چگونه تنوع ژنتیکی هربا سیستانچ ها را مطالعه کنیم؟

بررسی تنوع ژنتیکی گیاه هربا سیستانچ توسط RAPD

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

کوی گوانگگونگ، چن مین، هوانگ لوکی*، شیائو سوپینگ، لی دا

(موسسه ماتریا مدیکا چینی، آکادمی پزشکی چینی، پکن 100700)

خلاصه

هدف:برای مطالعه جمعیتتنوع ژنتیکیازCistanche deserticolaوCistanche tubulosa.

مواد و روش ها:دو جمعیت وحشی ازCistanche deserticolaو چهار جمعیت وحشی ازCistanche tubulosaتوسط RAPD تجزیه و تحلیل شدندتنوع ژنتیکیجمعيت ها با نرم افزار نسخه 1.31 POPGENE آناليز شدند.

نتایج:میانگین درصد جایگاه های چندشکلی ازCistanche deserticola47.37 درصد، جایگاه چندشکلی دو جمعیت 39.47 درصد و 35.53 درصد و میانگین تنوع ژنی Nei 0 بود.135 8. s شانون بیشتر بود. شاخص اطلاعات وضعیت 0 است.207 2 و ضریب تمایز ژن Gst {{1{{20}}}} است.254 6. میانگین درصد جایگاه‌های چندشکل در سیستانچه 59/27 درصد و درصد جایگاه‌های چندشکل در هر جمعیت از 54/19 درصد تا 29/25 درصد متغیر بود که از این میان جمعیت اندیر بیشترین 29/25 درصد و میانگین تنوع ژنی Nei 0 بود. {21}}، شاخص اطلاعات چندشکلی شانون 0.1258 است، ضریب تمایز ژن Gst =0.175 5.

نتیجه:Cistanche deserticolaوCistanche tubulosaدارای تمایز خاصی در بین جمعیت ها هستند. راتنوع ژنتیکیسیستانچ بیابانی به طور قابل توجهی بالاتر از سیستانچ توبولوزا بوده و به دو اکوتیپ متمایز شده است.

واژه‌های کلیدی: سیستانچ کویر; Cistanche tubulosa; RAPD; تنوع ژنتیکی

[شماره طبقه‌بندی کتابخانه چینی] S 567 [کد شناسایی سند] A [شماره مقاله] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

سیستانچ گیاهی انگلی از تیره سیستانچه از خانواده لیداناسه است که با نام دایون نیز شناخته می شود که یک ماده دارویی گرانبهای چینی است. منشا اصلی گیاهان Cistanche deserticola در کشور من می باشدCistanche deserticolaYCMa و C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. گیاهان میزبان بیابان Cistanche عبارتند از Haloxylon ammodendron و Haloxylon ammodendron که عمدتاً در لیگ آلاشان در مغولستان داخلی، شمال سین ​​کیانگ، چینگهای، گانسو و جاهای دیگر توزیع می شوند. پراکنش Cistanche deserticola مانند گیاهان میزبان است. در کشور من، سیستانچ سیستانچ فقط در شهرستان‌های اطراف صحرای تکلیماکان در جنوب کوه‌های تیانشان در سین‌کیانگ توزیع می‌شود و توزیع آن کاملاً با تاماریکس میزبان هماهنگ نیست. مناطق دیگر مانند شمال سین ​​کیانگ، گانسو، چینگهای، نینگشیا، مغولستان داخلی، شانشی و سایر مکان‌های گیاه تاماریکس، توبولای سیستانچی انگلی نیستند[2]. با توجه به افزایش سریع تقاضا برای سیستانچ در سال های اخیر و در نتیجه انقراض منابع آن، منابع سیستانچ وحشی تنها به چند منطقه اصلی تولید کاهش یافته است. هر دو به عنوان گونه های گیاهی حفاظت شده در خطر انقراض در کشور من فهرست شده اند [3] که از جمله آنهاستCistanche deserticolaدر ضمیمه II CITES [4] گنجانده شده است.

