خلاصه:ریشه‌های ویتیس آمورنسیس از طریق ارزیابی فعالیت‌های مهارکننده ملانوژنز و تیروزیناز پتانسیل سفید شدن پوست را دارند. در این مطالعه، ریشه های V. amurensis برای انتخاب سریع مواد سفیدکننده با استفاده از LC-Q-TOF-MS همراه با روش مهاری تیروزیناز، و بهینه سازی فرآیند استخراج برای استفاده به عنوان ماده کاربردی سفیدکننده پوست با روش سطح پاسخ استفاده شد. نتایج نشان داد که ریشه های V. amurensis اثرات مهاری تیروزیناز را توسط دو الیگومر استیل بن، ε-vinifera (1) و ویتامین B (2)، همانطور که توسط LC-Q-TOF-MS همراه با زیست سنجی پیش بینی شده بود، نشان دادند. شرایط استخراج بهینه (غلظت متانول 66 درصد، حجم حلال 140 میلی لیتر و زمان استخراج 100 دقیقه) برای مواد سفیدکننده پوست با بازده 6.20 درصد و فعالیت مهاری تیروزیناز 87.27 درصد بود. رابطه بین هر عامل و پاسخ متناظر آن با تحلیل همبستگی پیرسون تایید شد. حجم حلال یک رابطه خطی واضح با بازده نشان داد و غلظت متانول رابطه خطی قوی با فعالیت مهاری تیروزیناز برای ترکیبات 1 و 2 و همچنین ترکیب آنها داشت. به طور کلی، ثابت شد که LC-Q-TOF-MS همراه با سنجش زیستی پتانسیل یافتن مؤثر اجزای فعال جدید و همچنین اجزای فعال شناخته شده را دارد. ویتامین ها را می توان به عنوان یک عامل سفید کننده بالقوه طبیعی جدید پیشنهاد کرد.

طبق مطالعات مربوطه،سیستانچیک گیاه رایج است که به عنوان "علف معجزه آسا طولانی کننده عمر" شناخته می شود. جزء اصلی آن استسیستانوزید، که دارای اثرات مختلفی از جملهآنتی اکسیدان, ضد التهاب، وارتقاء عملکرد سیستم ایمنی. مکانیسم بین سیستانچ وسفید شدن پوستدر اثر آنتی اکسیدانی سیستانچ نهفته استگلیکوزیدها. ملانین در پوست انسان از اکسیداسیون تیروزین که توسط آن کاتالیز می شود تولید می شودتیروزینازو واکنش اکسیداسیون نیاز به مشارکت اکسیژن دارد، بنابراین رادیکال‌های آزاد اکسیژن در بدن به عامل مهمی بر تولید ملانین تبدیل می‌شوند. سیستانچ حاویسیستانوزیدکه یک آنتی اکسیدان است و می تواند تولید رادیکال های آزاد را در بدن کاهش دهد و در نتیجه تولید ملانین را مهار کند.

روی Cistanche Sold Near Me کلیک کنید

برای اطلاعات بیشتر:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

کلید واژه ها:Vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS همراه با روش مهاری تیروزیناز. روش سطح پاسخ. همبستگی پیرسون

1. معرفی

ملانین مسئول رنگ پوست و موی پستانداران است و از پوست در برابر اشعه ماوراء بنفش محافظت می کند، اما تولید بیش از حد ملانین و تجمع ملانین در پوست باعث اختلالات پوستی هیپرپیگمانتاسیون مانند کک و مک، ملاسما، لکه های پیری، افلیدها و لنتیژین های پیر می شود. تیروزیناز که به عنوان آنزیم اکسیداز حاوی مس شناخته می شود، نقش مهمی در بیوسنتز ملانین دارد. آنزیم دو واکنش اکسیداسیون متوالی را کاتالیز کرد: مرحله اول، هیدروکسیل کردن L-تیروزین به 3،{4}}دی هیدروکسی ال-فنیل آلانین (L-DOPA)، و مرحله دوم، اکسیداسیون L-DOPA به دوپاکینون دوپاکینون یک ماده بسیار واکنش پذیر است که می تواند به طور خود به خود پلیمریزه شود و ملانین تولید کند [1-3]. از این رو، مهارکننده‌های تیروزیناز را می‌توان به عنوان درمان اختلالات پوستی مرتبط با هیپرپیگمانتاسیون و به عنوان عوامل سفیدکننده پوست مورد استفاده قرار داد.

Vitis amurensis یک گونه انگور وحشی است که عمدتاً در آسیا (کره، چین و ژاپن) پراکنده شده است. میوه های کاملا رسیده به صورت خام مصرف می شوند و حاوی مواد مغذی فراوانی مانند ساکارز، گلوکز، پروتئین و ویتامین ها هستند، بنابراین از آنها به عنوان ماده ای برای شراب، آب میوه، ژله و مربا استفاده می شود. علاوه بر این، از برگ های آن در سالاد استفاده می شود [4]. ریشه و ساقه آن به عنوان طب سنتی برای درمان سرطان، دردهای عصبی و دردهای شکمی مورد استفاده قرار گرفته است [5،6]. ریشه‌های آن از استیلبن‌ها (یکی از اجزای اصلی)، پروسیانیدین‌ها، فلفلاوونوئیدها، تری ترپنوئیدها و سایر ترکیبات فنلی تشکیل شده است. تاکنون ترکیبات شیمیایی ریشه با جزئیات کافی مورد مطالعه قرار گرفته است. به طور خاص، الیگومرهای مختلف استیلبن، از جمله رسوراترول، آمورنسین A، ویتامین A، (به علاوه)-ε-vinifera، آمورنسین C-M، آمپلوپسین A، D و آمپلوپسین E گزارش شده است [6]. عصاره متانولی ریشه در برابر ملانوژنز ناشی از هورمون محرک ملانوسیت در سلول های B16F10 و در اکسیداسیون 3،{13}دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA) از طریق تیروزیناز قارچ [7] اثر ضد ملانوژنی از خود نشان می دهد. علاوه بر این، عصاره V. amurensis و ترکیبات فعال آنها اثرات آنتی اکسیدانی، ضد التهابی، محافظت کننده عصبی و ضد تومور را نشان می دهند [7-10].

