کمبود کالرتیکولین بیوژنز ریبوزوم را مختل می کند و منجر به تاخیر در رشد کلیه جنینی می شود

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصه

نفروژنز توسط مسیرهای سیگنالینگ پیچیده ای که رشد و تمایز سلولی را کنترل می کنند هدایت می شود. شبکه آندوپلاسمی چپرون کالرتیکولین (Calr) به دلیل عملکردش در ذخیره کلسیم و تا کردن گلیکوپروتئین ها به خوبی شناخته شده است. نقش آن درکلیهتوسعه هنوز درک نشده است. ما شواهدی برای نقش محوری Calr در نفروژنز در این تحقیق ارائه می‌کنیم. ما نشان می‌دهیم که کمبود Calr منجر به ایجاد اختلال در یک ناحیه نفروژنیک دست‌نخورده و به تأخیر افتادن نفروژنز می‌شود، همانطور که با اختلال در تشکیل بدن‌های کاما و s شکل مشهود است. با استفاده از روش‌های پروتئومیکس و رونویسی، نشان دادیم که علاوه بر تغییر در پروتئین‌های کلیدی سیگنال‌دهنده Wnt، جنینیکلیه هااز Calr // یک اختلال کلی در بیان پروتئین های ریبوزومی نشان داد که اختلال در سنتز پروتئین و نفروژنز را نشان می دهد. ناک اوت با واسطه CRISPR/cas9 تأیید کرد که کمبود Calr با کمبود چندین پروتئین ریبوزومی و پروتئین های کلیدی در بیوژنز ریبوزوم مرتبط است. داده های ما ارتباط مستقیم بین بیان Calr و بیوژنز ریبوزوم را برجسته می کند.

مقدمه

کلیهارگانوژنز با توالی رویدادهای مورفوژنتیکی مشخص می شود که توسط رشد و تمایز سلولی هدایت می شود. در طی نفروژنز، انتقال مزانشیمی-اپیتلیال (MET) و انشعاب جوانه حالب (UB) که نتیجه القای متقابل بین UB و مزانشیم متانفریک (MM) [1] است، نیروهای محرک برای تشکیل نفرون هستند. در طول این فرآیند، یک تعامل پیچیده و متقابل از مسیرهای سیگنالینگ مختلف برای هماهنگ کردن تمایز اپیتلیال و تشکیل نفرون ضروری است [1-3]. در میان مسیرهای کلیدی در این فرآیند، سیگنال‌دهی فاکتور نوروتروفیک مشتق از گلیا (Gdnf) از طریق گیرنده Ret، نقش اصلی را در طول فرآیندی به نام جوانه زدن حالب ایفا می‌کند. اختلال در این سیگنالینگ ممکن است باعث حالب نابجا یاکلیهagenesis زمانی که سیگنالینگ به طور کامل وجود ندارد [4]. جدا از سیگنال دهی Gdnf/Ret، سیگنال دهی متعارف Wnt/ -catenin برای هماهنگ کردن جنبه های مختلف شناخته شده است.کلیهتوسعه در هر دو MM و UB [5] و مهار سیگنالینگ Wnt متعارف در اصل و نسب جوانه حالب و اجداد نفرون منجر بهکلیهagenesis [6]. حفظ برنامه ریزی مجدد رونویسی در طول نفروژنز به دسترسی کروماتین بستگی دارد [7]. ما نشان دادیم که پروتئین‌های هتروکروماتین، که در تنظیم اپی ژنتیکی خاموش کردن ژن نقش دارند، برای حفظ تعادل بین فعال‌کننده‌های شاخه‌ای و مهارکننده‌ها در مراحل اولیه توسعه ضروری هستند [7].

CISTANCHE عملکرد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

Calreticulin (Calr) یک همراه ناسازگار از شبکه آندوپلاسمی (ER) با ظرفیت اتصال کلسیم بالا و میل ترکیبی کم است که برای جداسازی Ca2 به علاوه در ER و فرآیندهای سلولی مختلف از جمله انتقال سیگنال، بیان ژن و قاچاق پروتئین بسیار مهم است. [8،9]. مکانیسم‌هایی که به نقش Calr در بیماری‌ها می‌پردازند، عمدتاً مبتنی بر کیلاسیون Ca2 به‌علاوه توسط دامنه C ترمینال اتصال Ca2 به‌علاوه Calr و نقش آن در پاسخ پروتئین بازشده (UPR) است [10،11]. UPR می‌تواند نقش محافظ سلولی را در طول چالش با پروتئین‌های تاشو اشتباه بازی کند یا می‌تواند برای سلول‌ها مضر باشد زیرا سیگنال‌دهی پایدار UPR باعث آپوپتوز می‌شود. اگرچه مطالعات کمی به نقش بالقوه Calr در بیماری ها از طریق تنظیم رونویسی پرداخته است، عملکرد ER چپرون Calr یکی از مکانیسم های حیاتی برای سرنوشت سلول باقی مانده است [9،12]. استرس طولانی مدت ER و تاخوردگی اشتباه پروتئین در موارد مختلف برجسته استبیماری های کلیویمانند گلومرولوپاتی، حادآسیب کلیهنفروپاتی دیابتی،کلیهفیبروز و مزمنبیماری کلیوی[13،14]. نقش Calr در رشد جنینی هنوز مشخص نیست. ناک اوت Calr باعث مرگ جنینی در مرحله رشد E14.5 به دلیل اختلال در رشد قلبی می شود [15]. پیامدهای کمبود Calr بر مکانیسم‌های مولکولیکلیهرشد جنینی، با این حال، هنوز به طور کامل درک نشده است. در مطالعه حاضر ما آنالیزهای ترانسکریپتومی و پروتئومیک جنینی را انجام دادیمکلیهاز سه ژنوتیپ Calr plus / plus، Calr plus // و Calr// و تأثیر ناک اوت Calr بر نفروژنز و بیان پروتئین های ریبوزومی را برجسته کرد.

کلید واژه ها:کمبود کالرتیکولین؛ نفروژنز بیوژنز ریبوزومی، کلیه، کلیه

2. نتایج

2.1. نتایج ناک اوت کالرتیکولین در ناهنجاری های مورفولوژیکی و بافتی کلیه و اختلال در انشعاب کلیه

ناک اوت ژنتیکی Calr در موش باعث مرگ زودرس جنینی به دلیل نقص دیواره بین بطنی می شود [15]. به منظور بررسی اینکه آیا Calr ناک اوت تأثیر می گذارد یا خیرکلیهرشد، جنین های موش در مرحله E13.5 از Calr plus // موش باردار تهیه شد (شکل 1A). جنین Calr// تغییرات رشد قابل توجهی را در مقایسه با Calr plus / plus و Calr plus // نشان داد و اختلال قابل توجهی در رشد جنین نشان داد. مورفولوژی ناخالص جنین وکلیه هاکاهش قابل توجهی در اندازه بین Calr plus / plus و Calr-// موش با Calr// نشان داد که بیشترین ناهنجاری را نشان می دهد (شکل 1A). برای نشان دادن تاثیر ناک اوت Calr درکلیهنمو و ساختار، جنین ها در سه مرحله مختلف رشد (E13.5، E14.5، E16.5) و از سه ژنوتیپ (Calr plus / plus، Calr plus // و Calr//) قربانی شدند وکلیه هابدست آمدند. مقاطع بافتی مراحل مختلف رشد را نشان دادندکلیه،همانطور که توسط PAS و HE-رنگ آمیزی مقاطع بافتی مشهود است، از طریق ساختارهای مورفولوژیکی پیچیده پیشرفت می کند.کلیه هااز همان مرحله جنینی با ژنوتیپ های مختلف سطوح مختلف رشد را نشان داد (شکل 1B). علاوه بر این، تفاوت های قابل توجهی درکلیهساختارها به ویژه هنگام مقایسه Calr // با Calr plus / plus و Calr plus // مشاهده شد. این تفاوت ها همچنین در مراحل پیشرفته نفروژنز باقی می مانند (شکل 1B). کالر//کلیه هادر مقایسه با Calr plus / plus و Calr plus // اختلال شدید نشان می دهد (شکل 1B). در مرحله E13.5 اندازه Calr//کلیهکوچکتر بود و تعداد جوانه های حالب و شاخه های جوانه حالب به طور معنی داری کمتر بود. مشاهدات مشابهی در مراحل E14.5 و E16.5 انجام شد. کشت اندام جنینیکلیه هااز سه ژنوتیپ جنین اختلال قابل توجهی در انشعاب UB وکلیهرشد برای تجسم کردنکلیهساختارها، مقدمات کشت شده با لامینین به عنوان نشانگر غشای پایه و با لکتین Dolichos biflorus agglutinin (DBA) برای تجسم UB رنگ‌آمیزی شدند.