پس از چندین سال تحقیق، تحقیقات در زمینه پرورش مصنوعی سیستانچ موفق بوده و در مرحله ترویج و کاشت گسترده است. با این حال، چگونگی جلوگیری از کاهش گونه سیستانچ در طول تولید صنعتی، چگونگی احیای جمعیت محدود وحشی در اسرع وقت، و حفظ منابع ارزشمند ژرم پلاسم وحشی، کلید دستیابی به استفاده پایدار از آن است. در مورد میراث حفاظت شده سیستانچ [تاریخ دریافت]، 2004-03-11 [پروژه صندوق] وزارت علوم و فناوری پروژه رفاه اجتماعی (2001.109); پروژه "برنامه پنج ساله دهم" وزارت علوم و فناوری (2001BA701A09a) [نویسنده مسئول] * Huang Luqi، تلفن:( 010) 64014411-2955، پست الکترونیکی: huangluqi @263.net مطالعه انتقال هنوز ادامه دارد جای خالی. این مطالعه از فناوری RAPD برای مطالعه 2 جمعیت وحشی استفاده می کندCistanche deserticolaو 4 جمعیت وحشی ازCistanche tubulosa، و تجزیه و تحلیل هر دو تفاوت درتنوع ژنتیکیانتظار می رود که یک پایه ژنتیکی تجربی مهم برای محافظت از سیستانچ، یک داروی با ارزش چینی، فراهم کند.

سیستانچ

1. مواد و روش ها

1.1 مواد

Cistanche deserticolaاز شهرستان جیمسار در سین کیانگ و منطقه جیلانتای لیگ باستانی آلکسا در مغولستان داخلی جمع آوری شد. جمعیت سیستانچ از شهرستان Minfeng و Yutian شهرستان، سین کیانگ جمع آوری شد. شهرستان مین فنگ در حال حاضر منطقه ای است که بیشترین عملکرد سیستانچ سیستانچ را دارد و دارای بیشترین تراکم و جوامع نسبتا کامل جنگل های طبیعی است. نقاط نمونه برداری اندیل، ساووزک، یاتونگوز و داهیان شهرستان یوتیان مناطق اصلی تولید هستند که در رودخانه اندیر، رودخانه ییکه، رودخانه یاتونگوزی و کلانیا در پایین دست رودخانه، فاصله بین جمعیت ها بیش از 50 کیلومتر. هر جمعیت به طور تصادفی از 19-30 نفر نمونه برداری کردند. نمونه ها به سرعت در ژل سیلیکا خشک شدند و برای استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفتند (جدول 1).

جدول 1 نمونه برداری از جمعیت و مناطق تولیدی Cistanche deserticola و Cistanche tubulosa

1.2 استخراج DNA

روش استخراج DNA کل از روش نمک بالا و pH پایین استفاده می کند [5]. نمونه DNA تحت اسپکتروفتومتر برای تشخیص غلظت الگوی DNA قرار گرفت، سپس الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد، رنگ‌آمیزی EB، مشاهده و عکاسی تحت نور ماوراء بنفش، DNA الکتروفورز با نوارهای شفاف و باطله کمتر برای آنالیز RAPD استفاده شد.

1.3 غربالگری پرایمرهای RAPD

از آنجایی که آزمایش نشان داد که پرایمر یکسان اثر رضایت بخشی بر تقویت همزمان هر دو دارد.Cistanche deserticolaو Cistanche tubulosa، پرایمرها به طور مستقل غربال شدند. 150 پرایمر تصادفی (10 جفت باز)، سیستم واکنش 25 میکرولیتری شانگهای Shenggong Biotechnology Co., Ltd. برای تقویت و غربالگری استفاده شد. هر آغازگر از 2 الگوی جمعیتی و 1 آب مقطر استریل شده به عنوان شاهد بلانک استفاده کرد و 10 آغازگر برای تقویت گیاه سیستانش دسرتیکولا با نوارهای شفاف، چندشکلی قوی و تکرارپذیری خوب به دست آورد: S490، S{7}}، S{{{{ 8}}، S1 137، S1 165، S{11}}، S{12}}، S2 015، S2 112، S{15 }} 10 پرایمر ازCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 تقویت PCR و تشخیص محصول