LC-MS همراه با یک سنجش زیستی می تواند به طور همزمان مشخصات شیمیایی و فعالیت بیولوژیکی اجزاء در محصولات طبیعی را بدون نیاز به استخراج و جداسازی تایید کند. بنابراین، اخیراً برای شناسایی موثر و سریع ترکیبات زیست فعال در محصولات طبیعی استفاده شده است [11-13].

بهینه‌سازی فرآیندی است که حداکثر کارایی سیستم‌ها یا محصولات آزمایشی را ممکن می‌سازد. روش‌شناسی سطح پاسخ (RSM)، تحلیل چند متغیره، طراحی آزمایش‌ها با استفاده از تکنیک‌های ریاضی و آماری مبتنی بر مدل‌های تجربی و بیان همبستگی بین طراحی آزمایشی و نتایج به‌عنوان تابع چند جمله‌ای، از تکنیک‌هایی هستند که شرایط بهینه‌سازی ایده‌آل را با حداکثر کارایی فراهم می‌کنند. RSM یک روش بهینه سازی دقیق و کارآمد است که به طور گسترده در زمینه های مختلف از جمله فرآوری مواد غذایی، شیمی، زیست شناسی و کشاورزی استفاده می شود [14-16]. در طول دهه های گذشته، علاقه به داروها، لوازم آرایشی، و غذاهای کاربردی حاوی محصولات طبیعی افزایش یافته است. در نتیجه، تحقیقات مداومی در دانشگاه و صنعت با هدف توسعه چنین محصولاتی وجود دارد [17،18]. اولین مرحله در این مطالعات شامل استخراج ماده فعال زیستی از محصولات طبیعی است. در این زمان، از آنجایی که عوامل متعددی مانند زمان استخراج، دما، نسبت مایع به جامد و حجم حلال بر اجزای استخراج‌شده تأثیر می‌گذارند، بهینه‌سازی برای استخراج ترکیبات زیست فعال به حداکثر نیاز است.

طبق دانش ما، ترکیبات بازدارنده تیروزیناز و بهینه سازی عصاره های ریشه V. amurensis به ندرت گزارش شده است [5،19]. بنابراین، این مطالعه با هدف به دست آوردن سریع مهارکننده تیروزیناز از ریشه های V. amurensis با استفاده از LC-Q-TOF-MS همراه با روش مهاری تیروزیناز و بهینه سازی شرایط استخراج برای گسترش استفاده از ریشه های V. amurensis به عنوان یک عامل سفید کننده پوست انجام شد. توسط RSM

2. نتایج و بحث

2.1. LC-QTOF MS همراه با یک روش مهاری تیروزیناز با استفاده از عصاره ریشه V. amurensis

عصاره 8{3}} درصد MeOH ریشه V. amurensis فعالیت مهاری تیروزیناز قابل توجهی را نشان داد (80.7 ± 0.8 درصد در 50 میکروگرم بر میلی لیتر، جدول S1). برای شناسایی ترکیبات بازدارنده تیروزیناز در ریشه V. amurensis بدون جداسازی، LC-QTOF-MS همراه با یک روش مهاری تیروزیناز انجام شد. مشخصات شیمیایی عصاره ریشه V. amurensis در اولین اجرا به دست آمد (شکل S1)، و ترکیبات زیست فعال با استفاده از روش مهاری تیروزیناز از فراکسیون های جمع آوری شده هر 30 ثانیه از اجرای دوم شناسایی شدند (شکل 1). دو پیک بین 19 تا 22 دقیقه بر روی کروماتوگرام جرمی وجود داشت که پیش‌بینی می‌شد فعالیت مهاری تیروزیناز قابل‌توجهی داشته باشد، و ساختار آنها به‌عنوان استیلبن دایمر (1) و استیلبن تترامر (2) با استفاده از پروفایل شیمیایی (جدول 1) شناسایی شد.

2.2. شناسایی ترکیبات بازدارنده تیروزیناز ریشه V. amurensis

ابتدا، دو ماده تشکیل دهنده که انتظار می رود فعالیت مهاری تیروزیناز داشته باشند از بخش EtOAc جدا شدند و زیست فعالی آنها مورد ارزیابی قرار گرفت. ساختارهای ترکیبات جدا شده 1 و 2 به ترتیب با استفاده از 1H-NMR، 13C-NMR، و به عنوان ε-vinifera (1) [20،21] و ویتامین B (-vinifera، 2) [21-23] شناسایی شدند. ESI-MS (شکل 2، شکل های S2 و S3، و جدول S2). در روش مهاری تیروزیناز، مقادیر IC50 ترکیبات 1، 2 و کوجیک اسید به ترتیب 3.51، 10.74 و 27.09 میکرومولار بود. هر دو ترکیب اثرات بازدارندگی تیروزیناز بیشتری نسبت به کنترل مثبت، کوجیک اسید که جزء شناخته شده سفیدکننده پوست است نشان دادند (جدول 1 و شکل S4). در مطالعات قبلی، ε-vinifera (1) دارای فعالیت مهاری تیروزیناز گزارش شده است [23]. با این حال، ویتامین B (2) برای اولین بار در مطالعه ما شناسایی شد.

