afزبان
صفحه اصلی / دانش / محتوای

دانش

تحویل نانوداروهای پاسخگو در میکرومحیط تومور با واسطه CAR-نوتروفیل برای شیمی ایمونوتراپی گلیوبلاستوما

Nov 27, 2023

گلیوبلاستوما (GBM) یکی از تهاجمی ترین و کشنده ترین تومورهای جامد در انسان است. در حالی که درمان‌های مؤثر، مانند سلول‌های گیرنده آنتی‌ژن کایمریک (CAR)-T و داروهای شیمی‌درمانی، برای درمان سرطان‌های مختلف توسعه یافته‌اند، اثربخشی آنها در درمان GBM عمدتاً توسط سد خونی-مغزی و موانع خونی-مغزی-تومور متوقف شده است. نوتروفیل های انسانی به طور موثر از موانع فیزیولوژیکی عبور می کنند و مصونیت موثر را در برابر پاتوژن ها نشان می دهند، اما طول عمر کوتاه و مقاومت در برابر ویرایش ژنوم نوتروفیل های اولیه کاربرد گسترده آنها را در ایمونوتراپی محدود کرده است. در اینجا ما از نظر ژنتیکی سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی را با ضریب نفوذ ژن CRISPR/Cas{4}}برای بیان ساختارهای مختلف ضد GBM CAR با دامنه‌های سیگنالینگ CD3ζ اختصاصی T یا نوتروفیل‌ها مهندسی می‌کنیم. نوتروفیل‌های CAR با بهترین فعالیت ضد تومور تولید می‌شوند تا به‌طور اختصاصی و غیرتهاجمی نانوداروهای پاسخ‌دهنده به ریزمحیط تومور را برای هدف قرار دادن GBM بدون نیاز به القای التهاب اضافی در محل‌های تومور به‌صورت اختصاصی و غیرتهاجمی آزاد کنند. این شیمی-ایمونوتراپی ترکیبی فعالیت‌های ضد GBM برتر و خاص را نشان می‌دهد، دارورسانی خارج از هدف را کاهش می‌دهد و طول عمر را در موش‌های ماده حامل تومور افزایش می‌دهد. این سیستم تحویل داروی CAR-نوتروفیل بیومیمتیک با هم یک پلت فرم ایمن، قوی و همه کاره برای درمان GBM و احتمالاً سایر بیماری‌های ویرانگر است.


effects of cistance-antitumor

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

گلیوبلاستوما (GBM) با میزان مرگ و میر بالا، طول عمر کوتاه و پیش آگهی ضعیف با تمایل زیاد به عود مشخص می شود. اثربخشی درمانی هم جراحی و هم داروهای شیمی درمانی در درجه اول توسط ساختار خوب مغز و سد فیزیولوژیکی خونی مغزی (BBB) ​​یا سد خونی-مغزی-توموری (BBTB) 3-5 مانع می شود. به ویژه، تحویل دارو به سیستم عصبی مرکزی (CNS) برای درمان تومورهای مغزی بسیار چالش برانگیز است:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

ایمنی ذاتی و انعطاف پذیری نوتروفیل ها در برابر سرطان های مختلف 12-16، از جمله GBM، کمتر از کاربرد آنها به عنوان حامل های سلولی در دارورسانی 8-10 مورد بررسی قرار گرفت. نوتروفیل‌های در حال گردش در خون به ریزمحیط تومور هیپوکسیک (TME) تبدیل می‌شوند، جایی که به نوتروفیل‌های ناهمگن مرتبط با تومور (TANs) تبدیل می‌شوند، جزء ضروری TME سرکوب‌کننده سیستم ایمنی که به پیشرفت سرطان و مقاومت درمانی کمک می‌کند12،17. مشابه ماکروفاژها، فنوتیپ‌های ضد تومور N1 و N2 پروتومور TANs در TME18-21 هیپوکسیک یافت شدند. استراتژی‌های درمانی مختلفی برای هدف قرار دادن مستقیم نوتروفیل‌ها با تمرکز بر کاهش یا مهار نوتروفیل‌ها توسعه داده شده است. بنابراین، کاربرد مستقیم نوتروفیل‌های درمان‌نشده به‌عنوان یک نانوحامل ممکن است خطر بیشتری برای بیماران سرطانی ایجاد کند که در آن نوتروفیل‌های قاچاق دارو ممکن است پس از انتقال به محل‌های تومور به فنوتیپ N2 پیش‌تومور سرکوب‌کننده سیستم ایمنی در TME برنامه‌ریزی شوند. علاوه بر این، فعالیت‌های ضد توموری ذاتی نوتروفیل‌های ساده باید برای دستیابی به اثربخشی درمانی بهینه در صورت استفاده به عنوان حامل دارو در ترکیب با داروهای شیمی‌درمانی مورد بررسی و تقویت قرار گیرد.

Desert ginseng—Improve immunity

فواید سیستانچ توبولوزا-تقویت سیستم ایمنی بدن

اصلاح گیرنده آنتی ژن کایمریک (CAR) به طور قابل توجهی فعالیت های ضد توموری سلول های T ایمنی یا کشنده طبیعی (NK)24-27 را افزایش داده است. با این حال، اثربخشی آنها در تومورهای جامد هنوز محدود است تا حدی به دلیل قاچاق نسبتا کم و توانایی نفوذ تومور. وجود BBB و BBTB فیزیولوژیکی مانع از کارآیی این درمان های نوظهور علیه GBM در مغز می شود. ما حدس زدیم که ترکیبی از مهندسی CAR و نوتروفیل های بسیار متحرک ممکن است فنوتیپ ضد تومور N1 خود را حفظ کند و اثربخشی درمانی عالی در درمان GBM داشته باشد. نوتروفیل های اولیه عمر کوتاهی دارند و در برابر ویرایش ژنوم مقاوم هستند، و کاربرد آنها را در ایمونوتراپی هدایت شده توسط CAR محدود می کند. سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی (hPSCs)، که برای ویرایش ژن در دسترس‌تر هستند و قادر به تمایز انبوه به نوتروفیل‌ها هستند، می‌توانند منبع نامحدودی از نوتروفیل‌های CAR با کیفیت بالا برای ایمونوتراپی هدفمند تحت شرایط شیمیایی تعریف‌شده و عاری از زنو فراهم کنند. نوتروفیل‌ها همچنین ترجیحاً پاتوژن‌های میکروبی را با سطوح ناهموار یا بلند فاگوسیتوز می‌کنند، مانند S. aureus و E. coli30، که باید برای طراحی نانوذرات در دارورسانی با واسطه نوتروفیل در نظر گرفته شود. در واقع، سافاری و همکاران. اخیراً فاگوسیتوز ترجیحی ذرات طویل تزریق شده داخل وریدی، بدون اصلاح سطحی پیچیده، توسط نوتروفیل‌های در گردش را گزارش کرده است. چنین طراحی آسان و الهام‌گرفته‌شده در نانوذرات دارویی ممکن است بارگذاری دارو در نوتروفیل‌ها را به حداکثر برساند و سطوح درمانی دارورسانی را در مکان‌های مورد نظر فراهم کند.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20% از نانوداروهای تجویز شده توسط نوتروفیل‌های CAR به تومورهای مغزی منتقل می‌شوند در حالی که 1% توسط نانوداروهای رایگان. به طور خلاصه، سیستم تحویل داروی CAR-نوتروفیل بیومیمتیک ما یک پلت فرم ایمن، قوی و همه کاره برای درمان GBM و سایر بیماری‌های ویرانگر است.

effects of cistance-antitumor (2)

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

نتایج

غربالگری ساختارهای CAR ویژه نوتروفیل برای افزایش فعالیت های ضد تومور

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90٪، و اکثر کلون های هدف هتروزیگوت هستند (شکل تکمیلی 1a-d). بیان CAR روی hPSCهای مهندسی شده توسط RT-PCR و آنالیز فلوسیتومتری CLTX-IgG4 بیشتر تایید شد (شکل تکمیلی 1e-g). همانطور که انتظار می رفت، hPSCهای بیان کننده CAR سطوح بیان بالایی از نشانگرهای پرتوان، از جمله OCT4، SSEA4، و SOX2 را حفظ کردند (شکل تکمیلی 1f).

برای تولید نوتروفیل های جدید CAR، hPSC های بیان کننده CAR ابتدا با درمان سیتوکین مخصوص مرحله به پیش سازهای خونساز چند توان و سپس میلوئید تمایز داده شدند (شکل 2c). استفاده بعدی از G-CSF و آگونیست اسید رتینوئیک AM580 باعث افزایش تولید نوتروفیل قوی شد. مشابه همتایان خود در خون محیطی (PB)، نوتروفیل های CLTX-CAR مشتق از hPSC مورفولوژی نوتروفیل معمولی و نشانگرهای سطحی CD16، CD11b، MPO، CD15، CD66b و CD18 را ارائه کردند (شکل تکمیلی 2). ما بعداً اثرات بیان CAR را بر سمیت سلولی ضد تومور نوتروفیل‌های مشتق از hPSC با کشت همزمان آنها با سلول‌های U87MG گلیوبلاستوما (GBM) در شرایط آزمایشگاهی تعیین کردیم. همانطور که انتظار می رفت، نوتروفیل های CLTX-CAR مشتق شده از hPSC توانایی کشتن تومور را در مقایسه با نوتروفیل های PB (شکل 2d)، مطابق با مشاهدات قبلی در سلول های CLTX CAR-T نشان دادند. در میان این CAR های مختلف، CAR #1 فعالیت های برتر کشتن تومور را در نوتروفیل های hPSC واسطه کرد. قابل‌توجه، CAR #4 مبتنی بر زنجیره کمترین اثر را در تحریک کشتن تومور با واسطه نوتروفیل دارد، که ممکن است به دلیل کپی پایین‌تر ITAM در زیر واحد ζ و بیان کمتر CARهای حامل بر روی سطح سلول باشد. نوتروفیل ها گونه های اکسیژن فعال سیتوتوکسیک (ROS) و فاکتور نکروز تومور (TNF-) را برای کشتن سلول های هدف آزاد می کنند. تولید ROS و TNF- (شکل 2e، f) از نوتروفیل های مختلف به خوبی با افزایش سیتولیز آنها همزمان بود. همانطور که انتظار می رفت، تولید ROS و TNF- از نوتروفیل های مختلف پس از کشت همزمان با سلول های گلیال p12 SVG طبیعی به اندازه گروه کنترل منفی کم باقی ماند (شکل تکمیلی 3a, b). علاوه بر این، افزایش سمیت سلولی ضد تومور نوتروفیل‌های CAR تنها در انکوباسیون همزمان با سلول‌های GBM، از جمله U87MG، GBM43 بزرگسالان اولیه، و سلول‌های SJ-GBM2 کودکان (شکل 3c تکمیلی)، مشاهده شد که ویژگی بالای CLTX ما را نشان می‌دهد. -ماشین. نکته قابل توجه، نوتروفیل‌های CAR سازگاری بالایی با سلول‌های گلیال SVG p12، hPSCs و سلول‌های مشتق از hPSC نشان دادند (شکل تکمیلی 3d)، که مطابق با مشاهدات قبلی بود که نوتروفیل‌های اولیه غیرفعال شده سلول‌های سالم را نمی‌کشند. در مجموع، نوتروفیل های CAR مشتق شده از hPSC، به ویژه نوتروفیل های CAR حاوی CD3ζ، سمیت سلولی ضد توموری را افزایش دادند و ROS و TNF- بیشتری را در شرایط آزمایشگاهی تولید کردند و پتانسیل آنها را در ایمونوتراپی هدفمند برجسته کردند.

