محافظت از روده توسط پروآنتوسیانیدین ها شامل اقدامات ضد اکسیداتیو و ضد التهابی در ارتباط با بهبود حساسیت به انسولین، لیپید و هموستاز گلوکز است. قسمت 2

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

بیان Tein با استفاده از وسترن بلات. شکل 6 نشان می‌دهد که افزودن Fe/Asc به سلول‌های Caco{1}}/15 سطح دو آنزیم مهم را افزایش می‌دهد، اما PACs تنظیم دگرگونی ناشی از Fe/Asc آنها را متعادل می‌کند.

از آنجایی که سیگنال دهی انسولین فرآیندهای لیپوژنز، اکسیداسیون FA و گلوکونئوژنز را تعدیل می کند، بررسی تأثیر Fe/Asc و PACs بر MAPKs و PI3K/Akt، دو مسیر اصلی سیگنال دهی انسولین، مهم بود. برای این منظور، سلول های Caco-2/15 قبل از سایر سلول های Caco-2/15 با انسولین از قبل انکوبه شدند.

شکل 6. اثرات PACs بر گلوکوژنز در سلول های Caco-2/15. پروآنتوسیانیدین ها (PACs، 250 ug/mL) به مدت 24 ساعت قبل از درمان با Fe/Asc (200μM/2mM) به مدت 6 ساعت در دمای 37 درجه به محفظه سلول آپیکال اضافه شدند. بیان پروتئین (A) G6Pase و (B) PEPCK توسط وسترن بلات ارزیابی شد.پودر سیستانچنتایج نشان‌دهنده میانگین ± SEM 3 آزمایش مستقل، هر کدام در سه تکرار است. یک وسترن بلات نماینده نشان داده شده است، که آزمایشی را در سه تکرار روی همان ژل و در همان نوردهی نشان می‌دهد.*P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">ریشه سیستانچG6Pase گلوکز-6-فسفاتاز، PEPCK فسفونولپیروات کربوکسی کیناز.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

درمان به منظور فعال کردن مسیر سیگنالینگ. در حالی که Fe/Asc p{0}}بیان پروتئین MAPK و نسبت فسفو p38-MAPK/p38-MAPK را افزایش داد، PACها از این اقدامات جلوگیری کردند (شکل 7A-C). از طرف دیگر، در حالی که Fe/Asc توده پروتئین فسفو Akt (pAkt) و نسبت Akt/Akt را کاهش داد، PACها توانایی حفظ سطح طبیعی خود را نشان دادند. روند مشابهی برای PI3K (شکل 7D-I) مشاهده شد. بنابراین، این مشاهدات از نقش مطلوب PAC ها در سیگنال دهی انسولین حمایت می کنند.

بحث

پلی فنول ها به دلیل اثرات بیولوژیکی و دارویی پلیوتروپیک خود به خوبی شناخته شده اند، که جذابیت بسیاری از دانشمندان و صنایع غذایی را به این محصولات طبیعی شگفت انگیز مشتق شده از گیاه توضیح می دهد. PAC ها از تنوع و تعداد بالای پلی فنل ها به دلیل تأثیرات دارویی و درمانی آنها بر اختلالات مزمن 2021 متمایز هستند. علیرغم ویژگی‌های ستودنی آنها، هنوز چیزهای زیادی در مورد تأثیر آنها بر دستگاه گوارش ناشناخته باقی مانده است، که شبکه‌های گوارشی، ایمونولوژیک، عصبی و متاژنومیکس گسترده را به کار می‌گیرد.خواب سیستانچیبه همین دلیل، در تحقیق حاضر تلاش هایی برای روشن کردن نقش PAC ها در OxS روده، دفاع آنتی اکسیدانی، التهاب، اکسیداسیون FA، لیپوژنز، و گلوکونئوژنز اختصاص داده شده است، در حالی که در عین حال تلاش می شود مکانیسم های اساسی مانند سیگنال دهی انسولین را روشن کند. و وضعیت فاکتورهای رونویسی