به طور کلی، نتایج، با داده‌های پیش‌بینی‌شده LC-MS همراه با روش مهاری تیروزیناز و ویتامین B (2) مرتبط است، پتانسیل را به عنوان یک مهارکننده جدید تیروزیناز نشان می‌دهد. علاوه بر این، مطالعات داکینگ مولکولی برای حمایت از نتیجه فعالیت مهاری قابل توجه تیروزیناز دو الیگومر استیلبن انجام شد. همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است، ترکیبات 1 و 2 امتیاز اتصال بالاتری نسبت به کنترل مثبت، اسید کوجیک، مطابق با داده های تجربی ما نشان دادند. با این حال، نتایج اتصال ترکیبات برخلاف نتایج تجربی ما بود. حالت های برهمکنش ترکیبات 1 و 2 در شکل 3 توضیح داده شده است. ترکیب 1 4 پیوند هیدروژنی، 2 برهمکنش آبگریز، و 1 جفت برهمکنش pi-lone، و ترکیب 2 11 پیوند هیدروژنی، 7 برهم کنش آبگریز، 1 برهمکنش واندروالسی را تشکیل می دهد. و 3 برهمکنش جفت pi-lone. در نتیجه، تایید شد که ترکیبات را می توان به محل فعال پروتئین هدف وارد کرد و به باقی مانده های اسید آمینه کاتالیزوری متصل شد که می تواند فعالیت تیروزیناز را مهار کند. علاوه بر این، ε-vinifera (1) به عنوان یک مهارکننده رقابتی گزارش شده است که به همان محلی که L-DOPA به تیروزیناز متصل می شود، متصل می شود [23]. مشاهده شد که ویتامین B (2) به محل مشابه ε-vinifera (1) متصل می شود، که تأیید می کند که ویتامین B (2) یک بازدارنده رقابتی جدید است.

2.3. بهینه سازی استخراج ریشه V. amurensis با استفاده از RSM

برای استفاده از ریشه های V. amurensis به عنوان یک ماده کاربردی سفیدکننده پوست، شرایط استخراج بهینه با طراحی Box-Behnken (BBD) برای به حداکثر رساندن عملکرد استخراج و فعالیت مهاری تیروزیناز طراحی شد. اثرات پاسخ‌های مستقل مانند بازده استخراج، فعالیت بازدارنده تیروزیناز، مقدار ترکیب 1، مقدار ترکیب 2 و مقدار مجموع ترکیبات 1 و 2 بر سه متغیر مستقل (زمان استخراج، غلظت MeOH/آب و حجم حلال)، اندازه گیری شد (جدول 2). محدوده متغیرها به عنوان زمان استخراج (4{68}}، 70 و 1{25}} دقیقه)، غلظت MeOH (40، 70 و 100 درصد) و حجم حلال ( 35، 87.5، و 140 میلی لیتر) بر اساس یک آزمایش اولیه تک عاملی (داده ها نشان داده نشده است). مقادیر به دست آمده از آزمایش های طراحی شده به صورت چند جمله ای همبستگی بین متغیرها با استفاده از تحلیل رگرسیون بیان شد (جدول S4-S13 و شکل S5). در نتیجه انجام بهینه‌سازی فردی برای هر واکنش (جدول 3)، انتظار می‌رفت که بازدهی با 1{33}} 6.21 درصد را نشان دهد.00 min, MeOH 64.78 درصد , 140.{42} } میلی لیتر فعالیت مهاری تیروزیناز (درصد) با شرایط 65.22 دقیقه، MeOH 100.{49}} درصد، 140.00 میلی‌لیتر استخراج شد و پیش‌بینی شد که مقدار 90.37 درصد را نشان دهد. مقدار ترکیب 1 در 65.74 دقیقه، MeOH 1{00.00 درصد، 35.00 میلی‌لیتر 37.45 میکروگرم بر میلی‌گرم، و مقدار ترکیب 2 در 70.00 دقیقه، MeOH 70.00 درصد و 92.24 پیش‌بینی شد. میلی لیتر به صورت 86.77 میکروگرم بر میلی گرم پیش بینی شد. علاوه بر این، انتظار می‌رفت که محتویات کل ترکیبات 1 و 2 در شرایط 75.20 دقیقه، MeOH 100.00 درصد و 35.00 میلی‌لیتر، حداکثر مقدار 108.10 میکروگرم بر میلی‌گرم را نشان دهد. آزمایش‌ها بر اساس شرایط بهینه 0.36 ± 6.19 درصد، فعالیت بازدارنده تیروزیناز 3.48 ± 91.72 درصد، محتوای ترکیب 1 1.78 ± 36.54 میکروگرم بر میلی‌گرم، محتوای ترکیب 2 85.74 ± 85.74 ± 85.74 ± 85.74 ± 16.57 میکروگرم {16.57 میکروگرم در ترکیب {16.57 میکروگرم در هر میلی‌گرم }.10 ± 19.11 میکروگرم بر میلی گرم به دست آمد، و پاسخ های فردی برای هر متغیر تفاوت 5 درصد یا کمتر از مقادیر پیش بینی شده نظری را نشان داد. بهینه سازی پاسخ چندگانه برای به حداکثر رساندن بازده استخراج و فعالیت مهاری تیروزیناز انجام شد (جدول 3). شرایط بهینه به شرح زیر بود: زمان استخراج، 100 دقیقه. غلظت MeOH، 66.38 درصد؛ و حجم حلال 140 میلی لیتر. با استفاده از این شرایط، بازده 13/1 ± 95/5 درصد و فعالیت مهاری تیروزیناز 57/1 ± 93/85 درصد تعیین شد. این مقادیر مشابه مقادیر پیش بینی شده به ترتیب 20/6 و 25/87 درصد بود. علاوه بر این، همبستگی بین هر متغیر و پاسخ مربوطه با استفاده از همبستگی پیرسون تحلیل شد (جدول 4). بازده استخراج یک رابطه خطی واضح بین زمان استخراج و غلظت MeOH و یک رابطه خطی منفی با مقدار ترکیب 1 را نشان داد. علاوه بر این، فعالیت مهاری تیروزیناز رابطه خطی قوی بین مقدار ترکیب 2 و مقدار مجموع را نشان داد. از ترکیبات 1 و 2 و یک رابطه خطی واضح با ترکیب 1. بنابراین، فعالیت بازدارندگی تیروزیناز ریشه V. amurensis با هر دو ترکیب 1 و 2 متناسب بود اما رابطه خطی قوی تری با مقدار ترکیب 2 نسبت به ترکیب 1 نشان داد.