Fig. 1 | Schematic of enhanced anti-glioblastoma efficacy using combinatory immunotherapy of CAR-neutrophils and tumor microenvironment responsive nano-drugs. Human pluripotent stem cells were engineered with CARs and differentiated into CAR-neutrophils that are loaded with rough silica nanoparticles (SiO2 NPs) containing hypoxia-targeting tirapazamine (TPZ) or other drugs, as a dual immunochemotherapy. b Systemically administered CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NPs first attack external normoxic tumor cells by forming immunological synapses and kill tumor cells via phagocytosis. After apoptosis, CAR-neutrophils could then release R-SiO2-TPZ NPs, which are overtaken by tumor cells. Afterward, nano-prodrugs respond to the hypoxic tumor microenvironment and effectively kill tumor cells. TEOS tetraethyl orthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.


شکل 1|طرح کلی اثربخشی ضد گلیوبلاستوما با استفاده از ایمونوتراپی ترکیبی CAR-نوتروفیل ها و نانوداروهای پاسخگو به ریزمحیط تومور. سلول های بنیادی پرتوان انسانی با CAR ها مهندسی شده و به نوتروفیل های CAR تمایز داده شدند که با نانوذرات سیلیکا خشن (SiO2 NPs) حاوی تیراپازامین (TPZ) یا سایر داروها، به عنوان یک ایمونوشیمی درمانی دوگانه بارگذاری شده اند. b NP های CAR-نوتروفیل@R-SiO2- که به صورت سیستمیک تجویز می‌شوند، ابتدا با تشکیل سیناپس‌های ایمونولوژیک به سلول‌های تومور نورموکسیک خارجی حمله می‌کنند و سلول‌های تومور را از طریق فاگوسیتوز می‌کشند. پس از آپوپتوز، نوتروفیل‌های CAR می‌توانند NP‌های R-SiO{12}}TPZ را آزاد کنند که توسط سلول‌های تومور غلبه می‌کنند. پس از آن، نانو پیش داروها به ریزمحیط تومور هیپوکسیک پاسخ می دهند و به طور موثر سلول های تومور را از بین می برند. TEOS تترا اتیل ارتوسیلیکات، BTES bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfide، TPZ tirapazamine، BTZ benzotriazinyl.

نوتروفیل‌های CAR تحت ریزمحیط‌های تومور سرکوب‌کننده سیستم ایمنی، فعالیت‌های ضد توموری برتری را حفظ کردند.

مشابه ماکروفاژها، فنوتیپ‌های ضد تومور N1 و N2 پروتومور نوتروفیل‌های مرتبط با تومور در ریزمحیط تومور سرکوب‌کننده ایمنی یافت شدند. نوتروفیل های N2 طرفدار تومور نقش مهمی در رگزایی تومور، متاستاز و سرکوب سیستم ایمنی دارند، اما هدف گیری درمانی این نوع سلول چالش برانگیز بوده است.

به جای یک استراتژی کاهش سیستمیک22، در اینجا ما پتانسیل مهندسی CAR را در حفظ فنوتیپ ضد توموری نوتروفیل ها ارزیابی کردیم. نوتروفیل‌های مشتق شده از hPSC و PB با هیپوکسی (3% O2) و TGF، که به سرکوب سیستم ایمنی ریزمحیط تومور کمک می‌کنند، تحت درمان قرار گرفتند تا فعالیت کشتن تومور پایدار آنها ارزیابی شود. در حالی که نوتروفیل‌های PB کاهش قابل توجهی سیتولیز علیه سلول‌های GBM را تحت شرایط سرکوب‌کننده ایمنی نشان دادند، نوتروفیل‌های CAR فعالیت‌های کشتن تومور بالایی را حفظ کردند (شکل تکمیلی 4a). مشاهدات مشابهی نیز در انتشار TNF و تولید ROS (شکل تکمیلی 4b، c) از PB یا CAR-نوتروفیل ها تحت شرایط سرکوب کننده ایمنی و طبیعی انجام شد. برای تأیید بیشتر فنوتیپ نوتروفیل در شرایط هیپوکسیک و TGF، بیان N{14}}iNOS خاص و N{15}} N{16}}آرژیناز خاص را بر روی نوتروفیل‌های جدا شده با فلوسیتومتری اندازه‌گیری کردیم (شکل تکمیلی. 4d-f). در مقایسه با نورموکسی، هیپوکسی سرکوب کننده سیستم ایمنی، و TGF به طور قابل توجهی سطوح بیان iNOS و افزایش سطح آرژیناز در نوتروفیل های PB را کاهش دادند، در حالی که نوتروفیل های CAR سطوح بیان بالای iNOS را حفظ کردند. مطالعات قبلی نشان می‌دهد که فعال‌سازی مسیر سیگنالینگ Syk-Erk منجر به تولید ROS می‌شود39-42. بنابراین، ما فعال‌سازی Syk-Erk را در نوتروفیل‌های اصلاح‌نشده و CAR-نوتروفیل‌ها شناسایی و مقایسه کردیم، و نتایج ما فعال‌سازی قابل‌توجهی مسیر Syk-Erk در نوتروفیل‌های CAR تحت هیپوکسی را پیشنهاد کرد (شکل تکمیلی 5a-d)، که ممکن است حفظ شود. تولید بدون تغییر ROS از CAR-نوتروفیل ها تحت هیپوکسی. در مجموع، نوتروفیل‌های CAR یک فنوتیپ ضد تومور را حفظ کردند و فعالیت‌های ضد توموری بالایی را تحت شرایط شبیه‌سازی محیط تومور در شرایط آزمایشگاهی حفظ کردند، و پتانسیل آنها را در ایمونوتراپی هدفمند برجسته کرد.

Fig. 2 | Screening neutrophil-specific chimeric antigen receptor (CAR) structures with enhanced neutrophil-mediated anti-tumor activities. a Schematic of various CAR structures. b Schematic of CAR #1 construct and targeted knock-in strategy at the AAVS1 safe harbor locus of human pluripotent stem cells (hPSCs). The vertical arrow indicates the AAVS1 targeting sgRNA. Red and blue horizontal arrows indicate primers for assaying targeting efficiency and homozygosity, respectively. HDR: homologous recombination repair. c Schematic of optimized neutrophil differentiation from hPSCs under chemically defined conditions. d Cytotoxicity assays against U87MG glioblastoma cells were performed at different ratios of neutrophil-to-tumor target using indicated neutrophils. Data are represented as mean ± SD of five independent biological replicates, two-tailed Student's t-test. Reactive oxygen species (ROS) generation (e) and ELISA analysis of TNFα release (f) from different neutrophils after coculturing with U87MG cells were determined. n = 5 biologically independent samples. The data are represented as mean ± SD, two-tailed Student's t-test. Source data are provided as a Source Data file.


شکل 2|غربالگری ساختارهای گیرنده آنتی ژن کایمریک (CAR) ویژه نوتروفیل با افزایش فعالیت های ضد توموری با واسطه نوتروفیل. شماتیکی از ساختارهای مختلف خودرو. b شماتیک سازه CAR #1 و استراتژی ضربه‌ای هدفمند در جایگاه امن AAVS1 سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی (hPSCs). فلش عمودی نشان دهنده sgRNA هدف گیری AAVS1 است. فلش های افقی قرمز و آبی به ترتیب آغازگرهایی را برای سنجش کارایی هدف گیری و هموزیگوسیتی نشان می دهند. HDR: تعمیر نوترکیبی همولوگ. c شماتیک تمایز بهینه نوتروفیل از hPSCها تحت شرایط شیمیایی تعریف شده. d سنجش سمیت سلولی علیه سلول‌های گلیوبلاستوما U87MG در نسبت‌های مختلف هدف نوتروفیل به تومور با استفاده از نوتروفیل‌های مشخص شده انجام شد. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار پنج تکرار بیولوژیکی مستقل، آزمون t-test Student نشان داده شده است. گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) نسل (e) و تجزیه و تحلیل ELISA از انتشار TNF (f) از نوتروفیل‌های مختلف پس از کشت همزمان با سلول‌های U87MG تعیین شد. n=5 نمونه مستقل بیولوژیکی. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار، آزمون t دانشجوی دو طرفه نمایش داده می شوند. داده های منبع به عنوان یک فایل داده منبع ارائه می شوند.

