خصوصیات پتانسیل مهار آنزیم CYP3A4 فلاونوئیدهای منتخب قسمت 2

لطفا کلیک کنیدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

همانطور که در آزمایش های قبلی، بیشترین کاهش فعالیت آنزیم زمانی مشاهده شد که کریزین به عنوان یک بازدارنده استفاده شد. فعالیت باقیمانده آنزیم پس از انکوباسیون و دیالیز با کریزین 0.57 درصد و پس از انکوباسیون و دیالیز با درمان قبلی با هگزاسیانوفرات پتاسیم، 1.31 درصد بود (شکل 4).

در مورد مهار مستقیم (برگشت پذیر)، این نوع آزمایش بازیابی فعالیت آنزیم را پس از دیالیز نشان می دهد. در مورد مهار شبه برگشت ناپذیر، فعالیت آنزیم پس از درمان با اکسیدان و دیالیز بازیابی می شود. همانطور که این موارد در مورد هیچ یک از تجزیه و تحلیل شدفلاونوئیدها، می توان نتیجه گرفت که همه فلاونوئیدها مهار غیرقابل برگشت سیتوکروم P{0}}A4 را نشان می دهند.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

3. بحث

نشان داده شده است که برخی از فلاونوئیدها می توانند فعالیت آنزیم های سیتوکروم P45{12}} را مهار کنند. ساریچ-مستاپیک و همکاران [28] و کوندزا و همکاران. [29] نشان داد که آکاستین، آپیژنین، کریزین و پینوسمبرین آنزیم CYP3A4 را در سنجش با تستوسترون به عنوان سوبسترای نشانگر مهار می کنند. از آنجایی که آنزیم CYP3A4 دارای یک سایت فعال بزرگ است که می تواند سوبستراها را به طور متفاوتی در خود جای دهد، توصیه می شود که سنجش فعالیت را با سوبسترای نشانگر دیگری مانند نیفدیپین و میدازولام انجام دهید [3{16}}]. در نتیجه، ما از اکسیداسیون نیفدیپین به عنوان واکنش نشانگر فعالیت CYP3A4 استفاده کردیم و پارامترهای جنبشی غیرفعال را تعیین کردیم. مقادیر اثربخشی مهار به‌دست‌آمده با استفاده از نیفدیپین به‌عنوان یک سوبسترای نشانگر در مقایسه با سنجش تستوسترون برای آپیژنین، آکاستین و پینوسمبرین از همان مرتبه بزرگی برخوردار است. فقط کریسین در مقایسه با سنجش نیفدیپین، چهار برابر بیشتر در تستوسترون 【29】 نشان داد، یعنی 0.108 دقیقه-1 μM{15}} در مقابل 0.029 دقیقه-1uM{19}}. شباهت های مشاهده شده در سینتیک غیرفعال سازی مطابق با داده های ادبیات است که تأیید می کند که نیفدیپین وتستوستروندارای مکان های اتصال متفاوتی هستند که همپوشانی دارند [31]. سیتوکروم P{1}}A4 یکی از بزرگترین سایت‌های فعال را دارد و می‌تواند همزمان سوبسترا و مهارکننده را در خود جای دهد، که یکی بر اتصال دیگری تأثیر می‌گذارد، که می‌تواند تفاوت‌های مشاهده‌شده بین سنجش نیفدیپین و تستوسترون را توضیح دهد.

اگر مهارکننده از درمان قطع شود، می توان از پیامدهای بالینی مهارکننده های برگشت پذیر (به عنوان مثال، تداخلات غذا و دارو) اجتناب کرد. فعل و انفعالات مهم تر آنهایی هستند که برگشت ناپذیر هستند، در حالی که صرفاً قطع استفاده از بازدارنده، مسائل مربوط به تعامل را حل نمی کند. در این مطالعه، کریزین بالاترین پتانسیل بازدارندگی را با کمترین IC5n و K نشان داد. ارزش های. مطالعه اتصال مولکولی فلاونوئیدهایی که به سیتوکروم P4503A4 متصل می‌شوند، با قرار دادن حلقه B در برابر آهن در مرکز فعال آنزیم، میل پیوندی بالاتر کریزین را نشان می‌دهد [28]. مطالعه رابطه ساختار-مهار نشان داده است که گروه‌های هیدروکسیل در حلقه A احتمالاً به دلیل برهمکنش‌های یون-یون در اثر بازدارندگی نقش دارند، در حالی که حلقه B می‌تواند غیر جایگزین (پینوسمبرین، کریزین) یا تک‌جانشین (آکاستین، آپیژنین) باشد. اثر مهاری که باید مشاهده شود (شکل 1) [28]. فلاونوئیدهای غیر جایگزین (پینوسمبرین، کریزین) نسبت به اپوکسیداسیون و تولید واسطه‌های واکنشی که CYP3A4 را غیرفعال می‌کنند، حساس‌تر هستند. اثر بازدارندگی قوی‌تر مشاهده‌شده با کریزین احتمالاً به دلیل سفتی ساختار و وجود پیوند دوگانه C{13}}C3 در مقایسه با پینوسمبرین است.

