) به آن ملحق شود [3]، و به دنبال آن مسیرهای سیگنال دهی پایین دست شامل PI3K/AKT و NF-kB تحریک شوند. در نهایت، بیان فاکتور هسته ای سلول های T فعال c2 (NFAT2) و c-Fos [4] تنظیم شد تا تمایز استئوکلاست و همچنین تحلیل استخوان را تعدیل کند. بنابراین، عوامل و تنظیم کننده هایی که به طور مستقیم یا غیرمستقیم با فعال سازی و تمایز استئوکلاست مرتبط هستند، به عنوان اهداف مهمی برای جلوگیری از تحلیل استخوان در نظر گرفته شدند. در واقع برخی از داروهای بالینی و مصنوعی جایگزین هورمون درمانی مانند استرادیول والرات وجود دارد که در درمان پوکی استخوان پس از یائسگی موثر است. متأسفانه، برخی از این موارد خطر ابتلا به سرطان های جدی از جمله سرطان سینه و آندومتر [5] را افزایش می دهند که کاربردهای بالینی آنها را محدود می کند. بنابراین، انتخاب جایگزین های دیگر با اثربخشی و حداقل عوارض ضروری است. داروهای سنتی چینی (TCM)، و همچنین ترکیبات و فراکسیون‌های زیست فعال جدا شده [6-9]، بر روی بیماری‌های مختلف از جمله پوکی استخوان پس از یائسگی مؤثر بودند. در میان این اجزا و فراکسیون های فعال زیستی، ترکیبات فنیل اتانوئید گلیکوزید (PhG) با اثربخشی بالقوه به عنوان عوامل امیدوارکننده ای برای درمان پوکی استخوان اعتقاد داشتند [10-12]. ساختار PhG ها شامل آگلیکون اسید سینامیک، یک گروه هیدروکسیل فنیل اتیل است که از طریق یک پیوند گلیکوزیدی با -گلوکوپیرانوز، آپیوز، گالاکتوز، رامنوز یا زایلوز ترکیب می شود. آنها به طور گسترده در گونه های دارویی از جنس Cistanche [13] وجود دارند. Cistanche deserticola YC Ma یک TCM رسمی است که در داروسازی چینی ثبت شده است، و علاوه بر اینکه یک TCM مهم است [14]، C .deserticola همچنین یک گیاه مقوی ضد پیری با عوارض جانبی کمی است که به صورت مشروب دارویی و مایع تغذیه ای مورد تایید قرار گرفته است. سازمان غذا و داروی ایالتی بر اساس سوابق فارماکوپه چینی، C. deserticola به طور سنتی توسط بومیان برای رسیدگی به مشکلات کمبود جوهر کلیوی مانند ناتوانی عضلات و ضعف کمر، و ترکیبات گلیکوزید فنیل اتانوئید از جمله استفاده می شد.اکیناکوزیدو اکتئوزید ترکیبات فعال زیستی اصلی در این گیاه هستند. بر اساس تئوری TCM "کلیه-استخوان"، سیستم استخوان توسط جوهر کلیه کنترل می شود [15]، و مشکلات مربوط به استخوان مانند پوکی استخوان را می توان با گیاهان یا ترکیباتی که دارای فعالیت تغذیه کننده جوهر کلیه هستند، بهبود بخشید. بنابراین، ما فرض کردیم که کل کسر گلیکوزید فنیل اتانوئید جدا شده از C. deserticola، حداقل تا حدی، در درمان پوکی استخوان مفید بود. بنابراین آزمایش فعلی برای تأیید فرضیه ما با استفاده از یک مدل موش تخمدان برداشته شده (OVX) ابداع شد. علاوه بر نشانگرهای جذب و تشکیل استخوان که باید تخمین زده شوند، شاخص آنتی اکسیداسیون و همچنین مسیرهای سیگنالینگ PI3K/AKT و NF-kB ناشی از RANKL/RANK/TRAF{4}} نیز برای بررسی مکانیسم‌های اصلی زیست فعالی ضد پوکی استخوان به کار گرفته شد. .

2. مواد و روش

2.1. مواد گیاهی و آماده سازی.

مجموعاً 30 کیلوگرم ساقه Cistanche deserticola YC Ma از شهرستان Yongning در 2 سپتامبر015 با مختصات 106.{34}}26597 و 38.262816 جمع آوری شد. استان نینگشیا، چین این گیاه توسط دکتر لین دانگ (دپارتمان فارماکوژنزی، دانشگاه پزشکی نینگشیا) شناسایی شد و یک نمونه مربوطه (#20150901) در بخش نگهداری شد. تجزیه و تحلیل دارویی. ابتدا 0/3 0 کیلوگرم پودر C. deserticola به روش رفلاکس با حلال اتانول 70 درصد استخراج شد. نسبت ماده به حلال 1:10 و زمان رفلاکس 2 ساعت برای 3 بار تعیین شد. سپس تمام فیلترها با هم ترکیب و تحت فشار کاهش یافته در دمای 60 درجه سانتیگراد متراکم شدند. 30٪، 40٪، 50٪، و 60٪، هر 60 L) برای شستشو استفاده شد. ثالثاً، شوینده‌های 40% و 50% با استفاده از ستون‌های رزین ماکرو متخلخل مکرر AB{25}} با شوینده‌های 0%، 20%، 30%، 40% و 50% اتانول در آب ترکیب و خالص‌سازی شدند. هر شوینده 12 لیتر بود. در نهایت، کسر 40 درصد جمع آوری شد و تحت فشار کاهش یافته تغلیظ شد تا 150 گرم گلیکوزید فنیل تانوئیدی رسوب زرد کم رنگ C. deserticola (CDP، بازده 0.5 درصد) به دست آید. برای آزمایش‌های in vivo، از حلال CMC-Na 0.5% برای حل کردن CDP استفاده شد. تجویز خوراکی به حیوانات به عنوان 1 میلی لیتر / 100 گرم وزن بدن تعیین شد. برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات in vitro، CDP با DMSO حل شد و سپس با DMEM رقیق شد تا غلظت‌های نهایی mg/ml 0.1، mg/mL 0.01 و mg/ml 0.001 به دست آید. 