تهیه و شناسایی نوتروفیل های CAR hPSC بارگذاری شده با نانوذرات SiO2 حاوی تیراپازامین (TPZ)

نوتروفیل های PB به عنوان حامل های سلولی برای رساندن داروهای تصویربرداری و درمانی به تومورهای مغزی 8-10 مورد استفاده قرار گرفته اند، اگرچه نفوذ هدفمند نوتروفیل ها نیازمند جراحی یا التهاب ناشی از نور و تحویل داروی خارج از هدف ممکن است نگران کننده باشد. برای بهبود بیشتر فعالیت‌های ضد توموری نوتروفیل‌های CAR، نانوذرات سیلیکا (SiO2-NP) را با سطحی ناهموار یا صاف برای بارگذاری داروهای شیمی‌درمانی یا پرتودرمانی در نوتروفیل‌ها آماده کردیم. تصاویر میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) نشان داد که هر دو نانوذرات SiO2 به خوبی پراکنده شده‌اند و مورفولوژی کروی با اندازه یکنواخت را نشان می‌دهند (شکل 3a، شکل تکمیلی 6a). تجزیه و تحلیل توزیع ترکیب از طریق اسکن TEM (STEM) با طیف‌سنجی پرتو ایکس پراکنده انرژی (EDS) نشان داد که عنصر گوگرد (S) به طور مساوی در کل نانوذرات SiO2 خشن (R-SiO2) توزیع شده است (شکل 3b). با استفاده از ایزوترم های جذب و دفع نیتروژن (N2) و تجزیه و تحلیل توزیع اندازه منافذ مربوطه، اندازه منافذ نانوذرات R- و SSiO2 به ترتیب 25 نانومتر و 35 نانومتر اندازه گیری شد (شکل 3c، شکل تکمیلی 6b). با توجه به مساحت سطح بالا و اندازه منافذ بزرگ، داروهای درمانی را می‌توان به طور موثر در NPs R- و S-SiO2 بارگذاری کرد، همانطور که توسط داروی تیراپازامین (TPZ) واکنش‌دهنده به هیپوکسی نشان داده شده است (شکل 3d، شکل تکمیلی 6c). . پس از بارگذاری TPZ، تغییرات قابل توجهی در پراکندگی، مورفولوژی و اندازه R-SiO{35}}TPZ با استفاده از TEM و تجزیه و تحلیل پراکندگی نور پویا مشاهده نشد (شکل تکمیلی 6d، e). پیوندهای تترا سولفیدی که در نانوذرات R-SiO2 گنجانده شده‌اند به محیط‌های تقلیل‌دهنده حساس هستند و می‌توانند به سرعت توسط مقدار زیادی گلوتاتیون (GSH) موجود در سلول‌های تومور تجزیه شوند. سپس تجزیه پذیری پاسخگوی GSH نانوذرات R-SiO2-TPZ را در حضور 10 میلی‌مولار، 1 میلی‌مولار و 10 میکرومولار GSH تعیین کردیم که به ترتیب با شرایط داخل سلولی سلول‌های سرطانی، سلول‌های طبیعی و محیط‌های خارج سلولی یکسان بود. پس از تیمار 10 میلی مولار GSH، ساختار کروی اولیه نانوذرات R-SiO2-TPZ پس از 24 ساعت به شدت تخریب شد (شکل تکمیلی 6f، g). نانوذرات پس از 48 ساعت به طور کامل به بقایای کوچک متلاشی شدند و در نتیجه TPZ به روشی پاسخگو به GSH آزاد شد (شکل 3e). بقایای نانوذرات R-SiO2 هیچ گونه سمیت سلولی قابل توجهی برای سلول های آزمایش شده در شرایط آزمایشگاهی ایجاد نکرد (شکل تکمیلی 6h)، که نشان دهنده ایمنی نسبی نانوذرات R-SiO2 است.

Desert ginseng—Improve immunity (2)

cistanche tubulosa - سیستم ایمنی را بهبود می بخشد

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ما در مرحله بعد امکان استفاده از نانوذرات SiO2-TPZ را برای بارگذاری داروهای درمانی در نوتروفیل های CAR به عنوان یک شیمی ایمونوتراپی ترکیبی برای دستیابی به اثربخشی درمانی بیشتر ارزیابی کردیم. پس از سانتریفیوژ، ما جذب سلولی نانوذرات SiO2-TPZ توسط نوتروفیل ها را با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس و آنالیز فلوسیتومتری اندازه گیری کردیم (شکل 3f، g)، و جذب سلولی قابل توجه NPs R-SiO2-TPZ را نسبت به S-SiO2- شناسایی کردیم. TPZ NPs توسط نوتروفیل ها. محتوای Si سلولی در نوتروفیل ها به ترتیب به عنوان پروتئین Si/ug 11.3 و 19.1 نانوگرم برای SiO2 NPs@TPZ صاف و خشن (شکل 3h) با طیف سنجی جرمی پلاسما جفت شده القایی (ICP-MS) اندازه گیری شد. با توجه به ظرفیت بارگذاری بالای آنها در نوتروفیل ها، NP های R-SiO2-TPZ برای آزمایش های بعدی مورد استفاده قرار گرفتند. سپس ما به دنبال آزمایش عملکردهای فیزیولوژیکی نوتروفیل‌های CAR پس از بارگذاری NPs R-SiO2-TPZ بودیم. هیچ تغییری در زنده ماندن سلول ها (شکل 3i، شکل تکمیلی 6i)، توانایی مهاجرت از طریق چاهک (شکل 3j)، کموتاکسی، و سرعت متناظر (شکل 3k، l) CAR-نوتروفیل ها قبل یا بعد از بارگیری R-SiO2 مشاهده نشد. – TPZ NP ها که زیست سازگاری بالای خود را نشان می دهند. تجزیه و تحلیل بارگذاری نانوداروی وابسته به زمان نیز انجام شد و حداکثر محتوای بارگذاری در 1 ساعت پس از انکوباسیون سلول-NP به دست آمد (شکل تکمیلی 7a). بیش از 95٪ نوتروفیل های CAR با موفقیت با NP های R-SiO2-TPZ بارگیری شدند (شکل تکمیلی 7b). سطح بیان CD11b، یک پروتئین سطح نوتروفیل که واسطه چسبندگی و عملکرد مهاجرت بر تحریک مولکول التهابی است، در CAR-نوتروفیل ها با یا بدون بارگذاری R-SiO{39}}TPZ تغییری نکرد (شکل تکمیلی 7c، d). سوپراکسید یا گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) از نوتروفیل‌های فعال برای کشتن میکروب‌ها و سلول‌های تومور آزاد می‌شوند. همانطور که انتظار می رفت، تولید ROS توسط CAR-نوتروفیل ها پس از تیمار N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) به طور قابل توجهی افزایش یافت و تفاوت معنی داری در تولید ROS توسط CAR-نوتروفیل ها قبل و بعد از بارگذاری R-SiO مشاهده نشد{48} TPZ (شکل 3m). در مجموع، داده‌های ما نشان داد که نوتروفیل‌های CAR بارگذاری‌شده با R-SiO{51}}TPZ فعالیت‌های فیزیولوژیکی نوتروفیل‌های نوع وحشی را حفظ می‌کنند و می‌توانند فعالانه به سمت محرک‌های التهابی مهاجرت کنند و پتانسیل آن‌ها را در شیمی‌ایمونوتراپی هدفمند سرطان برجسته کنند.

CAR-نوتروفیل های بارگذاری شده با نانوذرات R-SiO2-TPZ به طور موثر سلول های گلیوبلاستوما را از بین می برند.

ما بعداً اثر R-SiO2-TPZ بر توانایی کشتن تومور نوتروفیل‌های CAR را ارزیابی کردیم. تعامل مؤثر-هدف صمیمی یک پیش نیاز برای سیتولیز با واسطه نوتروفیل بود. همانطور که انتظار می‌رفت، CAR-نوتروفیل‌ها@R-SiO2-TPZ سیناپس‌های ایمنی را با سلول‌های تومور در عرض 2 ساعت تشکیل دادند و اعداد تعامل اثربخش-هدف مشابهی را مانند نوتروفیل‌های CAR بدون دارو نشان دادند (شکل 4a، شکل تکمیلی 8) . قابل‌توجه، هیچ تعامل قابل مشاهده‌ای بین CAR-نوتروفیل@RSiO{16}}TPZ و سلول‌های سوماتیک غیرسرطانی یافت نشد (تصویر تکمیلی 8)، که ویژگی CLTX-CAR را در برابر تومورهای مغزی برجسته می‌کند. علاوه بر این، NP های R-SiO2-TPZ از نوتروفیل ها در محیط کشت آزاد شدند (شکل تکمیلی 9a، b) 12 ساعت پس از کشت همزمان و وارد سلول های تومور باقی مانده شدند (شکل 4a). بیست و چهار ساعت پس از انکوباسیون همزمان نوتروفیل‌های CAR با SiO2-TPZ NP با سلول‌های تومور، تا 95 درصد سلول‌های تومور حاوی NPs R-SiO2-TPZ بودند (شکل 4a، شکل تکمیلی 9c)، که نشان‌دهنده موفقیت آمیز بودن آن است. آبشار انتقال شامل نوتروفیل‌های حاملی است که عملکرد سلول مؤثر خود را اعمال می‌کنند و تحت آپوپتوز قرار می‌گیرند، در نتیجه به طور غیر فعال NPs R-SiO2-TPZ را به سلول‌های تومور هدف آزاد می‌کنند. ما همچنین عملکرد پاسخگوی هیپوکسیک و سمیت سلولی TPZ طرفدار دارو را در سلول‌های تومور با تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی رزونانس پارامغناطیس الکترونی (EPR) تولید رادیکال‌ها از TPZ (شکل تکمیلی 9d) و تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری TOPRO روی تومور تأیید کردیم. سلول ها (شکل تکمیلی 9e) تحت هیپوکسی و نورموکسی. برای تعیین سیتولیز نوتروفیل های CAR با NP-R-SiO2-TPZ، ما یک مدل چالش برانگیز تومور نورموکسی-هیپوکسی in vitro را اجرا کردیم (شکل 4b). بیست و چهار ساعت پس از کشت هم‌زمان نورموکسیک، نوتروفیل‌های CAR با NP‌های R-SiO{50}}TPZ یا فاقد سمیت سلولی ضد تومور مشابهی از خود نشان دادند (شکل 4c)، و هر دو بالاتر از نوتروفیل PB بارگذاری شده با R بودند. -SiO2-TPZ NPs یا نه و R-SiO2- TPZ NPs به تنهایی. افزایش سمیت سلولی عمدتاً به دلیل افزایش توانایی هدف گیری تومور نوتروفیل ها پس از مهندسی CAR است. پس از 12 و {60}ساعت هم‌کشت هیپوکسیک اضافی با سلول‌های تومور، نوتروفیل‌های CAR با R-SiO{62}}TPZ NP دارای توانایی ضد توموری برتری در مقایسه با گروه‌های دیگر نشان دادند (شکل 4d، e). علاوه بر این، نوتروفیل‌های CAR بارگیری شده با NP‌های R-SiO2-TPZ، سیتولیز عالی در برابر سلول‌های تومور تازه کاشته شده نشان دادند (شکل 4f)، که نشان‌دهنده توانایی ضد توموری R-SiO2-TPZ آزاد شده است. نانوذرات پس از آپوپتوز نوتروفیل

سپس آنالیز توالی‌یابی RNA (RNA-seq) را روی سلول‌های تومور انجام دادیم تا مکانیسم مولکولی بالقوه زیربنایی سیتولیز ضد تومور نوتروفیل‌ها توسط بیان CAR و NPs R-SiO{3}}TPZ را روشن کنیم. تجزیه و تحلیل بیان ژن نشان داد که در مقایسه با NP های کنترل و R-SiO2-TPZ، نوتروفیل های CAR بارگیری شده با یا بدون NP-SiO2-TPZ به طور قابل توجهی بیان سیتوپلاسم و ژن های غشایی را در سلول های تومور کاهش دادند. شکل تکمیلی 10a، شکل 4g)، بیشتر از فاگوسیتوز سلول های تومور در کشت همزمان حمایت می کند. در حالی که همه گروه‌های آزمایشی استرس اکسیداتیو سلولی را در سلول‌های تومور افزایش دادند، نوتروفیل‌های CAR بارگیری‌شده با R-SiO{12}}TPZ در تحریک سیگنال‌دهی استرس اکسیداتیو بهتر از سایر گروه‌ها عمل کردند. علاوه بر این، نوتروفیل‌های CAR با R-SiO{16}}TPZ به طور قابل توجهی آپوپتوز را ارتقا داده و تکثیر سلول‌های تومور را کاهش دادند. برای درک بیشتر فعالیت‌های ضد توموری افزایش‌یافته نوتروفیل‌های CAR با R-SiO{21}، از یک مهارکننده فاگوسیتوز سیتوکالاسین D و یک گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) N-استیل سیستئین (NAC) استفاده کردیم و یک مهارکننده ROS GSK2795039 برای هم کشت تومور-نوتروفیل. سیتولیز سلول های تومور توسط CAR-نوتروفیل ها به طور قابل توجهی توسط 5 میکرومولار سیتوکالاسین D، 5 میلی مولار NAC، و 100 نانومولار GSK2795039 کاهش یافت (شکل تکمیلی 10b, c)، که نشان دهنده نقش برجسته فاگوسیتوز و ROS در تومور-سلول تومور با واسطه ROS است. کشتن 40%-50% لیز سلول تومور باقی مانده در حضور نوتروفیل ها و NAC یا GSK2795039 نشان دهنده دخالت مکانیسم مستقل از ROS در کشتن تومور با واسطه نوتروفیل است که ارزش بررسی بیشتر را دارد.