پرایمرهای انتخاب شده برای تکثیر DNA الگو استفاده شدCistanche deserticolaوCistanche tubulosaتوسط PCR DNA ژنومی با توجه به غلظت اندازه گیری شده به عنوان یک الگو به 5{11}} ng·μL -1 رقیق شد. حجم کل واکنش 25 میکرولیتر است که 1{37}} × بافر PCR 2.5 میکرولیتر، Mg2 به اضافه 1.5 میکرولیتر، Taq (5 U·μL -1) 0.2 میکرولیتر، مخلوط dNTP (هر 2.5 میلی مولار) 1 میکرولیتر، 5 میکرومولار پرایمر 1 میکرولیتر، DNA الگو 1 میکرولیتر، آب مقطر دوبل استریل شده 18.8 میکرولیتر، محلول تقویت PCR فوق محصول شانگهای سانگون است. تقویت بر روی یک سیکلر حرارتی PTC{22}} انجام شد. برنامه تقویت 94 درجه پیش دناتوراسیون به مدت 5 دقیقه و سپس 40 سیکل بود. هر چرخه شامل 94 درجه 45 ثانیه، 34 درجه و 1 دقیقه، 72 درجه و 1 دقیقه و 30 ثانیه و در نهایت در 72 درجه به مدت 5 دقیقه تمدید می شود. محصولات تکثیر شده بر روی ژل آگارز 0/2 درصد (حاوی EB) در بافر 1×TAE الکتروفورز شدند و تحت سیستم تصویربرداری ژل SYNGENE مشاهده و عکسبرداری شدند.

1.5 آمار و تجزیه و تحلیل داده ها

در طیف الکتروفورز، موقعیت مربوطه محصول واکنش بر روی ژل با توجه به استاندارد وزن مولکولی مقایسه شده و وزن مولکولی محصول تقویت شده تخمین زده می شود. باند با باند به عنوان 1 و باند بدون باند به عنوان 0 ثبت می شود، یک نمودار ماتریس 0/1 را تشکیل می دهد و با استفاده از POPGENE32 برای محاسبه درصد سایت های چندشکلی به رایانه وارد می شود. (PPL) هر جمعیت، شاخص تنوع ژنی Nei (H)، شاخص اطلاعات چندشکلی شانون (I)، ضریب تمایز ژن (Gst)، تنوع ژنی (Ht)،تنوع ژنتیکی(Hs)، هویت ژنتیکی Nei (1978) (I) و فاصله ژنتیکی (D) در یک جمعیت و تجزیه خوشه‌ای با استفاده از روش UPGMA انجام شد.

2. نتایج و تجزیه و تحلیل

2.1 تنوع ژنتیکی Cistanche

همه نمونه ها نوارهایی با وزن مولکولی در بازه 200 تا 2 200 جفت باز به دست آوردند (شکل 1، 2). در مجموع 76 جایگاه در 60 نمونه از 2 جمعیت شناسایی شدCistanche deserticola، 36 مورد از آنها جایگاه چندشکلی بودند که 47.37 درصد را تشکیل می دادند، H=0.135 8، I=0.207 2. در این میان، PPL جیمسار 39.47 درصد و Gilanty's 35.53 درصد است. H 0 است. 0 95 3 و 0.1 070 به ترتیب، و من 0 هستم.15 12 و 0.163 7 به ترتیب. در مجموع 87 جایگاه در {{20}} افراد از 4 جمعیت سیستانچ شناسایی شد که 24 مورد از آنها جایگاه چندشکلی بودند که 27.59 درصد را تشکیل می‌دادند، H=0. من=0.1278. بالاترین PPL مربوط به Andil با 25.29 درصد بود، در حالی که PPL در Savuzek و Yatungusi کمتر بود (هر دو با 19.54 درصد). H 0 است.062 1 -0.080 0، من 0 هستم.095 0 -0.116. اندازه H و I با روند اندازه PPL هر جمعیت مطابقت دارد و ضرایب در Andier بزرگترین و پس از آن دایان هستند. در مورد همان PPL، H ساووزک=0.{{4{45}}}} مجموع I=0.097 0 کمی بیشتر از 0 است. }} و 0.095 0 از Yatunguska (جدول 2).