عصاره طبیعی سیستانچ برای رشد استخوانفنیل تانوئید گلیکوزید 75% اکیناکوزید 30% آکتئوزید 12%

2.2. مواد شیمیایی و حلال ها.

استرادیول والرات (EV) از Delpharm Lille SAS، فرانسه بود. کیت های الکالین فسفاتاز (ALP)، پروتئین گلا استخوان (BGP)، اسید فسفاتاز مقاوم به تارتارات (TRAP) و دئوکسی پیریدینولین (DPD) کیت های ELISA از شرکت مهندسی بیولوژیکی Xinyu، شانگهای، چین، 201605. کیت های معرف مالون دی آلدئید (MDA، 20181221)، سوپر اکسید دیسموتاز (SOD، 20121218)، و گلوتاتیون (GSH، 20181221) از موسسه مهندسی بیولوژیکی نانجینگ جیانچنگ، نانجینگ، چین؛ کیت های ELISA پیوند متقابل پاراتورمون (l-PTH، NEWASHE7UZ)، کلسی تونین (2L9ISN7AIU)، و گیرنده آلفا مرتبط با استروژن (ERR، Y3AY8QEWB3) از شرکت Elabscience Biotechnology Ltd.، ووهان، چین. کیت معرف کاتپسین K ELISA از BioVision، آمریکا، 1l300141; آنتی بادی های اولیه RANKL (GR3193842-5)، RANK (AA02113656)، TRAF6 (2)، c-Fos (AG12059411)، NFAT2 (AO11015648)، NF-kB p65 (AH04138226)، PI53 آلفااکیناز (P8206) ، AKT 1 (AF05173234)، -اکتین (17AV0411)، و آنتی بادی های ثانویه بز کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی IgG ضد خرگوش از ZSGB-BIO، چین، 136080. کیت سنجش کل پروتین BCA و کیت تجاری برای تشخیص تشکیل oste oclast و سرم جنین گاوی و محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) از HyClone، Logan، UT، ایالات متحده. غشاء پلی وینیلیدن فلوراید (PVDF) از Millipore Life Sciences، Billerica، MA، ایالات متحده؛ پنی سیلین و استرپتومایسین از Gibco، Rockville، MD، ایالات متحده آمریکا. تمام عوامل شیمیایی دیگر استفاده شده از درجه AR بودند.

2.3. HPLC کمی سازی CDP.

برای شناسایی و تعیین کمیت ترکیب CDP از یک ابزار HPLC 122{7}} استفاده شد. شرایط کروماتوگرافی به شرح زیر بود: ستون C18 (TSK-GEL، 4.6.id × 250 میلی متر، 5 میکرومتر). شستشوی گرادیان حاوی حلال‌های A (استونیتریل) و B (آب حاوی 0.5٪ اسید استیک) ({9}} دقیقه: 17-20% A؛ 10-30 دقیقه: 20-25% A؛ و 30-40 دقیقه: 25-30% A); طول موج تشخیص 333 نانومتر بود. دمای محیط؛ سرعت جریان 1.0 میلی لیتر در دقیقه بود. حجم تزریق نمونه 5 میکرولیتر بود. هشت ترکیب PhG، یعنی سیستانوزید F، اکیناکوزید، 6'-acetylacteoside، cistanoside C، سیستانوزید A، اکتئوزید، 2'-acetylakteoside، و ایزواکتئوزید، شناسایی شدند. با استفاده از مواد مرجع مربوطه و یک روش استاندارد خارجی، محتویات 8 PhG فوق با آنالیز HPLC اندازه‌گیری شد (شکل 1).

شکل 1: اثر انگشت HPLC از CDP. هشت ترکیب گلیکوزید فنیل اتانوئیدی در این بخش یافت شد و محتوای کل آن 5.7% 0 تعیین شد. ترکیبات و محتویات آنها به شرح زیر بود: (1) اکتئوزید F (3.6٪)، (2) اکیناکوزید (8.8٪)، (3) سیستانوزید A (5.0٪)، (4) اکتئوزید (13.3٪)، (5) ایزواکتئوزید (3.3٪)، (6) اکتئوزید C (3.6٪)، (7) 2'-acetylakteoside (9.9٪)، و (8) 6'-acetylakteoside (3.2٪).