Fig. 3 | Preparation and characterization of hPSC CAR-neutrophils loaded with tirapazamine (TPZ)-containing SiO2 nanoparticles. a–e Transmission electron microscope (TEM) (a) and energy dispersive spectroscopy (EDS) elemental mapping images (b) of rough SiO2 nanoparticles are shown. c Nitrogen adsorption-desorption isotherm of rough SiO2 nanoparticles along with Barrett-JoynerHalenda (BJH) pore size distribution plot is shown. Biological triplicates were performed independently. TPZ loading content in SiO2 nanoparticles (d) and glutathione (GSH)--responsive TPZ release (e) were measured at the indicated time. n = 3 biologically independent samples. One-way analysis of variance (ANOVA) for (e). Fluorescence images (f) and flow cytometry analysis (g) of neutrophils loaded with smooth and rough SiO2-TPZ. Biological triplicates were performed independently. h Cellular SiO2 content in hPSC-derived CAR-neutrophils was measured. n = 5 biologically independent samples, two-tailed Student's t-test. Cellular viability (i), n = 3 biologically independent samples, transmigration (j), n = 5 biologically independent samples, chemoattraction abilities (k, l), n = 20 biologically independent samples, and ROS generation ability (m) of hPSC-derived CAR-neutrophils loaded with or without rough SiO2-TPZ were shown, n = 5 biologically independent samples, two-tailed Student's t-test. PMA: phorbol myristate acetate. All data in this figure are represented as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file.


شکل 3|تهیه و شناسایی نوتروفیل‌های CAR hPSC بارگذاری شده با نانوذرات SiO2 حاوی تیراپازامین (TPZ). a-e میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) (a) و طیف‌سنجی پراکنده انرژی (EDS) تصاویر نقشه‌برداری عنصری (b) از نانوذرات SiO2 خشن نشان داده شده‌اند. c ایزوترم جذب و دفع نیتروژن نانوذرات SiO2 خشن به همراه نمودار توزیع اندازه منافذ Barrett-JoynerHalenda (BJH) نشان داده شده است. سه تکرار بیولوژیکی به طور مستقل انجام شد. محتوای بارگذاری TPZ در نانوذرات SiO2 (d) و گلوتاتیون (GSH) -- انتشار پاسخگو TPZ (e) در زمان مشخص شده اندازه‌گیری شد. n=3 نمونه مستقل از نظر بیولوژیکی. تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) برای (e). تصاویر فلورسانس (f) و آنالیز فلوسیتومتری (g) نوتروفیل‌های بارگذاری شده با SiO صاف و خشن2-TPZ. سه تکرار بیولوژیکی به طور مستقل انجام شد. h محتوای SiO2 سلولی در نوتروفیل های CAR مشتق از hPSC اندازه گیری شد. n=5 نمونه بیولوژیکی مستقل، آزمون t-test Student. زنده ماندن سلولی (i)، n=3 نمونه مستقل بیولوژیکی، انتقال (j)، n=5 نمونه مستقل بیولوژیکی، توانایی جذب شیمیایی (k، l)، n=20 نمونه مستقل بیولوژیکی، و توانایی تولید ROS (m) نوتروفیل‌های CAR مشتق از hPSC بارگیری شده با یا بدون SiO{24}}TPZ خشن نشان داده شد، n ​​= 5 نمونه مستقل از نظر بیولوژیکی، آزمون t دانشجوی دو طرفه. PMA: فوربول میریستات استات. تمام داده های این شکل به صورت میانگین ± SD نشان داده شده است. داده های منبع به عنوان یک فایل داده منبع ارائه می شوند.

ارزیابی عملکردی نوتروفیل‌های CAR بارگذاری شده با داروهای نانو با استفاده از مدل‌های گلیوبلاستومای بیومیمتیک در شرایط آزمایشگاهی

برای ارزیابی بیشتر فعالیت‌های نوتروفیل‌های CAR با R-SiO{1}}TPZ NP، ما یک مدل تومور سد خونی مغزی (BBB) ​​مبتنی بر چاهک را با استفاده از سلول‌های اندوتلیال ریز عروقی مغز انسان اجرا کردیم (شکل 5a، شکل تکمیلی). . 11a). همانطور که انتظار می رفت، نوتروفیل های CAR با R-SiO{9}}TPZ NP دارای توانایی انتقال عالی در مدل BBB in vitro (شکل 5b) بودند که به طور موثر سلول های تومور هدف را پس از انتقال تحت شرایط عادی و هیپوکسیک از بین می برد (شکل 5c). ، d)، و آزاد کردن سایتوکین های التهابی بیشتر (شکل 5e) که ممکن است سایر سلول های موثر را برای کشتن سلول های تومور جذب کند. علاوه بر این، نوتروفیل های CAR به طور قابل توجهی بر زنده ماندن سلول های اندوتلیال پس از انتقال تأثیر نمی گذارد (شکل تکمیلی 11b). نوتروفیل‌های CAR با R-SiO{17}}TPZ NP دارای توانایی انتقال عالی در طول آزمایش انتقال دوم (شکل 5f) و توانایی برتر ضد تومور در مقایسه با گروه‌های دیگر (شکل 5g) بودند. سپس یک مدل کروی تومور سه بعدی (3D) برای ارزیابی ظرفیت نفوذ تومور نوتروفیل‌های CAR با NP-R-SiO{26} TPZ استفاده شد (شکل 5h). CAR-نوتروفیل ها به تدریج به سمت مرکز کروی تومور مهاجرت کردند و پس از 8 ساعت انکوباسیون به طور یکنواخت در کروی توزیع شدند (شکل 5i). درجه بالایی از هم‌محلی‌سازی بین نوتروفیل‌های CAR و NP‌های R-SiO{35}}TPZ مشاهده شد (تصویر تکمیلی 12a-c)، که نشان می‌دهد NP‌های R-SiO{38}}TPZ به‌طور پایدار در CAR محصور شده‌اند. نوتروفیل ها در طول نفوذ تومور قبل از سیتولیز آنها. بدون تحویل با واسطه نوتروفیل، NP های R-SiO{42}}TPZ فقط در لایه بیرونی کروی های تومور یافت شدند. در مقایسه با NP‌های R-SiO{44}}TPZ و نوتروفیل‌های CAR، نوتروفیل‌های CAR بارگذاری‌شده با TPZ NP، سیتولیز ضد توموری برتری را در مدل تومور سه‌بعدی نشان دادند (شکل 5j). CAR-neutrophils@R-SiO2 NPs همچنین می‌تواند برای رساندن داروهای دیگر، از جمله تموزولوماید بالینی (TMZ) و JNJ{55}} به مدل‌های تومور سه بعدی و کشتن مؤثر سلول‌های GBM استفاده شود (شکل تکمیلی 12d-f). در مجموع، نوتروفیل‌های ترکیبی CAR و نانو داروهای ترکیبی، فعالیت‌های ضد توموری عالی در ریزمحیط تومور بیومیمتیک شبیه‌سازی شرایط in vitro نشان دادند، که پتانسیل درمانی شیمی‌ایمونوتراپی مبتنی بر نوتروفیل ترکیبی را برجسته می‌کند.

Desert ginseng—Improve immunity (9)

cistanche tubulosa - سیستم ایمنی را بهبود می بخشد

توزیع in vivo نانوذرات R-SiO2-TPZ تحویل‌شده توسط نوتروفیل CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20% از نانوداروهای تجویز شده توسط CAR-نوتروفیل ها به تومورهای مغزی تحویل داده شدند در حالی که 1% توسط نانوداروهای رایگان که با گزارش های قبلی مطابقت دارد. تحویل هدفمند NP های R-SiO2-TPZ به مغز میزبان در سراسر BBB توسط CAR-نوتروفیل ها نیز با تجزیه و تحلیل بافت شناسی تایید شد (شکل 6d). برعکس، NP های R-SiO{9}}TPZ به تنهایی عمدتاً در کبد و طحال انباشته می شوند. در مجموع، داده‌های ما انتقال هدفمند NPs R-SiO{11}}TPZ توسط نوتروفیل‌های CAR را بدون نیاز به القای التهاب اضافی در محل تومور نشان داد، که امکان‌پذیری و ایمنی شیمی‌ایمونوتراپی مبتنی بر نوتروفیل را در درمان سرطان برجسته می‌کند.

شیمی‌ایمونوتراپی ترکیبی نوتروفیل‌های CAR و نانوذرات R-SiO2-TPZ فعالیت‌های عالی ضد گلیوبلاستوما را در داخل بدن نشان داد.