رنگ‌آمیزی فلورسانس ترکیبی FL کشت‌شدهکلیهمقدمه‌ها یک اختلال انشعاب قابل توجه همراه با کمبود Calr را نشان دادند و منجر به عقب ماندگی کلی درکلیهتوسعه (شکل 2A,B). در زمان انزوا، Calr//کلیهابتدایی ها 6 تا 10 نوک UB را نشان دادند، در حالی که مقدمات Calr plus / plus و Calr plus // 20-30 نوک UB را نشان دادند. پایه های کشت Calr plus / plus و Calr plus // به طور معمول در طول دوره کشت (72 ساعت) توسعه یافتند و یک UB با شاخه خوب (9 ± 85، n=6 هر کدام) و همچنین ساختارهای شناخته شده متفاوتی را نشان دادند. کلیه در حال رشد داخل بدن فرهیخته هاکلیهسنگدانه های پیش لوله ای را نشان داد،کلیهوزیکول ها و مزانشیم کلاهک (شکل 2A,B). در مقابل، مقدمات Calr// نتوانستند به طور عادی توسعه یابند و تغییر قابل توجهی در انشعاب UB نشان دادند (15 ± 3 n=6) (شکل 2B).

شکل 2. ماوس Calr-/-کلیهابتدایی ها تغییر شدیدی در رشد و انشعاب UB نشان می دهند. (آ):کلیهمقدمات از Calr plus / plus Calr plus /- و Calr-/- (E13.5) جدا شد و در شرایط خارج از بدن به مدت سه روز کشت داده شد. Calr−/-کلیهابتدا تغییرات کلی در رشد و تغییر قابل توجهی در انشعاب جوانه حالب نشان داد. (B): رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس ازکلیهمقدمات پس از سه روز کشت. رنگ آمیزی مشترک لامینین (قرمز) و لکتین DBA (سبز) برای تجسم ساختارهای مختلف پایه ها انجام شد. کمیت انشعاب با شمارش تعداد شاخه های جوانه حالب به دست آمد. کمیت به صورت نمودار میله ای با میله های خطا ارائه می شود. هر نوار نشان دهنده تعداد شاخه به معنای ± sd از شش پایه کشت شده است. تفاوت های قابل توجه: (*) p < 0.05،="" (***)="" p=""><0.001. 2.5×2.5×2.5×="" داخلی.="" جی.="" مول.="" علمی="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" of="" 21="" شکل="" 2.="" calr悆="" پایه="" های="" کلیه="" موش="" تغییر="" شدیدی="" در="" رشد="" و="" انشعاب="" ub="" نشان="" می="" دهد.="">کلیهعناصر اولیه از Calr plus / plus Calr plus // و Calr / (E13.5) جدا شده و به مدت سه روز در شرایط محیطی کشت داده شدند. تماس بگیرید /کلیهابتدا تغییرات کلی در رشد و تغییر قابل توجهی در انشعاب جوانه حالب نشان داد. (B): رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس ازکلیهمقدمات پس از سه روز کشت. رنگ آمیزی مشترک لامینین (قرمز) و لکتین DBA (سبز) برای تجسم ساختارهای مختلف پایه ها انجام شد. کمیت انشعاب با شمارش تعداد شاخه های جوانه حالب به دست آمد. کمیت به صورت نمودار میله ای با میله های خطا ارائه می شود. هر نوار نشان دهنده تعداد شاخه به معنای ± sd از شش پایه کشت شده است. تفاوت های قابل توجه: (*) p < 0.05،="" (***)="" p=""><>

2.2. کمبود Calr با تغییرات بزرگ و قابل توجه رونوشت همراه است

بررسی‌های مورفولوژیکی و بافت‌شناسی اختلال در آن را نشان دادکلیهتوسعه در Calr/ جنین موش در مقایسه با Calr plus / plus و Calr plus //. به منظور بررسی اینکه آیا ناک اوت Calr بر بیان پروتئین‌ها و مسیرهای کلیدی نفروژنز تأثیر می‌گذارد، کل رونویسی آنالیز شد.کلیهمقدمات از سه ژنوتیپ جنین انجام شد. به منظور ارزیابی ژن های بیان شده متفاوت بین Calr plus / plus، Calr plus // و Calr/کلیهنمونه ها، آزمون های کمی بر اساس شمارش خواندن با استفاده از آزمون دقیق فیشر با تعدیل بنجامینی-هوچبرگ برای تست های متعدد انجام شد. شکل های تکمیلی S1 و S2 نقشه حرارتی تجزیه و تحلیل مقایسه ای بین بیان ژن ها را نشان می دهد.کلیهمبانی از Calr plus / plus ، Calr plus // و Calr / . به منظور به دست آوردن یک نمای کلی از تغییرات بیان ژن بین Calr plus / plus و Calr / کلیه، یک نقشه MA با تغییر برابر تغییر یافته (FC) بیان بین Calr plus / plus و Calr / به log2 از تبدیل ایجاد شد. میانگین سطح بیان برای هر ژن در تمام نمونه ها (شکل 3A، شکل تکمیلی S1). نمودار MA ژن های تنظیم شده متفاوت را در Calr plus / plus در مقایسه با Calr / نشان می دهد. طبقه‌بندی عملکردی ژن‌های تنظیم‌شده بر اساس فرآیند بیولوژیکی تغییری در روند رشد در Calr /کلیه ها(شکل 3B، جدول تکمیلی S1). بررسی دقیق تر در مورد حاشیه نویسی مسیر ژن های تنظیم شده، انحراف دو فرآیند اصلی را نشان داد: سیگنال دهی Wnt و تا شدن پروتئین به عنوان اکثر پروتئین های تنظیم شده در این دو مسیر اصلی دخیل هستند (شکل 3B). خوشه بندی سلسله مراتبی و خوشه بندی k-means بر روی پروفایل های بیانی تایید کرد که جنینکلیهرونوشت های Calr plus / plus و Calr plus // بسیار شبیه هستند اما به طور قابل توجهی با رونوشت های Calr / تفاوت دارند (شکل 3C، شکل های تکمیلی S1 و S2).

