فصل 5 تغییر فعالیت آنزیم در طول تخمیر آنزیم
Oct 29, 2024
فصل 5 تغییر فعالیت آنزیم در طول تخمیر آنزیم
پروتئاز ، لیپاز وسوپراکسید دیسموتاز (SOD)آنزیم های اصلی عملکردی هستندغذاهای بهداشتی آنزیم میکروبیبشر در میان آنها ،پیش بینینقش درترویج هیدرولیز پروتئین در مواد غذاییدر بدن انسان علاوه بر این ، همچنین می تواند برخی از سلولهای در حال مرگ را تجزیه کند ، خاک را روی سطح پوست و منافذ از بین ببرد و در لایه برداری نقش داشته باشد ، بنابراین در محصولات حمام بسیار مورد استفاده قرار می گیرد. لیپاز بر پیوند استر بین اسیدهای چرب و گلیسرول عمل می کند و بستر هیدرولیز به طور کلی روغنهای طبیعی است. بنابراین ، در بسیاری از غذاهای کاهش وزن و محصولات بهداشتی مشاهده می شود. بسیاری از خانم ها بسیار نگران موضوع کاهش وزن هستند ، به همین دلیل آنزیم ها به سرعت در سراسر جهان محبوبیت پیدا کرده اند.آنزیم ها سرشار از لیپاز هستند، این بدان معنی است که آنها دارای ارزش تحقیق بالایی و چشم انداز کاربردی هستند.چیدنیک آنزیم فلزی خاص است که واکنش ناآرامی را کاتالیز می کندرادیکال های آنیون سوپر اکسید، بدین ترتیباز بین بردن رادیکال های آنیون سوپراکسیددر بدن این یک مانع محافظ برای ارگانیسم ها است ، بنابراین در زمینه پزشکی بسیار مورد استفاده قرار می گیرد.
این فصل آنزیم اپل را به عنوان نمونه می گیرد. شروع از مرحله اولیه تخمیر ،فعالیت های سوپر اکسید دیسموتاز، آمیلاز ، لیپاز ، پروتئاز و سلولز در گروه آزمایش و گروه کنترل هر 15 روز یک اندازه گیری شد تا به طور جامع و منظم روند تغییر فعالیت آنزیم را در کل فرآیند تخمیر منعکس کند.
برای به دست آوردن جزئیات بیشتر کلیک کنید
خدمات حمایتی Wecistanche- بزرگترین صادر کننده Cistanche در چین:
ایمیل: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/TEL: +86 15292862950
5.1 مواد و روش ها
5.1.1 مواد
(1) مواد آزمایشی
سیب های تازه را با آب استریل در شرایط استریل بشویید ، آنها را به طور طبیعی روی یک میز عمل استریل خشک کنید ، آنها را پوست بگیرید و آنها را برای استفاده بعدی برش دهید. شکر و سیب سفید را به یک شیشه شیشه ای استریل با نسبت جرم 1: 1 اضافه کنید. باکتری های مورد نیاز برای آزمایش را فعال کرده و مطابق با طرح بهینه آنها را در آنزیم تلقیح کنید (این مرحله عمل برای گروه کنترل حذف شده است) ، آن را مهر و موم کرده و آن را در یک مکان خنک و خشک قرار دهید. پس از 3 ماه تخمیر دمای اتاق ، یک نمونه را تهیه کنید تا کل مایع آنزیم حاوی پالپ را بدست آورید و آن را فیلتر کنید. سوپرناتانت را به عنوان نمونه آزمایشی بگیرید. بعد از اینکه نمونه در 10 سانتریفیوژ شد ، {4}} RPM به مدت 15 دقیقه در یک سانتریفیوژ با سرعت بالا ، از آن برای اندازه گیری داده های مربوطه استفاده می شود. شایان ذکر است که در روند ساخت آنزیم ها ، برای جلوگیری از آلودگی غیر ضروری ، تمام عملیات ما تحت شرایط استریل انجام شد.
(2) ابزارهای اصلی
ابزارهای مورد نیاز برای آزمایش برابر با 3.1.1 (2) است.