3. مواد و روشها

3.1. رویه های تجربی عمومی

کروماتوگرافی مایع با فشار متوسط ​​(MPLC) با استفاده از Biotage Isolera (Biotage AB، Uppsala، سوئد) انجام شد. یک سیستم مجهز به پمپ کروماتوگرافی فلش (HPFC) با کارایی بالا، آشکارساز با طول موج دوگانه متغیر و یک کلکتور است. طیف‌های NMR با استفاده از طیف‌سنج Bruker SPECTROSPIN 300 MHz (Bruker Corporation، Billerica، MA، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. متانول-d4، یک حلال NMR، از آزمایشگاه ایزوتوپ کمبریج، شرکت خریداری شد. استونیتریل (ACN)، آب و متانول (MeOH) درجه کروماتوگرافی از ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (سئول، جمهوری کره) خریداری شد. L-تیروزین، قارچ تیروزیناز، اسید کوجیک و اسید فرمیک از شرکت سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد.

3.2. ماده ی گیاهی

ریشه V. amurensis از Gyeongbuk، کره به دست آمد، و همچنین از Omniherb (Daegu، جمهوری کره) خریداری شد. آنها توسط دکتر پروفسور کی یونگ لی، از کالج داروسازی در دانشگاه کره شناسایی شدند. یک نمونه کوپن (KUP-HD071) در آزمایشگاه فارماکوگنوزی، کالج داروسازی، دانشگاه کره سپرده شد.

3.3. طیف سنجی جرمی LC-Q-TOF

LC با استفاده از یک سری Agilent 1260 (Agilent، Santa Clara، CA، USA) که شامل یک پمپ باینری، گاززدا آنلاین، نمونه‌برگیر خودکار، محفظه ستون با کنترل ترموستاتیک و آشکارساز آرایه فتودیود است، انجام شد. جداسازی کروماتوگرافی با استفاده از ستون Shiseido CapCell PAK C18 (5 میکرومتر، 4.6 میلی‌متر، ID × 150 نانومتر) انجام شد. فاز متحرک شامل آب (حلال A) و ACN (حلال B) بود که هر دو حاوی 0.1 درصد اسید فرمیک بودند. شرایط گرادیان به شرح زیر بود: 0-5 دقیقه، 10 درصد B، 5-30 دقیقه، و افزایش خطی B از 10 به 90 درصد. نرخ همراه روی 0.6 میلی لیتر در دقیقه تنظیم شد. 5 میکرولیتر و 20 میکرولیتر از نمونه ها به ترتیب برای آنالیز LC-Q-TOF-MS و LC-Q-TOF-MS همراه با روش مهاری تیروزیناز تزریق شد. طیف سنجی جرمی با استفاده از طیف سنج جرمی Agilent 6530 Q-TOF (Agilent، Santa Clara، CA، USA) با رابط یونیزاسیون الکتروسپری (ESI) در حالت منفی انجام شد. داده های محدوده جرمی از m/z 50-1{44}}0 در حالت مرکز جمع آوری شد. پارامترهای جرمی به شرح زیر بود: ولتاژ مویرگی، 4000 ولت. فشار نبولایزر 40 psi; ولتاژ قطعه، 175 ولت; ولتاژ کفگیر، 65 ولت؛ دمای گاز خشک کردن، 325 ◦C; نرخ همراه گاز خشک کردن، 12.0 لیتر در دقیقه. انرژی برخورد 10، 20، 30 و 40 eV. تنظیم پارامتر اکتساب و پردازش داده ها با استفاده از LC-MS/MS Data Acquisition با استفاده از سری 6530 Q-TOF (نسخه B.05.00) (نرم افزار MassHunter Workstation، Agilent، Santa Clara، CA، USA) انجام شد.