2.4. پروتکل آزمایشی حیوانات

در مجموع 6 0 موش صحرایی ماده بالغ نژاد Sprague-Dawley 3 ماهه از مرکز آزمایشات حیوانی دانشگاه پزشکی نینگشیا با میانگین وزن اولیه بدن حدود 25 ± 234 گرم مورد استفاده قرار گرفتند. موش‌ها در یک محیط استاندارد عاری از پاتوژن قرار گرفتند تا به مدت 1 هفته سازگار شوند. سپس تمام موش‌ها بیهوش شدند (هیدرات کلرال، 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم، داخل صفاقی) یا تخمدان شم برداشته شدند (SHAM)، یا دو تخمدان هر دو برداشته شدند و سپس به طور تصادفی به 5 زیر گروه تقسیم شدند: خوراکی با وسیله نقلیه (0.5% CMC-) Na) به عنوان گروه مدل (OVX)، استرادیول والرات (1 میلی گرم بر کیلوگرم در روز) به عنوان گروه مثبت (EV)، و 60، 120 و 240 میلی گرم بر کیلوگرم در روز CDP به عنوان کم (CDPL) تعیین شد. گروه‌های دوز متوسط ​​(CDPM) و بالا (CDPH). همه موش‌ها روزانه به صورت خوراکی تجویز شدند و به مدت 3 ماه با دوز تنظیم شده هر 2 هفته که به تغییر وزن کل بدن بستگی داشت، ادامه یافت. در آخرین روز آزمایش حیوان، 24-ساعت ادرار با استفاده از قفس‌های متابولیک گرفته شد. سرم از شریان فمورال موش های بیهوش جمع آوری شد. استخوان ران راست، درشت نی و تمام اندام‌ها تشریح شد و برای تجزیه و تحلیل بیشتر در -80 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. آزمایش‌های حیوانی که ما انجام دادیم توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی دانشگاه پزشکی نینگشیا تأیید شد.

2.5. تعیین تراکم مواد معدنی استخوان و آنالیز میکرو CT.

در مرحله اول، یک دستگاه جذب سنجی اشعه ایکس با انرژی دوگانه (Lunar، ایالات متحده آمریکا) برای تخمین تراکم استخوان کل استخوان ران راست هر موش استفاده شد. در مرحله دوم، همان استخوان ران برای تخمین تصویر سه بعدی ریزمعماری استخوان ترابکولار با استفاده از دستگاه اسکنر میکرو سی‌تی (GE، آمریکا) استفاده شد. وضوح همسانگرد 14 میکرومتر برای به دست آوردن یک تصویر سه بعدی ایده آل تنظیم شد. منطقه مورد نظر (ROI) با تنظیم مختصات یکسان در صفحه رشد استخوان ران هر نمونه انتخاب شد. و پارامترهای مورفومتریک استخوان شامل جداسازی ترابکولار (Tb.Sp)، تعداد ترابکولار (Tb.N)، ضخامت ترابکولار (Tb.Th)، محتوای معدنی استخوان (BMC)، تراکم معدنی بافت (TMD) و محتوای مواد معدنی بافت (TMC) ) با تجزیه و تحلیل ROI به دست آمد.

شکل 2: اثرات OVX و 12 هفته درمان با CDP یا EV بر تراکم کل استخوان در استخوان ران راست موش‌ها که با استفاده از جذب سنجی اشعه ایکس با انرژی دوگانه (n=10/گروه) ارزیابی می‌شوند. داده ها به عنوان میانگین ± انحراف معیار ارائه شد. ∗p < 0 05، ∗∗p < 0 01، و ∗∗∗p < 0 001 در مقابل گروه OVX. ###p < 0 001 در مقابل گروه SHAM.

شکل 3: تصاویر میکرو سی تی اسکن از ریزمعماری استخوان ران راست موش های تحت درمان با CDP. عکس های نشان داده شده نماینده 4 موش مختلف در هر گروه بود: (الف) گروه OVX. (ب) گروه SHAM; (C) گروه EV; (د) گروه CDPH. (E) گروه CDPM; (F) گروه CDPL. پارامترهای اندازه گیری شده شاملمحتوای مواد معدنی استخوان(BMC)، محتوای مواد معدنی بافت (TMC)، تراکم معدنی بافت (TMD)، جداسازی ترابکولار (Tb.Sp)، تعداد ترابکولار (Tb.N) و ضخامت ترابکولار (Tb.Th). موش های OVX کاهش قابل توجهی از ناحیه ریزمعماری و تعداد ترابکولار را بیان کردند. موش‌های تحت درمان با CDP و موش‌های تحت درمان با EV تا حدودی یافته‌های فوق را در همان درجه پس از 12 هفته درمان معکوس کردند. تمام مقادیر به عنوان میانگین ± انحراف معیار ارائه شد. ∗p < 0 05، ∗∗p < 0 01، و ∗∗∗p < 0 001 در مقابل گروه OVX. ###p < 0 001 در مقابل گروه SHAM.

شکل 4: اثرات OVX و 12 هفته درمان با CDP یا EV بر ادرار و کلسیم و فسفر سرم و همچنین PTH و کلسیتونین موش‌ها (n=10/گروه). تمام داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد. ∗p < 0 05، ∗∗p < 0 01، و ∗∗∗p < 0 001 در مقابل گروه OVX. # p < 0 05، ##p < 0 01 و ###p < 0 001 در مقابل گروه SHAM.

