عصاره متانولی پوست Beta Vulgaris Rubra L. (چغندر) استرس اکسیداتیو را کاهش می دهد و تکثیر سلولی را از طریق افزایش بیان VEGF در سلول های اندوتلیال ورید ناف انسانی تحت استرس اکسیداتیو ناشی از H2O2 تحریک می کند.

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای دانستن بیشتر

لیلا نایف الحربی 1*، سوباش بابوپندورنگان 1، الحانوف محمد الدوسری 1، غالیه شملان 1، احمد محمد سلامت الله 1، علی الشاتوی 1 و آمنه عبدالله التیبی 2

خلاصه:ظرفیت آنتی اکسیدانی پلی فنل ها وفلاونوئیدهاموجود در مواد غذایی به جلوگیری از توسعه گونه های فعال اکسیژن (ROS) و محافظت از سلول های ماهیچه صاف اندوتلیال در برابر استرس اکسیداتیو/نکروز ناشی از آن کمک می کند. چغندر (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) یک سبزی پرمصرف است که منبعی غنی ازآنتی اکسیدان ها. ترکیبات زیست فعال پوست چغندر و نقش آنها در سلول‌های اندوتلیال ورید ناف انسان (HUVECs) هنوز مورد بررسی قرار نگرفته است. در مطالعه حاضر، عصاره متانولی پوست چغندر (BPME) تهیه شد و اثر آن بر روی کارایی زیستی، یکپارچگی هسته ای، پتانسیل غشای میتوکندری، رشد سلول های عروقی و سطوح بیان ژن مرتبط با تنظیم ایمنی در HUVECs با القا شده است.اکسیداتیواسترس مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج کروماتوگرافی گازی-طیف‌سنجی جرمی (GC-MS) تأیید کرد که BPME حاوی 5-هیدروکسی متیل فورفورال (32.6 درصد)، متیل پیروات (15.13 درصد)، فورفورال (9.98 درصد) و 2،{10}}دی هیدرو{11} است. }،5-دی هیدروکسی-6-متیل-4H-Pyran{16}}یک (12.4 درصد). عصاره BPM به طور موثر تکثیر سلولی را افزایش داد و با روش MTT تایید شد. یکپارچگی هسته ای با استفاده از روش رنگ آمیزی یدید پروپیدیوم (PI) تایید شد. پتانسیل غشای میتوکندری (∆ψm) با استفاده از روش رنگ‌آمیزی JC تأیید شد. سنجش Annexin V تایید کرد که HUVEC های تیمار شده با BPME 99 درصد سلول های زنده را نشان می دهند، اما تنها 39.8 درصد زنده ماندن در HUVEC های تیمار شده با H2O2 به تنهایی نشان داده شد. علاوه بر این، تیمار BPME HUVECs به مدت 48 ساعت بیان mRNA پراکسید لیپیدی (LPO) را کاهش داد و NOS{27}}، Nrf{28}}، GSK{29}}، GPX، اکسید نیتریک سنتاز اندوتلیال (eNOS) را افزایش داد. و سطوح بیان mRNA فاکتور رشد سلول عروقی (VEGF). ما دریافتیم که درمان BPME باعث کاهش پیش التهابی (فاکتور هسته‌ای-κ (F-κ)، فاکتور نکروز بافتی (TNF-)، گیرنده‌های شبه عوارضی{35}} (TLR{36}})، اینترلوکین{37} } (IL-1 ))و عروقیالتهاب(مولکول چسبندگی داخل سلولی (ICAM)، مولکول چسبندگی سلول عروقی (VCAM)، EDN1، IL-1 بیان‌های مربوط به mRNA. در نتیجه، درمان پوست چغندر به طور موثر فاکتورهای رشد سلول های صاف عروقی و توسعه میکروتوبول ها را افزایش داد، در حالی که تنظیم کننده های التهابی عروقی را کاهش داد. BPM ممکن است برای بازسازی سلول های صاف عروق، ترمیم بافت و پتانسیل ضد پیری مفید باشد.