برای بررسی اثرات PAC، ما از رده سلولی Caco-2/15 استفاده کردیم، یک مدل روده محبوب که عمدتاً توسط جامعه علمی مورد استقبال قرار گرفته است و توسط سازمان غذا و دارو برای فرآیندهای جذب و حمل و نقل به رسمیت شناخته شده است. نه تنها سلول‌های Caco{4}}/15 به‌طور خودبه‌خود به انتروسیت‌های انسان از نظر عملکردی و مورفولوژیکی مشابه تمایز می‌یابند، بلکه برای کاوش مؤثر در جذب روده و تعاملات، تغذیه، سم‌شناسی، میکروبیولوژی مواد غذایی، آزمایش‌های فراهمی زیستی و غربالگری مفید هستند. نفوذپذیری دارو در برنامه کشف 2²627. همانطور که در گزارش‌های قبلی ما در مورد موضوعات مختلف{10}}】، رده سلولی Caco-2/15 در مطالعه کنونی برای کشف پتانسیل PACها برای تنظیم مسیرهای متابولیک متنوع نقش مهمی داشته است. نکته مهم این است که در این مطالعه، سلول‌ها روی فیلترهای متخلخل کاشته شدند و امکان دسترسی به هر دو طرف اپیتلیوم روده دوقطبی را فراهم می‌کردند: محفظه‌های آپیکال و قاعده‌ای که به ترتیب مربوط به لومن روده یا گردش خون سروزی هستند. /15 سلول با Fe/Asc، زیرا این سیستم برای القای OxS و التهاب قوی در آزمایشگاه ما بسیار مرتبط بود، که به نوبه خود توسط طیف وسیعی از عوامل موثر به چالش کشیده شد،{17}} قابل توجه، Fe/Asc به عنوان یک اکسیژن قوی -سیستم مولد رادیکال باعث آسیب اکسیداتیو به ماکرومولکول های بیولوژیکی می شود، محیط ردوکس داخل سلولی را تغییر می دهد و در بسیاری از حالت های پاتولوژیک درگیر می شود. بیان پروتئین SOD2).مزایای cistanche tubulosaعلاوه بر این، به دلیل توانایی خود در تولید پراکسیدهای لیپیدی، کمپلکس Fe/Asc باعث التهاب می شود، همانطور که با افزایش بیان TNFa، COX2 و NF-is مشهود است. در مجموع، نتایج حاضر تولید رادیکال و التهابی را در پاسخ به Fe/Asc تایید می‌کند

حضور PACs با پراکسیداسیون لیپیدی با واسطه Fe/Asc مقابله کرد. از آنجایی که شکست دفاع آنتی اکسیدانی می تواند القای OCS را توضیح دهد، ما عملکرد آن را بر روی آنزیم های آنتی اکسیدانی درون زا بررسی کردیم. در واقع، PAC ها توانستند کاهش SOD2 و GPx با واسطه Fe/Asc را بازیابی کنند. برای تشریح مکانیسم تشدید OxS توسط Fe/Asc و کاهش توسط PACs، ما مسیر سیگنالینگ عنصر پاسخ آنتی اکسیدانی Keap1-NRF2-(ARE) را ارزیابی کردیم که قوی‌ترین آنتی‌اکسیدان درون‌زا در نظر گرفته می‌شود. تنظیم کننده 37.چای سیستانچNRF2 یک حسگر OCS سلولی است که وظیفه آن حفظ هموستاز ردوکس است. در شرایط عادی. NRF2 به طور مداوم توسط تنظیم کننده باند منفی Keap18 مورد هدف تخریب پروتئازومی قرار می گیرد. در حضور عوامل درون زا و برون زا، Keapl غیرفعال و تنظیم می شود، در نتیجه تعامل Keapl-NRF2 مختل می شود و NRF2 آزاد می شود که به هسته سلول منتقل می شود و به پروموترهای حاوی متصل می شود.