سیستانچ می تواند ایمنی را بهبود بخشد

اهمیت این سینتیک آنزیم توصیف شده را می توان در زمینه تداخلات غذا و دارو مشاهده کرد، جایی که تجویز کریزین ({1}} uM) به طور قابل توجهی AUC و حداکثر غلظت سرمی (Cmax) نیتروفورانتوئین را در موش‌ها افزایش داد [32] . به عنوان مثال، مهارکننده نسبتا ضعیف مبتنی بر مکانیسم آنزیم CYP3A4/5،اریترومایسین[33]، گزارش شده است که باعث ایجاد تعامل متوسط ​​با سریواستاتین در داوطلبان سالم می شود (افزایش 21 درصدی در AUC سریواستاتین) [34]. Chrysin همچنین دارای پتانسیل مهاری بیشتری نسبت به mibefradil، یک داروی ضد فشار خون است که به دلیل تداخلات قابل توجه با سایر داروها کنار گذاشته شد. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که کریزین می‌تواند یک مهارکننده قوی باشد و احتمالاً با سایر داروهای مورد استفاده تداخل داشته باشد و AUC و Cmax این داروها را تغییر دهد. کریسین در بره موم (28 گرم در لیتر) فراوان است و سومین فلاونوئید اصلی عسل به میزان 3/5 میلی گرم بر کیلوگرم است [35]. بنابراین، یک رژیم غذایی غنی از این غذاها پتانسیل تداخل با داروهایی را دارد که سوبستراهای CYP3A4 هستند.

پینوسمبرین، یک مهارکننده غیرقابل برگشت اثبات شده آنزیم CYP3A4، کمترین ارزش حرکتی 0 را نشان داد.04 ± 0.01 دقیقه. اثر غیرفعال سازی آن مشابه آکاستین و آپیژنین بود (0.01 دقیقه-1 uM-). پینوسمبرین بیشتر در غذاهایی مانند عسل و نوشیدنی ها (چای و شراب قرمز) یافت می شود که منبع غنی این فلاونوئید است [29]. با توجه به این پارامترهای جنبشی، باید در مصرف این منابع پینوسمبرین همراه با داروهایی که به عنوان سوبستراهای CYP3A4 عمل می کنند، احتیاط کرد.

Acacetin سه برابر ارزش IC50 بالاتر از کریزین و پنج برابر بالاتر از K نشان داد. ارزش، در حالی که ارزش تاثیر مشابه با سایر فلاونوئیدها حفظ می شود، نشان دهنده اثر مهاری پایین تر است. آکاستین عمدتاً در گونه‌های گیاهی مانند Turnera diffusa، Robinia pseudoacacia و Betula pendula [36] یافت می‌شود، اما غذاهای خاصی نیز منبعی از این فلاونوئید هستند. به عنوان مثال، آب کامکوات منبع غنی آکاستین است و آکاستین را می توان در غلظت های 0.1 میلی گرم در 100 گرم آب تازه یافت [37]. ترکیب اصلی acacetin، apigenin بالاترین مقدار IC50 و بالاترین K را نشان داد. ارزش در میان چهار فلاونوئید آزمایش شده است. پتانسیل مهاری آپیژنین در داخل بدن تأیید شد زمانی که درمان ترکیبی آپیژنین و پاکلیتاکسل منجر به افزایش فراهمی زیستی خوراکی پاکلیتاکسل شد که عمدتاً به افزایش جذب در دستگاه گوارش از طریق مهار P-گلیکوپروتئین و کاهش گذر اول نسبت داده شد. متابولیسم پاکلیتاکسل از طریق مهار زیرخانواده CYP3A در روده کوچک و/یا در کبد توسط آپیژنین [38]. آپیژنین یک فلاونوئید غالب در کرفس، جعفری و بابونه است. گزارش شده است که جعفری خشک دارای حداکثر مقدار آپیژنین، 45035 میکروگرم در گرم است. منابع اضافی آپیژنین در گیاهانی مانند گل خشک بابونه که حاوی 3000 تا 5000 میکروگرم در گرم است و دانه های کرفس که حاوی 786.5 میکروگرم در گرم 【39】 است یافت می شود.