کلید واژه ها:چغندر; استرس اکسیداتیو؛ میتوکندری؛ رگزایی؛ التهاب

خواهشمند است برای آگاهی بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

آنژیوژنز فرآیند فیزیولوژیکی واسکولوژنز از عروق موجود بدن است [1]. این نه تنها برای رشد و تولید مثل جنین بلکه برای چرخه سلولی و ترمیم بافت ضروری است [2،3]. با این حال، با پاتوژنز بیماری های مختلف، مانند رشد تومور، آرتریت روماتوئید، و بیماری های ایسکمیک و التهابی مختلف مرتبط است [3-5]. اندوتلیوم عروقی با تنظیم تون عروق خونی و واکنش های ایمنی و التهابی نقش مهمی در حفظ هموستاز عروقی ایفا می کند [6،7]. سلول‌های اندوتلیال (ECs) لایه‌های تک سلولی نازکی هستند که تمام سطوح داخلی رگ‌های خونی را می‌پوشانند و مولکول‌های مختلفی تولید می‌کنند که به صورت موضعی یا در مکان‌های دور عمل می‌کنند [7]. اندوتلیوم برای هموستاز بدن ضروری است و هر گونه تغییر در پاسخ سلول های اندوتلیوم منجر به رویدادهای اولیه فرآیندهای بیماری التهابی و عروقی مانند تصلب شرایین و فشار خون بالا می شود [6،8،9]. این بیماری ها باعث استرس اکسیداتیو می شوند که ساختار و عملکرد EC را تغییر می دهد و منجر به اختلال عملکرد اندوتلیال می شود [9]. ECs ورید ناف انسان (HUVECs) به طور گسترده ای به عنوان مدلی برای مطالعات مرتبط با اندوتلیوم عروقی انسان استفاده شده است. علاوه بر این، آنها یک مدل مفید برای مطالعه مسیرهای بیولوژیکی اصلی درگیر در عملکرد اندوتلیوم [10] ارائه می کنند. ترکیبات زیست فعال و فیتوکمیکال ها به وفور در میوه ها، سبزیجات، گیاهان سبز و بسیاری از گیاهان یافت می شوند که دارای مزایای سلامتی متعددی مانند خواص ضد التهابی، آنتی اکسیدانی، ضد سرطان زایی و رگ زایی هستند [11-13]. در این راستا، چغندر قرمز (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) متعلق به خانواده Amaranthaceae است و به عنوان یکی از بهترین منابع سطوح بالای آنتی اکسیدان ها طبقه بندی می شود [14،15]. به طور خاص، حاوی مواد شیمیایی گیاهی متعددی است که از نظر بیولوژیکی فعال هستند، از جملهبتالاین هافلاونوئیدها،پلی فنول هاآنزیم های درمانی، اسید اسکوربیک، دهیدروآسکوربیک اسید (DHAA) و نیترات معدنی (NO3) [16-18]. علاوه بر این، مواد مغذی ضروری ارزشمندی مانند پتاسیم، کلسیم، منیزیم، سدیم، آهن، روی، فسفر، مس و منگنز را فراهم می‌کند [19]. چندین مطالعه گزارش کرده اند که عصاره چغندر قرمز (ریشه) دارای اثرات مفید متعددی است زیرا دارای خواص کاهنده قند خون، کاهش دهنده چربی، ضد التهاب، ضد فشار خون و ضد تکثیر است [20-22]. همه این خواص مفید را می توان با توانایی های مهار رادیکال های آزاد ترکیبات زیست فعال مرتبط دانست. بنابراین، مصرف چغندر قرمز با فواید تغذیه ای و سلامتی متعددی مرتبط است. به دلیل ارزش غذایی آن، ممکن است به عنوان یک منبع غذایی کاربردی در برابر استرس های اکسیداتیو که باعث بیماری های متابولیک مزمن مانند دیابت نوع 2 و بیماری های قلبی عروقی می شوند، استفاده شود [23]. بر اساس بررسی متون، بتا ولگاریس دارای خواص آنتی اکسیدانی قوی، تنظیم کننده ایمنی و رگ زایی است. آپیژنین در برگ چغندر یافت شده است. دارای اثرات ضد تکثیری در سلول های کبد و روده است و می تواند بیماری چاقی ناشی از رژیم غذایی پرچرب را از طریق فعال سازی AMPK بهبود بخشد [24،25]. De Silva و همکاران، (2020) [26] شناسایی کردند که بتا ولگاریس از EC های عروقی در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از خارج محافظت می کند، که ممکن است به دلیل اثر ترکیبی چندین ترکیب فعال زیستی موجود در این گیاه باشد. تا به حال، عمل مکانیکی برای تکثیر EC و اثر رگزایی پوست ریشه بتا ولگاریس کمتر مورد بررسی قرار گرفته است. از این رو، هدف ما این بود که مطالعه حاضر را برای بررسی تکثیر سلول های عروقی، توسعه میکروتوبول، استرس اکسیداتیو و ظرفیت رگزایی مربوط به لایه برداری ریشه بتا ولگاریس با استفاده از مورفولوژی سلولی و تجزیه و تحلیل بیان ژن در HUVECs انجام دهیم. اثرات رگ زایی عصاره متانولی پوست چغندر قرمز مرتبط با یکپارچگی هسته ای، توسعه میکروتوبول، کارایی میتوکندری و تحریک چرخه سلولی در EC های عروقی انسان بررسی شده است.

2. مواد و روشها

2.1. تهیه چغندر(Beta vulgaris rubra L.) عصاره متانولی نمونه‌های چغندر تازه (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) در ابتدا از فروشگاه‌های سبزیجات، ریاض، پادشاهی عربستان سعودی (KSA) تهیه شد. چغندرهای تازه با آب مقطر شسته شدند تا ساقه ها و آلاینده ها از بین بروند. پوست بیرونی پوست کنده شد تا برداشته شود و به قطعات کوچک بریده شود. نمونه ها در اجاق با هوای گرم با دمای 40 خشک شدند و سپس با استفاده از مخلوط کن الکترونیکی پودر شدند. سپس، 5{{10}}0 گرم از پودر در یک بطری استریل حاوی 1 لیتر متانول (Sigma, St. Louis, MO, USA) به مدت 24 ساعت در دمای اتاق استخراج شد. یک تکان دهنده و سه بار تکرار کنید. پس از آن، یک فیلتر Whatmanfi (Whatman, Clifton, NJ, USA) برای فیلتر کردن عصاره استفاده شد. در نهایت با کاهش فشار، حلال از عصاره جدا شد و پس از تبخیر متانول، عصاره به صورت ماده خشک جامد جمع آوری شد. نمونه استخراج شده تا زمان استفاده بعدی در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. 2.2. کروماتوگرافی گازی و تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی عصاره متانولی پوست چغندر (BPME) به یک ستون مویرگی سیلیس (30 m × {{60}}.25 mm ID × 0) تزریق شد. ضخامت فیلم 0.25 میکرومتر) ابزار GC-MS (Agilent 6890N/5973I, California, CA, USA) با یک آشکارساز انتخابی جرم برای تشخیص ترکیبات شیمیایی. دمای دستگاه به عنوان اولیه 7{{90}} ◦C تنظیم شد، ۲ دقیقه نگه داشت، تا ۳0}5 ◦C در 20 ◦C/min، و سپس برای 1 دقیقه نگه داشت. کل زمان کار GC روی 45 دقیقه با گاز هلیوم (99.999 درصد) به عنوان گاز حامل (نرخ ثابت 1.2 میلی لیتر در دقیقه)، 250 درجه سانتیگراد به عنوان دمای انژکتور و 230 درجه سانتیگراد به عنوان منبع یون تنظیم شد. درجه حرارت. بر اساس طیف GC-MS، درصد نسبی مولفه مربوطه محاسبه شد و طیف جرمی جزء مجهول با مقایسه با 62،{29}} الگوهای شناخته شده موجود در مؤسسه ملی استاندارد و فناوری شناسایی شد. کتابخانه کامپیوتری (NIST08). 2.3. مواد و مواد شیمیایی کشت سلولی HUVECها از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (ATCC، Manassas، VA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. مواد کشت سلولی مانند محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM)، EDTA، تریپسین و سایرین از Gibco (Paisley، انگلستان) به دست آمد. پنی سیلین-استرپتومایسین (PS) و سرم جنین گاوی (FBS) از آزمایشگاه Hyclone، ایالات متحده آمریکا خریداری شد. مواد شیمیایی مورد استفاده در آزمایش بیولوژی مولکولی از سیگما آلدریچ، به ویژه، MTT [3-(4,{36}}dimethylthiazol{37}}yl){38}}،{39}} به دست آمد. رنگ آمیزی دی فنیل تترازولیوم بروماید]، PI و JC{40}}. SYBR Green PCR Master Mix و کیت سنتز cDNA از Qiagen (Hilden، آلمان) به دست آمد. 2.4. HUVECs HUVECها در DMEM کشت داده شدند و با 1 درصد PS و 10 درصد کمپلکس FBS تکمیل شدند. سلولها در اتمسفر مرطوب در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO2 انکوبه شدند و تقریباً هر 3 روز یکبار کشت فرعی شدند. 2.5. زنده ماندن سلولی و تکثیر سلولی با روش MTT Assay HUVECs (1 × 104 سلول در چاه) با یک محیط نگهدارنده کشت داده شدند و اجازه داده شد تا یک شبه در یک صفحه کشت چاهک بچسبند. سپس، محیط کشت با یک محیط کشت جدید حاوی غلظت های فزاینده BPME (0، 0.05، 0.1، 0.2، 0.4، 0.8، 1.6، و 3.2 میکروگرم بر میلی لیتر) بر اساس نقشه صفحه سنجش MTT جایگزین شد و به مدت 24 و 48 انکوبه شد. h; سلول های تیمار نشده به عنوان شاهد استفاده شدند. پس از دوره انکوباسیون، سلول های تجربی با 20 میکرولیتر در چاه 5 میلی گرم در میلی لیتر MTT (3-[4,5-دی متیل تیازول-2-} yl]-2 تیمار شدند، 5-دی فنیل تترازولیوم بروماید که در دی متیل سولفوکسید (DMSO) حل شد) و به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس محیط دور ریخته شد و فورمازان ارغوانی تولید شده در 100 میکرولیتر DMSO 100 درصد حل شد. جذب محلول با استفاده از میکروپلیت خوان (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) در طول موج 570 نانومتر اندازه گیری شد. درصد (درصد) تکثیر سلولی با معادله زیر محاسبه شد: (جذب نمونه/میانگین جذب شاهد) × 100. 2.6. طراحی آزمایشی با توجه به سنجش تکثیر سلولی حاضر، غلظت پایین‌تر آزمایش‌شده BPME (0.1 و 0.2 میکروگرم در میلی‌لیتر) HUVECs و مورفولوژی میکروتوبول بدون سمیت در حال تکثیر را نشان داد. حجم‌های 0.1 و 0.2 میکروگرم بر میلی‌لیتر BPME انتخاب شد و با HUVECs نرمال و 10 میلی‌مولار HUVECهای تحت استرس اکسیداتیو القا شده به مدت 48 ساعت تیمار شدند تا پتانسیل‌های تکثیر سلولی، ضد التهابی، رگ‌زایی و آپوپتوز مشخص شود. (شکل 1). کنترل وسیله نقلیه نیز به مدت 48 ساعت در هر دو گروه حفظ شد. در هر دو گروه تجربی از کوئرستین (10 میکرومولار) به عنوان کنترل مرجع استفاده شد. پس از انکوباسیون، سلول‌های تیمار نشده و آزمایشی برای مورفولوژی سلولی و هسته‌ای و پتانسیل غشای میتوکندری با استفاده از کیت BDTM MitoScreen (JC{105}}) تجزیه و تحلیل شدند. آپوپتوز با روش مرتب‌سازی سلولی مبتنی بر Annexin V/Apoptosis در سیتومتری همکار تعیین شد. استرس اکسیداتیو، پیش التهابی، و سطح بیان ژن مربوط به رگ زایی مورد بررسی قرار گرفت.