شکل 7. اثرات PAC ها بر حساسیت به انسولین در رده سلولی Caco-2/15. پروآنتوسیانیدین ها (PACs، 250 ug/mL) به مدت 24 ساعت قبل از درمان با Fe/Asc (200μM/2mM) به مدت 6 ساعت در دمای 37 درجه به محفظه سلول آپیکال اضافه شدند. دو ساعت قبل از پایان انکوباسیون 6 ساعته با مخلوط Fe/Asc، انسولین (100 نانومولار) برای ارزیابی حساسیت به انسولین اضافه شد. بیان پروتئین (A) p38-MAPK، (B) فسفر p38-}MAPK، (D)Akt، (E) فسفو Akt، (G) PI3k، و (H) فسفو PI3k بود توسط وسترن بلات ارزیابی شده است. سپس نسبت‌های (C) فسفو p38-MAPK/p{17}}MAPK، (F) فسفو Akt/Akt، و (Dphospho PI3k/PI3k) محاسبه شد. نتایج نشان‌دهنده میانگین±SEM 3 آزمایش مستقل است. هر کدام در دو نسخه یک وسترن بلات نشان داده شده است که آزمایشی را در سه تکرار روی ژل مشابه و با نوردهی یکسان نشان می دهد.*P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE، و رونویسی آنزیم های آنتی اکسیدان را تسریع می کند39. طبق داده‌های ما، درمان سلول‌های Caco-2/15 با PACs، Keapl را سرکوب کرد و احتمالاً به NRF2 اجازه داد تا به هسته منتقل شود و اجازه اتصال به ARE (توالی هسته: 5'TGACnnnGC3') در ناحیه پروموتور ژن‌های آنتی‌اکسیدان را بدهد. (SOD2 و GPx)، که منجر به تحریک رونویسی و تنظیم هماهنگ آنها می شود. مطابق با این داده‌ها، ترکیب فنلی رزوراترول از OxS در سینوویوسیت‌های فیبروبلاست مانند آرتریت روماتوئید تحت درمان با H، O با ترویج بیان NRF2 و کاهش بیان Keap12 جلوگیری کرد. علاوه بر این، طبق گفته کانزاکی و همکاران، فعال شدن آنزیم های آنتی اکسیدانی و محافظ سلولی می تواند با نسبت NRF2/Keapl 1 مرتبط باشد.

همانطور که از بهبود OCS انتظار می رفت، PAC ها به طور قابل توجهی التهاب را کاهش دادند همانطور که با کاهش TNFa و COX2 مشهود است. از آنجایی که NF-KB یک تنظیم کننده کلیدی سیتوکین های پیش التهابی است، ما پاسخ آن را به PAC ها بررسی کردیم. در راستای روند عوامل التهابی، PAC ها القای NF-KB با واسطه Fe/Asc را لغو کردند و نسبت NF-KB/IikB را کاهش دادند. بنابراین، ممکن است منطقی فرض کنیم که PAC ها از طریق کنترل NF-kB، تنظیم کننده اصلی پاسخ التهابی، در برابر التهابی که عملکرد سلول های روده را به خطر می اندازد، محافظت می کند. شایان ذکر است که PAC ها ممکن است با تحریک مکانیسم های دفاعی آنتی اکسیدانی سلولی از التهاب محافظت کنند زیرا یک رابطه نزدیک بین بیومارکرهای عدم تعادل ردوکس و التهاب وجود دارد.