سیستانچ عفونت کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

داده های آنالیز رونوشت ما نشان داد که ناک اوت Calr با تغییر در بیان پروتئین های کلیدی درکلیهتوسعه (شکل های 3C و 4A، جدول تکمیلی S2) در کنار پروتئین های کلیدی در سیگنال دهی Wnt و تعداد زیادی از ژن های نفروژنیک در Calr/کاهش تنظیم شده یا شناسایی نشدند.کلیهمقدمات (شکل 3C، شکل 4A). در میان دیگران، فاکتورهای رونویسی، مانند Six1 و Six2 که قبلاً گزارش شده بود در مراحل مختلف نفروژنز کار می‌کنند، به طور قابل‌توجهی در کلیه جنینی Calr// کاهش یافتند. Osr1 یکی از ژن هایی است که بیان آن برای Eya1، Pax2، Six2، Sall1 و GDNF مورد نیاز است و بیان این ژن در Calr / تقریباً وجود نداشت. به منظور بررسی تاثیر تغییر سیگنالینگ Wnt و ژن های کلیدی نفروژنیک برکلیهتوسعه در موش‌های ناک اوت Calr، رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس با نشانگرهای رشد جنینی انجام شد.کلیهبخش هایی از جنین در مرحله E14.5. رنگ آمیزی به وضوح تغییر ژن های مورد بررسی در Calr / را تایید کرد (شکل 4B). علاوه بر این، در مقایسه با Calr plus / plus و Calr plus //، Calr /کلیهفاقد ناحیه نفروژنیک واضح است (شکل 4B) همانطور که با رنگ آمیزی مشهود است و این اختلال شدید را تایید می کند.کلیهتوسعه در Calr/ جنین.

2.3. آنالیزهای پروتئومی مقایسه ای تغییرات قابل توجهی را در پروتئوم کلیه کالر / جنینی شناسایی کرد

تجزیه و تحلیل های مورفولوژیکی و بافت شناسی نشان داد که محدودیت Calr برای رشد جنینی مشکل ساز است.کلیه. برای درک بیشتر نقش Calr درکلیهرشد جنینی، آنالیزهای گسترده پروتئوم روی جنین انجام شدکلیه هابا استفاده از دو استراتژی در اولین آزمایش، ما از الکتروفورز ژل دو بعدی برای مقایسه جنین استفاده کردیمکلیهپروتئوم های Calr plus / plus و Calr plus // جنین های موش از مرحله E13.5. الگوی دو بعدی تغییر قابل توجهی را در پروتئوم Calr plus نشان داد //کلیه ها(p < 0.05)="" (شکل="" تکمیلی="" s3a).="" شناسایی="" پروتئین‌های="" فراوان="" متفاوت،="" تغییری="" را="" در="" بیان="" پروتئین‌های="" دخیل="" در="" مسیرهای="" استرس="" و="" متابولیسم="" rna="" در="" calr="" plus="" جنینی="" نشان="">کلیه(شکل تکمیلی S3B,C). به منظور بررسی بهتر تغییر پروتئوم در Calr plus // و Calr悆 / در مقایسه با Calr plus / plusکلیه، ما پروفایل پروتئوم مبتنی بر طیف سنجی جرمی را انجام دادیم (شکل 5، جداول تکمیلی S3-S8). تجزیه و تحلیل همپوشانی تکرارپذیری بالایی از تشخیص پروتئین بین ژنوتیپ ها را نشان داد (شکل 5A). تجزیه و تحلیل آماری تغییرات قابل توجهی را در بیان پروتئین بین Calr پلاس / پلاس در مقابل Calr 悆 / (شکل 5A، جداول تکمیلی S3 و S4، شکل تکمیلی S4A.)، Calr plus // در مقابل Calr/ (شکل 5A، جداول تکمیلی S5 و S6، شکل تکمیلی S4B)، و Calr plus / plus در مقابل Calr plus // (شکل 5A، جداول تکمیلی S7 و S8، شکل تکمیلی S4C). رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس ناک اوت Calr در Calr را تایید کرد //کلیه ها. علاوه بر این، ما یافته‌های پروتئومیکس را برای دو پروتئین با تنظیم پایین در Calr / تأیید کردیم: Calbindin 1 (Calb-1) و Superoxide dismutase 1 (Sod1). در مورد Sod1، داده‌های پروتئومی و ترانسکریپتومیک حذف Sod1 را در Calr悆 // جنینی نشان دادند.کلیهو رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس کمبود Sod1 در Calr / جنینی را تایید کرد.کلیه(شکل 5B). Sod1 یک متالوآنزیم آنتی اکسیدانی است که با تبدیل رادیکال های سوپراکسید آزاد به پراکسید هیدروژن برای سم زدایی بیشتر توسط کاتالازهای سلولی، نقش مهمی در سم زدایی گونه های فعال اکسیژن (ROS) ایفا می کند و در نتیجه از سمیت جلوگیری می کند. Calb{2}} اصلی ترین پروتئین درون سلولی اتصال دهنده کلسیم در لوله پیچیده انتهایی (DCT) است و نقش کلیدی در جذب مجدد Ca2 بین سلولی به همراه دارد. Calb{9}} به عنوان یک بافر داخل سلولی Ca2 + بافر و Ca2 plus-transit Ca2 plus را از قسمت آپیکال به سمت قاعده‌ای بدون تغییر قابل توجهی در غلظت Ca2 داخل سلولی منتقل می‌کند. ارتباط بین ناک اوت Calr و تغییر در بیان هر دو پروتئین مشخص نیست و نیاز به بررسی بیشتر دارد.

شکل 3. تجزیه و تحلیل بیان ژن مقایسه ای موش کالرتیکولین حذفی. (الف): نمودار MA که ژن‌های تنظیم‌شده و پایین‌تنظیم‌شده در مقیاس وسیع را در موش Calr plus / plus در مقابل Calr / نشان می‌دهد. آزمون‌های کمی تغییر برابری (بر اساس تعداد خواندن log-تبدیل شده نرمال شده) با استفاده از آزمون دقیق فیشر با تصحیح بنجامینی-هوچبرگ (05/0 < 0)="" انجام="" شد="" و="" ژن‌های="" غیر="" معنی‌دار="" به="" رنگ="" خاکستری="" نشان="" داده="" شدند.="" نمودار="" ma="" برای="" نمایش="" ژن="" های="" متفاوت="" بیان="" شده="" در="" calr="" plus="" plus="" در="" مقابل="" calr="" استفاده="" می="" شود.="" (b):="" توزیع="" فرآیندهای="" بیولوژیکی="" ژن‌های="" کاهش‌یافته="" در="" calr/در="" مقایسه="" با="" calr="" plus="" plus="" -.="" طبقه="" بندی="" ژن="" های="" شناسایی="" شده="" با="" استفاده="" از="" ابزار="" بیوانفورماتیک="" david="" انجام="" شد.="" نماد="" ژن="" برای="" دسته="" بندی="" حاشیه="" نویسی="" هستی="" شناسی="" ژن،="" به="" عنوان="" مثال،="" فرآیندهای="" بیولوژیکی="" استفاده="" شد.="" (c):="" تجزیه="" و="" تحلیل="" غنی‌سازی="" ژن‌های="" برتر="" که="" بین="" سه="" ژنوتیپ="" (calr="" plus="" plus،="" calr="" plus="" و="" calr/)="" به="" طور="" قابل‌توجهی="" تنظیم="" می‌شوند.="" تجزیه="" و="" تحلیل="" مقایسه="" ای="" به="" عنوان="" یک="" نقشه="" حرارتی="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. طبقه بندی هستی شناسی ژن و تجزیه و تحلیل شبکه های تعامل پروتئین-پروتئین