2.7. سنجش رنگ آمیزی یدید پروپیدیوم برای آسیب هسته ای مورفولوژی های سلولی برای آسیب مشخصه هسته ای، پیکنوز یا تغییرات مورفولوژیکی آپوپتوز پس از درمان با 0.1 و 0.2 میکروگرم در میلی لیتر BPME (با یا بدون H2O2) در HUVECs با استفاده از آنالیز رنگ‌آمیزی PI تحت میکروسکوپ فلورسانس معکوس، همانطور که توسط Leite و همکارانش توضیح داده شد، تعیین شد. [27].

2.8. سنجش پتانسیل غشای میتوکندری (∆ψm) با رنگ‌آمیزی JC{2}} پتانسیل غشای میتوکندری (∆ψm) با استفاده از روش JC{3}} برای ارزیابی کارایی میتوکندری در کنترل وسیله نقلیه و {{4} }.1 و 0.2 میکروگرم در میلی لیتر HUVECهای تیمار شده با BPME (با و بدون H2O2). به طور خلاصه، محلول رنگ‌آمیزی JC{11}} با حجم مشابهی از محیط کشت مخلوط شد و سپس به HUVECs تجربی اضافه شد و در تاریکی به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس رنگ JC{14}} به آرامی دو بار با استفاده از 200 میکرولیتر از بافر شستشوی رنگ‌آمیزی JC{16}} در دمای 4 درجه سانتیگراد شسته شد. پس از آن، تجمع j-aggregated در برابر رنگ‌آمیزی JC{19}} در زیر میکروسکوپ فلورسانس با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شد و تصاویر گرفته شد. علاوه بر این، پتانسیل غشای میتوکندری در فلوسیتومتری با استفاده از کیت BDTM MitoScreen (JC{20}}) اندازه‌گیری شد.

2.9. آنالیز Annexin V/apoptosis با استفاده از فلوسایتومتری روش کیت تشخیص Annexin V/PI مبتنی بر سیتومتری (Sigma Chemicals، USA) برای تعیین کمیت سلول‌های زنده، پرواپوپتوز، آپوپتوز اولیه و نکروزه استفاده شد. HUVECهای ناشی از استرس اکسیداتیو (1 × 105/چاه) در 24-صفحه چاهی قرار گرفتند و با BPME (0.1 و 0.2 میکروگرم در میلی لیتر) یا کنترل وسیله نقلیه برای انکوبه شدند. 48 ساعت پس از انکوباسیون، سلول ها در 400 میکرولیتر از 5 میکرولیتر Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) و 5 میکرولیتر PI حاوی بافر اتصال انکوبه شدند. پس از این، سلول ها به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق (RT) در تاریکی نگهداری شدند. سلول‌ها با سیتومتری دیگر (BD Biosciences، San Jose، CA، USA) برای شناسایی سلول‌های آپوپتوز (PI منفی و Annexin V مثبت) و آپوپتوز دیررس (PI مثبت و Annexin V مثبت) تجزیه و تحلیل شدند [28].