شکل 1 باندهای تقویت شده RAPD برخی از نمونه های بیابانCistanche deserticolaآغازگر S490 1-10. نمونه های گارانتی; 11-20. نشانگر M-DNA نمونه‌های Jimpster (200 - 2 000 bp)

شکل 2 باندهای تقویت شده RAPD برخی از نمونه های Cistanche Tubulosa، پرایمر S{1}}. نشانگر M-DNA نمونه سین کیانگ اندیر (200 - 2 000 bp)

جدول 2تنوع ژنتیکیازCistanche deserticolaوCistanche tubulosaجمعیت ها

2.2 تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی Cistanche

با توجه به سطحتنوع ژنتیکیدر جمعیت ها (Hs)، تمایز بین جمعیت ها (Dst) و نسبت تفاوت های ژنتیکی بین جمعیت ها در کل تفاوت های ژنتیکی (Gst)، می توان مشاهده کرد که تنوع ژنتیکی کل Cistanche deserticola Ht=0.{{{{ 1}}، جایی که Hs=0.101 2، Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2، که از آن Hs=0.067 8، Gst=0.175 5 (جدول 3). نتایج فوق نشان می دهد که درجاتی از تنوع ژنتیکی در بین جمعیت ها وجود دارد. تنوع بین جمعیت های بیابانی Cistanche deserticola 25.46 درصد از کل تنوع را به خود اختصاص داده است و تنوع جمعیت Cistanche tubulosa 17.55 درصد از کل تغییرات را به خود اختصاص داده است.

جدول 3 تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکیCistanche deserticolaوسیستانچ توبولوزا.

2.3 تجزیه و تحلیل فاصله ژنتیکی و خوشه ای در بین جمعیت های Cistanche deserticola

فاصله ژنتیکی دو جمعیت ازCistanche deserticola{{0}} است.080 0، و هویت ژنتیکی 0.9231 است. فاصله ژنتیکی چهار جمعیت سیستانچ 0 بود.012 0-0.031 5، و هویت ژنتیکی 0 بود.988 1 (جدول 4) . خوشه بندی افراد Cistanche deserticola و cistanche tubulosa نشان می دهد که Cistanche deserticola را می توان با توجه به جمعیت به دو گروه مجزا دسته بندی کرد، در حالی که افراد مختلف cistanche tubulosa را نمی توان بر اساس جمعیت دسته بندی کرد، که همچنین نشان می دهد که تمایز ژنتیکی بین Cistanche deserticola جمعیت نسبتاً زیاد است. بزرگ، اما تمایز ژنتیکی در بین جمعیت های Cistanche tubulosa اندک است.

جدول 4 هویت ژنتیکی (پایین سمت چپ) و فاصله ژنتیکی (بالا سمت راست) ازسیستانچ توبولوزا.