نمودارهای آتشفشان و تجزیه و تحلیل نمودار دایره ای نشان داد که تغییر بیان Calr منجر به تغییرات کلی در جنین می شود.کلیهپروتئوم (شکل تکمیلی S4). به منظور کسب اطلاعات بیشتر در مورد مکانیسم های بیولوژیکی مرتبط با جنینکلیهتغییر توسعه در Calr / موش، ما بیوانفورماتیک DAVID را با اطلاعات مربوط به عملکرد احتمالی پروتئین‌های موجود در پایگاه‌های داده UniProt و GenBank ترکیب کردیم. طبقه‌بندی پروتئین‌های شناسایی‌شده با توجه به درگیری آنها در فرآیندهای بیولوژیکی منجر به بیست دسته شد، با نه دسته‌بندی بسیار برجسته (شکل تکمیلی S4D). یکی از دسته بندی های اصلی فرآیند رشد بود که بیش از 1000 پروتئین شناسایی شده متعلق به این گروه بودند. از آنجایی که فعل و انفعالات پروتئین-پروتئین مکانیسم های کلیدی برای تقریباً تمام فرآیندهای بیولوژیکی از جمله توسعه، استخراج اطلاعات در مورد فعل و انفعالات احتمالی پروتئین- پروتئین و تنظیم مسیر اتصال پروتئین های تنظیم شده در Calr plus // و Calr/ جنینی است.کلیهممکن است اطلاعات قابل توجهی در مورد فرآیندهایی که تحت شرایط کمبود Calr مختل می شوند ارائه دهد. برای این منظور، شبکه‌های تعامل بین پروتئین‌های تنظیم‌شده را با استفاده از STRING 11 بررسی کردیم.{1}} (http://string.embl.de، در 24 مارس 2021 مشاهده شد). تجزیه و تحلیل بیشتر پروتئین های بیان شده تنها در Calr plus / plus و Calr plus // دو گره برهمکنش قوی از پروتئین های درگیر در دو فرآیند اصلی را نشان داد که متابولیسم RNA و فسفوریلاسیون اکسیداتیو هستند (شکل تکمیلی S5A). این نشان می دهد که Calr / جنینیکلیهممکن است از یک ناهنجاری در متابولیسم RNA و کمبود انرژی رنج ببرند. بررسی شبکه‌های برهمکنش بین پروتئین‌های بیان شده در Calr plus / plus و Calr plus // در مقایسه با Calr/ قویاً از فرضیات ما پشتیبانی می‌کند زیرا شبکه‌ها سه گره تعامل قوی را نشان می‌دهند. دو تا از گره ها پروتئین های دخیل در متابولیسم RNA و فسفوریلاسیون اکسیداتیو را انباشته کردند، در حالی که گره سوم شامل پروتئین های ریبوزومی است و اختلال در تشکیل ریبوزوم و گردش پروتئین را آشکار کرد (شکل تکمیلی S5B). بررسی دقیق پروتئین‌های ریبوزومی تنظیم‌شده، تغییر قابل‌توجهی در پروتئین‌ها از زیر واحدهای ریبوزومی بزرگ و کوچک را نشان داد و این اختلال شدید در بیوژنز ریبوزومی و سنتز پروتئین را نشان داد (شکل 6A-D).

2.5. Calr Knockout منجر به تغییر در بیان پروتئین ریبوزومی می شود 

تجزیه و تحلیل داده‌های ترانسکریپتومیک و پروتئومیک تغییر قابل‌توجهی در بیان پروتئین‌های ریبوزومی در موش‌های جنینی Calr/موش نشان داد.کلیه ها. تجزیه و تحلیل وسترن بلات و کمیت MS جنینیکلیهعصاره پروتئینی از سه ژنوتیپ کاهش قابل توجه Rps10، Rps19 و Rps26 را تایید کرد.کلیه ها(شکل 7A) و Rps12، Rps13، Rps14 Rps15، Rps17، و Rps19 (شکل تکمیلی S6A,B) در Calr/ . علاوه بر این، رنگ آمیزی جنینیکلیهبخش ها میزان تغییر در بیان پروتئین های ریبوزومی را تایید کردند. هیچ Rps10 یا Rps6 را نمی توان در Calr / جنینی تشخیص دادکلیهبخش ها (شکل 7B). به منظور بررسی ارتباط بین ناک اوت Calr و بیان پروتئین ریبوزومی، ما یک مدل حذفی Calr in vitro در MDCK ایجاد کردیم.کلیهسلول های توبولی با استفاده از سیستم اندونوکلئاز CRISPR/cas9. تجزیه و تحلیل‌های وسترن بلات، کاهش وابسته به دوز بیان Calr را در سلول‌های MDCK تأیید کرد و کاهش قابل‌توجهی از زیرواحد ریبوزومی 40S را که پروتئین‌های Rps10 و Rps19 را کد می‌کند، نشان داد که اختلال در بیوژنز ریبوزوم را نشان داد. علاوه بر این، بیان اجزای ضروری برای سنتز پروتئین، به عنوان مثال، طویل شدن، نشان داد که فاکتور شروع eEIF5a به طور قابل توجهی در سلول‌های MDCK حذفی Calr کاهش یافته است (شکل 7C). ناک اوت Calr با تغییرات مورفولوژیکی، پروتئومی و transcriptomic قابل توجهی همراه بود. تحقیقات in vivo و in vitro ما بیشتر نشان داد که این انحرافات با کاهش قابل توجهی در بیوژنز ریبوزوم همراه بود. کاهش بیان پروتئین ریبوزومی در ناک اوت Calrکلیهبه مراحل جنینی محدود نمی‌شود، بلکه می‌تواند در سلول‌های مشتق شده از بزرگسالان نیز نشان داده شودکلیه ها، نقش بالقوه Calr را در بیوژنز ریبوزومی نشان می دهد.

شکل 7. کمبود Calr با کاهش در بیان پروتئین ریبوزومی همراه است. (الف): تجزیه و تحلیل وسترن بلات پروتئین های ریبوزومی Rps10، Rps19، و Rps26 در عصاره های پروتئینی Calr plus / plus، Calr plus // و Calr // جنینیکلیه ها. کلیه های جنینی از سه موش باردار مختلف Calr plus /- برداشت شدند. پس از تعیین ژنوتیپ، جنین های یک مادر و ژنوتیپ با هم گروه بندی شدند و جنین آنهاکلیهعصاره های پروتئینی با هم ترکیب شدند. پس از تخمین پروتئین، آنالیز وسترن بلات در سه تکرار برای هر پروتئین مورد بررسی انجام شد. برای تجزیه و تحلیل مقایسه ای نمونه ها از آنالیز واریانس یک طرفه استفاده شد. نتایج به عنوان میانگین ± sd از حداقل سه آزمایش مستقل ارائه شده است. زمانی که p < 0="" تفاوت="" ها="" از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="" شد.{14}}5.="" (b):="" رنگ‌آمیزی="" ایمونوفلورسانس="" در="" برابر="" rps10="" و="" rps6="" در="" calr="" plus="" plus="" و="" calr悆="" بخش‌های="" بافت="" کلیه="" جنینی="" با="" بزرگنمایی="" 20×.="" (c):="" تجزیه="" و="" تحلیل="" وسترن="" بلات="" عصاره="" پروتئین="" از="" سلول="" های="" mdck="" (سمت="" چپ)="" و="" کمیت="" mrna="" پس="" از="" ناک="" اوت="" calr="" در="" سلول="" های="" mdck="" (راست).="" calr="" با="" استفاده="" از="" سیستم="" crispr/cas9="" با="" دو="" sgrna="" مختلف="" حذف="" شد.="" وسترن="" بلات="" با="" آنتی="" بادی="" های="" calr،="" gapdh،="" rps10،="" rps19،="" و="" eif5a="" بررسی="" شد.="" کمی="" سازی="" calr="" و="" rps10="" mrna="" در="" نمونه="" sgcalr{11}}="" با="" استفاده="" از="" qpcr="" انجام="" شد.="" تنظیم="" پایین="" calr="" با="" استفاده="" از="" سیستم="" crispr/cas9="" ارتباط="" بین="" کمبود="" calr="" و="" تغییر="" در="" بیان="" پروتئین="" ریبوزومی="" را="" نشان="" داد.="" تفاوت="" های="" قابل="" توجه:="" (**)="" p=""><0.01، (***)="" p=""><0.001، (****)="" p=""><>