2.10. تجزیه و تحلیل کمی PCR Real-Time کیت سلول به cDNA Fastlane® (Qiagen، Hilden، آلمان) برای استخراج RNA کل و سنتز cDNA از کنترل وسیله نقلیه، HUVECهای تیمار شده با BPME (با و بدون H2O2) با استفاده از یک PCR کمی (qPCR) نیمه خودکار استفاده شد. ابزار (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). سطوح بیان استرس اکسیداتیو شامل (پراکسید لیپیدی، NOS-3)، آنتی اکسیدان (Nrf-2، GSK-3 و GPx)، پیش التهابی (فاکتور هسته‌ای-κ (NF-κ)، فاکتور نکروز تومور- (TNF-)، اینترلوکین{13}} (IL{14}})، فاکتور رشد سلولی عروقی (VEGF)، گیرنده شبه تلفات-4 (TLR-4)) ژن‌های مرتبط با التهاب عروقی (مولکول چسبندگی داخل سلولی (ICAM)، مولکول چسبندگی سلول‌های عروقی (VCAM)، EDN1 و اکسید نیتریک اندوتلیال سنتاز (eNOS)) و ژن مرجع، -اکتین، در HUVECs مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و با روش کمی‌سازی شدند. یوان و همکاران [29]. مقادیر تقویت (∆Ct) با تفاوت بین Ct (درمان شده) و Ct (شاهد) محاسبه شد. بیان ژن با استفاده از بیان مقدار 2-∆∆Ct رسم شد.

2.11. تجزیه و تحلیل آماری همه آزمایش ها سه برابر شدند و داده های حاصل به صورت مقادیر میانگین ± انحراف استاندارد (SD) بیان شد. تجزیه و تحلیل آماری تفاوت ها بین گروه ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) با استفاده از نرم افزار SPSS (نسخه 28.5، SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) انجام شد. سپس در صورت مشاهده تفاوت معنی دار، آزمون مقایسه چندگانه توکی انجام شد. تمامی نتایج به عنوان میانگین ± انحراف معیار برای شش تکرار در هر گروه ارائه شد. مقدار p < 0.05="" نشان="" دهنده="" در="" نظر="" گرفته="" شد="">

سیستانچ برای بهبود ایمنی

3. نتایج

3.1. مولکول‌های فعال زیستی در BPME ترکیبات شیمیایی BPME با استفاده از GC-MS (Turbomass، PerkinElmer) تأیید شدند. ترکیب شیمیایی عصاره پوست چغندر با مقایسه طیف جرمی موجود با پایگاه داده طیفی موسسه ملی استاندارد و فناوری (NIST) تعیین شد. نتایج GC-MS تأیید کرد که BPME حاوی هیدروکسی استون (8.18 درصد)، 5-هیدروکسی متیل فورفورال (32.6 درصد)، متیل پیروات (15.13 درصد)، بتا-d-آلوپیرانوز (1.48 درصد)، فورفورال (9.98 درصد)، 2-هیدروکسی-گاما-بوتیرولاکتون (1.32 درصد) و 2،3-دی هیدرو-3،5-دی هیدروکسی{26}}متیل{27}}H-Pyran -4-یک (12.4 درصد؛ شکل 2a، جدول 1). 3.2. تکثیر سلولی پتانسیل تکثیر سلولی در شرایط آزمایشگاهی BPME در برابر HUVECs در شکل 2b ارائه شده است. مهار رشد سلولی قابل توجهی در گروه های تجربی در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نشد. در مطالعه حاضر تأیید شد که افزایش غلظت BPME تیمار شده با HUVECs منجر به افزایش تکثیر و زنده ماندن سلولی پس از 48 ساعت (112 درصد) در مقایسه با 24 ساعت (1{51}}3 درصد) درمان شد. علاوه بر این، تصاویر میکروسکوپی نوری HUVEC های تیمار شده با BPME پس از 48 ساعت سلول های نرمال را با شکل یکنواخت مورفولوژی سلولی چسبنده تایید کرد، افزایش تعداد سلول های در حال تکثیر (تکثیر) بدون هیچ آسیبی آشکار شد (شکل 2c). 3.3. تجزیه و تحلیل مورفولوژی سلولی و هسته‌ای، تشکیل میکروتوبول، و رنگ‌آمیزی JC{46}} در HUVECs شکل 3 مورفولوژی توسعه میکروتوبول‌ها را در تصاویر میکروسکوپی فلورسانس FL نشان می‌دهد. HUVEC های تحت استرس اکسیداتیو ناشی از H2O در مقایسه با HUVEC های کنترل، تکثیر ضعیف و مورفولوژی نامنظم سلول های چسبنده را نشان دادند. HUVECهای نرمال تیمار شده با 0.2 میکروگرم در میلی لیتر BPME سلولهای در حال تکثیر را از طریق تکثیر یا نئوژنز با مورفولوژی میکروتوبول نشان دادند. در همین حال، دوز 0.1 میکروگرم بر میلی‌لیتر سلول‌های تیمار شده با BPME، 100 درصد سلول‌های چسبنده با مراحل اولیه میکروتوبول‌ها را نشان داد. HUVEC های تحت استرس اکسیداتیو تیمار شده با 0.2 میکروگرم در میلی لیتر BPME سلول های جدید در حال تکثیر را با مورفولوژی میکروتوبول شناسایی کردند و آسیب سلولی اکسیداتیو را کاهش دادند. علاوه بر این، 0.1 میکروگرم در میلی لیتر BPME نیز مورفولوژی سلول های عروقی طبیعی را با سلول های در حال تکثیر افزایش داد.

شکل 4a مورفولوژی طبیعی ساختار هسته ای را با شکل کروی در کنترل و HUVEC های تیمار شده با BPME (0.1 یا 0.2 میکروگرم/میلی لیتر) نشان می دهد. شکل 4b تصاویر رنگ آمیزی PI از نرمال و HUVECs با استرس اکسیداتیو ناشی از H2O2 را نشان می دهد. HUVECهای تیمار شده با H2O{{1{12}}}} هسته‌هایی با اشکال نامنظم را نشان می‌دهند که بعد از ۳0 دقیقه، تراکم و پیکنوز را نشان می‌دهند. با این حال، 0.2 میکروگرم در میلی لیتر از تیمار BPME برای HUVECs تحت استرس اکسیداتیو هسته‌های دایره‌ای با مورفولوژی طبیعی را نشان داد. در مقایسه با 0.2 میکروگرم در میلی لیتر عصاره BPME، 0.1 میکروگرم در میلی لیتر BPME اثر محافظتی کمتری در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از H2O در HUVECها داشت.