مطالعه حاضر با هدف بررسی اثرات Pac بر هموستاز لیپید روده انجام شد. یافته‌های جالب ما نشان داد که PAC‌ها از یک طرف CPTla را تنظیم می‌کنند و FAS را کاهش می‌دهند که به ترتیب نشانگرهای زیستی اکسیداسیون FA و لیپوژنز را نشان می‌دهند. بنابراین، این آنزیم ها اهداف بالقوه PACs هستند که نشان دهنده پتانسیل پلی فنولی برای جلوگیری از تجمع لیپید است که یک تظاهرات پاتولوژیک التهاب OxSand در بسیاری از بافت ها محسوب می شود. مکانیسم‌های مولکولی احتمالاً به تنظیم مثبت PPARa و کاهش SREBPlc، دو فاکتور رونویسی که متابولیسم لیپید را تنظیم می‌کنند، مرتبط هستند. FAS آنزیم مرکزی در لیپوژنز است که مسئول کاتالیز کردن تبدیل مالونیل-CoA به FAs45 است. از طرفی، ACC تشکیل مالونیل-CoA را کاتالیز می کند، یک بستر ضروری برای FAS. مطابق با یافته‌های ما، پلی‌فنول‌های Solanum nigrum همچنین FAS و SREBPs را کاهش می‌دهند، در حالی که CPTla و PPARa را در سلول‌های کبدی تیمار شده با اسید اولئیک افزایش می‌دهند.

مکانیسم های اعمال پلی فنل ها به طور کلی با فعال شدن فسفوریلاسیون AMPKa مرتبط است. نکته مهم این است که AMPKa فسفریله شده در مطالعه ما توسط Fe/Asc کاهش یافت، اما توسط PACs تحریک شد، که تنظیم پایین فسفو ACC را توضیح می‌دهد و در نتیجه باعث مهار لیپوژنز و افزایش متابولیسم انرژی می‌شود. با این حال، بیان پروتئین AMPKa توسط OxS ناشی از Fe/Asc در سلول‌های Caco2/15 افزایش یافت. بر این اساس، ROS و OxS ممکن است AMPKa را از طریق کینازهای بالادستی مختلف القا کنند.

OCS و التهاب به شدت مقاومت به انسولین و اختلالات متابولیکی اضافی را القا می کنند، که ما را بر آن داشت تا ظرفیت Pac را برای تنظیم برخی پروتئین های کلیدی نسبت به مسیر سیگنالینگ انسولین ارزیابی کنیم. ما ابتدا روی p38-MAPK متمرکز شدیم که بیان آن توسط OxS تنظیم مثبت شد در حالی که با آبشار سیگنال دهی گیرنده انسولین تداخل داشت. هم تجزیه و تحلیل p{3}}MAPK فسفوریلاسیون و هم محاسبه نسبت فسفو p38-MAPK/p38-MAPK افزایش قابل توجهی در پاسخ به Fe/Asc نشان داد که با IS مختل شده در Caco سازگار است. {6}}/15 سلول. اعتبار سنجی با کاهش pAkt و PI3K به دست آمد. در مقابل، PAC ها روند را معکوس کردند زیرا توانایی کاهش فسفوریلاسیون p38-MAPK و نسبت فسفو p{10}}MAPK/p{11}}در حالی که مسیر سیگنالینگ PI3K/Akt را افزایش می‌دادند، را نشان دادند. شناخته شده است که با تنظیم انتقال گلوکز، سنتز پروتئین، تکثیر سلولی، بقای سلولی و گلوکونئوژنز، فعالیت های بیولوژیکی اصلی انسولین را واسطه می کند. اختلال در IS ناشی از OxS و التهاب مزمن نیز می تواند بر روند گلوکونئوژنز تأثیر بگذارد 3،54. تجزیه و تحلیل دو آنزیم اصلی درگیر در سنتز گلوکز جدید (PEPCK، G6Pase) افزایش قابل توجهی در پاسخ به Fe/Asc نشان داد در حالی که تجویز PACs آنها را به سطوح طبیعی در سلول‌های Caco2/15 بازگرداند.