3.4. LC-Q-TOF-MS همراه با روش مهاری تیروزیناز

LC-Q-TOF-MS همراه با یک روش مهاری تیروزیناز با استفاده از روش تعیین شده در مطالعه قبلی [24] انجام شد. به طور خلاصه، سنجش در دو نوبت انجام شد. در مرحله اول، مشخصات شیمیایی نمونه با استفاده از LC-Q-TOF-MS به دست آمد. در مرحله بعدی، محلول شستشو پس از عبور از سیستم LC تحت شرایط LC-Q-TOF اعلام شده در 96- صفحات چاه هر 30 ثانیه جمع آوری شد. فعالیت مهاری تیروزیناز فراکسیون های جمع آوری شده با استفاده از روش مهاری تیروزیناز مورد بررسی قرار گرفت.

3.5. جداسازی ترکیبات بازدارنده تیروزیناز از ریشه V. amurensis

برای جداسازی ترکیبات بازدارنده تیروزیناز شناسایی شده با استفاده از LC-Q-TOF-MS همراه با روش مهاری تیروزیناز، ریشه V. amurensis (3.{16}}1 کیلوگرم) سه بار با 80 درصد استخراج شد. MeOH به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق با استفاده از فراصوت. حلال استخراج شده فیلتر و تغلیظ شد تا عصاره خام (7/215 گرم) به دست آید، که در آب تعلیق شد و به طور متوالی با استفاده از n-هگزان، اتیل استات (EtOAc) و n-BuOH تقسیم شد. بخش EtOAc (25.85 گرم) تحت کروماتوگرافی ستونی سیلیکاژل با استفاده از n-هگزان: EtOAc تحت شرایط گرادیان (2{57}}:1 → 0:1) قرار گرفت تا هفت فراکسیون (E1-E7) تولید شود. کسر E4 با استفاده از MPLC و 100 گرم SNAP KP-Sil، یک کارتریج سیلیکاژل، و دی کلرومتان: MeOH در شرایط گرادیان (97:3 → 0:100) جدا شد تا هفت بخش فرعی تولید شود (E4-1 تا E4-7). . ترکیب 2 (417.0 میلی گرم) از E4-5 به دست آمد. بخش فرعی E4-4 با استفاده از SNAP 25 g Ultra، یک کارتریج سیلیکاژل، و کلروفرم:MeOH:H2O در شرایط گرادیان (50:4:1 → 15:4:1) مجدداً روی MPLC کروماتوگرافی شد تا هفت فراکسیون تولید شود. E4-4-1 تا E4-4-7). ترکیب 1 (396.0 میلی گرم) از E4-4-5 به دست آمد که به صورت یک نقطه روی صفحه کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) مشاهده شد.

3.6. سنجش مهاری تیروزیناز

فعالیت مهاری تیروزیناز با استفاده از روشی که قبلا توضیح داده شده بود با تغییرات جزئی ارزیابی شد [25]. دو میکرولیتر نمونه و 50 میکرولیتر 0}.1 واحد در میکرولیتر قارچ تیروزیناز در 96- پلیت‌های چاهی تیمار و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. پس از 15 دقیقه، 5{17}} میکرولیتر L-تیروزین 1 میلی مولار اضافه شد و سپس در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه واکنش نشان داد. مقدار دوپاکروم تشکیل شده در 495 نانومتر با استفاده از یک میکروپلیت خوان Spectra Max 19{{20}} اندازه گیری شد (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). فعالیت مهاری تیروزیناز با استفاده از معادله زیر محاسبه شد: مهار تیروزیناز ( درصد )=[1 - (S - S0)/(C - C0)] × 100، که در آن S جذب نمونه، تیروزیناز و L است. -تیروزین؛ S0 جذب نمونه و L-تیروزین است. C میزان جذب تیروزیناز و ال تیروزین و C0 جذب ال تیروزین است. کوجیک اسید، یک مهار کننده تیروزیناز شناخته شده، به عنوان یک کنترل مثبت استفاده شد. مقادیر IC50 با استفاده از GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) محاسبه شد.

3.7. مطالعات اتصال مولکولی

اتصال مولکولی با استفاده از نرم افزار SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Ltd., St. Louis, MO, USA) با ساختارهای کریستالی PPO3، یک تیروزیناز از Agaricus bisporus (بانک داده پروتئین (PDB) ID: 2Y9W) انجام شد. تمام مولکول‌های آب پروتئین هدف حذف شدند و آماده‌سازی لیگاند با پروتکل آماده‌سازی «عفونی‌سازی» در SYBYL-X 2.1.1 انجام شد. میل پروتئین لیگاند توسط میدان نیروی Tripos محاسبه شد و به عنوان نمره کل بیان شد. حالت لنگر انداخته لیگاند از مجتمع پروتئین-لیگاند در برنامه مشتری R2 Discovery Studio 2017 (شرکت Biovia، سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) مشاهده شد.

3.8. طراحی تجربی و تجزیه و تحلیل آماری

یک شرایط بهینه برای استخراج ترکیبات با حداکثر فعالیت مهاری تیروزیناز از ریشه V. amurensis با استفاده از BBD با سه متغیر و سه سطح ایجاد شد (نرم‌افزار آماری MINITAB Release 14.12.{2}}). بر اساس نتایج آزمایش تک عاملی اولیه، متغیرهای مستقل شامل زمان استخراج (X1)، MeOH و غلظت آب (X2) و حجم مایع (X3) و طیفی از متغیرهای آنها انتخاب شدند (جدول S3). متغیرهای RSM با استفاده از سه سطح -1، 0 و 1 کدگذاری شدند. به طور کلی، 15 آزمایش شامل 3 تکرار در مرکز طرح طراحی شد (جدول 2). به عنوان پاسخ های مستقل، بازده (درصد)، فعالیت مهاری تیروزیناز (درصد)، مقدار ترکیب (1) (μg/mg) و مقدار ترکیب (2) (μg/mg) اندازه گیری شد. فعالیت مهاری تیروزیناز عصاره در غلظت 50 میکروگرم بر میلی لیتر ارزیابی شد. هر پاسخ با استفاده از معادله چند جمله ای مرتبه دوم زیر بیان می شود:

جایی که R نشان دهنده پاسخ است. 1، 2 و 3 ضرایب خطی هستند. 12، 23 و 13 ضرایب تعامل بین سه متغیر هستند. و 11 و 22 و 33 ضرایب درجه دوم هستند.
علاوه بر این، تجزیه و تحلیل همبستگی پیرسون برای تعیین وجود رابطه خطی بین هر متغیر و پاسخ انجام شد. ضریب همبستگی پیرسون یک رابطه خطی قوی بین {0}}}.7 و 1 دارد.0، یک رابطه خطی واضح بین 0.3 و 0.7، یک رابطه خطی ضعیف بین {{10}}.1 و 0.3، و هیچ یا یک رابطه خطی ناچیز بین 0}.0 و 0.1. همبستگی مثبت و منفی بسته به مثبت یا منفی بودن ضریب همبستگی پیرسون بیان می شود.

3.9. تجزیه و تحلیل کمی ترکیبات بازدارنده تیروزیناز 1 و 2

مقدار هر ترکیب 1 و 2 در عصاره های به دست آمده با استفاده از 15 شرایط آزمایشی طراحی شده با استفاده از منحنی های کالیبراسیون اندازه گیری شد (جدول 2). منحنی‌های کالیبراسیون برای ترکیبات 1 و 2 با استفاده از ناحیه زیر منحنی کروماتوگرام UV (33{7}} نانومتر به‌دست‌آمده در غلظت‌های 0.1-1000 میکروگرم بر میلی‌لیتر و 7.81-1000 میکروگرم بر میلی‌لیتر، به دست آمد) تعیین شد. LC با استفاده از سیستم Waters 2695 LC (Waters، Santa Clara، CA، USA) با شرایط مشابه با شرایط سیستم LC که در مواد و روش‌ها، طیف‌سنجی جرمی LC-Q-TOF شرح داده شده است، انجام شد.

4. نتیجه گیری

ε-Viniferin (1) و ویتامین B (2) از ریشه V. amurensis به عنوان ترکیبات سفید کننده پوست با استفاده از LC-Q-TOF-MS همراه با یک روش مهاری تیروزیناز مشخص شدند. به طور خاص، ویتامین B (2) برای اولین بار به عنوان یک ترکیب بازدارنده تیروزیناز در این مطالعه شناسایی شد و ε-vinifera (1) و ویتامین B (2) اثرات مهاری تیروزیناز بیشتری نسبت به کنترل مثبت، اسید کوجیک نشان دادند. شرایط بهینه سازی با حداکثر اثر بازدارندگی تیروزیناز و عملکرد ریشه V. amurensis با استفاده از زمان استخراج (100 دقیقه)، غلظت MeOH (66.38 درصد) و حجم مایع (140 میلی لیتر) ایجاد شد. نتیجه مطابقت خوبی بین مقادیر تجربی و پیش بینی شده نشان داد. در نتیجه، LC-Q-TOF-MS همراه با سنجش زیستی پتانسیل یافتن موثر ترکیبات فعال جدید و همچنین ترکیبات فعال شناخته شده، ویتامین B (2) را ثابت کرده است که می تواند به عنوان یک عامل سفید کننده بالقوه طبیعی جدید پیشنهاد شود.