برای تعیین اثربخشی درمانی نوتروفیل‌های CAR بارگذاری‌شده با R-SiO2-TPZ NP، یک مدل زنوگرافت در محل گلیوبلاستوما در موش‌های NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) با استفاده از سلول‌های لوسیفراز (NRG) ایجاد شد. موش های حامل تومور به صورت داخل وریدی 5 × 106 نوتروفیل به صورت هفتگی تجویز شدند (شکل 7a)، و بار تومور در میزبان اندازه گیری و اندازه گیری شد (شکل 7b، c). در مقایسه با موش های تحت درمان با PBS یا PB-نوتروفیل، درمان با CAR-نوتروفیل ها و CAR neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs به طور موثر رشد تومور را کند کرد. نوتروفیل های CAR@R-SiO2-TPZ NP ها سمیت سلولی ضد توموری بسیار بالاتری نسبت به سایر گروه های تجربی نشان دادند. در مقابل، PB-نوتروفیل ها به طور قابل توجهی رشد تومور را در مغز افزایش دادند، که منجر به مرگ موش های حامل تومور در اوایل روز 23 شد (شکل 7d)، که نشان می دهد نوتروفیل های مهندسی نشده ممکن است خطرات بیشتری ایجاد کنند. ما در مرحله بعد آزادسازی سیتوکین انسانی را در پلاسمای گروه های آزمایشی مختلف موش اندازه گیری کردیم (شکل 7e). همه گروه‌های آزمایشی غیر PBS، TNF و IL{28}} قابل تشخیص را در پلاسما از روز 5 تا 26 تولید کردند که نشان‌دهنده فعال شدن نوتروفیل‌های انسانی بر تحریک تومور است. مطابق با نرخ رشد بالاتر مشاهده شده تومور، نوتروفیل های اصلاح نشده به تدریج IL{31}} و TNF بیشتری آزاد می کنند که ممکن است منجر به سندرم آزادسازی سیتوکین در بیماران شود و نیاز به مطالعات ایمنی عمیق تری با مسدود کننده های IL{33}} داشته باشد46،47 . قابل‌توجه، نانوذرات CAR-نوتروفیل@RSiO2-TPZ توانایی تولید سیتوکین کاهش یافته را در مقاطع زمانی بعدی (روز 19 و روز 26) نشان دادند، که نشان‌دهنده خطر بالقوه پایین سندرم آزادسازی سیتوکین در بیماران تحت درمان با شیمی‌درمانی مبتنی بر نوتروفیل CAR است. زیست سازگاری ترکیبی CAR-نوتروفیل ها و NPs R-SiO2-TPZ از طریق اندازه گیری هفتگی وزن بدن و نظارت بر تغییرات پاتولوژیک در اندام های اصلی موش مورد ارزیابی قرار گرفت. هیچ تفاوتی در وزن بدن بین موش‌های تحت درمان با نوتروفیل CAR@R-SiO2-TPZ و سایر گروه‌های آزمایشی مشاهده نشد (شکل 7f)، که نشان‌دهنده حداقل سمیت سیستمیک و زیست سازگاری عالی NPs CAR-نوتروفیل@ R-SiO2-TPZ در داخل است. 28 روز درمان تجزیه و تحلیل بافت شناسی بر روی اندام های اصلی برش داده شده از موش ها در روز 30 نشان داد که موش های تحت درمان با CAR-نوتروفیل@R-SiO2-TPZ NP باعث ناهنجاری قابل توجه یا آسیب اندام در قلب، کبد، طحال، ریه و کلیه نشدند (شکل تکمیلی. 13)، ایمنی ترکیبی CAR-نوتروفیل ها و NP های R-SiO2-TPZ را بیشتر تایید می کند.

Fig. 4 | CAR-neutrophils loaded with R-SiO2-TPZ nanoparticles effectively kill glioblastoma cells. Representative images of immunological synapses indicated by polarized F-actin accumulation at the interface between CAR-neutrophils and tumor cells at 6, 12, and 24 h were shown. R-SiO2-TPZ nanoparticles released from CAR-neutrophils upon tumor cell phagocytosis were up-taken by tumor cells. Triplicates were performed independently. b Schematic of neutrophil-mediated anti-tumor cytotoxicity assay. Cytotoxicity against U87MG glioblastoma cells was performed at different ratios of neutrophil-to-tumor target using indicated neutrophils at 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e), and 72 h (f). n = 3 biologically independent samples. Data are represented as mean ± SD, one-way analysis of variance (ANOVA). g Bulk RNA sequencing analysis was performed on U87MG cells under various conditions. Heatmap shows expression levels of selected cytoplasm, membrane, oxidative stress, apoptosis, and proliferation-related genes in the indicated glioblastoma cells. n = 2 biologically independent samples. Source data are provided as a Source Data file.

شکل 4|CAR-نوتروفیل های بارگذاری شده با نانوذرات R-SiO{3}}TPZ به طور موثر سلول های گلیوبلاستوما را از بین می برند. تصاویری از سیناپس‌های ایمونولوژیک نشان‌دهنده تجمع قطبی شده F-اکتین در سطح مشترک بین CAR-نوتروفیل‌ها و سلول‌های تومور در ساعت‌های 6، 12 و 24 نشان داده شد. نانوذرات R-SiO{10}}TPZ آزاد شده از نوتروفیل‌های CAR در فاگوسیتوز سلول تومور توسط سلول‌های تومور جذب شدند. سه تکرار به طور مستقل انجام شد. b شماتیک سنجش سمیت سلولی ضد تومور با واسطه نوتروفیل. سمیت سلولی علیه سلول‌های گلیوبلاستوما U87MG در نسبت‌های مختلف هدف نوتروفیل به تومور با استفاده از نوتروفیل‌های مشخص شده در 24 ساعت (c)، 36 ساعت (d)، 48 ساعت (e)، و 72 ساعت (f) انجام شد. n=3 نمونه بیولوژیکی مستقل. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار، آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) نشان داده می شوند. g تجزیه و تحلیل توالی RNA حجیم بر روی سلول های U87MG تحت شرایط مختلف انجام شد. Heatmap سطوح بیان سیتوپلاسم انتخابی، غشاء، استرس اکسیداتیو، آپوپتوز، و ژن‌های مرتبط با تکثیر را در سلول‌های گلیوبلاستومای نشان‌داده‌شده نشان می‌دهد. n=2 نمونه بیولوژیکی مستقل. داده های منبع به عنوان یک فایل داده منبع ارائه می شوند.

Fig. 5 | Functional evaluation of CAR-neutrophils loaded with R-SiO2-TPZ nanoparticles using biomimetic glioblastoma (GBM) models in vitro. a Schematic of our in vitro tumor model of GBM with blood-brain-barrier (BBB), which is composed of endothelial cells on the cell insert membrane and tumor cells in the bottom of the same transwell. b Transwell migration analysis of neutrophils at 12 h is shown. Anti-GBM cytotoxicity of indicated neutrophils at 24 h (c) and 36 h (d) was measured and quantified. e ELISA analysis of IL-6 and TNFα released from indicated neutrophils at 36 h was performed. f Second migration of different neutrophils at 48 h is shown. g Anti-GBM cytotoxicity of indicated neutrophils at 60 h was measured and quantified. h–j Schematic of neutrophil-infiltrated three-dimensional (3D) tumor model in vitro was shown in (h). Representative fluorescent images of infiltrated neutrophils in the 3D tumor models were shown. DAPI was used to stain the cell nuclear and CD45 was used to stain neutrophils. Scale bars, 200 μm. Biological triplicates were performed independently. j The corresponding tumor-killing ability of indicated neutrophils was measured and quanti- fied using a cytotoxicity kit. Data are represented as mean ± SD of five independent biological replicates, one-way analysis of variance (ANOVA). Source data are provided as a Source Data file.


شکل 5|ارزیابی عملکردی نوتروفیل‌های CAR بارگذاری شده با نانوذرات R-SiO{3}}TPZ با استفاده از مدل‌های گلیوبلاستومای بیومیمتیک (GBM) در شرایط آزمایشگاهی. شماتیکی از مدل تومور آزمایشگاهی ما از GBM با سد خونی مغزی (BBB)، که از سلول‌های اندوتلیال روی غشای درج سلولی و سلول‌های تومور در پایین همان transwell تشکیل شده است. b تجزیه و تحلیل مهاجرت ترانسول نوتروفیل ها در 12 ساعت نشان داده شده است. سمیت سلولی ضد GBM نوتروفیل های نشان داده شده در 24 ساعت (ج) و 36 ساعت (د) اندازه گیری و کمی سازی شد. تجزیه و تحلیل ELISA IL{10}} و TNF آزاد شده از نوتروفیل های مشخص شده در 36 ساعت انجام شد. f مهاجرت دوم نوتروفیل های مختلف در 48 ساعت نشان داده شده است. گرم سمیت سلولی ضد GBM نوتروفیل های نشان داده شده در 60 ساعت اندازه گیری و اندازه گیری شد. h-j شماتیک مدل تومور سه بعدی (3D) نفوذ شده با نوتروفیل در شرایط آزمایشگاهی در (h) نشان داده شد. تصاویر فلورسنت نماینده نوتروفیل های نفوذ شده در مدل های تومور سه بعدی نشان داده شد. DAPI برای رنگ آمیزی هسته سلول و CD45 برای رنگ آمیزی نوتروفیل ها استفاده شد. میله های مقیاس، 200 میکرومتر. سه تکرار بیولوژیکی به طور مستقل انجام شد. j توانایی کشتن تومور مربوطه نوتروفیل های نشان داده شده با استفاده از کیت سمیت سلولی اندازه گیری و اندازه گیری شد. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار پنج تکرار بیولوژیکی مستقل، آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) نشان داده می شوند. داده های منبع به عنوان یک فایل داده منبع ارائه می شوند.

در حالی که نانوذرات CAR-نوتروفیل@R-SiO2-TPZ به طور قابل توجهی رشد تومور را در موش های پیوند زنوگرافت کند کرد، تفاوت در بقای حیوانات در گروه های تجربی CAR-نوتروفیل ها، SiO2-TPZ NPs و NPs CAR-نوتروفیل@R-SiO2-TPZ ناچیز است. (p > 0.05)، که احتمالاً به دلیل مرگ نوتروفیل های کوتاه مدت در طی آماده سازی و تزریق سلول است. ما در مرحله بعد بر روی این سه گروه تمرکز کردیم و تعیین کردیم که آیا کاهش زمان آماده‌سازی سلول و افزایش دوزهای CAR-نوتروفیل‌ها و نانو داروها تفاوتی در بقای حیوانات ایجاد می‌کند (شکل 7g). هنگامی که به طور سیستمیک 6 بار تجویز شد، نانوذرات CAR-نوتروفیل@R-SiO2-TPZ از دو گروه دیگر در افزایش طول عمر موش های حامل تومور بهتر عمل کردند (شکل 7h)، در حالی که تفاوت بقای حیوانات در گروه های CAR-نوتروفیل و SiO2- TPZ NPs ناچیز باقی ماندند. در حالی که منحنی بقای مشابهی از گروه R-SiO2- TPZ بین این دو مطالعه حیوانی مستقل مشاهده شد، زمان جداسازی سلولی و آماده‌سازی برای تزریق از مجموع 4 ساعت به 1 ساعت در طول 4 نوتروفیل اول کاهش یافت. دوزها منجر به بهبود بقای حیوانات در گروه‌های CAR-نوتروفیل قبل از روز 32 شد. در مجموع، داده‌های ما اهمیت آماده‌سازی نوتروفیل و بهینه‌سازی دوز را در کاربردهای بالینی آینده درمان‌های نوتروفیل نشان داد.