3. بحث

راکلیه هااز طریق مورفوژنز شاخه ای ایجاد می شود که فرآیندی است که شامل فرآیندهای پیچیده رشد و تمایز است و توسط سیگنال هایی که از سلول های اطراف در محفظه مزانشیمی نوپای می آید هدایت می شود [16]. طی سالهای گذشته چندین ژن و مسیرهای کلیدی درکلیهتوسعه شناسایی شده اند. عوامل تغذیه ای، به ویژه GDNF، پروتئین های مورفوژنتیک استخوان (BMPs) و فاکتورهای رشد فیبروبلاست (FGFs) درکلیهرشد و تمایز آنها بر سیگنال دهی درگیر در مورفوژنز انشعاب UB و همچنین در حفظ و تمایز مزانشیم نفروژنیک در جنین نظارت می کنند.کلیه[17]. ناک اوت Calr به دلیل رشد ناکارآمد قلبی باعث مرگ جنینی می شود [15]. افزایش غلظت Ca2 سیتوپلاسمی به علاوه در کاردیومیوسیت های طبیعی برای ایجاد میوفیبریلوژنز قلبی لازم است. این تغییر ضروری در غلظت Ca2 به اضافه به Calr بستگی دارد و در شرایط کمبود Calr وجود ندارد [18]. نقش عملکردی چپرون ER و پروتئین Calr متصل به کلسیم در نفروژنز هنوز کشف نشده است. به منظور بررسی نقش بالقوه Calr در جنینکلیهتوسعه و تأثیر کمبود Calr بر نفروژنز، ما یک تجزیه و تحلیل مقایسه ای رونوشت و پروتئومی انجام دادیم. به طور کلی، کمبود Calr منجر به تاخیر در رشد کلیه و تغییرات ناچیز رونوشت و پروتئوم شد. علاوه بر این، داده‌های ما نشان داد که کمبود Calr باعث ایجاد اختلالات شدید در مسیرهای نفروژنز می‌شود، زیرا تغییرات بیانی قابل‌توجهی در پروتئین‌های کلیدی سیگنال‌دهنده Wnt (مانند Wnt7a، Wnt11، Wnt10b، Fzd10، Fzd9، Prkcb، Prkcq و Kremen2) شناسایی شد. سیگنال دهی القایی بین اپیتلیوم جوانه حالب و مزانشیم متانفریک عمدتاً توسط سیگنالینگ بازخورد Wnt تنظیم می شود [19،20]. در حالی که Calr بخش عمده ای از هموستاز کلسیم سلولی است، به طور همزمان یک همراه ER ضروری برای تاخوردن و قاچاق گلیکوپروتئین ها و پروتئین های دخیل در سیگنال دهی سلولی و بیان ژن است [21]. ناک اوت Calr می تواند منجر به اختلال در تا شدن پروتئین و استرس ER شود که باعث اختلال در ماشین های ترجمه می شود. این ممکن است عقب ماندگی مشاهده شده در رشد کلیه در موش های هموزیگوت را توضیح دهد.

یکی از جنبه های شگفت انگیز و جالبی که توسط داده های ما برجسته شده است، تغییر در بیان پروتئین های ریبوزومی است. ما کاهش تقریباً کامل چندین پروتئین زیر واحدهای ریبوزومی 40S و 60S را نشان دادیم. علاوه بر این، آزمایش‌های آزمایشگاهی ما ارتباط بین تنظیم کاهشی Calr و اختلال در بیان پروتئین ریبوزومی را تأیید کرد. بیوژنز ریبوزوم به خوبی سازماندهی شده است و تحت نظارت دقیق قرار می گیرد. مطالعات نوظهور نشان داده اند که ریبوزوم نه تنها در فیزیولوژی سلولی طبیعی بلکه در واکنش به محرک ها و در پاتوژنز بیماری ها نیز نقش مهمی ایفا می کند. علاوه بر این، بیوژنز ریبوزوم رشد سلول را کنترل می کند و تکثیر و تغییرات در ریبوزوم ها در انحراف تکثیر سلولی، توقف چرخه سلولی، آپوپتوز و تظاهرات پاتولوژیک منعکس می شود [22،23].

علاوه بر نقش آنها در بیوژنز ریبوزوم، پروتئین های ریبوزومی برای اعمال عملکردهای اضافی ریبوزومی مختلف، به عنوان مثال، در رشد و تکثیر سلولی، در ترمیم DNA، و در تمایز و توسعه سلولی یافت شده است [24-31]. اختلال در عملکرد پروتئین ریبوزومی با اختلالات خونی و متابولیک مرتبط بود و ممکن است منجر به بیماری های قلبی عروقی و سرطان شود [32-36]. جهش در ژن‌های کدکننده پروتئین‌های ریبوزومی با ناهنجاری اریتروپوئزیس مرتبط است که منجر به سندرم‌های بالینی می‌شود، به عنوان مثال، کم‌خونی Diamond–Blackfan (DBA) [37] و سندرم 5q [38]. جهش در RPS10 با کم خونی Diamond-Blackfan مرتبط است و 30 درصد از این بیماران مبتلا به نعل اسب یا سیگموئید هستند.کلیه ها[39]. جالب توجه است که بیماران Diamond-Blackfan شانس بیشتری برای ابتلا به سندرم میلودیسپلاستیک دارند که با جهش اگزون 9 ژن Calr مرتبط است [40-42]. این بازسازی ماشین ترجمه باعث انحرافات عظیم در روند رشد می شود و نه تنها بر دستگاه ادراری تناسلی بلکه بر سیستم گردش خون و تولید مثل تأثیر می گذارد و در نهایت باعث مرگ جنینی در اثر کمبود کالرتیکولین می شود. داده های ما بیوژنز ریبوزوم نگران کننده را در Calr/ جنینی نشان دادکلیهو نقش اساسی Calr را در بیوژنز پروتئین برجسته کرد. ما معتقدیم که درک بهتر روابط بین کمبود Calr و تغییر بیان پروتئین ریبوزومی، بینش جدیدی را برای درک اینکه چگونه Calr بر بیوژنز ریبوزوم و جنین تأثیر می گذارد، ارائه می دهد.کلیهتوسعه و ارائه دیدگاه های جدید در مورد فرآیندهای حاکم بر رشد اندام.

4. مواد و روش ها

4.1. حیوانات

Calreticulin هتروزیگوت (Calr plus //) و نوع وحشی (Calr plus / plus) موش های همزاد با زمینه های ژنتیکی یکسان C57BL/6J از پروفسور Marek Michalak، دانشگاه آلبرتا، ادمونتون، آلبرتا، کانادا به دست آمد. موش ها تحت شرایط مسکن بدون پاتوژن خاص پرورش داده شدند و ژنوتیپ شدند همانطور که قبلا در Michalak و همکاران توضیح داده شد. [15]. برای مطالعه ما، موش های باردار Calr plus // در مراحل مختلف رشد جنینی قربانی شدند (روزهای جنینی 13.5: E13.5؛ 14،5: E14.5؛ و 16.5: E16.5)، جنین ها برداشت شدند وکلیه هاتشریح شدند. برای تعیین ژنوتیپ از تکه ای از دم جنین استفاده شد. راکلیه هابیشتر برای رنگ آمیزی هیستوشیمیایی یا ترانس کریپتومیکس یا آنالیز پروتئومیکس آماده شدند. تمام مراحل آزمایشی مطابق با قوانین مراقبت از حیوانات و اخلاقیات آلمان (استانداردهای NIH) انجام شد و توسط کمیته اخلاق محلی مرکز پزشکی دانشگاه گوتینگن، آلمان (33.{1}}/0598) تأیید شد.