5.1.2 روش
(1) تعیین فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD) [66]
محلول پیروگالول در یک حمام آب دمای 25 درجه ثابت برای یک دوره زمانی از قبل گرم شد. طبق جدول 5.1 ، مقدار مناسبی از بافر ، آب مقطر و همان حجم اسید هیدروکلریک یا محلول پیروگالول به لوله آزمایش اضافه شد. حمام آب دمای ثابت برای 2 دقیقه 2 {5}}} تعیین شد. بعد از اینکه مایع مخلوط به سرعت لرزید ، بلافاصله به داخل کوت تزریق شد. مقدار جذب A0 نمونه هر 30 ثانیه در طول موج 325 نانومتر با استفاده از یک اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد.
tab.5.1 مقدار بنزن مجاور سه معرف فنل را برای تعیین میزان اتوکسیداسیون اضافه کنید
روش تعیین فعالیت SOD اساساً همان عملکرد فوق است. تنها تفاوت این است که قبل از افزودن پیروگالول ، {0}}. 5 میلی لیتر محلول نمونه آنزیم از غلظت های مختلف ابتدا اضافه می شود. در همان زمان ، همان حجم آب مقطر اضافه می شود. جذب اندازه گیری شده ASOD است. The inhibition rate and SOD enzyme activity are calculated according to formula 5.1 and formula 5.2: Inhibition rate (%)=(△A0-△ASOD)/△A0×100 (5.1) Enzyme activity (U/mL)=inhibition rate/50% × V1/V2×n (5.2) که در آن: V1 حجم کل محلول ، میلی لیتر است. V2 حجم محلول نمونه آنزیم ، ML است. △ A0 میزان اکسیداسیون خودکار پیروگالول است. △ ASOD میزان تغییر مقدار جذب نمونه است. n رقت چندگانه (2) تعیین فعالیت آمیلاز در این مطالعه از روش رنگ سنجی ید- ستاره برای تعیین فعالیت آمیلاز استفاده شده است. مراحل عملیاتی خاص به "روش عملکرد آزمایشگاه بالینی ملی" اشاره دارد [67]. این عمدتا به دو نکته زیر تقسیم می شود:
① آماده سازی محلول
راه حل نشاسته بافر ({0}}} 4g/l): با دقت 9 گرم کلرید سدیم ، 22.6 گرم فسفات هیدروژن بی آب و بی آب ، و تا زمانی جوش با دقت 0.4 گرم نشاسته محلول را وزن کنید ، آن را در 10 میلی لیتر آب مقطر حل کنید ، به طور مساوی مخلوط کنید و با خمیر تنظیم کنید. محلول نشاسته را که به یک خمیر در محلول جوش فوق تنظیم شده است تزریق کنید و لیوان را بارها و بارها بشویید تا نشاسته به طور کامل به محلول آب جوش منتقل شود. بعد از هم زدن به طور مساوی با یک میله شیشه ای ، به دمای اتاق خنک شوید ، 5 میلی لیتر از محلول فرمالدئید 37 ٪ مو را اضافه کنید و با آب مقطر به 1 لیتر رقیق شوید. مقدار pH محلول 0.1 70 7.0 است و برای استفاده در یخچال قرار می گیرد.
راه حل سهام ید (0 1 مول در لیتر): به طور دقیق وزن 1.7835 گرم یدات پتاسیم و یدید پتاسیم 22.5 گرم در 500ml تمیز
لیوان ، به آرامی و به طور مساوی 4/5 میلی لیتر اسید هیدروکلریک غلیظ را اضافه می کند ، به طور مداوم در طی فرآیند اضافه می شود ، با آب مقطر به مقیاس رقیق می شود و به طور مساوی هم بزنید. آن را برای استفاده در یخچال قرار دهید و آن را در یک بطری معرف قهوه ای ذخیره کنید.
راه حل برنامه ید ({{0}}. 01mol/l): مقدار مشخصی از محلول سهام ید (0.1 مول در لیتر) مصرف کنید ، آن را 10 بار با آب مقطر رقیق کنید ، آن را برای استفاده در یخچال قرار دهید و تا 1 ماه آن را ذخیره کنید.
مراحل عملیاتی آزمایشی
محلول آنزیم را بگیرید و 10 بار آن را با نمک فیزیولوژیکی رقیق کنید و مطابق جدول 5.2 کار کنید. خوب مخلوط کنید ، طول موج اسپکتروفتومتر 660 نانومتر است و مسیر نور فنجان رنگ سنجی 10 میلی متر است. صفر با آب مقطر و جذب هر لوله را بخوانید. فعالیت آمیلاز را بر اساس فرمول محاسبه اساسی 5.3 محاسبه کنید.