مهار برگشت پذیر سیتوکروم P{0}}A4 مربوط به مرحله اول چرخه کاتالیزوری سیتوکروم P450 است (شکل 5). اغلب، رقابت بین سوبسترا و بازدارنده در اتصال به محل فعال (آهن آهن) مشاهده می شود. در این صورت، انجام آزمایشات الزام آور توصیه می شود (تیتراسیون آنزیم) و برای آزمایش آن با بیش از یک سوبسترا، زیرا CYP3A4 دارای یک سایت فعال بزرگ است که می تواند بیش از یک مولکول بستر/بازدارنده را در خود جای دهد [26،30]. در این مطالعه، ما از نیفدیپین به عنوان یک سوبسترا استفاده کرده‌ایم، و نتایج کارایی مهار با سنجش‌های گزارش‌شده قبلی که با تستوسترون به‌عنوان سوبسترای نشانگر انجام شده بود، بسیار قابل مقایسه بود (جدول 1).

شکل 5. چرخه کاتالیزوری سیتوکروم P450 از نه مرحله تشکیل شده است. مرحله اول نشان دهنده اتصال بستر و نقطه تعامل با بازدارنده های برگشت پذیر است. در مرحله دوم، آهن هِم به شکل آهنی تبدیل می شود که مهارکننده های شبه برگشت ناپذیر به آن متصل می شوند. اگر یک مهار برگشت ناپذیر مشاهده شود، معمولاً به شکل رادیکال بستر (تشکیل شده در مرحله 7) و/یا محصول (تشکیل شده در مرحله 8) مربوط می شود.سیستانچ در شلوارتگونه های فعال اکسیژن تشکیل شده در چرخه بیهوده سیتوکروم P450 (مرحله 3a و 5a) می توانند باعث تخریب آنزیم شوند که با افزودن SOD و CAT می توان از آن جلوگیری کرد. شرح مراحل غیر مرتبط با مهار حذف شده است. مطابق با مرجع [26] تهیه شده است.

با این حال، همانطور که قبلا نشان داده‌ایم [28،29] و در اینجا در آزمایش‌های انجام‌شده خود تأیید کردیم، همه فلاونوئیدهای مورد مطالعه یک مهار غیرقابل برگشت نشان می‌دهند. صرف نظر از نوع مهار برگشت ناپذیر (پیوند شبه برگشت ناپذیر یا کووالانسی ماده واسطه به هم یا آپوپروتئین)، در صورتی که پیش جوجه کشی، قبل از افزودن یک بستر نشانگر، انجام شود، مهار بسیار برجسته خواهد بود [26]. در دوره پیش جوجه کشی، یک چرخه کاتالیزوری با افزودن سیستم مولد برای تولید کوآنزیم (NADPH) فعال می شود و زمان کافی برای مشاهده غیرفعال شدن آنزیم در نظر گرفته می شود. بنابراین، تمام انواع غیر قابل برگشت مهار نیاز به کاهش آنزیم به فرم آهن دارند (شکل 5).

از آنجایی که سیتوکروم های P45{5}} هموپروتئین هستند، ما اتصال فلاونوئیدها به شکل آهنی محل فعال و اتصال یک واسطه واکنشی احتمالی به هم را مطالعه کرده ایم [26]. برای ارزیابی تشکیل ترکیب اضافی هم، یک سنجش هموکروموپیریدین انجام شد. تمام فلاونوئیدهای آزمایش شده به طور قابل توجهی غلظت هم را در هر دو سنجش تا بیش از 50 درصد کاهش دادند. کرایسین، دوباره قوی ترین بازدارنده بود که با مقادیر جنبشی مهار مشاهده شده در این مطالعه مطابقت داشت. غلظت هم با پینوسمبرین پنج برابر بیشتر و با آپیژنین تقریباً ده برابر بیشتر از کریزین بود (به ترتیب 4/0±3/25 و 7/1±1/45 درصد). این کاهش در غلظت هِم نشان می‌دهد که مهار غیرقابل برگشت CYP3A4 توسط فلاونوئیدهای مورد مطالعه را می‌توان به اتصال کووالانسی یک واسطه واکنشی به هم نسبت داد. لازم به ذکر است که هم ها را می توان توسط گونه های اکسیژن فعال تخریب کرد و نتایج سنجش هموکروموپریدین را کاهش داد. برای از بین بردن این احتمال، انکوباسیون در حضور SOD و CAT (lable2) انجام شد که نتیجه‌گیری فوق‌الذکر را تایید می‌کند.