2.6. سنجش بیوشیمیایی سرم و ادرار

فعالیت کاتپسین K، TRAP، SOD، و GSH سرم، و همچنین محتوای سرمی PTH، کلسی تونین، ERR، MDA، BGP و DPD ادرار، با استفاده از کیت های معرف مربوطه مطابق با دستورالعمل سازنده تعیین شد. سطح آلکالن فسفاتاز (ALP) و محتوای کلسیم سرم و ادرار (Ca) و فسفر (P) با استفاده از دستگاه اتوماتیک (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA) برآورد شد.

2.7. تجزیه و تحلیل وسترن بلات.

استئوکلاست ها با استفاده از سلول های RAW 264.7 اضافه شده با فاکتور تحریک کننده کلنی ماکروفاژ (MCSF) و RANKL القا شدند. به طور خلاصه، 1 × 107 سلول RAW 264.7 در یک صفحه چاهی در حضور 30 نانوگرم در میلی لیتر MCSF و 25 نانوگرم در میلی لیتر RANKL کشت داده شدند. پس از 6 روز القا، سلول‌های استئوکلاست بالغ با استفاده از روش رنگ‌آمیزی TRAP با کیت مربوطه شناسایی شدند، سپس با CDP تیمار شدند ({16}}.1، 0.01 و 0.001 mg/mL). به ترتیب) به مدت 24 ساعت؛ سپس سلول ها با یک بافر لیز حاوی 0.5 میلی مول فنیل متیل سولفونیل فلوراید، پروتئاز و مهارکننده های فسفاتاز لیز شدند. سپس لیزات با استفاده از 10% SDS-PAGE جدا شد و به غشای PVDF منتقل شد که با AKT1، NF-κB-p65، RANKL، PI3K p85، RANK، NFAT2، TRAF6، c-Fos و -اکتین کاوش شد. 1: 400) پس از مسدود کردن با شیر بدون چربی 5 درصد به مدت 2 ساعت. همان غشاها به ترتیب با 9 آنتی بادی متناظر بالا جدا شده و دوباره کاوش شدند و سپس توسط نرم افزار Image Lab در انتها شناسایی شدند. آزمایش سه بار تکرار شد.

2.8. تحلیل آماری.

تمام داده‌های به‌دست‌آمده از آزمایش‌های in vivo و in vitro، که به‌عنوان میانگین ± انحراف معیار توصیف می‌شوند، با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه و سپس آزمون دانت (نرم‌افزار SPSS 22.{2}}، SPSS، USA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. p < 0 05 از نظر آماری معنی دار بود.

3. نتایج

3.1. ترکیب شیمیایی CDP.

با استفاده از روش HPLC، هشتترکیبات گلیکوزید فنیل اتانوئیدهمانطور که شکل 1 نشان می دهد در این کسر یافت شد. با استفاده از منابع استاندارد و روش استاندارد خارجی، ترکیبات و محتویات آنها به شرح زیر شناسایی و کمی سازی شد: (1) اکتئوزید F (3.6٪)، (2) اکیناکوزید (8.8٪)، (3)سیستانوزیدA (5.{1}}%)، (4) آکتئوزید (13.3%)، (5) ایزواکتئوزید (3.3%)، (6) اکتئوزید C (3.6%)، (7) 2'-acetylakteoside (9.9٪ و (8) 6'-acetylakteoside (3.2%). مجموع محتویات این هشت جزء 50.7 درصد تعیین شد.

عصاره سیستانچ لوله طبیعیبرای رشد استخوانفنیل تانوئید گلیکوزید 75% اکیناکوزید 30% آکتئوزید 12%

3.2. اثرات CDP بر تراکم معدنی استخوان و ریزمعماری ترابکولا.

تراکم استخوان کل موش ها در زیر گروه های مختلف در شکل 2 نشان داده شده است. روند کاهشی در محتوای تراکم استخوان در موش های عمل مدل OVX در مقایسه با موش های گروه SHAM مشاهده شد (p < {{{ 1}}). همه موش‌های تحت درمان با CDP در مقایسه با موش‌های گروه مدل OVX، به ترتیب 11.2%، 12.{6}}% و 10.7% (p <{9}}) تراکم استخوان را به طور قابل‌توجهی افزایش دادند. علاوه بر این، مطابق با داده‌های تراکم مواد معدنی کل استخوان، بازسازی میکروسی‌تی، و همچنین تعیین هیستومورفومتریک استخوان ران، نشان داد که موش‌های گروه OVX وخامت آشکاری در معماری ترابکولار نشان دادند که با کاهش قابل توجه تعداد و مساحت ترابکول‌ها مشخص شد. و همچنین افزایش قابل توجهی Tb.Sp در مقایسه با موش های گروه SHAM. درمان با CDP از زوال ناشی از OVX در معماری ترابکولار جلوگیری کرد. همانطور که شکل 3 نشان می دهد، مقادیر BMC، TMC و Tb.N به طور قابل توجهی افزایش یافته و مساحت Tb.Sp به طور قابل توجهی کاهش یافته است، در حالی که مقادیر TMD و Tb.Th به طور قابل توجهی تحت تاثیر عملیات OVX و ما قرار نگرفته است. مداخله CDP

شکل 5: اثرات OVX و 12-درمان هفتگی با CDP یا EV بر فعالیت‌های سرمی TRAP، کاتپسین K، DPD، ALP، و BGP موش‌های OVX (n=10/گروه). تمام مقادیر به عنوان میانگین ± انحراف معیار ارائه شد. ∗p < 0 05، ∗∗p < 0 01، و ∗∗∗p < 0 001 در مقابل گروه OVX. # p < 0 05، ##p < 0 01 و ###p < 0 001 در مقابل گروه SHAM.