TAB.5.2 مراحل عملکرد تعیین آمیلاز
(3) تعیین فعالیت لیپاز
روش تعیین مطابق با QB/T {{0}} [68] انجام شد. یک محلول تست آنزیم 2 ٪ با {17}}. {27 {27} 25 بافر فسفات فسفات (pH 7.5) ، به عنوان شاخص استفاده شد و اسیدهای چرب با یک محلول هیدروکسید سدیم استاندارد تیتراسیون شدند. فعالیت لیپاز بر اساس حجم هیدروکسید سدیم مصرفی در آزمایش محاسبه شد. این قانون: در pH 7.5 و دمای محیط 40 درجه ، 1 میلی لیتر محلول آنزیم مایع ، لیپاز را به مدت 1 دقیقه هیدرولیز می کند تا 1 میکرومول اسید چرب تولید شود ، که یک واحد فعالیت لیپاز است ، به عنوان U/ML بیان شده است. سپس ، فعالیت لیپاز مطابق فرمول 5.4 محاسبه شد: فعالیت آنزیم (U/ml) {15 {}} (Ba) × C/0.05 × 50 × 1/15=200}/3 × (BA) × C × N (5.4) که در آن: B آیا حجم Sodium Hydoxide Solution Manidium Hydoxide Solution Underated Hydoxide Solution Underated Hydoxide Solution Underation Soluted of Sodium Hydoxide استاندارد A حجم محلول استاندارد هیدروکسید سدیم است که در گروه کنترل خالی ، ML مصرف می شود. C غلظت محلول استاندارد هیدروکسید سدیم ، mol/L است. 0.05 ضریب تبدیل غلظت محلول استاندارد هیدروکسید سدیم است. 50 مقدار اسید چرب محلول هیدروکسید سدیم است. 15 دقیقه زمان واکنش است. n چند رقیق است.
(4) تعیین فعالیت پروتئاز
به GB/T 23527-2009 [69] با اصلاحات جزئی مراجعه کنید.
① آماده سازی منحنی استاندارد
1 میلی لیتر محلول استاندارد تیروزین را با غلظت جرم مختلف ، که {1}}} ، 1 {8}} ، 20 ، 30 ، 40 و 50mg/l است ، بگیرید و 5 میلی لیتر از 0.4mol/L محلول کربنات سدیم و 1 میلی لیتر محلول معرف فولین را به آن اضافه کنید. به مدت 20 دقیقه در دمای 40 درجه واکنش نشان دهید. پس از اتمام واکنش ، محلول واکنش را برداشته و مقدار جذب محلول را در طول موج 680 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه گیری کنید. یک منحنی استاندارد تیروزین را با غلظت تیروزین به عنوان محور افقی و مقدار جذب به عنوان محور عمودی بکشید.
گیاهان جدید Cistanche با قدرت آنتی اکسیدانی قوی
② تعیین فعالیت پروتئاز
گروه آزمایشی: 1 میلی لیتر محلول کازئین با غلظت 10 گرم در لیتر مصرف کنید و آن را به طور مساوی با 1 میلی لیتر محلول نمونه برای آزمایش مخلوط کنید و به مدت 10 دقیقه در دمای محیط 40 درجه واکنش نشان دهید. فیلتر و به دست آوردن تصفیه پس از ایستادن ، 1 میلی لیتر از تصفیه ، 5 میلی لیتر محلول کربنات سدیم و 1 میلی لیتر معرف فولین ، به طور مساوی مخلوط کنید و به مدت 20 دقیقه در دمای محیط 40 درجه واکنش نشان دهید. برای اندازه گیری مقدار جذب محلول در طول موج 680 نانومتر از یک اسپکتروفتومتر استفاده کنید.
گروه کنترل خالی: 1 میلی لیتر از محلول نمونه را برای آزمایش انجام دهید ، اسید تری کلرواستیک را اضافه کنید ، به طور کامل برای غیرفعال کردن پروتئاز واکنش نشان دهید و سایر روشهای عملکرد همانند گروه آزمایش است.
فعالیت پروتئاز را مطابق فرمول 5.5 محاسبه کنید:
فعالیت پروتئاز (u/ml)=Ak × 4/10 (5.5) که در آن: A جذب محلول آنزیم در گروه آزمایش است. k مقدار تیروزین است که میزان جذب آن برابر با 1 باشد. 4 حجم کل محلول واکنش ، میلی لیتر است. 10 زمان واکنش است ، حداقل.