اولین مرحله در چرخه کاتالیزوری آنزیم سیتوکروم P450، اتصال یک بستر به یون آهن است. اگر بازدارنده مهار رقابتی را نسبت به سوبسترا نشان دهد، فعالیت آنزیم را می توان با دیالیز بازیابی کرد، زیرا حذف بازدارنده، بازیابی کامل فعالیت آنزیم را ممکن می سازد [26]. با این حال، اگر بازدارنده به آهن آهن متصل شود، استفاده از یک اکسیدان، مانند PCF، قبل از دیالیز برای بازیابی فعالیت آنزیم مورد نیاز است. اگر فعالیت آنزیم بازیابی شود، مهار به عنوان شبه برگشت ناپذیر مشخص می شود [26]. از آنجایی که فعالیت آنزیم پس از دیالیز با یا بدون PCF قابل بازیابی نیست، هیچ یک از فلاونوئیدهای آزمایش شده (در غلظت 25 میکرومولار) به عنوان مهارکننده های برگشت پذیر یا شبه برگشت ناپذیر آنزیم CYP3A4 عمل نمی کنند. این همچنین تأیید می کند که مهار غیرقابل برگشت با اتصال کووالانسی به هم یا آپوپروتئین، علت احتمالی غیرفعال شدن آنزیم است.

لازم به ذکر است که کریزین باعث کاهش تقریباً کامل هم در انکوباسیون شد: 97.1 درصد بدون و 94.5 درصد با SOD و CAT (جدول 2). در حالی که نتایج فعالیت آنزیم باقیمانده در شرایط مشابه کاهش فعالیت آنزیم را تقریباً 99 درصد نشان داد (شکل 4). سنجش هموکروموپیریدین، هم ها را از همه منابع موجود در انکوباسیون، یعنی سیتوکروم P450 و همچنین سیتوکروم bs ثبت می کند. نتایج برای کریزین نشان می دهد که یک واسطه واکنشی تولید شده توسط سیتوکروم P450 با هم از سیتوکروم P450 و همچنین سیتوکروم b5 واکنش نشان می دهد.

تجزیه و تحلیل بیشتر LC-MS برای تعیین حدواسط های فلاونوئیدی واکنشی ممکن یا به شکل ترکیب اضافی هم یا به دام افتاده با استفاده از گلوتاتیون به عنوان یک جاذب رادیکال انجام شد (داده ها نشان داده نشده است). با این حال، ما قادر به جداسازی هیچ یک از ترکیب‌های افزایشی پیش‌بینی‌شده نبودیم که احتمالاً به دلیل بی‌ثباتی میانی فلاونوئیدی واکنشی و/یا ترکیب افزایشی هم/گلوتاتیون است. رفتار مشابهی در مورد میبفرادیل، یک داروی ضد فشار خون، که به دلیل تداخلات دارو/دارو از بازار خارج شده بود، مشاهده شد. اگرچه میبفرادیل باعث کاهش هم می شود، اما یک واسطه واکنشی ایجاد نشده است [40].

4. مواد و روش ها

4.1. مواد

در این مطالعه از چهار فلاونوئید (آکاستین، آپیژنین، کریزین و پینوسمبرین) استفاده شد (سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده). سیتوکروم های نوترکیب P{1}}A4 که با نیکوتین آمید-آدنین-دی نوکلئوتید فسفات (NADPH) ردوکتاز و سیتوکروم bs در اتوزوم ها بیان می شوند از Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) خریداری شدند.