3.3. اثرات CDP بر پارامترهای بیوشیمیایی ادرار و سرم.

همانطور که شکل 4 نشان می دهد، روند کاهش معنی داری سطح فسفر ادراری و محتوای سرمی کلسی تونین در موش های گروه مدل OVX مشاهده شد که تقریبا 30% و 60% کمتر از موش های SHAM بود (p < 0 001} به ترتیب، در حالی که هیچ روند افزایش یا کاهش آشکاری در سطوح ادراری کلسیم و کلسیم سرم و همچنین فسفر و PTH سرم بین گروه‌های OVX و SHAM مشاهده نشد. درمان با CDP به طور قابل‌توجهی از از دست دادن فسفر و کلسیم سرم در موش‌های OVX جلوگیری کرد، که نشان‌دهنده آن بود که سطوح سرمی P و کلسیم به طور قابل‌توجهی تنظیم شده بود (p <0 05) در مقایسه با موش‌های گروه مدل OVX. علاوه بر این، روند افزایشی اما غیرآماری معنی دار کلسی تونین در هر دو گروه با دوز کم و بالا CDP در مقایسه با گروه مدل OVX مشاهده شد.

شکل 6: اثرات OVX و 12-درمان هفتگی با CDP یا EV بر بیان ERR، وزن بدن، و وزن رحم و واژن موش‌ها (n=10/گروه). داده ها به عنوان میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. ∗p < 0 05، ∗∗p < 0 01، و ∗∗∗p < 0 001 در مقابل گروه OVX. ###p < 0 001 در مقابل گروه SHAM.

3.4. اثرات CDP بر تشکیل استخوان و نشانگرهای تحلیل استخوان.

اثرات مفید CDP بر شاخص تشکیل استخوان و همچنین مهار آن برتحلیل استخواننشانگرها در شکل 5 توضیح داده شده است. در رابطه با نشانگرهای تشکیل استخوان، سطوح BGP سرم تقریباً تحت تأثیر عمل جراحی برداشته شده تخمدان قرار نگرفت که با تغییرات غیر قابل توجه مشاهده شده در همه گروه‌های تحت درمان مشهود بود، در حالی که بهبودهای آماری معنی‌داری در ALP سرم در هر دو سطح پایین به دست آمد (6). دوزهای 0 mg/kg) و متوسط ​​(120 mg/kg) گروه‌های مداخله CDP در مقایسه با موش‌های گروه SHAM (p < 0 01). با توجه به شاخص تحلیل استخوان، سطوح کاتپسین K و DPD سرم و همچنین TRAP در موش‌های گروه مدل OVX، به‌ترتیب حدود 75.0 درصد، 41.4 درصد و 21.0 درصد در مقایسه با موش‌های SHAM افزایش یافت. و هنگامی که با CDP درمان شد، به خصوص دوز پایین 60 میلی گرم بر کیلوگرم، خواص کاتپسین K و DPD و همچنین TRAP در گروه مدل OVX به طور قابل توجهی به ترتیب 67.3٪، 41.4٪ و 25.9٪ مهار شد. در مقایسه با موش های گروه مدل OVX.

سیستانچ لوله طبیعی برای رشد استخوانفنیل تانوئید گلیکوزید 75% اکیناکوزید 30% آکتئوزید 12%

3.5. اثرات CDP بر واژن و رحم و همچنین وزن کل بدن.

تفاوت های غیر قابل توجهی در وزن اولیه کل بدن موش ها قبل از درمان در شش گروه مشاهده شد (شکل 6). با این حال، عمل برداشتن تخمدان منجر به افزایش قابل توجهی در وزن نهایی بدن موش‌ها در گروه مدل OVX شد که نزدیک به 36 درصد است. }.0% و 60.0% به ترتیب، در مقایسه با موش‌های SHAM (p < 0 001). اگرچه محتوای ERR تفاوت معنی‌داری بین گروه‌های OVX و SHAM نشان نداد، اما همه گروه‌های درمانی شامل CDP و EV به طور معنی‌داری سطح ERR را افزایش دادند. علاوه بر این، هنگام درمان با EV، وزن‌های کل بدن و همچنین کاهش وزن واژن و رحم موش‌های OVX تا حدی معکوس شد (p <0 001) ​​اما تحت تأثیر مداخله CDP قرار نگرفت.

3.6. اثرات CDP بر سطوح سرمی MDA، SOD و GSH.