3. بحث

3.1 تنوع ژنتیکی Cistanche

سطح ازتنوع ژنتیکیگیاهان از خصوصیات بیولوژیکی، زیستگاه، منشأ و تکامل آنها جدایی ناپذیر است. در این میان سیستم اصلاح نژاد، دامنه توزیع، شکل زندگی و روش های پراکندگی گرده و بذر بیشترین تأثیر را دارند [6]. بر اساس نتایج آماری داده های آلوزیمی 499 گونه گیاهی در 165 جنس توسط Ge Song و همکاران. [7]، چندشکلی سیستانچ در سطح گونه باید حدود 50 درصد و چندشکلی در سطح جمعیت باید حدود 40 درصد باشد. حدود 0.17 سطوح پلی مورفیسم به دست آمده در این آزمایش همگی کمتر از این مقادیر متوسط ​​هستند. در عین حال، در مقایسه با سطوح مکان‌های چندشکل به‌دست‌آمده با روش RAPD برای چندین گیاه معمولی در حال انقراض، مانند 32 درصد گونه در حال انقراض صنوبر نقره ای[18]، 22.5 درصد گل صد تومانی کوتوله، و 27.6 درصد گل صد تومانی بنفش. [9] ] می توان مشاهده کرد که تنوع ژنتیکیCistanche deserticola کمی پایین تر از سطح متوسط ​​است، در حالی که تنوع ژنتیکی Cistanche tubulosa در حال حاضر بسیار کم است.

3.2 دلایل تنوع ژنتیکی کم سیستانچ

سیستانچ یک گیاه انگلی خاص است که همزمان در مناطق باریک بیابانی پراکنده می شود. بنابراین، سبک زندگی منحصر به فرد و منطقه زندگی نسبتاً باریک ممکن است دلیل ذاتی باشدتنوع ژنتیکیسیستانچ به طور کلی کمتر از گیاهان معمولی است.

تفاوت درتنوع ژنتیکیبین Cistanche deserticola و Cistanche tubulosa ممکن است به تفاوت در محدوده توزیع این دو و اینکه آیا آنها با توزیع میزبان هماهنگ هستند مرتبط باشد. منطقه توزیع Cistanche tubulosa به طور قابل توجهی کوچکتر از Cistanche deserticola است و توزیع آن به شدت با گیاه میزبان ناهماهنگ است. مطالعات نشان داده است که تنوع زیادی در میان گونه های تاماریکس وجود دارد. به عنوان مثال، ژانگ خوان و همکاران. گزارش داد که تنوع ژنتیکی Tamarix sibiricus به 98.7 درصد می رسد [10]، در حالی که تنوع ژنتیکی Cistanche بسیار ضعیف است که نشان دهنده تکامل طولانی مدت است. Cistanche tubulosa ممکن است در تاریخ با تنگناهای جدی مواجه شده باشد که منجر به از دست دادن مقدار زیادی ازتنوع ژنتیکی.

در عین حال، طبق بررسی ها مشخص شد که هیچ یک ازCistanche deserticolaدر 20 کیلومتری سکونتگاه های انسانی را می توان کشف کرد و به طور معمول شکوفا شد. گودال های بزرگ و کوچک سیستانچ به ویژه در مناطق اصلی تولید گل لوله سیستانچ حفاری شد. بنابراین، در اثر حفاری زیاد ایجاد شد. فقدان منشأ و تخریب زیستگاه ممکن است از دلایل اصلی این کم بودن باشدتنوع ژنتیکیسیستانچی

3.3 تمایز ژنتیکی سیستانچ

با توجه به فاصله جغرافیایی بین سین کیانگ و مغولستان داخلی، انزوای جغرافیایی باعث تمایز و انزوا بینCistanche deserticolaجمعیت ها، و دو جمعیت به دلیل سازگاری با شرایط زیستگاه محلی، اکوتیپ های ژنتیکی متفاوتی را تشکیل دادند. به دلیل محدوده توزیع محدود و تبادلات ژنی مکرر بین جمعیت ها، تمایز ژنتیکی بین جمعیت ها کمتر از Cistanche deserticola است.