بر اساس سنجش مونوکسید کربن سیتوکروم P450 [41]، محتوای آنزیم CYP3A4 که توسط سازنده اعلام شده، 1 uM تایید شد. گلوکز{5}فسفات (G6P)گلوکز{7}فسفات دهیدروژناز و نمک دی سدیم فسفات نینکوتین آمید-دی نوکلئوتید (NADP plus) از سیگما آلدریچ خریداری شد. پتاسیم فسفات (pa) و دی کلرومتان (pa) از Kemika dd (زاگرب، کرواسی)، اسید فرمیک (85 درصد، pa) از Semikem doo (سارایو، بوسنی و هرزگوین) و متانول مورد استفاده برای انحلال معرف از chro خریداری شد. Merck KGaA (دارمشتات، آلمان). در مخلوط های جوجه کشی و کروماتوگرافی از آب فوق خالص استفاده شد. برای تهیه بافر فسفات پتاسیم pH 7.85 از پتاسیم دی هیدروژن فسفات (Kemika dd) استفاده شد. pH با استفاده از هیدروکسید سدیم خریداری شده از Semikem doo Nifedipine (Sigma-Aldrich) تنظیم شد و نیفدیپین اکسید شده (اداره اروپا برای کیفیت داروها، فارمکوپه، ویرایش 10، استراسبورگ، فرانسه) در مطالعه فعالیت آنزیم باقیمانده نیز استفاده شد. سینتیک غیر فعال سازی تستوسترون (سیگما آلدریچ) و 6 -هیدروکسی تستوسترون (کیمن اروپا، تالین، استونی) برای سنجش در مهار شبه برگشت ناپذیر استفاده شد. ترولئاندومایسین و دیلتیازم از آژانس فرآورده‌های دارویی و تجهیزات پزشکی (زاگرب، کرواسی) تهیه شدند. پیریدین (pa) (Semikem doo)، هیمین گاوی (Sigma-Aldrich)، و دی متیل سولفوکسید (Semikem doo) در سنجش هموکروموپیریدین استفاده شد. هگزاسیانوفرات پتاسیم (زیگفرید AG، زوفینگن، سوئیس) در مطالعه مهار برگشت پذیر و شبه برگشت پذیر استفاده شد. سوپراکسید دیسموتاز (SOD) (Sigma-Aldrich)، کاتالاز (CAT) (Sigma-Aldrich)، و اسید هیدروکلریک (36 درصد، pa) (Semikem doo) در سنجش ویژگی اتصال استفاده شد. انکوباسیون آنزیمی در حمام آب (اینکولب، زاگرب، کرواسی) انجام شد. سنجش فعالیت آنزیم باقیمانده و سینتیک غیرفعال سازی فلاونوئید با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا همراه با تشخیص UV-Vis (HPLC UV-Vis، Agi-lent 1100، Agilent Technologies، Santa Clara، CA، USA) انجام شد. محاسبات فعالیت باقیمانده و پارامترهای سینتیک بازداری با استفاده از برنامه R (پروژه R برای محاسبات آماری، وین، اتریش) و مایکروسافت اکسل (مایکروسافت، ردموند، WA، ایالات متحده آمریکا) ساخته شد.