سیستانچ درد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

4.2. رنگ آمیزی هیستوشیمیایی

برای رنگ آمیزی بافت شناسی جنینکلیه ها، برداشته شدهکلیه هابه مدت یک شب در محلول فرمالدئید بافر 4 درصد تثبیت و سپس در بلوک های پارافین جاسازی شدند. بخش‌های تعبیه‌شده پارافین، پارافین‌زدایی و هیدراته شدند و با محلول هماتوکسیلین Gill III و محلول ائوزین Y (Merck, Darmstadt, آلمان) مطابق پروتکل سازنده رنگ‌آمیزی شدند.

4.3. کشت اندام قبلی کلیه جنینی

کشت اندام ex vivo طبق Davies و همکاران [43] انجام شد. موش های باردار در مرحله E13.5 رشد جنینی قربانی شدند، جنین ها برداشت شدند وکلیه هاتشریح شدند. پس از تعیین ژنوتیپ، 6کلیهعناصر اولیه از هر ژنوتیپ (Calr plus / plus، Calr plus // و Calr/) روی یک غشای PET شفاف با اندازه منافذ 0.4 میکرومولار (24 چاه، BD Falcon) قرار گرفتند. غشاء در یک چاه از یک صفحه 24 چاهی، حاوی 400 میکرولیتر قرار داده شدکلیهمحیط کشت (KCM، DMEM، 10 درصد FCS غیرفعال شده). این را فعال کردکلیهبرای تماس با رسانه بدون غرق شدن آن. در این شرایط امکان حفظ آن وجود داشتکلیهدر دمای 37 ◦C و 5 درصد CO2 برای حداقل 144 ساعت کشت داده شود.

4.4. رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس کلیه های کشت شده و آنالیز ایمونوهیستولوژیکی برش های کلیه

جنینیکلیه هادر شرایط محیطی به مدت 72 ساعت کشت داده شدند، پس از آن، آنهاکلیهمقدمات در متانول سرد در دمای 20 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه ثابت شد. مرحله تثبیت با 3 مرحله شستشو دنبال شد که هر کدام به مدت 5 دقیقه در PBS بود. آنتی بادی اولیه مونوکلونال خرگوش آنتی بادی ضد لامینین (سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) در PBS رقیق شد و در دمای 4 درجه سانتیگراد یک شبه انکوبه شد. فرهیخته هاکلیهمقدمات به مدت 4 ساعت در PBS شسته شد و آنتی بادی ثانویه (Molecular Probes Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG (1:500)) یک شبه در دمای 4◦C اضافه شد. UB با استفاده از لکتین Dolichos biflflorus agglutinin (DBA) برای حداقل 3 ساعت رنگ آمیزی شد. پس از انکوباسیون،کلیه هابه مدت 3 ساعت در PBS شسته و برای آنالیز میکروسکوپی جاسازی شدند. ایمونوهیستوشیمی جنین دپارافین شده و هیدراته شدهکلیهبخش ها برای تشخیص بیان و توزیع چندین پروتئین انجام شد. بخش ها با محلول بازیابی آنتی ژن (1.8 میکرومولار اسید سیتریک و 8.2 میکرومولار سیترات سدیم) که در بخارپز غذا به مدت 25 دقیقه از قبل گرم شده بود، تیمار شدند. مقاطع با سرم 10 درصد بز در PBS به مدت 1 ساعت مسدود شد و یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد با آنتی بادی های اولیه انکوبه شد (آنتی بادی های اولیه زیر استفاده شد: خرگوش مونوکلونال آنتی کالبیندین{9}}، ضد Wt1، ضد Six2، anti-Pax2، anti-Calr (Abcam، Cambridge، UK)، مونوکلونال خرگوش anti-Rps6، antiRps10 (Invitrogen) و آنتی بادی مونوکلونال ضد Sod1 خرگوش (Abnova، تایپه، تایوان). آنتی بادی های اولیه با فلورسانس شناسایی شدند. آنتی بادی های ثانویه نشاندار شده (مولکولی پروب های الکسا فلور 555 بز آنتی بادی IgG ضد موش و الکسا فلور 555 بز ضد خرگوش IgG) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق. برای کنترل منفی، مقاطع بافتی تنها با آنتی بادی ثانویه انکوبه شدند. لام ها سوار شدند. با روکش‌هایی در محیط نصب Vectashield با DAPI برای ضدلک کردن هسته‌ها (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

4.5. کشت سلولی

سگ مدین-داربیکلیهسلول های (MDCK) از مجموعه کشت نوع آمریکایی (ATCC) به دست آمد و در محیط کشت اصلاح شده Dulbecco's Eagle (DMEM)، 10 درصد سرم جنین گاو (FBS)، 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین و 1 درصد ال-گلوتامین در دمای 37 درجه سانتی گراد تکثیر شد. در یک جو 5 درصد CO2-. سلول ها در فلاسک های T25 کشت می شوند و دو بار در هفته تقسیم می شوند. برای عبور سلولی، سلول‌های MDCK برای مدت کوتاهی تریپسین شدند تا از تغییر ساختار سلولی جلوگیری شود.

4.6. تولید سلول های ناک اوت

توالی‌های sgRNA Calr (XM8622117) برای گونه‌های لوپوس کانیس با استفاده از ابزار آنلاین BlueHeronBio (اوریژن، هرفورد، آلمان) طراحی شدند. توالی sgRNA 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 به پلاسمید pLenti-Cas-Guide (Addgene plasmids #3931646) با آنزیم های محدود کننده BamHI و BsmBI وارد شد تا pLenti-Cas توسط Sanconstructal بعداً تایید شود{7}C. به منظور حذف کارل در سلول‌های MDCK، ترانسفکشن گذرا pLenti-Cas{9}}Calr انجام شد. یک روز قبل از ترانسفکشن، 200،{11}} سلول در میلی لیتر در صفحات 6 چاهی با محیط MEM کاشته شد. قبل از ترانسفکشن، محیط کشت به محیط Opti-MEM عاری از FCS تغییر یافت. لیپوفکتامین 2000 (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) برای انتقال سلول ها استفاده شد. مخلوط DNA پلاسمید لیپوفکتامین با OptiMEM بر اساس پروتکل مربی تهیه شد. برای ترانسفکشن پلیت 6 چاهی، 4 میکروگرم DNA پلاسمید به طور جداگانه به محیط 250 میکرولیتری Opti-MEM اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. پس از آن، مخلوط DNA به مخلوط Lipofectamine 2000 اضافه شد و به مدت 30 دقیقه قبل از اضافه شدن به سلول ها انکوبه شد. موفقیت ترانسفکشن با استفاده از وسترن بلات ارزیابی شد.