بحث

نوتروفیل‌های موش به‌عنوان یک حامل قدرتمند برای رساندن مؤثر نانوداروها به تومورهای مغزی ملتهب پس از عمل نشان داده شده‌اند. با این حال، امکان‌سنجی و ایمنی استفاده از نوتروفیل‌های انسانی در دارورسانی همچنان مبهم است. مقدار زیادی از نوتروفیل‌های موش (10 برابر بیشتر از تعداد کل نوتروفیل‌های در گردش در موش‌ها) که در این مطالعات برای دستیابی به مزایای درمانی مورد استفاده قرار گرفت، ممکن است مانع از ترجمه بالینی آنها شود زیرا استخراج تعداد زیادی از نوتروفیل‌ها از بیماران سرطانی ممکن است منجر به نوتروپنی و پوسیدگی شود. سایر خطرات برای مقابله با این چالش ها، ما از قدرت hPSC های خود تجدید شونده در به دست آوردن نوتروفیل های انسانی نامحدود 29 استفاده کردیم. ما یک سیستم انتقال دارو با واسطه نوتروفیل با الهام از زیستی قوی با مهندسی CAR29 توسعه دادیم و از نوتروفیل‌های CAR انسانی مهندسی شده به عنوان یک نانوحامل با فعالیت‌های ضد تومور چشمگیر استفاده کردیم. NP های خشن SiO2 بهتر از نانوذرات SiO2 صاف در حامل های CAR-نوتروفیل کار می کنند، مطابق با مشاهدات قبلی که نوتروفیل ها ترجیحاً پاتوژن های میکروبی خشن را فاگوسیتوز می کنند30. گزارش شده است که نوتروفیل ها باعث افزایش تکثیر و پیشرفت سلول های گلیوم می شوند. ما در مطالعه حیوانی خود، یک اثر مشابه بر تومور نوتروفیل‌های اصلاح‌نشده را مشاهده کردیم، که بر ضرورت مهندسی CCAR یا سایر تغییرات در نوتروفیل‌ها برای اطمینان از ایمنی آنها در دارورسانی و سایر کاربردهای درمانی تاکید می‌کند. قابل ذکر است که تحویل دارو با واسطه نوتروفیل CAR ما صرفاً به توانایی جذب شیمیایی بومی GBM بستگی دارد، اما نه سیگنال‌های التهابی پس از جراحی تقویت‌شده، که نشان‌دهنده ویژگی بالای و پتانسیل درمانی سیستم دارورسانی ما در ریشه‌کن کردن گلیوم‌های عمیق نفوذ شده است. که با جراحی قابل برداشتن نیست. از آنجایی که برداشتن جراحی و شیمی درمانی/رادیوتراپی کمکی مداخلات بالینی اولیه برای GBM12 هستند، درمان ترکیبی با نانوحامل نوتروفیل CAR و جراحی/رادیوتراپی ممکن است به اثربخشی درمانی بهینه دست یابد و ارزش بررسی بیشتر را دارد. سازه‌های CAR اختصاصی سلول‌های T و NK به طور گسترده برای تقویت فعالیت‌های ضد توموری سلول‌های T و NK مورد استفاده قرار گرفته‌اند، اما CAR‌های اختصاصی نوتروفیل که عملکردهای ضد توموری نوتروفیل‌ها را بهبود می‌بخشند، شرح داده نشده‌اند. گیرنده‌های ایمنی کایمریک CD4ζ و CD4 قبلاً برای افزایش سیتولیز نوتروفیل‌ها در برابر سلول‌های انتقال یافته با HIVenv در شرایط آزمایشگاهی گزارش شده بودند. با این حال، بازده لیز تنها 10٪ در نسبت اثرگذار به هدف (E: T) 10:128 بود. Fc RIIA (CD32a) یک گیرنده گذرنده تک زنجیره ای با میل ترکیبی کم برای IgG مونومر است که در نوتروفیل ها (30،{39}} تا 60،{41}} مولکول/سل31) به شدت بیان می شود، و بستن آن باعث القای Fc ​​- می شود. عملکردهای وابسته در نوتروفیل ها، مانند آزادسازی محتویات گرانول، تحرک کلسیم، سمیت سلولی ضد تومور، و فاگوسیتوز49. با توجه به نقش برجسته CD32a در فعال سازی و عملکرد نوتروفیل ها، ما ساختارهای CAR مبتنی بر CD32a را طراحی و آزمایش کردیم. با این حال، نتایج ما نشان داد که CD3ζ زمانی که در نوتروفیل‌های مشتق از hPSC بیان می‌شود، سیتولیز بهتری نسبت به CD32a انجام می‌دهد، که ممکن است تا حدی به دلیل کپی‌های بالاتر ITAMs در CD3ζ نسبت به CD32a باشد: به ترتیب سه و یک نسخه، و سطوح بیان بالاتر ζ نسبت به سطح سلولی نوتروفیل ها28. مانند CD32a، Fc RIII (CD16b) یکی دیگر از گیرنده های کم میل ترکیبی برای IgG مونومر است و در سطح بسیار بالاتری نسبت به CD32a بر روی نوتروفیل ها 31 بیان می شود. در حالی که پیوند متقابل CD16b فقط باعث تحرک و دگرانولاسیون کلسیم می شود، اما فاگوسیتوز و سیتولیز در نوتروفیل ها را تحریک نمی کند. -CAR ها در تحریک و تقویت عملکردهای ضد توموری نوتروفیل ها.

imageFig. 6 | In vivo distribution of CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ nanoparticles (NPs). a Schematic of intravenously administered Cy5-labeled CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs for in vivo cell tracking study. 5 × 105 luciferase (Luci)-expressing U87MG cells were stereotactically implanted into the right forebrain of NRG mice. After 4 days, mice were intravenously treated with PBS, 5 × 106 Cy5-labeled CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs. b Time-dependent biodistribution of Cy5+ neutrophils in the whole body, brain, and other organs was determined and quantified by fluorescence imaging at the indicated hours. c Biodistribution of CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs in mice at 24 h post-injection was analyzed by inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) based on Si element, and data was expressed as the percentage of injected dose per gram of tissue (%ID/g). n = 5 biologically independent samples. Data are represented as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file. d Representative fluorescence images of CD45 and SiO2 in the indicated glioblastoma xenografts isolated from tumor-bearing mice were shown. Scale bars, 100 μm. Biological triplicates were performed independently.

شکل 6|توزیع in vivo نانوذرات R-SiO{3}}TPZ (NPs) تحویل‌شده توسط نوتروفیل CAR. شماتیکی از NPs و NPs R-SiO2 با نشاندار Cy{4}}CAR به صورت داخل وریدی برای مطالعه ردیابی سلولی in vivo. 5 × 105 لوسیفراز (Luci) سلول های U87MG بیان کننده استریوتاکتیک در جلو مغز راست موش NRG کاشته شد. پس از 4 روز، موش‌ها با PBS، 5 × 106 Cy{16}}با NPs CAR نوتروفیل@R-SiO2 و NPs R-SiO2 به صورت داخل وریدی تحت درمان قرار گرفتند. b توزیع زیستی وابسته به زمان نوتروفیل‌های Cy{22}} در کل بدن، مغز و سایر اندام‌ها با تصویربرداری فلورسانس در ساعات مشخص شده تعیین و اندازه‌گیری شد. توزیع زیستی NP های نوتروفیل CAR@R-SiO2 و NPs R-SiO2 در موش ها در 24 ساعت پس از تزریق توسط طیف سنجی نشری پلاسما-اپتیکال جفت القایی (ICP-OES) بر اساس عنصر Si تجزیه و تحلیل شد و داده ها به عنوان درصد بیان شد. دوز تزریقی در هر گرم بافت (%ID/g). n=5 نمونه مستقل بیولوژیکی. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار نمایش داده می شوند. داده های منبع به عنوان یک فایل داده منبع ارائه می شوند. d تصاویر فلورسانس نماینده CD45 و SiO2 در پیوندهای زنوگرافت گلیوبلاستومای مشخص شده جدا شده از موش های حامل تومور نشان داده شد. میله های مقیاس، 100 میکرومتر. سه تکرار بیولوژیکی به طور مستقل انجام شد.

Fig. 7 | In vivo anti-tumor activities of combinatory CAR-neutrophils and R-SiO2-TPZ nanoparticles (NPs) were assessed via intravenous injection. a Schematic of intravenously administered PBS, PB-neutrophils, CAR-neutrophils, and CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs for in vivo tumor-killing study. 5 × 105 luciferase (Luci)-expressing U87MG cells were stereotactically implanted into the right forebrain of NRG mice. After 4 days, mice were intravenously treated with indicated neutrophils weekly for a month. Time-dependent tumor burden was determined (b) and quantified (c) by bioluminescent imaging (BLI) at the indicated days. Data are mean ± SD for mice in (b) (n = 5), one-way analysis of variance (ANOVA). d Kaplan-Meier curve demonstrating survival of indicated experimental groups (n = 5) was shown. Released human tumor necrosis factor-α (TNFα) and IL-6 in the peripheral blood (e) and body weight (f) of different mouse groups were measured at the indicated days. Data are mean ± SD, n = 5 biologically independent samples. g, h Anti-tumor activity of increased dosage frequencies of CAR-neutrophils and RSiO2-TPZ NPs was assessed. g Schematic of intravenously administered CAR-neutrophils, R-SiO2-TPZ NPs, and CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs for in vivo tumor killing study. h Kaplan-Meier curve demonstrating survival of indicated experimental groups was shown (n = 5). Kaplan–Meier curves were analyzed by the log-rank test. Source data are provided as a Source Data file.