4.2.روش ها

4.2.1. تعیین سینتیک آنزیم و فعالیت باقیمانده

انکوباسیون آنزیمی در سه تکرار، با هم زدن مکانیکی در حمام آب در دمای 378 درجه سانتیگراد انجام شد. مقدار کمی از فلاونوئیدها با غلظت نهایی 1 میکرومولار در متانول حل شده، به لوله‌های شیشه‌ای منتقل شده و تا خشک شدن تبخیر شدند، مگر در نمونه‌های شاهد بدون بازدارنده (فلاونوئید). پس از تبخیر حلال، مخلوط جوجه کشی به حجم 10{38}} میکرولیتر، متشکل از 5 pmol آنزیم CYP3A4، بافر فسفات پتاسیم 50 میلی مولار (PH 7.4) و آب فوق خالص تهیه شد. یک سیستم تولید NADPH متشکل از 0.1 M G6P∶10mg/mL NADP به اضافه ∶1000 IU/mL G6PDH{15}}∶25∶1 (v/v/ø) بلافاصله قبل از استفاده آماده شد. این سیستم مولد حاوی گلوکز{18}فسفات دهیدروژناز است که NADP را به NADPH بازسازی می‌کند و غلظت کوآنزیم سیتوکروم P450 (NADPH) را در انکوباسیون ثابت نگه می‌دارد. افزودن سیستم مولد (15 درصد حجم در انکوباسیون نهایی، v/ø) واکنش را آغاز کرد. نیفدیپین برای آزمایش فعالیت آنزیم باقیمانده در غلظت نهایی 200 میکرومولار استفاده شد. واکنش با استفاده از 1 میلی لیتر محلول یخ سرد 1 درصد اسید فرمیک در دی کلرومتان متوقف شد. نمونه ها مخلوط شدند، سپس به مدت 10 دقیقه روی 1900 گرم سانتریفیوژ شدند (Rotofix32، Westfalia، آلمان). پس از سانتریفیوژ، دو لایه تشکیل شد (آب و لایه آلی). میکرومتر، Agilent Technologies، سانتا کلارا، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) برای آنالیز نمونه ها با HPLC استفاده شد. فاز متحرک از متانول و آب به نسبت 64:36 تشکیل شده بود. تجزیه و تحلیل ایزوکراتیک بود. جریان در 1.0 میلی لیتر تنظیم شد. Min{39}} حجم تزریق 10 میکرولیتر تعیین شد، نیفدیپین به عنوان سوبسترای نشانگر استفاده شد، واکنش مشاهده شده اکسیداسیون نیفدیپین بود، کروماتوگرام در طول موج 254 نانومتر ثبت شد و مدت زمان آنالیز 25 دقیقه تعیین شد. زمان ماند نیفدیپین 7.1 دقیقه و نیفدیپین اکسید شده 10.8 دقیقه است [42]. در هر دو مورد، مقدار محصول به دست آمده به عنوان مقدار سطح زیر منحنی (AUC) نسبت به نمونه شاهد مشاهده شد. تمام فلاونوئیدها، نیمه حداکثر غلظت بازدارنده (IC5)، ثابت بازداری (K؛)، ثابت سرعت غیرفعال سازی (Kinect)، و اثربخشی غیرفعال سازی (Kinect/K؛) تعیین شد. ترولئاندومایسین به عنوان یک کنترل مثبت - مهارکننده غیرقابل برگشت سیتوکروم P{50}} غلظت A4.25 میکرومولار ترولئاندومایسین باعث کاهش فعالیت آنزیم به 5±35 درصد شد.

4.2.2. سنجش هموکروموپریدین

سنجش هموکروموپیریدین برای ارزیابی تخریب احتمالی هم توسط شکل میانی واکنشی در چرخه سیتوکروم P45{3}} مورد استفاده قرار گرفت و طبق روشی که توسط Flink و Watson [43] و Paul et al. [44]، با برخی اصلاحات. منحنی کالیبراسیون با استفاده از هیمین محلول در دی متیل سولفوکسید (0.6 تا 0.1 میکرومولار) ایجاد شد. طیف در طول موج 500 تا 600 نانومتر ثبت شد. مخلوط جوجه کشی با مهارکننده‌های 25 میکرومولار (فلاونوئید) به حجم 200 میکرولیتر تهیه شد. واکنش با افزودن یک سیستم تولید NADPH آغاز شد (برای ترکیب، بخش 4.2.1 را ببینید)، و انکوباسیون 30 دقیقه به طول انجامید. واکنش متوقف شد. پس از نیم ساعت با افزودن پیریدین (غلظت نهایی 0.83 مولار) و هیدروکسید سدیم (غلظت نهایی 0.06 مولار) نمونه ها در مدت 1 دقیقه روی دستگاه اسپکتروفتومتر (UV{19}} Shimadzu Corporation، کیوتو، ژاپن) ثبت شدند. اضافه کردن محلول قلیایی به دلیل ناپایداری هموکروموژن پیریدین در شرایط پایه [44]. غلظت هم در نمونه ها بر اساس منحنی کالیبراسیون تهیه شده محاسبه شد. سوپراکسید دیسموتاز (5 واحد بین المللی) در t مخلوط جوجه کشی برای جلوگیری از تولید پراکسید هیدروژن از طریق چرخه کاتالیزوری بیهوده.