شکل 2. نتایج کروماتوگرام GC-MS عصاره متانولی پوست چغندر (a)، تکثیر سلولی در شرایط آزمایشگاهی (b)، و تصاویر میکروسکوپ نوری برای مورفولوژی سلولی (c) در HUVECs، تیمار شده با افزایش غلظت عصاره متانولی پوست چغندر (BPME) ) (شکل یکنواخت سلولهای چسبنده و در حال تکثیر که با نوک پیکان قرمز ذکر شده است). همه مقادیر میانگین ± SD (n=6) هستند. * p کمتر یا مساوی 0.05 در مقایسه با کنترل خودرو.

شکل 3. تجزیه و تحلیل تشکیل میکرولوله بر اساس میکروسکوپ فلورسانس در کنترل وسیله نقلیه، 0.1 و 0.2 میکروگرم در میلی لیتر دوز عصاره متانولی پوست چغندر (BPME) تیمار شده نرمال و H2O{6} HUVECهای تحت استرس اکسیداتیو را پس از 48 ساعت القا کرد. پس از 48 ساعت، HUVECهای تحت استرس اکسیداتیو ناشی از H2O در مقایسه با کنترل وسیله نقلیه، مورفولوژی تغییر یافته ای نشان دادند. حجم‌های 0.1 و 0.2 میکروگرم بر میلی‌لیتر از عصاره متانولی پوست چغندر (BPME) HUVECs مورفولوژی طبیعی با میکروتوبول‌های عروقی با سلول‌های در حال تکثیر شبیه مورفولوژی رایج رفتار سلول‌های عضله صاف را نشان دادند.

شکل 4. تجزیه و تحلیل رنگ آمیزی یدید پروپیدیوم (PI) برای مورفولوژی هسته ای در کنترل وسیله نقلیه، 0.1 و 0.2 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره متانولی پوست چغندر (BPME) با تیمار نرمال (3a) و H2O{8}} HUVECهای تحت استرس اکسیداتیو (3b) را پس از 48 ساعت القا کرد. در رنگ آمیزی پی، کنترل وسیله نقلیه نشان داد که هسته طبیعی به نظر می رسد و هیچ نشانه ای از کوچک شدن، پیکنوز یا هسته آپوپتوز وجود ندارد. تنها در H2O2، سلول های تیمار شده پس از 48 ساعت یک غشای هسته ای پلاریزه را نشان دادند. تیمار با 0.2 میکروگرم در میلی‌لیتر BPME، قطبش غشای هسته‌ای ناشی از H2O{18}}را در مقایسه با 0.1 میکروگرم/میلی‌لیتر BPME یا کوئرستین 10 میکرومولار عادی کرد.

شکل 5a نتایج رنگ آمیزی JC-1 را برای HUVECها، از جمله سلول های کنترل و تیمار شده با BPME نشان می دهد. شکل سلول‌های سالم با میتوکندری فعال را نشان می‌دهد، همانطور که توسط جذب میتوکندری با بار منفی کاتیونی چربی دوست خارج میتوکندری JC{3}} (رنگ سبز) و دانه‌های J تبدیل شده با رنگ قرمز درون میتوکندری تأیید می‌شود. شکل 5b نتایج رنگ‌آمیزی JC{7}} را برای 0.2 میکروگرم در میلی‌لیتر BPME تجویز شده به HUVECs با استرس اکسیداتیو ناشی از H2O2 نشان می‌دهد. نتایج نشان داد که تقریباً 94 درصد از میتوکندری‌های دارای بار منفی، کاتیونی چربی دوست JC{13}} (رنگ سبز) را در مقایسه با 0.1 میکروگرم در میلی‌لیتر BPME (61.4 درصد) به دانه‌های J رنگ قرمز تبدیل کردند. یا استرس اکسیداتیو ناشی از H2O در HUVECs (2 درصد). پتانسیل غشای میتوکندری (MMP) در سلول‌های تحت درمان با BPME در مقایسه با داروی مرجع کورستین بالاتر بود. 3.4. تجزیه و تحلیل پتانسیل غشای میتوکندری با کمک FACS (∆ψm؛ BD MitoScan) و Annexin V/apoptosis در HUVECs. و HUVECs با استرس اکسیداتیو ناشی از H2O2. ما دریافتیم که 0.2 میکروگرم بر میلی لیتر از تیمار BPME، MMP (∆ψm) را به 3.7 ± 92.7 درصد در مقایسه با HUVECs تیمار شده با H2O2 به تنهایی (7.2 ± 27.9 درصد) افزایش داد. در مقابل، سلول‌های تیمار شده با کوئرستین در مقایسه با HUVECهایی که با BPME و H2O2 یا H2O2 به تنهایی تیمار شده بودند، 41.4 ± 1.6 درصد درصد افزایش MMP (∆ψm) را نشان دادند.

شکل 5. تجزیه و تحلیل پتانسیل غشای میتوکندری با استفاده از رنگ‌آمیزی JC{1}} برای کنترل وسیله نقلیه، 0.1 و 0}.2 میکروگرم در میلی‌لیتر از عصاره متانولی پوست چغندر (BPME) تیمار شده نرمال (a ) و HUVECهای تحت استرس اکسیداتیو (ب) پس از 48 ساعت H2O{7}}القاء شدند. JC{{10}}تصاویر فلورسانس که تصاویر ادغام شده از سیگنال‌های قرمز و سبز رنگ را نشان می‌دهد، مطابق با JC-1 به شکل J-aggregates در مقابل مونومر. ما دانه‌های J کمتری را یافتیم که H2O2 به تنهایی درمان شده با HUVECs. در 0.2 میکروگرم در میلی‌لیتر HUVEC تیمار شده با BPME، تجمعات j بالایی را نشان می‌دهد که مستقیماً پتانسیل غشای میتوکندری بالا (MMP، ∆ψm) بالا را در مقایسه با 0.1 میکروگرم در میلی‌لیتر BPME یا 10 میکرومولار کوئرستین نشان می‌دهد.