3.4 توصیه هایی برای حفاظت از سیستانچ

تنوع ژنتیکیپیش نیاز بقای طولانی مدت گونه ها برای جلوگیری از انقراض است. کاهش ازتنوع ژنتیکیتوانایی جمعیت ها را برای سازگاری با تغییرات محیطی در کوتاه مدت و بلندمدت کاهش می دهد [11]. بنابراین حفاظت از تنوع ژنتیکی سیستانچ برای حفاظت از این داروی کمیاب و گرانبهای چینی بسیار مهم است. از آنجایی که سیستانچ گونه ای با نوع اکولوژیکی خاص است، باید عمدتاً در محل محافظت شود و پایگاه حفاظت طبیعی سیستانچ با توجه به تنوع ژنتیکی آن ایجاد شود. به عنوان مثال، برایCistanche tubulosaاز آنجایی که تنوع ژنتیکی عمدتاً از درون جمعیت سرچشمه می‌گیرد، جمعیت‌هایی با تنوع ژنتیکی زیاد اولویت حفاظتی را خواهند داشت [12]، مانند Minfeng's Angier و Yutian's Daheyan می‌توان آن را به عنوان پایگاه حفاظتی طبیعی برای سیستانچ فهرست کرد. همانطور که برایCistanche deserticolaجمعیت مغولستان داخلی و سین کیانگ دستخوش تغییرات قابل توجهی شده اند، بنابراین تحقیقات تجربی برای تعیین جمعیت هایی که برای حفاظت در اولویت هستند باید بیشتر تقویت شود. در عین حال، تحقیقات اساسی در مورد بیولوژی تولید مثل و اکولوژی گرده افشانی سیستانچ برای ارائه اطلاعات برای حفاظت بیشتر از آن انجام دهید.

منابع

[1] هی یانپینگ، یین ژژو، تو پنگفی، و همکاران. شناسایی ازسیستانچو بررسی مواد دارویی تجاری مواد دارویی چینی، 1997، 20 (3): 117.

[2] لیو مینگتینگ. تحقیق جامع و کاربرد عمومی گیاه گز. لانژو: انتشارات دانشگاه لانژو، 1995.

[3] فو گولی. کتاب قرمز گیاهان چینی پکن: انتشارات علمی، 1992.

[4] دفتر مدیریت واردات و صادرات گونه های در خطر انقراض جمهوری خلق چین، کمیته علمی گونه های در خطر انقراض جمهوری خلق چین. کنوانسیون تجارت بین‌المللی گونه‌های در معرض خطر جانوران و گیاهان وحشی (CITES)، پیوست II. 2003.41.

[5] Zou Yuping، Wang Xiaoquan، Lei Yiding، و همکاران. استخراج و شناسایی DNA کل چندین گیاه در حال انقراض و خویشاوندان آنها. Acta Botany, 1994, 36:528.

[6] وانگ هونگشین، هو ژیانگ. سیستم اصلاح نباتات، ساختار ژنتیکی و حفاظت ازتنوع ژنتیکی. تنوع زیستی، 1996، 4(2): 92.

[7] چن جیاکوان، یانگ جی. زیست شناسی تکاملی گیاهی. ووهان: انتشارات دانشگاه ووهان، 1994.

[8] وانگ Xiaoquan، Zou Yuping، Zhang Daming، و همکاران. تجزیه و تحلیل RAPD تنوع ژنتیکی صنوبر نقره ای علوم چینی (C)، 1997، 40 (2): 145.

[9] پی یانلونگ، زو یوپینگ، یین ژن، و همکاران. گزارش اولیه در مورد تجزیه و تحلیل RAPD گل صد تومانی کوتوله و گل صد تومانی بنفش. مجله چینی طبقه بندی گیاهان، 1995، 33 (4): 350.

[10] ژانگ خوان، یین لینکه، ژانگ دائویوان. مطالعه مقدماتی درتنوع ژنتیکیجمعیت طبیعی نیزه گز. تحقیقات گیاه شناسی یوننان، 2003، 25(5):557.

[11] Ellstrand NC، Elam D R. پیامدهای ژنتیکی جمعیت اندازه جمعیت کوچک: پیامدهای حفاظت از گیاه. بررسی سالانه اکولوژی و سیستماتیک، 1993، 34:217.

[12] لیو ژانلین، ژائو گویفانگ. اصل ژنتیک جمعیت و کاربرد آن در حفاظت از گیاهان کمیاب و در حال انقراض تنوع زیستی، 1999، 7(4): 340.

از: مجله China Materia Medica; جلد 29، شماره 8 اوت 2004