4.2.3. سنجش مهار شبه برگشت ناپذیر

هدف این مقاله آزمایش تشکیل کمپلکس های کووالانسی با آهن آهن (Fe2 plus)، با ارزیابی بازیابی فعالیت آنزیم پس از دیالیز با یا بدون افزودن یک اکسیدان است. سه نوع آزمایش برای هر فلاونوئید انجام شد: مخلوط جوجه کشی بدون فلاونوئید (شاهد)، مخلوط جوجه کشی با فلاونوئید و مخلوط جوجه کشی با فلاونوئید که اکسیدان پس از انکوباسیون به آن اضافه شد. هر انکوباسیون با بازدارنده به مدت 30 دقیقه با استفاده از همان تنظیمات تجربی که در بالا توضیح داده شد (بخش 4.2.1) انجام شد. پس از انکوباسیون، نمونه ها به کارتریج های دیالیز منتقل شدند. اکسیدان Aa - محلول 20 میلی مولار هگزاسیانوفرات پتاسیم قبل از دیالیز به یکی از انکوباسیون ها اضافه شد [45]. کاست ها (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) به مدت 30 دقیقه در محلول بافر فسفات پتاسیم 50 میلی مولار (pH7.4) غوطه ور شدند (محلول دیالیز سه بار تعویض شد). پس از دیالیز، نمونه ها از کاست به لوله شیشه ای منتقل شدند و فعالیت آنزیم باقیمانده با استفاده از تستوسترون به عنوان سوبسترای نشانگر (غلظت نهایی 200 میکرومولار) ارزیابی شد. از آنجایی که سیستم تولید کننده NADPH نیز دیالیز شد، مجدداً برای شروع واکنش های آنزیمی به انکوباسیون ها اضافه شد. نمونه ها به مدت 30 دقیقه با همان تنظیمات (شرح شده در بخش 4.2.1) انکوبه شدند. واکنش با افزودن محلول سرد یخی اسید فرمیک در دی کلرومتان خاتمه یافت. نمونه ها با HPLC آنالیز شدند. دیلتیازم، یک مهارکننده کاذب برگشت ناپذیر شناخته شده سیتوکروم P{20}}A4، به عنوان یک کنترل مثبت برای ارزیابی اکسیداسیون به فرم آهن مورد استفاده قرار گرفت (بازیابی کامل فعالیت آنزیمی مشاهده شد).

4.2.4. پردازش نتایج

برای ارزیابی اهمیت آماری تفاوت‌های بین نمونه‌ها و کنترل‌ها، بر اساس اندازه‌گیری فعالیت باقیمانده، از آزمون t یک طرفه استفاده می‌شود. برای محاسبه مقدار IC50 از یک معادله غیر خطی استفاده شد. برای تعیین ثابت غیرفعال سازی و نرخ غیرفعال سازی بازدارنده از معادله Michaelis-Menten استفاده شد. پردازش آماری و آماده‌سازی نمودار با استفاده از برنامه R (پروژه R برای محاسبات آماری، وین، اتریش) و مایکروسافت اکسل (Microsoft، Redmond، WA، USA) انجام شد.

5. نتیجه گیری ها

آکاستین، آپیژنین، کریزین و پینوسمبرین فعالیت آنزیم CYP3A4 را در شرایط آزمایشگاهی مهار می کنند. Chrysin قوی ترین مهار کننده آنزیم است، با کمترین IC50، K. مقادیر کینکت و بالاترین اثر غیرفعال سازی. تمام فلاونوئیدها غلظت هِم آنزیم را کاهش می دهند و تأیید می کنند که این یک مهار غیرقابل برگشت توسط واسطه واکنشی است که با افزودن SOD و CAT نمی توان از آن جلوگیری کرد. هیچ یک از فلاونوئیدهای آزمایش شده به عنوان مهار کننده های برگشت پذیر یا شبه برگشت ناپذیر آنزیم CYP3A4 در غلظت 25 میکرومولار عمل نمی کنند، زیرا فعالیت آنزیم را نمی توان با دیالیز با و بدون افزودن هگزاسیانوفرات پتاسیم بازیابی کرد. از آنجایی که این فلاونوئیدها را می توان به وفور در غذاهای مختلف مانند میوه ها، سبزیجات، ادویه ها، چای و شراب قرمز یافت، این احتمال وجود دارد که با بیگانه بیوتیک های مختلف که سوبستراهای CYP3A4 هستند تداخل داشته باشند. مطالعات بیشتری در داخل بدن برای بررسی کامل احتمالات چنین تداخلات غذا و دارو، و همچنین سهم احتمالی دیگر آنزیم‌ها و ناقل‌ها در فعل و انفعالات مورد نیاز است.

این مقاله از Molecules 2021, 26, 3018 استخراج شده است