4. بحث

در اثر استرس خارج سلولی یا درون سلولی، فراهمی زیستی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) از دفاع آنتی اکسیدانی سبقت می‌گیرد و استرس اکسیداتیو سیگنال‌دهی و کنترل ردوکس را مختل می‌کند [31]. ایجاد استرس اکسیداتیو با پاتوژنزهای اختلالات مزمن مانند بیماری های نورودژنراتیو، دیابت و تصلب شرایین مرتبط است. از جمله استرس اکسیداتیو باعث شروع اختلال عملکرد اندوتلیال و ترویج التهاب سیستمیک و جذب ماکروفاژها می شود [32]. سلول‌های ایمنی فعال شده به داخل عروق مهاجرت می‌کنند و سیتوکین‌ها و کموکاین‌ها را آزاد می‌کنند که با انقباض عروق و بازسازی عروق خونی سلول‌های عضلانی صاف و التهاب روی سلول‌های ماهیچه صاف عروق و دیواره عروقی تأثیر می‌گذارد [33]. افزایش استرس اکسیداتیو عروقی با آسیب عروقی، سفتی سلول های ماهیچه صاف و ناهنجاری های ساختاری الاستین پایان می یابد. علاوه بر این، استرس اکسیداتیو عروقی در سایر شرایط پاتولوژیک مانند چاقی احشایی یا آترواسکلروز به دلیل افزایش فعالیت NADPH اکسیداز (NOX{3}}) در بافت چربی اطراف عروقی تحریک شده است [34]. استرس اکسیداتیو عروقی باعث تغییرات اپی ژنتیکی اصلی می شود که در طول پیری رخ می دهد و با یک فرآیند پیری زودرس به پایان می رسد [35]. توسعه تولید ROS و استرس اکسیداتیو در سیستم بیولوژیکی تا حد زیادی به اختلال عملکرد میتوکندری، علاوه بر NOX{6}}، گزانتین اکسیداز اندوتلیال، eNOS غیر جفت نشده و لیپوکسیژناز بستگی دارد [36]. خواص آنتی اکسیدانی عوامل رژیمی ممکن است تولید ROS را از طریق افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی خنثی کند [26]. عصاره جینکو بیلوبا با کاهش تولید ROS و فعالیت لیپوکسیژناز در اختلال عملکرد اندوتلیال ناشی از OxiLDL در برابر پیشرفت آترواسکلروز محافظت می کند [37]. علاوه بر این ترکیبات فنلی مختلف وفلاونوئیدها ازگیاهان و غلات خوراکی این خاصیت را دارند که ROS و پراکسیداسیون لیپیدی را از بین ببرند [38]. عصاره متانولی پوست چغندر (بتا ولگاریس) به دلیل در دسترس بودن فیبر بالا، آنتوسیانین ها و فلاونوئیدهایی مانند ویتکسین و بتانین دارای پتانسیل آنتی اکسیدانی است [39]. در مطالعه حاضر، BPME برای شناسایی رویکرد مکانیکی وابسته به میتوکندری برای کشف اثر آن بر پتانسیل غشای میتوکندری، خاموش کردن LPO، و مهار سطوح بیان mRNA مربوط به التهاب عروقی انتخاب شد. سنجش MTT تایید کرد که BPME به طور قابل توجهی تکثیر سلولی را افزایش می‌دهد، همانطور که با افزایش یکپارچگی هسته‌ای در رنگ‌آمیزی PI با دوز مؤثر 0.2 میکروگرم بر میلی‌لیتر BPME در مقابل آزمایش‌شده 0، میکروگرم در میلی‌لیتر تأیید شد. BPME شناسایی دوز موثر با غلظت کم و بیشترین فعالیت ممکن است از نظر فیزیولوژیکی بی خطر در نظر گرفته شود. ما رنگ‌آمیزی میکروسکوپی فلورسانس FL را در JC{8}} پیدا کردیم، و پتانسیل غشای میتوکندری در هر دو حالت طبیعی و H2O{1{12}}} پس از 0.2 میکروگرم در میلی‌لیتر BPME با تحریک بیرونی تحریک‌شده با استرس اکسیداتیو بازسازی شد. رفتار. اختلال عملکرد میتوکندری، فسفوریلاسیون اکسیداتیو را تغییر می دهد، که نمی تواند رادیکال های اکسیژن (O2·-) را توسط گلوتاتیون پراکسیداز به H2O2 و H2O تبدیل کند. به دلیل سم زدایی ناکافی ROS یا تولید کنترل نشده ROS، افزایش استرس اکسیداتیو میتوکندری با آترواسکلروز مرتبط است [40]. عصاره پوست چغندر به طور موثر پتانسیل غشای میتوکندری را بازسازی کرد که با موفقیت سم زدایی ROS و تولید H2O2 را افزایش داد. آنالیز رنگ‌آمیزی Annexin V/PI تأیید کرد که تیمار BPME درصد سلول زنده را حفظ کرده و مرحله تکثیر سلولی را هم در HUVECs و هم HUVECs با استرس اکسیداتیو ناشی از H2O2 افزایش می‌دهد. در این زمینه، چو و همکاران. [41] تایید کرد که پس از تولید ROS بیش از حد یا H2O2 اگزوژن در محل ایسکمیک، سلول‌های بنیادی مزانشیمی پیوندی (MSCs) ممکن است تکثیر خود و ظرفیت چند دودمانی را مختل کنند. در طب بازساختی، سلول‌های عضلانی صاف عروقی از طریق حفظ مقاومت شریانی محیطی، تنظیم‌کننده‌های فشار خون، همخون و ترمیم شریان‌ها، تنظیم‌کننده‌های اصلی شریان‌های تن انقباضی هستند [42]. علاوه بر این، مدولاسیون فنوتیپ ناشی از سن ECs با کاهش انقباض سلولی و افزایش پیری سلول همراه است. با استرس مداوم یا به دلیل کاهش حساسیت مکانیکی، کاهش انطباق سیگنال‌های ریزمحیط در سلول‌های عضله صاف مسن شناسایی می‌شود [43]. نتایج حاضر تایید کرد که درمان BPME جمعیت سلولی زنده را حفظ می‌کند، همانطور که ظرفیت رگزایی نشان می‌دهد. ظرفیت تکثیر شناسایی شده BPME در HUVECs با کاهش بیان LPO و افزایش بیان ژن آنتی اکسیدانی پشتیبانی شده است. ROS و LPO در ابتدا از کمپلکس میتوکندریایی (I و III) و NOX{31}} در طی تکثیر یا تمایز سلولی تولید می‌شوند [44]. ROS بیش از حد واکنش نشان می دهد و به بیومولکول ها آسیب می رساند، به ویژه یکپارچگی DNA ژنومی را تغییر می دهد، که برای تکثیر و عملکرد سلولی حیاتی است [45]. با این حال، تایید شده است که دریافت رژیم غذایی پلی فنول های آنتی اکسیدانی، مانند اپی گالوکاتچین و توکوفرول، از سلول ها در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می کند و ظرفیت تکثیر را افزایش می دهد [46]. در مطالعه ما، سطوح بیان mRNA LPO کاهش یافت و NOS{35}}، Nrf{36}} و eNOS دو برابر در HUVECs با استرس اکسیداتیو ناشی از H2O2 افزایش یافت. eNOS ایزوفرم غالب NOS است که مسئول اکثر محصولات NO· در سلول های ماهیچه صاف و بافت های عروقی است. NO· تمام انواع عروق عروقی را گشاد می کند و از تجمع پلاکت ها و چسبندگی لکوسیت ها در EC ها محافظت می کند [47]. تاکنون گزارش‌های متناقض زیادی در مورد عوامل خطر قلبی عروقی وجود داشته است و اختلال عملکرد اندوتلیال با کاهش یا افزایش بیان eNOS همراه بوده است [48]. افزایش بیان eNOS در بیماری عروقی مشاهده شد که احتمالاً نتیجه تولید بیش از حد H2O2 است. O2·-، یک محصول تغییر جهش، ممکن است بیان eNOS را از طریق مکانیسم های رونویسی و پس از رونویسی افزایش دهد [49]. پاتوژنز بیماری عروقی با تخریب سریع NO· پس از واکنش با O2·- و در نهایت شکل ONOO- همراه است که منجر به جدا شدن eNOS و اختلال عملکرد آنزیم NOX می شود [50]. استرس اکسیداتیو توسط آنزیم های آنتی اکسیدانی سرکوب شده است و سطوح mRNA GSK{49}} و GPX پس از درمان BPME افزایش یافته است. BPME حاوی مواد شیمیایی گیاهی متعددی است که از نظر بیولوژیکی فعال هستند، از جمله بتالین ها، فلاونوئیدها، پلی فنول ها، آنزیم های درمانی، اسید اسکوربیک، اسید دهیدروآسکوربیک (DHAA) و نیترات معدنی (NO3) و اینها ممکن است در افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی در HUVECs نقش داشته باشند. در این زمینه، چا و همکاران. (2014) [51] گزارش کرد که اسید کلروژنیک به طور موثری در برابر آسیب DNA ناشی از استرس اکسیداتیو در کراتینوسیت های انسانی محافظت می کند. اندوتلین{54}} (Edn-1)، منقبض کننده عروق مشتق از اندوتلیوم، مهاجرت سلول های ماهیچه صاف را انجام می دهد و به عنوان یک عامل ضد آپوپتوز در سلول های دارای استرس ناشی از اکسید نیتریک عمل می کند [52،53]. فرآیندهای بازسازی عروقی، مهاجرت، تکثیر و تجمع ماتریکس خارج سلولی توسط Edn{60}} و NO [54،55] تحریک شده است. ما افزایش بیان Edn-1 را پس از درمان BPME در HUVECs با استرس اکسیداتیو مشاهده کردیم. با استرس اکسیداتیو یا تجمع LPO، مرحله اولیه التهاب عروقی، چسبندگی لکوسیت ها به سلول های عضله صاف اندوتلیال است، که برای رویدادهای مهم ایسکمی و آترواسکلروز برجسته است [56]. این توسط عبارات VCAM و ICAM واسطه می شود. توسط بسیاری از کموکاین‌ها و عوامل کموتاکسی مانند NF-kB، IL{66}} و بیان TNF- تحریک شده است [57]. مهار فعال‌سازی IL{69}} و به دنبال آن بیان مولکول چسبندگی توسط ترکیب فنولیک رژیم غذایی الاژیک اسید حاصل شده است [58]. درمان با BPME برای HUVEC های تحریک شده خارجی با استرس اکسیداتیو به طور قابل توجهی باعث کاهش فاکتورهای پیش التهابی خاص سلول های عروقی مانند VCAM، ICAM، NF-κB، IL{73}} و سطوح بیان TNF شد. در این زمینه، کرسپو و همکاران. [59] گزارش کردند که کامفرول و کورستین به ترتیب ژن های پیش التهابی مانند VCAM، ICAM، NF-κB و IL{78}} را مهار می کنند. به طور کلی، مهار استرس اکسیداتیو و پتانسیل بیان ژن مربوط به التهاب عروقی BPME بیان فاکتورهای رشد سلول های عروقی را مورد علاقه قرار داد و به طور بالقوه به تکثیر و رشد سلول های عروقی کمک کرد.