مواد تکمیلی: موارد زیر به صورت آنلاین موجود است، شکل S1: کروماتوگرام MS در حالت یونیزاسیون منفی (A); کروماتوگرام UV در 280 نانومتر (B) از عصاره ریشه های V. amurensis، شکل S2: طیف 1H-و 13C-NMR ترکیب 1 (300 و 75 مگاهرتز، CD3OD)، شکل S3: طیف 1H-و 13C-NMR ترکیب 2 (300 و 75 مگاهرتز، CD3OD)، شکل S4: نمودار سیگموئیدی و IC50 کنترل مثبت، ترکیبات 1 و 2، شکل S5: نمودارهای سطح پاسخ و کانتور که اثر پارامترهای استخراج را نشان می دهد (X1: زمان استخراج، دقیقه، X2: غلظت MeOH، درصد؛ X3: حجم حلال، میلی لیتر). (الف) بازده؛ (ب) فعالیت مهاری تیروزیناز. (C) ترکیب 1; (د) ترکیب 2; (E) مجموع ترکیبات 1 و 2، جدول S1. فعالیت مهاری تیروزیناز عصاره های ریشه V. amurensis، جدول S2: داده های NMR 1H- و 13C ترکیبات 1 و 2 در CD3OD (δ بر حسب ppm)، جدول S3: متغیرها و سطوح مستقل برای روش سطح پاسخ، جدول S4: رگرسیون تخمینی ضریب عملکرد، جدول S5: آنالیز واریانس برای عملکرد، جدول S6: ضریب رگرسیون تخمینی برای فعالیت مهاری تیروزیناز، جدول S7: تجزیه و تحلیل واریانس برای فعالیت مهاری تیروزیناز، جدول S8: ضریب رگرسیون تخمینی برای ترکیب 1، جدول S9: واریانس برای ترکیب 1، جدول S10: ضریب رگرسیون تخمینی برای ترکیب 2، جدول S11. آنالیز واریانس برای ترکیب 2، جدول S12: ضریب رگرسیون تخمینی برای مجموع ترکیبات 1 و 2، جدول S13: آنالیز واریانس برای مجموع ترکیبات 1 و 2.
مشارکت نویسنده: مفهوم سازی، KYL; روش، K.-EO، HS، و KYL. نرم افزار، K.-EO، و HS. اعتبار سنجی، HS; تجزیه و تحلیل رسمی، K.-EO، و HS. بررسی، K.-EO، HS، MKL، و KYL. مدیریت داده، K.-EO، HS، BP، و KYL. نوشتن - آماده سازی پیش نویس اصلی، K.-EO، و HS. نوشتن - بررسی و ویرایش، HS، MKL، BP و KYL. نظارت، MKL، BP، و KYL همه نویسندگان نسخه منتشر شده نسخه خطی را خوانده و با آن موافقت کرده اند.
منابع مالی: این تحقیق توسط کمک مالی بنیاد تحقیقات ملی کره با بودجه دولت کره (NRF-2017R1A2B4003403 و NRF{4}}R1A6A1A03031807) و کمک مالی پروژه تحقیق و توسعه فناوری بهداشت کره از طریق توسعه صنعت بهداشت کره پشتیبانی شد. موسسه (KHIDI)، توسط وزارت بهداشت و رفاه، جمهوری کره (HF20C0038).
بیانیه در دسترس بودن داده ها: داده های ارائه شده در این مطالعه در مطالب تکمیلی موجود است.
تضاد علاقه:نویسندگان هیچ تضاد منافع را اعلام نمی کنند.
در دسترس بودن نمونه: در دسترس نیست

منابع

1. رنجبر، س. شاهواران، ص. ادراکی، ن. خوشنویس زاده، م. دررودی، م. صرافی، ی. حمزه لوئیان، م. خوشنویس زاده، م. 1، 2، 3-بنزیلیدین (تیو) باربیتورات‌های 3- مرتبط با تریازول به عنوان مهارکننده‌های جدید تیروزیناز و پاک‌کننده‌های رادیکال آزاد. قوس. فارم. 2020, 353, 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. چانگ، T.-S. دینگ، اچ.-ای. لین، اچ.-سی. شناسایی 6، 7، 40 -تری هیدروکسی ایزوفلفلاوون به عنوان یک مهارکننده قوی تیروزیناز. Biosci. بیوتکنول. بیوشیمی. 2005، 69، 1999-2001. [CrossRef] [PubMed]

3. میازوا، م. اوشیما، تی. کوشیو، ک. ایتسوزاکی، ی. Anzai، J. مهارکننده تیروزیناز از سبوس برنج سیاه. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2003، 51، 6953-6956. [CrossRef]

4. چن، س. دیائو، ال. آهنگ، اچ. Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: مروری بر شیمی و فارماکولوژی. فیتومدیسین 2018، 49، 111-122. [CrossRef] [PubMed]

5. جین، ک.-س. اوه، YN; هیون، SK; Kwon، HJ; کیم، BW بتولینیک اسید جدا شده از ریشه Vitis amurensis از طریق تنظیم مسیرهای MEK/ERK و PI3K/Akt در سلول های B16F10، ملانوژنز ناشی از 3-ایزوبوتیل-1- متیل گزانتین را مهار می کند. مواد شیمیایی مواد غذایی سموم 2014، 68، 38-43. [CrossRef]

6. کیم، اچ. Thuong، PT; Ngoc، TM; لی، آی. آویزان، ND; Bae, K. فعالیت مهاری آنتی اکسیدانی و لیپوکسیژناز الیگوستیلبن ها از برگ و ساقه Vitis amurensis. J. Ethnopharmacol. 2009، 125، 304-309. [CrossRef]

7. جین، ک.-س. اوه، YN; هیون، SK; Kwon، HJ; Kim، BW Vitis amurensis ریشه Ruprecht ملانوژنز ناشی از هورمون محرک ملانوسیت را در سلول‌های B16F10 مهار کرد. Nutr. Res. تمرین کنید. 2014، 8، 509-515. [CrossRef]

8. جانگ، م.ح. Piao، XL; کیم، هی؛ چو، ای جی. باک، SH; Kwon، SW; الیگومرهای پارک، JH Resveratrol از Vitis amurensis استرس اکسیداتیو ناشی از آمیلوئید را در سلول‌های PC12 کاهش می‌دهند. Biol. فارم. گاو نر 2007، 30، 1130-1134. [CrossRef]

9. لی، ای.-او. لی، اچ.-جی. هوانگ، H.-S.; Ahn، K.-S. چای، سی. کانگ، ک.-س. لو، جی. کیم، اس.-اچ. مهار قوی رشد سرطان ریه لوئیس توسط هگزانول A از ریشه Vitis amurensis از طریق فعالیت های آپوپتوز و ضد رگ زایی. سرطان زا 2006، 27، 2059-2069. [CrossRef]

10. Bak, M.-J. Truong، VL; کانگ، اچ.-اس. جون، م. جئونگ، دبلیو-اس. اثر ضد التهابی پروسیانیدین ها از دانه های انگور وحشی (Vitis amurensis) در سلول های RAW 264.7 القا شده با LPS. اکسید. پزشکی سلول. لانگف. 2013، 2013. [CrossRef]