در نتیجه، مطالعات متعدد در متون علمی اثرات بهداشتی قابل توجهی از ترکیبات فنلی را به عنوان یک مولکول فنلی خاص یا مخلوطی از چندین پلی فنل با شواهد غیرمستقیم نشان می‌دهند. کار حاضر به تأثیر مهم PACs (فلاوانول‌های پیچیده) در هموستاز روده با جلوگیری از OxS، التهاب و اختلالات متابولیک مرتبط اشاره می‌کند. از آنجایی که PAC ها ممکن است به طور کامل توسط روده باریک جذب نشوند، مطالعات بیشتری برای بررسی مکانیسم های دخیل در اثرات مفید سلامتی آنها در روده کوچک مورد نیاز است.

مواد و روش ها

کشت و درمان سلولی Caco{0}}/15 روده. برای همه آزمایش‌ها، از رده سلولی آدنوکارسینوم کولورکتال اپیتلیال انسان Caco-2/15، یک کلون پایدار از سلول‌های کاکو{4}} استفاده کردیم (مجموعه کشت نوع آمریکایی، Rockville، Md.، ایالات متحده)، که از دکتر JF Beaulieu (گروه زیست شناسی سلولی، دانشکده پزشکی، دانشگاه د شربروک، شربروک، کبک، کانادا) به دست آمد. رده سلولی Caco{5}}/15 دارای خاصیت منحصربه‌فردی است که در شرایط آزمایشگاهی به انتروسیت‌های بالغ پلاریزه تمایز می‌یابد و یک مون-اور غیرقابل نفوذ را تشکیل می‌دهد. سلول های Caco{8}}/15 همانطور که قبلا توضیح داده شد323455 کشت داده شدند و برای مطالعه یکپارچگی سلولی، OCS و التهاب17،19 و IS56 مورد استفاده قرار گرفتند.

تجزیه و تحلیل بیان پروتئین با ایمونوبلات پس از انکوباسیون با تیمارهای مختلف، سلول‌های Caco{0}}/15 در بافر سرد یخی حاوی 20 میلی‌مولار Tris-HCl (pH 7.4)، 150 میلی‌مولار NaCl، 1 میلی‌مولار Na2E-DTA، 1 میلی‌مولار EGTA، 1 درصد NP لیز شدند. -40، 1 درصد دئوکسی کولات، 2.5 میلی‌مولار سدیم پیروفسفات، 1 میلی‌مولار Na2VO4، 1 میکروگرم در میلی‌لیتر لوپپتین، و 1 میلی‌مولار PMSF. غلظت پروتئین هر نمونه با استفاده از روش برادفورد (Bio-Rad) تعیین شد. سپس پروتئین ها به مدت 5 دقیقه در بافر نمونه حاوی SDS و β-مرکاپتواتانول دناتوره شدند. هموژن های حاوی 15 میکروگرم پروتئین کل بر روی ژل 10 درصد SDS-پلی آکریل آمید بر اساس وزن مولکولی پروتئین جدا شده و بر روی غشاهای نیتروسلولزی الکتروبلات شدند. قبل از افزودن آنتی‌بادی‌های اولیه در طول شب در دمای 4 درجه، از شیر بدون چربی برای مسدود کردن مکان‌های غیر اختصاصی غشاها استفاده شد. رقیق شدن آنتی بادی ها در اطلاعات تکمیلی و در انتشار اخیر ما گزارش شده است. باندهای واکنشی با استفاده از سیستم تصویربرداری ChemiDoc MP (Bio-Rad) گرفته شدند. تمام داده ها به صورت نسبت پروتئین هدف به -اکتین در همان نمونه بیان می شوند.

تحلیل آماری. همه مقادیر به عنوان میانگین ± SEM حداقل سه آزمایش مختلف انجام شده در سه تکرار بیان می شوند. داده ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و سپس آزمون های مقایسه چندگانه توکی با استفاده از PRISM 7 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. تفاوت ها در P معنی دار در نظر گرفته شد<>

این مقاله از Scientifc Reports|استخراج شده است (2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5