تفاوت آماری معنی داری در خواص SOD و GSH سرم بین گروه های مدل SHAM و OVX وجود نداشت. همانطور که شکل 7 توضیح می دهد، روند افزایشی در GSH را می توان بین دو گروه بالا مشاهده کرد. علاوه بر این، سطح MDA سرم به شدت نزدیک به 50٪ در موش های گروه مدل OVX در مقایسه با موش های SHAM افزایش یافت. فعالیت SOD تحت تأثیر تیمار CDP قرار نگرفت، در حالی که ویژگی GSH به طور قابل توجهی با مداخله CDP بهبود یافت، و CDP به طور قابل توجهی سطح MDA را به ترتیب 33.9٪ و 42.4٪ در دوزهای 60 و 240 میلی گرم بر کیلوگرم کاهش داد. p < 0 001).

3.7. اثرات CDP بر سطوح بیان پروتئین.

داده های ما، نشان داده شده در شکل 8، نشان می دهد که تیمار CDP به طور قابل توجهی سطوح پروتئین TRAF6، RANK و RANKL را در مقایسه با شاهد کاهش می دهد. مسیرهای سیگنال پایین دست از جمله NF-kB سرکوب شدند، و PI3K/AKT با مداخله CDP تحریک شد، که با بیان کاهش NF-kB-p65 مشهود بود، در حالی که PI3K p85 و AKT1 تنظیم مثبت شدند. در نتیجه، بیان NFAT2 به طور قابل توجهی کاهش یافت و c Fos پس از تیمار با CDP در غلظت 0 افزایش یافت. 1 mg/ml. یک مکانیسم پیشنهادی در شکل 9 توضیح داده شده است، که در آن CDP سطوح RANKL و RANK را کاهش داد و مقادیر اتصال این لیگاند با گیرنده آن را کاهش داد. ارتباط RANKL با RANK با کاهش TRAF6 و به دنبال آن سرکوب مسیرهای پایین دستی از جمله مسیر NF-kB کاهش بیشتری پیدا کرد. در مقابل، مسیر سیگنال PI3K/AKT تحریک شد که در نهایت منجر به کاهش بیان NFAT2 و افزایش سطح c-Fos شد.

4. بحث

گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیداجزای طبیعی محلول در آب هستند که به طور گسترده در قلمرو گیاهان دارویی وجود دارند [11]. تاکنون، ترکیبات گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی به دلیل نقش آشکارشان در کنترل بیماری‌ها و ناهنجاری‌های مختلف انسان، توجه محققان بیشتری را به خود جلب کرده‌اند [13]. تعدادی از فراکسیون ها و ترکیبات زیست فعال ضد پوکی استخوان، از جمله پلی فنل و گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی، از ده ها گیاه دارویی طبیعی شناسایی و جداسازی شدند [5، 10، 12، 16، 17]

شکل 8: اثرات غلظت های مختلف CDP بر بیان پروتئین TRAF6 (a)، RANKL (b)، RANK (c)، PI3K (d)، AKT (e)، NF-κBIA (f)، NFAT2 (g)، و c-Fos (h) (n=3/group); بیان پروتئین به -اکتین نرمال شد و داده های کمی هر پروتئین سیگنال به عنوان درصدی از مقدار کنترل نشان داده شد. داده ها به عنوان میانگین ± انحراف معیار توصیف شد. ∗p < 0 05، ∗∗p < 0 01 و ∗∗∗p < 0 001 در مقابل گروه کنترل.

C. deserticola به خوبی به عنوان "جینسنگ صحرا" شناخته می شود که نمایانگر مشخصات ایمنی این TCM خوراکی است [18، 19]. C. deserticola به عنوان یک گیاه مقوی عمومی و غذای سالم طبیعی که مدت‌هاست در کشورهای آسیایی مورد استفاده قرار می‌گرفت، عملکرد مفیدی برای افزایش قدرت کلیه نشان داد. مشخص شد که TCM که به طور سنتی برای تقویت و حفظ جوهر کلیه استفاده می‌شود، معمولاً برای درمان پوکی استخوان استفاده می‌شود، داده‌های منتشر شده در شرایط آزمایشگاهی و in vivo فعالیت ضد پوکی استخوان C. deserticola را ثابت کرده‌اند [2{13}}-23]. و ترکیبات گلیکوزید فنیل اتانوئید از جمله اکیناکوزید و اکتئوزید اجزای فعال زیستی اصلی موجود در این گیاه دارویی خوراکی هستند. همه اینها نشان می دهد که نه تنها خود اکیناکوزید و اکتئوزید، بلکه سایر اجزای گلیکوزید فنیل اتانوئید موجود در C. deserticola نیز مسئول خاصیت ضد پوکی استخوان این گیاه هستند. در مطالعه حاضر، از یک رزین ماکرو متخلخل ایمنی مطلوب برای جداسازی و غنی‌سازی کسر گلیکوزید فنیلتا نوید از C. deserticola استفاده شد و با استفاده از روش HPLC، هشت جزء اصلی گلیکوزید فنیل اتانوئید، یعنی اکتئوزید F، اکیناکوزید، سیستانوزید A، آکتئوزید، ایزواکتئوزید، اکتئوزید C، 2'-استیلاکتئوزید، و 6'-استیلاکتئوزید، در کسر گلیکوزید فنی لتانوئید جدا شده یافت شد و محتویات آن 3.6٪، 8.8٪، 5.0٪، 13.3٪، 3.3٪، 3.3٪ بود. به ترتیب 9.9٪ و 3.2٪. Echinacoside، یکی از ترکیبات فعالیت اصلی ثبت شده در C. deserticola [14]، دارای فعالیت ضد پوکی استخوان است. با این حال، دوز 270 میلی گرم بر کیلوگرم آنقدر بالا بود که کاربرد بالینی بیشتر آن را محدود کرد [24]. در آزمایش‌های کنونی، کسر گلیکوزید فنیل اتانوئید کل با دوز کمتر 60-240 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن در روز بر روی موش‌های صحرایی OVX استفاده شد و محتویات ترکیبات شناسایی شده در این بخش تقریباً 50 درصد خالص بود. روش HPLC