4.7. تجزیه و تحلیل رونوشت

برای بررسی رونوشت، از 3 موش باردار Calr plus // استفاده شد. جنین (8-10 / موش باردار) برداشت شد وکلیه هامنزوی شدند. پس از تعیین ژنوتیپ،کلیه هااز یک ژنوتیپ و یک مادر با هم ترکیب شدند و برای استخراج RNA پردازش شدند. کل RNA از Calr پلاس / پلاس، Calr پلاس // و Calr / جنینی جدا شد.کلیه هابا استفاده از روش تریزول (اینویتروژن) طبق توصیه های سازنده. سپس نمونه ها با DNAse I (سیگما) برای حذف آلودگی DNA تیمار شدند. کیفیت RNA با استفاده از الکتروفورز میکروسیالی Agilent 21{{10}}0 (Agilent Technologies، Santa Clara، CA، USA) مشخص شد. برای توالی یابی، نمونه های RNA با استفاده از "کیت آماده سازی نمونه RNA TruSeq" طبق پروتکل سازنده (Illumina، San Diego، CA، USA) تهیه شدند. توالی خوانی یکباره (5{28}} bp) با استفاده از HiSeq 2000 (Illumina، San Diego، CA، USA) انجام شد. توالی ها با توالی مرجع ژنوم Muscullus (مجموعه ژنوم Ensembl 3.2.1؛ https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly. html، قابل دسترسی در 24 مارس 2021) با استفاده از تراز STAR تراز شدند. نرم افزار (Cold Spring Labaro tory، Cold Spring Harbor، USA) (نسخه 2.3.0e، https://github.com/alexdobin/STAR، دسترسی به 24 مارس 2021) [44] که امکان 2 عدم تطابق را در 50 پایه فراهم می کند. بسته SAMtools (نسخه 0.1.18) و HTSeq (نسخه 0.6.1p1) برای فیلتر کردن بازدیدهای منحصر به فرد و شمارش استفاده شد [45،46]. ژن‌های کاندید تا حداقل 2-تغییر برابر و p-value تصحیح شده با FDR <0.05 فیلتر="" شدند.="" حاشیه="" نویسی="" ژن="" با="" استفاده="" از="" mus="" muscullus="" از="" ensembl="" v78="" (www.ensembl.org،="" قابل="" دسترسی="" در="" 1="" مارس="" 2019)="" از="" طریق="" بسته="" biomart="" (نسخه="" 2.24.0)="" [47]="" انجام="" شد.="" تجزیه="" و="" تحلیل="" غنی‌سازی="" go="" برای="" ژن‌های="" کاندید="" با="" بسته="" goseq="" (نسخه="" 1.2)="" [48]="" با="" استفاده="" از="" پارامترهای="" استاندارد="" انجام="">

4.8. لیز کلیه، استخراج پروتئین و الکتروفورز ژل دو بعدی (2-DE)

برای الکتروفورز ژل دو بعدی، جنین های 6 زن باردار Calr plus // (8-10 جنین / ماده) استفاده شد. برای استخراج پروتئین برای الکتروفورز ژل دو بعدی (2-DE)،کلیه هااز جنین ها در همان مرحله جنینی و از همان ژنوتیپ و ماده (8 تا 10 جنین / ماده باردار) با یک بافر لیز (9.5 مولار اوره، 2 درصد CHAPS (w/v)، 2 درصد آمفولیت (w) مختل شدند. /v)، 1 درصد DTT)، و گرداب شد. پس از افزودن بافر لیز، نمونه ها در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. برای حذف بقایای سلولی، سانتریفیوژ در دمای 13،{10}}× گرم و ۴ ◦C به مدت ۳۰ دقیقه انجام شد. مایع رویی مجدداً به مدت 30 دقیقه دیگر در دمای 13،{15}}× گرم و 4 ◦C تریفیوژ شد تا حداکثر خلوص حاصل شود. مواد رویی جمع آوری و گلوله ها دور ریخته شد و نمونه های به دست آمده بلافاصله مورد استفاده قرار گرفتند یا تا زمان استفاده در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. به منظور کاهش آلودگی نمک و غنی سازی پروتئین ها، رسوب متانول-کلروفرم بر اساس Wessel و Flügge [49] انجام شد. گلوله خشک شد و در بافر لیز حل شد. غلظت کل پروتئین با استفاده از سنجش پروتئین Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) طبق برادفورد تعیین شد. BSA (سیگما، اشتاینهایم، آلمان) به عنوان استاندارد استفاده شد. به منظور تضمین تکرارپذیری تجربی، ما از هر یک ژل‌های سه‌گانه تولید کردیمکلیهاستخر. جداسازی پروتئین دو بعدی همانطور که قبلاً توضیح داده شد [50] انجام شد. ژل های 2-DE با رنگ ژل فلورسنت فلامینگو (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) طبق دستورالعمل سازنده رنگ آمیزی شدند. پس از رنگ‌آمیزی، ژل‌ها با وضوح 50 میکرومتر روی اسکنر FLA فوجی اسکن شدند. تصاویر دیجیتالی شده با استفاده از Delta 2D 3.4 (Decodon، Braunschweig، آلمان) تجزیه و تحلیل شدند. برای تجسم پروتئین، ژل‌های 2- DE علاوه بر این در طول شب با رنگ‌آمیزی کلوئیدی Coomassie blue، Roti-Blue (راث، کارلسروهه، آلمان) رنگ‌آمیزی شدند.

4.9. تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی و شناسایی پروتئین

لکه‌های تنظیم‌شده قابل توجهی از ژل‌ها جدا شدند و هضم تریپتیک در ژل و استخراج پپتید همانطور که قبلاً توسط دیهازی و همکارانش توضیح داده شد انجام شد. [51]. به طور خلاصه، لکه های ژل دو بار در 25 میلی مولار بی کربنات آمونیوم (amBic) و یک بار در آب، با 1{16}}0 درصد استونیتریل (ACN) به مدت 15 دقیقه شسته و در SpeedVac خشک شدند (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA، ایالات متحده) به مدت 20 تا 30 دقیقه. تمام نقاط جدا شده با 12.5 نانوگرم بر میکرولیتر تریپسین درجه توالی یابی (Roche Molecular Biochemicals, Basel, CH) در 25 میلی مولار amBic یک شبه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. استخراج پپتید دو بار با استفاده از 50 درصد ACN/1 درصد تری فلورواستیک اسید (TFA) و سپس 100 درصد ACN انجام شد. تمام عصاره ها با هم ترکیب شدند و حجم با استفاده از SpeedVac کاهش یافت. پپتیدهای تریپتیک با استفاده از یک طیف‌سنج جرمی Q-TOF Ultima Global (Micromass، منچستر، انگلستان) مجهز به یک اسپری Z-ESI با نانوفلوک قرار گرفتند. شناسایی پروتئین با موتور جستجوی Mascot در برابر پایگاه‌های داده MSDB و Swissprot با استفاده از تحمل جرم پپتید و تحمل قطعه 0.5 Da انجام شد.