شکل 7|فعالیت‌های ضد تومور ترکیبی CAR-نوتروفیل‌ها و نانوذرات R-SiO{4}}TPZ (NPs) از طریق تزریق داخل وریدی ارزیابی شد. شماتیکی از PBS، PB-نوتروفیل ها، CAR-نوتروفیل ها و CAR-نوتروفیل@ R-SiO{9}}TPZ NP های تزریق داخل وریدی برای مطالعه کشتن تومور در داخل بدن. 5 × 105 لوسیفراز (Luci) سلول های U87MG بیان کننده استریوتاکتیک در جلو مغز راست موش NRG کاشته شد. پس از 4 روز، موش ها به مدت یک ماه به صورت هفتگی با نوتروفیل های مشخص شده به صورت داخل وریدی تحت درمان قرار گرفتند. بار تومور وابسته به زمان (ب) تعیین شد و (ج) با تصویربرداری بیولومینسنت (BLI) در روزهای مشخص شده تعیین شد. داده‌ها میانگین ± SD برای موش‌ها در (b) (n=5)، تجزیه و تحلیل واریانس یک‌طرفه (ANOVA) است. منحنی d Kaplan-Meier نشان‌دهنده بقای گروه‌های آزمایشی مشخص شده (n=5) نشان داده شد. فاکتور نکروز تومور انسانی آزاد شده (TNF) و IL{22}} در خون محیطی (e) و وزن بدن (f) گروه‌های مختلف موش در روزهای مشخص شده اندازه‌گیری شد. داده ها میانگین ± انحراف معیار، n=5 نمونه مستقل از نظر بیولوژیکی هستند. g, h فعالیت ضد توموری افزایش فرکانس دوز CAR-نوتروفیل ها و RSiO{26}}TPZ NPs مورد ارزیابی قرار گرفت. g شماتیکی از نوتروفیل‌های CAR، R-SiO{29}}TPZ NPs، و CAR-نوتروفیل@ R-SiO{32}}TPZ NPهای تزریقی داخل وریدی برای مطالعه کشتن تومور in vivo. منحنی h Kaplan-Meier نشان‌دهنده بقای گروه‌های آزمایشی نشان‌داده‌شده بود (n=5). منحنی های کاپلان- مایر با استفاده از آزمون لگ رتبه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. داده های منبع به عنوان یک فایل داده منبع ارائه می شوند.

ما همچنین در اینجا یک پلت فرم مدولار و همه کاره برای تحویل داروی نوتروفیل hPSC را ارائه کردیم که ممکن است در آینده برای حمایت از سایر تلاش‌های مبتنی بر نوتروفیل برای درمان سایر بیماری‌های انسانی دوباره مهندسی و تنظیم شود. اول، مهندسی CAR در hPSCها بیشتر از سلول‌های T ایمنی اولیه و نوتروفیل‌ها قابل دسترسی است. برای دستیابی به بیان پایدار و همگن CARهای مختلف، تنها به یک بار ویرایش ژنوم نیاز دارد. علاوه بر ماشین‌های CLTX، ما همچنین خطوط پایدار hPSC ساختیم که یک ضد فلورسین جهانی (FITC)51 یا ضد PD-L1 CAR52 را بیان می‌کنند، که هر دو می‌توانند برای به دست آوردن نانوحامل جامد جهانی CAR-نوتروفیل‌های هدف‌گیری تومور، مهار شوند. سایر تغییرات ژنتیکی، مانند فیبروز که ضد FAP CARs53 را هدف قرار می دهد، نیز می تواند برای هدایت نانوحامل های نوتروفیل برای درمان بیماری های دژنراتیو کشنده، از جمله ضربه مغزی و فیبروز قلبی انجام شود. علاوه بر این، hPSCهای بیان کننده CAR نیز می توانند به راحتی برای تولید سلول های CAR-T یا CAR-NK29 سازگار شوند، و ترکیب این روش های ایمنی با نانوحامل های CAR-نوتروفیل ممکن است به مزایای درمانی بهینه ضد تومور دست یابد. در نهایت، سیستم نانوداروی پاسخگو به تومور گلوتاتیون (GSH) ما یک پلت فرم مدولار و همه کاره برای بارگیری داروهای شیمی درمانی یا رادیواکتیو امیدوارکننده در نوتروفیل های CAR برای دارورسانی هدفمند است، همانطور که بالینی TMZ، JNJ64619187، و ProZ به عنوان مثال نشان داده شده است. مطالعات آتی بر روی آزمایش سایر نانوذرات ممکن است بارگذاری دارویی بهینه در نوتروفیل ها را به همراه داشته باشد و حداکثر اثربخشی درمانی در داخل بدن را به دست آورد.

در حالی که ما مفهوم درمانی استفاده از نوتروفیل های CAR را برای رساندن داروهای شیمیایی به طور خاص و کارآمد به تومورهای مغزی در سراسر BBB نشان داده ایم، در این مطالعه محدودیت هایی وجود دارد. اول، 4-تلقیح روزانه سلول تومور ممکن است برای ایجاد تومورهایی که سناریوی بالینی را برای تحقیقات درمانی تقلید می‌کنند کافی نباشد، و کار آینده با دوره‌های مختلف تلقیح تومور برای خلاصه کردن مراحل مختلف رشد گلیوبلاستوما و پاسخ درمانی در موارد مختلف ضروری است. بیماران 54،55. دوم، موش‌های دارای نقص ایمنی که در اینجا استفاده کردیم، فاقد ایمنی تطبیقی ​​هستند و سایر مدل‌های بالینی با سیستم ایمنی دست نخورده، مانند سگ‌های خانگی با گلیومای خودبخودی56، برای ارزیابی بهتر ایمنی و کارایی نوتروفیل‌های CAR تولید شده در شرایط آزمایشگاهی مورد نیاز هستند. به ویژه، بررسی سمیت خارج از هدف نوتروفیل‌های CAR با یا بدون بارگذاری نانوداروها در حیوانات تزریق شده، از جمله سندرم آزادسازی سیتوکین، سمیت عصبی، و سمیت‌های خارج از هدف خارج از تومور مشاهده شده در سلول‌های CAR-T57، با وجود طول عمر کوتاه مورد نیاز است. از نوتروفیل ها در حالی که رویکردهای عملی، مانند مهندسی hPSCs58-61 اهداکننده جهانی هیپوایمونوژن و کتابخانه های بانکی آنتی ژن لکوسیت انسانی (HLA)-هموزیگوت hPSC62، برای جلوگیری از خطر بالقوه بیماری پیوند در مقابل میزبان (GvHD) به آسانی در دسترس هستند، مدل های حیوانی پیش بالینی با سیستم ایمنی دست نخورده هنوز برای ارزیابی پتانسیل انتقالی داروهای نوتروفیل ما مورد نیاز است. در نهایت، سمیت سلولی ضد تومور محدود و افزایش طول عمر حیوانات نانوداروهای CAR-نوتروفیل درمانی مشاهده شد. بنابراین، کاوش در آینده در مورد داروهای شیمی‌درمانی مؤثرتر یا حساس‌کننده‌های پرتو، و درمان‌های ترکیبی با CAR-T کلاسیک و برداشتن جراحی برای دستیابی به حداکثر اثربخشی ضد توموری درمان‌های CAR-نوتروفیل ضروری است. به عنوان مثال، یک مطالعه اخیر بر روی طراحی مبتنی بر مکانیسم منجر به یک داروی موثرتر KL{25}} شده است که بر مقاومت اکتسابی همانطور که در داروی TMZ بالینی مشاهده شد غلبه می کند و بنابراین می تواند در پلت فرم نانودارویی مدولار CAR-نوتروفیل ما برای یک داروی بالقوه گنجانده شود. اثربخشی درمانی بهتر افزایش ماندگاری نوتروفیل ها به 5 روز از طریق درمان CLON-G (نفوذ پذیری غشای کاسپاز-لیزوزومی- مهار اکسیدان-نکروپتوز به اضافه فاکتور 64 تحریک کننده کلونی گرانولوسیت) و/یا استفاده از یک سیستم آزادسازی داروی کنترل شده طولانی مدت در نوتروفیل های CAR نیز ممکن است پس از آپوپتوز نوتروفیل، به اثربخشی ضد توموری پایدار در داخل بدن دست یافت. در مجموع، یافته‌های ما به وضوح نشان داد که نوتروفیل‌های CAR بارگذاری‌شده با R-SiO2-TPZ می‌توانند فنوتیپ ضد تومور N1 را حفظ کرده و سلول‌های تومور را تحت شرایط مختلف تومور مانند در شرایط آزمایشگاهی از بین ببرند. نوتروفیل‌های CAR عملکردی همچنین می‌توانند در مقادیر زیادی از hPSCهای مهندسی شده تولید شوند تا دقیقاً نانوداروهای پاسخ‌دهنده به ریزمحیط تومور را برای هدف قرار دادن GBM در داخل بدن ارائه دهند، که منجر به شیمی‌ایمونوتراپی ترکیبی با فعالیت‌های قوی و خاص ضد GBM و حداقل تحویل داروی خارج از هدف می‌شود. طول عمر طولانی در موش های حامل تومور

منابع

1. یانگ اف و همکاران. ایمونوتراپی سینرژیک گلیوبلاستوما با هدف قرار دادن دوگانه IL-6 و CD40. نات اشتراک. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. وضعیت فعلی ایمونوتراپی برای گلیوبلاستوما. نات کشیش کلین. اونکول. 15, 422-442 (2018).

3. Agliardi، G. et al. تحویل داخل توموری IL{1}} ایمونوتراپی سلول های CAR-T را در یک مدل پیش بالینی گلیوبلاستوما تقویت می کند. نات اشتراک. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrophils به عنوان اهداف درمانی در حال ظهور. نات Rev. Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s{3}}z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrophils به عنوان یک هدف درمانی و ابزار نوظهور برای درمان سرطان. زندگی علمی. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. متاآنالیز تحویل نانوذرات به تومورها با استفاده از مدلسازی و شبیه سازی فارماکوکینتیک مبتنی بر فیزیولوژیک. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. تجزیه و تحلیل انتقال نانوذرات به تومورها. نات کشیش ماتر. 1، 1-12 (2016).

8. Xue, J. et al. تحویل داروی ضد سرطان با واسطه نوتروفیل برای سرکوب عود گلیوما بدخیم پس از عمل. نات فناوری نانو 12, 692-700 (2017).

9. وو، ام و همکاران. ردیابی تصویربرداری MR نوتروفیل های مهندسی شده قابل فعال سازی با التهاب برای درمان هدفمند گلیوما تحت درمان با جراحی. نات اشتراک. 9، 1-13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. پرایمینگ حساس به نور در ریزمحیط های تومور باعث بهبود انتقال نانودرمان ها از طریق نفوذ نوتروفیل می شود. Adv. ماتر 29، (2017).

11. اوسوکا، اس و ون میر، درمان سرطان EG: تردد نوتروفیل ها در نانوداروهای سرطان. نات فناوری نانو 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL نقش نوتروفیل ها در گلیوما و متاستازهای مغزی. جلو. ایمونول. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. فریدلندر، ز و همکاران. پلاریزاسیون فنوتیپ نوتروفیل مرتبط با تومور توسط TGF-بتا: "N1" در مقابل "N2" TAN. سلول سرطانی (2009).

14. Blaisdell, A. et al. نوتروفیل ها از طریق دبریدمان سلول های تومور هیپوکسیک با سرطان زایی اپیتلیال رحم مخالفت می کنند. سلول سرطانی 28، 785-799 (2015).

15. Mahidine, K. et al. تسکین هیپوکسی تومور، پتانسیل تومورکشی نوتروفیل ها را آزاد می کند. جی. کلین. Invest 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. نوتروفیل های پلی مورفونکلئر انسانی به طور خاص سلول های سرطانی را شناسایی کرده و می کشند. Oncoimmunology 3, e950163 (2014).