به خوبی شناخته شده بود که OVX می تواند باعث پوکی استخوان شود و موش OVX به عنوان یک مدل کلاسیک و مناسب برای شبیه سازی پوکی استخوان پس از یائسگی انسان تصور می شد. در عین حال، کاهش قابل توجهی در تراکم مواد معدنی استخوان، ریزمعماری استخوان ترابکولار، وزن مرطوب رحم و واژن و سطح استروژن و همچنین افزایش آشکار در تحلیل استخوان و وزن بدن، پس از عمل جراحی تخمدان مشاهده شد. بخشی به دلیل از دست دادن استروژن [25]. داده‌های ما، تا کنون، به وضوح نشان داده‌اند که OVX در واقع پوکی استخوان پس از یائسگی را القا می‌کند و همیشه با کاهش شدید کیفیت استخوان، ریزمعماری استخوان، و وزن مرطوب رحم و واژن همراه است. از آنجایی که EV یک عامل جایگزین هورمونی است که در عمل بالینی استفاده شده است، به عنوان یک کنترل مثبت در آزمایش in vivo ما استفاده شد، و وزن به دست آمده بدن و وزن های رحم آتروفی شده و همچنین تراکم معدنی استخوان و ریزمعماری استخوان ترابکولار کاهش یافت. انتظار می رود با مکمل EV معکوس شود. متفاوت از کنترل مثبت، کاهش وزن واژن و رحم و همچنین وزن کل بدن موش‌های گروه مدل OVX تحت تأثیر درمان CDP قرار نگرفت، که نشان می‌دهد CDP می‌تواند استخوان‌سازی را بدون ایجاد عوارض جانبی افزایش دهد. بر روی بافت های ارگانیک بدن و رحم اگرچه سطوح ERR به طور قابل توجهی توسط درمان CDP تنظیم شد، اما دقیقاً مانند یک اثر فیتواستروژن بود که هیچ عارضه جانبی بر روی بافت‌های آلی رحم و واژن مشاهده نشد. علاوه بر این، درمان CDP به طور قابل توجهی باعث تقویت کیفیت استخوان در موش‌های صحرایی OVX شد که در اثر جراحی اوارکتومی بدتر شده بودند.

علاوه بر این، سطوح فسفر و کلسیم در ادرار و سرم موش‌های OVX نیز برای انعکاس اثر ضد پوکی استخوان مورد استفاده قرار گرفت و غلظت کلسیم و فسفر معدنی معمولاً به سطوح کلسی تونین و PTH وابسته بود [26]. در مطالعه حاضر، اگرچه کاهش یا روند افزایشی در سطح دفع ادراری کلسیم مشاهده نشد.

شکل 9: مکانیسم مولکولی فرضی: CDP می تواند از از دست دادن استخوان در موش OVX از طریق غیرفعال کردن NF-kB ناشی از RANKL/RANK/TRAF{1} و فعال شدن مسیرهای PI3K/AKT و همچنین تحریک c-Fos و سرکوب NFAT2 جلوگیری کند. که با کاهش سطح بیان TRAF6، RANKL، RANK، NF-kBIA، و NFAT2 مشهود است، در حالی که c-Fos، AKT و PI3K به طور قابل توجهی توسط درمان CDP در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت.

سرم فسفر، کلسیم و PTH سرم در موش های گروه مدل OVX به دست آمد و سطوح ادراری قابل توجهی از فسفر و کلسی تونین (P <{0}}) مشاهده شد. مطابق با داده های منتشر شده مبنی بر اینکه کمبود استروژن ناشی از جراحی تخمدان همیشه منجر به کاهش سطح کلسی تونین در خون می شود، این کاهش کلسی تونین سرم در نهایت منجر به افزایش سطح PTH می شود که در آن کلسیم به عنوان تنظیم کننده اصلی ترشح PTH شناخته می شود. از آنجایی که غلظت PTH در مطالعه حاضر تفاوت معنی‌داری را بین گروه‌های OVX و SHAM نشان نداد، سطح کلسیم در سرم و ادرار نیز هیچ تغییر آشکاری بین دو گروه بالا نشان نداد. با این حال، تمایل به کاهش قابل توجهی در سطح کلسی تونین بین گروه OVX و SHAM به دست آمد، و در نتیجه، محتوای P در ادرار OVX به شدت کاهش یافت. ما معتقدیم که داده‌های بالا ممکن است پدیده متناقضی را توضیح دهد که چرا دفع ادراری سطح کلسیم در موش‌های OVX تغییر آشکاری در مقایسه با موش‌های SHAM نشان نمی‌دهد و این پدیده ممکن است با افزایش سرعت چرخش استخوان نیز مرتبط باشد [27] . پس از درمان با CDP، سطح فسفر و کلسیم در سرم به طور قابل توجهی افزایش یافت و محتوای فسفر در ادرار در موش‌های صحرایی OVX کاهش یافت، که نشان می‌دهد CDP نه تنها می‌تواند از دفع عناصر معدنی استخوان جلوگیری کند، بلکه محتوای سرمی آن‌ها را نیز افزایش می‌دهد. عناصر، بنابراین به طور غیر مستقیم از دست دادن استخوان را سرکوب می کند.