5. نتیجه گیری ها

یافته‌های حاضر تأیید می‌کنند که افزایش بیان ژن‌های آنتی‌اکسیدانی با فرونشاندن استرس اکسیداتیو همراه بوده و به غلبه بر اختلال در تکثیر HUVEC و رگ‌زایی کمک می‌کند. سیر سیاه حاوی هیدروکسی متیل فورفورال اثر التهابی چسبندگی سلول های مونوسیتی ناشی از TNF به HUVECs را سرکوب می کند و بیشتر تولید ROS، بیان VCAM{1}} و فعال سازی NF-kB را سرکوب می کند [60]. علاوه بر این، او و همکاران. [61] تایید کرد که هیدروکسی متیل فورفورال پتانسیل محافظت از EC ها را از هیپوکسی دارد. همچنین مشخص شده است که پوست چغندر حاوی فلاونوئیدها، فوران و ترکیبات آنتی اکسیدانی مانند 5-هیدروکسی متیل فورفورال، متیل پیروات، فورفورال، و 2،3-دی هیدرو-3،5- است. دی هیدروکسی{10}}متیل-4H-Pyran-4-one; این اجزا مسئول افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی و سرکوب مولکول های چسبنده سلول های عضله صاف عروقی پیش التهابی هستند. پوست چغندر به عنوان یک محرک برای استخرهای آنتی اکسیدانی برای خاموش کردن محرک خارجی یا محرک پاتولوژیک داخلی استرس پراکسیداتیو سلولی استفاده شده است. یافته‌های ما نشان داد که اجزای چغندر به کاهش استرس متابولیک و التهاب در HUVECها کمک می‌کند، که ممکن است برای تکثیر سلول‌های عروقی و رگ‌زایی مفید باشد.