17. Jaillon، S. و همکاران. تنوع نوتروفیل و انعطاف پذیری در پیشرفت و درمان تومور نات Rev. Cancer 20, 485-503 (2020).

18. Li X. و همکاران. پیشرفت تحقیقات در مورد سلول های بنیادی گلیوما در ریزمحیط ایمنی گلیوما. جلو. داروسازی https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A.، Pszczolkowska، D.، Walentynowicz، KA، Rajan، WD & Kaminska، B. ریزمحیط ایمنی گلیوما. آزمایشگاه. تحقیق کنید. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. یونگ ای و همکاران. شکل پذیری، ناهمگنی و مقاومت سلول های تومور در سوله های ریزمحیطی حیاتی در گلیوما. نات اشتراک. https://doi.org/10.1038/s{3}} (2021).

21. دان جی پی و همکاران. ایمونوتراپی های نوظهور برای گلیوما بدخیم: از ایمونوژنومیک تا سلول درمانی. عصبی. اونکول. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. فروپتوز ناشی از نوتروفیل نکروز تومور را در پیشرفت گلیوبلاستوما ترویج می کند. نات اشتراک. 11، (2020).

23. ساگیو، جی وای و همکاران. تنوع فنوتیپی و شکل پذیری در زیر جمعیت های نوتروفیل در حال گردش در سرطان Cell Rep. 10, 562-573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS سلول های کشنده طبیعی مشتق شده از iPSC انسانی که با گیرنده های آنتی ژن کایمریک مهندسی شده اند فعالیت ضد توموری را افزایش می دهند. Cell Stem Cell 23, 181-192.e5 (2018).

25. کیم، جی بی و همکاران. سلول های CAR T هدفمند جهش یافته اینترلوکین{2}} با میل ترکیبی بالا، انتقال نانوذرات فلورسنت زیست تخریب پذیر قابل کلیک به گلیوبلاستوما را افزایش می دهند. Bioact. ماتر 5، 624-635 (2020).

26. نگوین، وی و همکاران. یک سیستم تحویل لیگاند جدید برای تجسم غیر تهاجمی و بهره برداری درمانی از نشانگر زیستی محدود شده با تومور IL13R 2. عصبی. اونکول. 14، 1239-1253 (2012).

27. وانگ دی و همکاران. سلول های CAR T هدایت شده توسط کلروتوکسین برای هدف قرار دادن خاص و موثر گلیوبلاستوما. علمی ترجمه پزشکی 12، (2020).

28. رابرتز، ام آر و همکاران. سیتولیز اختصاصی آنتی ژن توسط نوتروفیل ها و سلول های NK بیان کننده گیرنده های ایمنی کایمریک دارای حوزه های سیگنالینگ زتا یا گاما. J. Immunol. 161، 375-384 (1998).

29. چانگ، ی و همکاران. مهندسی نوتروفیل های گیرنده آنتی ژن کایمریک از سلول های بنیادی پرتوان انسانی برای ایمونوتراپی هدفمند سرطان. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. نوتروفیل ها ترجیحاً ذرات طویل را فاگوسیتوز می کنند تا در بیماری های التهابی حاد هدف گیری انتخابی داشته باشند. علمی Adv. 6، (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. بیان، نقش، و تنظیم گیرنده های نوتروفیل Fc. جلو. ایمونول. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. اهمیت تیروزین های ITAM با زنجیره گیرنده fc در فعال سازی نوتروفیل و آرتریت خودایمنی درون تنی. جلو. ایمونول. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. نقش نوتروفیل Fc RIIa (CD32) و Fc RIIIb (CD16) اشکال پلی‌مورف در فاگوسیتوز IgG{3}} و IgG{4}}opsonized باکتری‌ها و گلبول‌های قرمز. انتقال خون پزشکی Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN گیرنده‌های نوتروفیل Fc انسانی نقش‌های غیر اضافی تخصصی را در بیماری‌های التهابی با واسطه آنتی‌بادی ایفا می‌کنند. مصونیت. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. چانگ، ی و همکاران. نسل اندوتلیوم هموژنیک انسانی و سلول‌های پیش ساز خونساز قطعی از نظر شیمیایی. Biomaterials 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya، VS et al. تولید موثر و سریع نوتروفیل های عملکردی از سلول های بنیادی پرتوان القایی با استفاده از mRNA اصلاح شده ETV2-. Stem Cell Rep. 13, 1099-1110 (2019).

37. امامی نژاد ع و همکاران. نقش هیپوکسی در ریزمحیط تومور و توسعه سلول های بنیادی سرطانی: رویکردی جدید برای توسعه درمان Cancer Cell Int. https://doi.org/ 10.1186/s{3}} (2021).

38. Lequeux A. et al. تأثیر ریزمحیط تومور هیپوکسیک و شکل پذیری سلول تومور بر بیان نقاط بازرسی ایمنی سرطان لت. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. نقش پروتئین تیروزین کیناز Syk در سیگنال دهی استرس اکسیداتیو در سلول های B. سیگنال ردوکس آنتی اکسیدان ها https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. و همکاران. سیگنالینگ سلولی با واسطه ROS و ROS. اکسیدات. پزشکی سلول. طول عمر. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. و همکاران. یک مسیر فعال سازی Ras وابسته به فسفوریلاسیون Syk پروتئین کیناز C. Proc. Natl. آکادمی علمی ایالات متحده آمریکا. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai، A.، Ruland، J. & Tybulewicz، VLJ تیروزین کیناز SYK: یک بازیکن مهم در عملکردهای بیولوژیکی متنوع. نات کشیش ایمونول. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. لیو بی و همکاران. یک نانوکامپوزیت پاسخگو به ریزمحیط تومور برای گاز سولفید هیدروژن و درمان پویا آنزیم تقویت‌شده با سه‌وجهی. Adv. ماتر https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: مکانیسم‌های فعال‌سازی NADPH اکسیداز و مقاومت باکتریایی. جلو. سلول. آلوده کردن میکروبیول. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. نوتروفیل ها تحویل لیپوزوم موضعی و غیر تهاجمی را به عضلات اسکلتی ملتهب و قلب ایسکمیک امکان پذیر می کنند. Adv. ماتر 32، (2020).

46. ​​Le, RQ و همکاران. خلاصه تایید FDA: توسیلیزوماب برای درمان سندرم آزادسازی سیتوکین شدید یا تهدید کننده حیات ناشی از گیرنده آنتی ژن کایمریک سلول T. انکولوژیست 23، 943-947 (2018).

47. موریس، EC، Neelapu، SS، Giavridis، T. & Sadelain، M. نشانگان انتشار سیتوکین و سمیت عصبی مرتبط در ایمونوتراپی سرطان. نات کشیش ایمونول. 22، 85-96 (2022).

48. لیانگ، جی و همکاران. نوتروفیل ها فنوتیپ گلیوما بدخیم را از طریق S100A4 ترویج می کنند. کلین سرطان Res. 20, 187-198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. تنظیم سلولی خاص و وابسته به فعال سازی عملکرد اتصال لیگاند نوتروفیل CD32A. Blood https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k{11}} (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Cytotoxicity با واسطه گیرنده های Fc ​​انسانی برای IgG. ایمونول. امروز. https://doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. لی، وای جی و همکاران. تنظیم سمیت شبیه به سندرم آزادسازی سیتوکین با واسطه سلول های CAR T با استفاده از آداپتورهای با وزن مولکولی کم. نات اشتراک. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. یک گیرنده آنتی ژن کایمریک جدید حاوی یک دامنه سیگنال دهی JAK-STAT واسطه اثرات ضد توموری برتر است. نات پزشکی 24، 352-359 (2018).

53. آقاجانیان ح و همکاران. هدف قرار دادن فیبروز قلبی با سلول های T مهندسی شده طبیعت. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. و همکاران. سلول‌های NK اختصاصی ErbB2/HER برای درمان هدفمند گلیوبلاستوما. J. Natl. Cancer Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. اخوان د و همکاران. سلول های CAR T برای تومورهای مغزی: درس های آموخته شده و راه پیش رو ایمونول. کشیش https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. عمر، NB و همکاران. داده های ایمنی و بقای موقت پس از تجویز داخل جمجمه ای M032، یک HSV انکولیتیک مهندسی شده ژنتیکی -1 بیان کننده IL-12، در سگ های خانگی با گلیوم پراکنده. جراحی مغز و اعصاب. تمرکز 50، 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV پیشرفت ها و اکتشافات اخیر در مکانیسم ها و عملکرد سلول های CAR T. نات Rev. Cancer 21, 145-161 (2021).

58. وانگ، بی و همکاران. تولید سلول‌های T هیپوایمونوژن از سلول‌های بنیادی پرتوان القایی انسان آلوژنیک مهندسی ژنتیکی شده. نات Biomed. مهندس 5، 429-440 (2021).

59. Deuse, T. et al. مشتقات هیپوایمونوژنیک سلول‌های بنیادی پرتوان القایی از رد ایمنی در گیرنده‌های آلوژنیک کاملاً دارای قابلیت ایمنی اجتناب می‌کنند. نات بیوتکنول. 37، 252-258 (2019).

60. Han X. و همکاران. تولید سلول های بنیادی پرتوان انسانی هیپوایمونوژن. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW و همکاران. ویرایش ژنوم HLA DR با استفاده از TALEN در iPSCهای انسانی سلول‌های دندریتیک مقاوم به ایمنی را تولید کرد. سلول های بنیادی بین المللی https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. تطبیق MHC پیوند نورون های مشتق شده از iPSC را در پستانداران غیر انسانی بهبود می بخشد. نات اشتراک. https://doi. org/10.1038/s{5}} (2017).

63. Lin, K. et al. طراحی مبتنی بر مکانیسم از عواملی که به طور انتخابی گلیومای مقاوم به دارو را هدف قرار می دهند. علمی (80-.) 377, 502-511 (2022).

64. فن Y. و همکاران. هدف قرار دادن چندین مسیر مرگ سلولی، عمر مفید را افزایش می دهد و عملکرد نوتروفیل های انسان و موش را برای انتقال خون حفظ می کند. علمی ترجمه پزشکی 13، (2021).

65. Chang Y. و همکاران. شاخص های فلورسنت برای گزارش دهی مستمر و اختصاصی از مراحل چرخه سلولی در سلول های بنیادی پرتوان انسانی. بیوتکنول. Bioeng. بیت.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. یونگ، جی و همکاران. تولید سلول های بنیادی خونساز و پیش ساز قطعی انسان از نظر شیمیایی STAR Protoc. 4, 101953 (2023).

شما نیز ممکن است دوست داشته باشید