علاوه بر این، نشانگرهای تشکیل و جذب استخوان و همچنین آنزیم های آنتی اکسیدانی از جمله SOD و GSH نیز برای توضیح مکانیسم های ضد پوکی استخوان زمینه ای CDP مورد استفاده قرار گرفتند. مشابه با داده‌های منتشر شده، سطح ALP در موش‌های گروه مدل OVX روند افزایشی غیرآماری معنی‌داری را نشان داد که نشان‌دهنده سرعت تسریع گردش استخوان در پوکی استخوان پس از یائسگی است [10]. با این حال، پس از درمان با CDP (60، 120 و 240 میلی گرم بر کیلوگرم در روز)، ویژگی ALP به طور قابل توجهی افزایش یافت. به خوبی شناخته شده بود که OVX باعث کاهش شدید سطح استروژن می شود که معمولاً منجر به جذب بیش از حد استخوان و استرس اکسیداتیو می شود [28] که توسط سطوح TRAP، کاتپسین K و DPD و همچنین MDA به طور قابل توجهی در موش های صحرایی تنظیم شده است. گروه مدل OVX. با این حال، این وخامت تا حدی با مداخله CDP بهبود یافت. علاوه بر این، تیمار OVX موش با CDP (60 و 240 میلی‌گرم بر کیلوگرم) افزایش قابل توجهی در فعالیت GSH نشان داد (P <{8}}). نتایج فوق حاکی از آن است که CDP یک اثر درمانی بر روی پوکی استخوان ناشی از OVX نشان می‌دهد، و این اثرات هم از طریق تقویت استخوان‌سازی و سرکوب تحلیل استخوان و هم بهبود سیستم آنتی اکسیدانی استخوان بود.

فعال سازی RANK توسط لیگاند آن RANKL بیان NFAT2 و c-Fos را از طریق سیگنالینگ PI3K/AKT و NF-kB تحریک کرد [29]. ثابت شد که NF-κB برای استئوکلاستوژنز ضروری است زیرا اختلال NF-kB می‌تواند منجر به اختلال در تمایز استئوکلاست‌ها با فنوتیپ پوکی استخوان شود، و NF-kB باعث تنظیم مثبت c-Fos و کاهش بیان NFAT2 در طول استئوکلاستوژنز ناشی از RANKL/RANK/TRAF شود. برای تخمین تأثیر مفید CDP بر استئوکلاستوژنز با واسطه NFAT2 و c-Fos، سطح بیان RANKL و RANK مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. انتظار می رود، CDP به طور قابل توجهی NFAT2 را مهار کرد و سطوح c-Fos را با کاهش عبارات RANKL و RANK تحریک کرد. در همین حال، خود RANK فاقد خاصیت کیناز ذاتی بود، مگر اینکه توسط TRAF6 برای راه‌اندازی سیگنال‌دهی پایین‌دست به آن ملحق شود [3]. CDP همچنین بیان TRAF6 را کاهش داد، که منجر به کاهش قابل توجه مقادیر اتصال RANKL و RANK شد. مکانیسم فرضی ضد پوکی استخوان CDP روی موش‌های OVX مسیرهای سیگنال‌دهی فوق را پوشش می‌دهد و تنظیم‌کننده‌ها در شکل 9 توضیح داده شده است. توسط RANKL/RANK تحریک می شوند و در نهایت بیان و فعالیت پروتئین های کلیدی استئوکلاستوژنیک NFAT2 و c-Fos را کاهش می دهند. بنابراین، سرنخ‌های متعدد داده حاکی از تأثیر مفید CDP بر متابولیسم استخوان موش‌های OVX عمدتاً از طریق مسیرهای PI3K/AKT و NF-kB با واسطه RANKL/RANK/TRAF است.

5. نتیجه گیری

به طور خلاصه، کل گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید جدا شده از C. deserticola، اثرات مفید قابل توجهی بر پوکی استخوان پس از یائسگی موش‌های صحرایی OVX نشان دادند و پتانسیل درمانی در سرکوب از دست دادن استخوان عمدتاً از طریق تحریک استخوان‌سازی و مهار تحلیل استخوان و همچنین تقویت استخوان بود. سیستم؛ مکانیسم‌ها ممکن است مربوط به فعال‌سازی NF-kB ناشی از RANKL/RANK/TRAF و غیرفعال‌سازی PI3K/AKT و همچنین تحریک c-Fos و سرکوب NFAT2 باشد، و در نهایت، تمایز استئوکلاست‌ها مهار شد.

سیستانچ لوله طبیعی برای رشد استخوانفنیل تانوئید گلیکوزید 75% اکیناکوزید 30% آکتئوزید 12%