مشارکت نویسنده:

مفهوم سازی، LNA-H. و S.-BP; روش، LNA-H. و S.-BP; نرم افزار، GS; اعتبار سنجی، LNA-H. و S.-BP; تجزیه و تحلیل رسمی، S.-BP، AMA-D.، AAA (Ali A Alshatwi)و GS. بررسی، LNA-H.، S.-BP و AMA-D. منابع، LNA-H.; بررسی داده ها، S.-BP و LNA-H. نوشتن - آماده سازی پیش نویس اصلی، LNA-H. و S.-BP; نوشتن-بررسی و ویرایش، LNA-H.، AMS، GS و AAA (Amna Abdullah Alotiby); تجسم، S.-BPand AAA (Ali A Alshatwi); نظارت، LNA-H.، و S.-BP. مدیریت پروژه، LNA-H. کسب بودجه، LNA-H. همه نویسندگان نسخه منتشر شده نسخه خطی را خوانده و با آن موافقت کرده اند. بودجه: نویسندگان قدردانی خود را از ریاست تحقیقات علمی دانشگاه پادشاه سعود برای تأمین مالی این کار از طریق گروه تحقیقاتی بدون RG-1442-432 ابراز می دارند. بیانیه هیئت بررسی نهادی: قابل اجرا نیست. بیانیه رضایت آگاهانه: قابل اجرا نیست. بیانیه در دسترس بودن داده ها : داده های ارائه شده در این مطالعه به درخواست نویسنده مسئول در دسترس است. تضاد منافع: هیچ تضاد منافعی برای این مطالعه وجود ندارد.

منابع

1. عبدالملکی، ز. عرب، ح.-ع. امانپور، س. محمدنژاد، س. اثرات ضد رگ زایی عصاره اتانولی گیاه درمنه در مقایسه با ماده مؤثر آن آرتمیسینین. سوتین کشیش. فارماکگن. 2016، 26، 326-333. [CrossRef]
2. یو، سی. Kwon، SM Angiogenesis و فرصت های درمانی آن. واسطه التهاب 2013، 2013، 127170. [CrossRef] [PubMed]
3. Folkman، J. Angiogenesis در سرطان، عروق، روماتوئید و بیماری های دیگر. نات. پزشکی 1995، 1، 27-31. [CrossRef]
4. هوبن، ا. لاندویت، بی. هایلی، ام اس؛ وایلدیرز، اچ. Van Oosterom، AT; De Bruijn، EA فاکتور رشد اندوتلیال عروقی و رگزایی. داروسازی Rev. 2004, 56, 549-580. [CrossRef]
5. فرارا، ن. Alitalo, K. کاربردهای بالینی فاکتورهای رشد رگ زایی و مهارکننده های آنها. نات. پزشکی 1999، 5، 1359–1364. [CrossRef]
6. Galley, HF; وبستر، NR فیزیولوژی اندوتلیوم. برادر جی. آنیست. 2004، 93، 105-113. [CrossRef]
7. اونات، د. بریلون، دی. کلمبو، رایانه شخصی؛ اشمیت، AM سلول های اندوتلیال عروقی انسان: یک سیستم مدل برای مطالعه التهاب عروقی در دیابت و آترواسکلروز. Curr. Diabetes Rep. 2011، 11، 193-202. [CrossRef] [PubMed]
8. Packard, RR; لیبی، P. التهاب در آترواسکلروز: از زیست شناسی عروقی تا کشف نشانگرهای زیستی و پیش بینی خطر. کلین. شیمی. 2008، 54، 24-38. [CrossRef]
9. Esper، RJ; نوردبی، RA؛ ویلارینو، جو. پاراگانو، ا. کاچارون، جی ال. Machado، RA اختلال عملکرد اندوتلیال: یک ارزیابی جامع. قلب و عروق. دیابت. 2006، 5، 4. [CrossRef]
10. بودین، بی. برونیل، آ. بوسلوت، ن. Vaubourdolle، M. یک پروتکل برای جداسازی و کشت سلولهای اندوتلیال ورید نافی انسان. نات. پروتکل 2007، 2، 481-485. [CrossRef] [PubMed]
11. کائو، ی. Cao, R. Angiogenesis با نوشیدن چای مهار شد. Nature 1999, 398, 381. [CrossRef] [PubMed]
12. ین، G.-C.; Duh، P.-D. تسای، اچ.-ال. خواص آنتی اکسیدانی و پرواکسیدانی اسید اسکوربیک و اسید گالیک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2002، 79، 307-313. [CrossRef]
13. دالاریا، ر. ورما، ر. کومار، دی. پوری، س. تپوال، ع. کومار، وی. نپوویمووا، ای. Kuca, K. ترکیبات زیست فعال میوه های خوراکی با خواص ضد پیری آنها: یک بررسی جامع برای افزایش طول عمر انسان. آنتی اکسیدان ها 2020، 9، 1123. [CrossRef] [PubMed]
14. Baião، DdS; دا سیلوا، دی. دل آگویلا، EM; Paschoalin، VMF ویژگی های تغذیه ای، زیست فعال و فیزیکوشیمیایی فرمولاسیون های مختلف چغندر. معتاد به غذا 2017، 6. [CrossRef]
15. لالوند، آر. Roitberg، B. در مورد تکامل رفتار جفت گیری در درختان: شکار یا آب و هوا؟ صبح. نات. 1992، 139، 6. [CrossRef]
16. سیلوا، د. Baiao، DDS؛ فریرا، VF; Paschoalin، VMF Betanin به عنوان تعدیل کننده استرس اکسیداتیو و التهاب چند مسیره: رنگدانه چغندر با اثرات محافظتی بر پاتوژنز بیماری های قلبی عروقی. کریت Rev. Food Sci. Nutr. 2020، 1-16. [CrossRef]
17. Baiao، DDS; سیلوا، دی. Paschoalin، VMF سبزی قابل توجه: محتوای نیترات و فیتوشیمیایی آن را می توان در فرمول های جدید تنظیم کرد تا برای سلامتی مفید باشد و از درمان های بیماری های قلبی عروقی حمایت کند. Antioxidants 2020, 9, 960. [CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar, EA; هگازی، NM; سعد، ح. سلیمان، م.م. الری، MA; شهاتا، اس ام. برکات، ع. یاسر، ع. Sobeh, M. HPLC-ESI- تجزیه و تحلیل MS/MS برگ چغندر (بتا ولگاریس) و خواص مفید آن در موش های صحرایی دیابتی نوع 1. بیومد. داروساز. 2019, 120, 109541. [CrossRef]
19. سینگ، بی. ناتان، BS ترکیب شیمیایی، خواص عملکردی، و پردازش چغندر - بررسی. بین المللی J. Sci. مهندس Res. 2014، 5، 679.
20. نینفالی، ص. آنجلینو، دی. پتانسیل غذایی و عملکردی بتا ولگاریس سیکلا و روبرا. فیتوتراپیا 2013، 89، 188-199. [CrossRef]