11. شین، ح. چانگ، اچ. پارک، بی. Lee, KY شناسایی ترکیبات آنتی اکسیدانی از Polygonum aviculare با استفاده از LC-MS همراه با سنجش DPPH. نات تولید علمی 2016، 22، 64-69. [CrossRef]

12. پارک، اس. شین، اچ. پارک، ی. چوی، آی. پارک، بی. Lee, KY خصوصیات ترکیبات بازدارنده تولید NO از Catalpa ovata با استفاده از LC-MS همراه با یک روش مبتنی بر سلول. Bioorg. شیمی. 2018، 80، 57-63. [CrossRef] [PubMed]

13. اینگکانینان، ک. دی بست، سی. ون در هایدن، آر. هوفته، ع. کاراباتک، بی. ایرث، اچ. Tjaden، U. ون در گریف، جی. Verpoorte, R. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با UV جفت شده آنلاین، تشخیص طیف سنجی جرمی و بیوشیمیایی برای شناسایی مهارکننده های استیل کولین استراز از محصولات طبیعی. J. کروماتوگر. 2000، 872، 61-73. [CrossRef]

14. Bezerra، MA; Santelli، RE; اولیویرا، EP; ویلار، LS; Escaleira، روش سطح پاسخ LA (RSM) به عنوان ابزاری برای بهینه سازی در شیمی تجزیه. Talanta 2008, 76, 965-977. [CrossRef] [PubMed]

15. ویتک کرویاک، ا. چوجناکا، ک. پادستاوچیک، دی. داویک، ا. پوکومدا، ک. کاربرد روش‌شناسی سطح پاسخ و روش‌های شبکه عصبی مصنوعی در مدل‌سازی و بهینه‌سازی فرآیند جذب زیستی. بیورسور. تکنولوژی 2014، 160، 150-160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo، PW; Brereton، RG Experimental design I. Screening. تحلیلگر روندها شیمی. 1996، 15، 26-31. [CrossRef]

17. وانگ، ی. ژائو، ال. ژانگ، آر. یانگ، ایکس. سان، ی. شی، ال. Xue, P. بهینه سازی استخراج به کمک اولتراسوند با روش سطح پاسخ، ظرفیت آنتی اکسیدانی و فعالیت مهاری تیروزیناز آنتوسیانین از سبوس برنج قرمز. علوم غذایی Nutr. 2020، 8، 921–932. [CrossRef]

18. Weremfo، A. آدلی، اف. Adarkwah-Yiadom، M. بهینه‌سازی همزمان استخراج ترکیبات فنلی به کمک مایکروویو و فعالیت آنتی‌اکسیدانی دانه‌های آووکادو (Persea americana Mill.) با استفاده از روش‌شناسی سطح پاسخ. جی. مقعد. روشها شیمی. 2020، 2020، 7541927. [CrossRef]

19. کو، ج. چوی، جی. Bae, SK; کیم، جی. یون، KD جداسازی پنج الیگوستیلبن از V itis amurensis توسط کروماتوگرافی مخالف جریان با عملکرد بالا با گرادیان همکار. J. Sep. Sci. 2013، 36، 3860-3865. [CrossRef]

20. وانگ، K.-T. چن، ال.-جی. Tseng، S.-H.; هوانگ، J.-S. حسیه، م.س. وانگ، سی.-سی. اثرات ضد التهابی رسوراترول و الیگوستیلبن ها از Vitis thunbergii var. تایوانیانا در برابر آرتریت ناشی از لیپوپلی ساکارید. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2011، 59، 3649-3656. [CrossRef]

21. هو، ج. لین، تی. خو، جی. دینگ، آر. وانگ، جی. شن، آر. ژانگ، Y.-W. چن، H. پلی فنول های جدا شده از برگ Vitis thunbergii var. تایوانیانا مسیر مربوط به APP را تنظیم می کند. Bioorg. پزشکی شیمی. Lett. 2016، 26، 505-511. [CrossRef] [PubMed]

22. اوشیما، ی. کامیجو، ا. اوهیزومی، ی. نیوا، م. ایتو، جی. هیسامیچی، ک. تاکشیتا، ام. الیگوستیلبن های جدید از Vitis coignetiae. چهار وجهی 1995، 51، 11979-11986. [CrossRef]

23. آنا مالینوفسکا، م. بیلت، ک. دروئت، اس. مونچ، تی. اونلوبایر، م. تونگمونیتوم، دی. Giglioli-Guivarc'h، N.; هانو، سی. Lanoue، A. عصاره های نیشکر انگور به عنوان یک ماده آرایشی جوان کننده چند منظوره: ارزیابی فعالیت سیرتوئین، مهار تیروزیناز و پتانسیل فراهمی زیستی. Molecules 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. یانگ، اچ. اوه، K.-E. جو، YH; Ahn، JH; لیو، کیو. ترک، ا. جانگ، جی. هوانگ، BY; لی، کی. Lee, MK خصوصیات ترکیبات بازدارنده تیروزیناز از قسمت های هوایی Humulus japonicus با استفاده از روش آنلاین جفت شده LC-MS/MS. Bioorg. پزشکی شیمی. 2018، 26، 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. لیو، کیو. کیم، سی. جو، YH; کیم، اس بی؛ هوانگ، BY; لی، MK سنتز و ارزیابی بیولوژیکی مشتقات رسوراترول به عنوان مهارکننده های ملانوژنز. Molecules 2015, 20, 16933-16945. [CrossRef] [PubMed]

برای اطلاعات بیشتر: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501