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

4.10. استخراج پروتئین، SDS-PAGE، در هضم ژل تریپتیک، و آنالیز طیف سنجی جرمی

برای تعیین کمیت طیف سنجی جرمی تغییر پروتئین در Calr/کلیهنمونه ها از یک ژنوتیپ و یک مادر با هم ادغام شدند. به منظور تولید استخرهای کافی و اطمینان از تکثیر بیولوژیکی و تجربی، از 6 Cal plus // مختلف باردار با 8 تا 10 جنین / موش استفاده کردیم. جنینیکلیه هااز سه ژنوتیپ از جنین ها برداشت شد و استخراج پروتئین با استفاده از بافر لیز همانطور که در بالا توضیح داده شد انجام شد. عصاره های پروتئینی توسط SDS-PAGE جدا شدند، ژل ها با کوماسی بلو رنگ آمیزی شدند، هر خط جدا شد و به 20 برش با اندازه مساوی بریده شد، و برش ها در معرض هضم ژل با تریپسین قرار گرفتند. برای تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی جرمی، نمونه‌ها روی یک پیش ستون فاز C18 معکوس بسته‌بندی شده (0.15 mm ID × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{11}) غنی شدند. }AQ 5 میکرومتر، Dr. Maisch، Ammerbuch-Entringen، آلمان) و روی یک ستون تحلیلی فاز-C18 معکوس (0) جدا شد.075 mm ID × 200 mm، Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 μm, Dr. Maisch) با استفاده از یک گرادیان خطی 30 دقیقه ای 5-35 درصد استونیتریل/0.1 درصد اسید فرمیک (v:v) در 300 nl دقیقه-1). شوینده بر روی یک طیف سنج جرمی چهار قطبی/اوربیتراپ هیبریدی Q Exactive (ThermoFisher Scientific، Dreieich، آلمان) که به منبع نانواسپری FlexIon مجهز شده بود و تحت نرم افزار Excalibur 2.4 با استفاده از روش اکتساب وابسته به داده کار می کرد، تجزیه و تحلیل شد. هر چرخه آزمایشی به شکل زیر بود: یک اسکن کامل MS در محدوده 350-1600 m/z با تنظیم وضوح 70،{36}} FWHM و هدف AGC 106 و حداکثر زمان پر شدن 60 میلی‌ثانیه به دست آمد. . تا 12 فراوان‌ترین پیش‌سازهای پپتیدی حالت‌های بار از 2 تا 5 بالاتر از آستانه شدت 2 × 104، سپس به‌طور متوالی در عرض جداسازی 2.0 FWHM، با نیتروژن در یک تنظیم انرژی برخورد نرمال 25 درصد و محصول طیفی حاصل جداسازی شدند. در تنظیم وضوح 17500 FWHM ثبت شد و هدف AGC 2 × 105 و حداکثر زمان پر شدن 60 میلی ثانیه وجود داشت. سپس مقادیر m/z انتخاب شده برای 15 ثانیه حذف شدند. دو تکرار فنی در هر نمونه به دست آمد. پیک لیست ها از داده های خام با استفاده از نرم افزار Raw2MSMS v1.17 (مؤسسه بیوشیمی ماکس پلانک، مارتینسرید، آلمان) استخراج شد. شناسایی پروتئین با استفاده از نرم افزار MASCOT 2.5.1 (Matrixscience، لندن، انگلستان) به دست آمد. پروتئین‌ها در برابر پروتئوم مرجع موش UniProtKB v2017.09 (16930 ورودی پروتئین) همراه با مجموعه‌ای از 51 آلاینده که معمولاً در آزمایشگاه ما شناسایی می‌شوند، شناسایی شدند. جستجو با تریپسین به عنوان آنزیم و یدوااستامید به عنوان عامل مسدود کننده سیستئین انجام شد. تا دو شکاف تریپتیک از دست رفته و اکسیداسیون متیونین به عنوان یک تغییر متغیر مجاز بود. تلورانس جستجو بر روی 10 ppm برای جرم پیش ساز و 0.05 Da برای توده های قطعه تنظیم شد و ESI-QUAD-TOF به عنوان نوع ابزار مشخص شد. نرم‌افزار Scaffold نسخه 4.8.9 (Proteome Software Inc., Portland, OR, USA) برای اعتبارسنجی شناسایی‌های پپتید و پروتئین مبتنی بر MS/MS استفاده شد. شناسایی پپتیدها در صورتی پذیرفته می‌شوند که با احتمال بیش از 95 درصد توسط الگوریتم Percolator ایجاد شوند. شناسایی پروتئین به نرخ کشف نادرست 1 درصد در حداقل 2 پپتید با اطمینان شناسایی شده کوتاه شد. بازدیدهای پروتئینی که حاوی پپتیدهای مشابه بودند و به‌علاوه، نمی‌توان بر اساس تجزیه و تحلیل MS/MS به تنهایی تمایز قائل شد، برای ارضای اصول صرفه‌جویی گروه‌بندی شدند. پروتئین هایی که شواهد پپتید قابل توجهی را به اشتراک می گذارند در خوشه ها گروه بندی شدند. فراوانی پروتئین با شمارش طیفی آنها به دنبال عادی سازی مجموع مجموع بین تمام تکرارها برآورد شد.

4.11. تجزیه و تحلیل وسترن بلات

تجزیه و تحلیل وسترن بلات بر اساس Towbin و همکاران انجام شد. [52]. مقادیر مساوی پروتئین (5{11}}-75 میکروگرم) توسط الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) جدا شد و روی غشاهای نیتروسلولز (Amersham Pharmacia Biotech، باکینگهامشر، انگلستان) منتقل شد. غشاها در شیر خشک بدون چربی 5 درصد در بافر TBST (20 میلی‌مولار Tris-HCl، pH 7.{10}} میلی‌مولار NaCl 0.1 درصد توئین 20) مسدود شدند و با آنتی‌بادی‌های اولیه (ضد کالر، ضد) انکوبه شدند. -Rps10، anti-Rps19، anti-Rps26 و anti-eIF5A) یک شب در دمای 4◦C. به منظور تجسم باندهای پروتئینی، از آنتی بادی های ثانویه نشاندار فلورسانس استفاده شد. به منظور تایید بارگذاری پروتئین برابر، بلات ها با آنتی بادی های ضد Actb یا ضد GAPDH (Sigma، Taufkirchen، آلمان) درمان شدند.

4.12. بیوانفورماتیک

طبقه‌بندی پروتئین‌های شناسایی‌شده با توجه به عملکردهای شناخته شده و فرضی آنها با استفاده از بیوانفورماتیک DAVID (http://david.abcc. ncifcrf.gov، در تاریخ 21 فوریه 2019) [53،54] انجام شد. نمادهای ژن برای بررسی و دسته بندی حاشیه نویسی هستی شناسی ژن (GO) (فرایندهای بیولوژیکی و عملکردهای مولکولی) استفاده شد. تجزیه و تحلیل شبکه ای برهمکنش های پروتئین-پروتئین شناخته شده و پیش بینی شده پروتئین های شناسایی شده با استفاده از STRING (ابزار جستجو برای بازیابی ژن ها/پروتئین های متقابل) [55] انجام شد.

4.13. تحلیل آماری

برای {0}}DE، تصاویر دیجیتالی شده تجزیه و تحلیل شدند و تطبیق نقطه بین ژل‌ها و نرمال‌سازی با استفاده از Delta2D 3.4 (Decodon، Braunschweig، آلمان) انجام شد. Delta2D یک مقدار "spot quality" را برای هر نقطه شناسایی شده محاسبه می کند. این مقدار نشان می دهد که یک نقطه تا چه اندازه شکل زنگ سه بعدی گاوسی "ایده آل" را نشان می دهد. بر اساس میانگین نسبت حجم لکه، لکه هایی که بیان نسبی آنها حداقل سه برابر (افزایش یا کاهش) بین نمونه های مقایسه شده حداقل 2- برابر (افزایش یا کاهش) تغییر کرده است، معنی دار در نظر گرفته شدند. به منظور تجزیه و تحلیل معناداری تنظیم پروتئین، آزمون t Student انجام شد و برای مقادیر P کمتر از 0.05 اهمیت آماری در نظر گرفته شد. همه بلات ها با استفاده از نرم افزار ImageJ اندازه گیری شدند. داده ها با بسته نرم افزاری GraphPad Prism، ​​نسخه 8 (سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) گردآوری شدند. این نرم‌افزار برای نمایش و تحلیل گرافیکی با استفاده از توزیع t Student یا ANOVA یک طرفه استفاده شد. نتایج به عنوان میانگین ± sd از حداقل سه آزمایش مستقل ارائه شده است. تفاوت ها از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد که P <0.05. نوک="" جوانه="" های="" حالب="" و="" نفرون="" ها="" به="" صورت="" دستی="" شمارش="" و="" داده="" ها="" با="" بسته="" نرم="" افزاری="" graphpad="" prism="" نسخه="" 8="" گردآوری="">