(5) تعیین فعالیت سلولز [70]
فعالیت سلولز در آنزیم ها به طور کلی با مقدار گلوکز آزاد شده توسط مقدار مشخصی از محلول آنزیم در هر واحد بیان می شود. اصل استفاده از روش کاغذ فیلتر برای اندازه گیری فعالیت سلولز این است که سلولز می تواند سلولز را در کاغذ فیلتر تجزیه کند تا متابولیتهای ثانویه مانند گلوکز تولید کند و گلوکز می تواند با 3 ، {1}}} dinitrosalicylic اسید واکنش نشان دهد تا یک مجموعه زرد تشکیل شود. رنگ این واکنش نسبتاً روشن است ، که به خوبی می تواند میزان گلوکز و سایر قندهای کاهش یافته تولید شده را تعیین کند.
①3 ، {1}} عامل رنگ سنجی اسید Dinitrosalicylic
با دقت وزن 1 0 g از 3 ، 5-} اسید dinitrosalicylic با یک نقطه ذوب {3}} درجه ، آن را با آب مقطر حل کنید ، 20 گرم هیدروکسید سدیم و 200 گرم تارترات پتاسیم را اضافه کنید ، 4 گرمی را اضافه کنید تا آب جامد کاملاً حل شود ، تا 500mlifiled تا 500mlifiled ، رقیق شده است ، تا 500mliled ، رقیق شود ، تا 500 متر از آن جدا شود ، تا 500mliled ، رقیق شود ، تا 500 متر از آن جدا شود ، تا 500mliled ، تا 500mliled diled. 0.5 گرم سولفیت سدیم بی آب ، به طور مداوم در طی فرآیند اضافی هم بزنید تا کاملاً حل شود ، گرمایش را بعد از مخلوط کردن به طور مساوی متوقف کنید ، به دمای اتاق خنک شوید ، همه را به یک فلاسک حجمی 1000 میلی لیتری منتقل کنید ، با آب مقطر رقیق شوید ، در دمای اتاق به مدت یک هفته ، فیلتر کنید ، مایع فوق العاده را بدست آورید و در بطری آژانس Brown Browne قرار دهید.هیدرولیز آنزیمی
به طور دقیق پیپت {{0} ، 0. 5 ، 1.. بعد از 5 دقیقه حمام آب دمای ثابت در 40 درجه ، 6 قطعه کاغذ فیلتر کروماتوگرافی را به ترتیب با مساحت 1 × 1cm2 اضافه کرده و بلافاصله زمان بندی را شروع کنید تا زمان واکنش به 60 دقیقه دقیق شود. بلافاصله به مدت 10 دقیقه به حمام آب جوش منتقل می شود و سلولز فعالیت خود را از دست می دهد.
③ واکنش رنگ
Take the enzyme sample solution, add 3mL of 3, 5-dinitrosalicylic acid colorimetric agent prepared in ①, heat in boiling water bath for 15 minutes, take out, cool to room temperature, add 10mL of distilled water, mix evenly, use spectrophotometer at a wavelength of 550nm, adjust the blank control group to zero, and measure its absorbance value.
④ ترسیم منحنی استاندارد گلوکز
یک محلول استاندارد گلوکز را با غلظت 1mg/ml به طور دقیق تهیه کنید ، و از آب مقطر استفاده کنید تا محلول استاندارد گلوکز را با حجم 0 ، 0. {{4}. 4 ، 0. 6 ، {{{8 {8 {8}}. 8}}. از 3 ، {18}}} dinitrosalicylic اسید ماده رنگری تهیه شده در ① برای انجام واکنش توسعه رنگ. منحنی استاندارد را با غلظت گلوکز به عنوان محور افقی و جذب به عنوان محور عمودی ترسیم کنید.
محاسبه
از مقدار جذب A پس از توسعه رنگ با محلول آنزیم استفاده کنید و سپس مقدار رهاسازی گلوکز M را با توجه به منحنی استاندارد گلوکز محاسبه کنید و مطابق فرمول 5.6 محاسبه کنید:
فعالیت سلولز (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) که در آن: m مقدار انتشار گلوکز ، ug است. T هیدرولیز آنزیمی ، حداقل است. m محتوای آنزیم در واکنش ، ug/ml است.
