شبیه‌سازی ژن، شناسایی عملکردی، تحلیل ساختاری و بیانی ساکارز سنتاز از Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 تجزیه و تحلیل بیان CtSus در بخش های مختلف Cistanche tubulosa و در سیستم کشت سلولی تحت تنش خشکی

4.1 تجزیه و تحلیل بیان CtSus در قسمت های مختلف Cistanche tubulosa

آزمایش‌های تبدیل سلول کامل در شرایط آزمایشگاهی و آزمایش‌های واکنش کاتالیزوری آنزیمی تأیید کردند که پروتئین کدگذاری شده توسط ژن CtSus توانایی کاتالیز کردن سنتز UDP-گلوکز را دارد. به منظور بررسی بیشتر همبستگی بین این ژن و بیوسنتز ترکیبات گلیکوزیدی در Cistanche tubulosa، میزان بیان این ژن در بخش‌های مختلفCistanche tubulosaتجزیه و تحلیل شد.

مواد اولیه CISTANCHE با کیفیت بالا برای فروش

خدمات پشتیبانی Wecistanche-با ما تماس بگیرید تا اطلاعات تخفیف را دریافت کنید:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

واتساپ/تلفن:+86 15292862950

اکیناکوزیدنماینده ترین ترکیب گلیکوزیدی در Cistanche tubulosa است و محتوای آن می تواند به بیش از 30٪ وزن خشک گیاهان Cistanche tubulosa برسد [23]. گروه تحقیقاتی قبلاً محتوای اکیناکوزید را در قسمت‌های مختلف گیاهان Cistanche tubulosa اندازه‌گیری کردند و عملکرد ویژه این بود:echinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>قسمت هوایی; در میان آنها، محتوای اکیناکوزید در هاستوریوم بالاترین بود. PCR کمی فلورسانس بلادرنگ با استفاده از cDNA از قسمت‌های مختلف Cistanche tubulosa به عنوان الگو انجام شد و نتایج توسط 2 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.روش -ΔΔCT، و تجزیه و تحلیل دیفرانسیل انجام شد. نتایج در شکل 4 الف نشان داده شده است. سطح بیان ژن CtSus در هاستوریوم بالاترین، 1.5 برابر بیشتر از قسمت بالای زمین بود، و سطح بیان در قسمت زیرزمینی به طور قابل توجهی بیشتر از قسمت بالای زمین بود که با الگوی تجمع گلیکوزیدهای فنیل اتانول مطابقت دارد. توسط اکیناکوزید در قسمت های مختلف نشان داده شده استCistanche tubulosa.

شکل 4 سطوح بیان نسبی CtSus در قسمت‌های مختلف C. tubulosa و در سلول‌های سوسپانسیون تیمار شده با PEG6000. A: سطح بیان نسبی CtSus در قسمت های مختلف C. tubulosa. B: سطح بیان نسبی CtSus در سلول‌های سوسپانسیون C. tubulosa تیمار شده با PEG6000 در زمان‌های مختلف n=3، ❑±± s.*P ＜ 0.05، ***P ＜ 0.001

مواد اولیه CISTANCHE با کیفیت بالا

4.2 تجزیه و تحلیل بیان CtSus در سلول های تعلیق Cistanche deserticola تحت شرایط تنش خشکی

تحقیقات اولیه روی این پروژه نشان داد کهتنش خشکی ناشی از PEG6000می تواندبه طور قابل توجهی افزایش یابدراتجمع گلیکوزیدهای فنیل اتانولدر سلول های تعلیق Cistanche. از 3 تا 9 روز پس از القا، محتوای اکیناسید به طور قابل توجهی افزایش یافت. از روز 12 تا 15،سرعت رشد اکیناسیدمحتوا کند شد و در روز پانزدهم به حداکثر مقدار رسید. سپس، با افزایش زمان کشت، محتوای اکیناسید به طور قابل توجهی افزایش یافت. محتوای فروکتوزید به تدریج کاهش یافت [24]. بر اساس این تحقیق، این مقاله از cDNA سلول‌های سوسپانسیون Cistanche deserticola درمان نشده و سلول‌های تعلیق Cistanche deserticola القا شده با PEG به عنوان الگوهایی برای انجام تشخیص کمی فلورسانس PCR در زمان واقعی برای بررسی ژن CtSus در سوسپانسیون Cistanche deserticola استفاده کرد. سلول ها در شرایط تنش خشکی تغییرات در سطوح بیان نتایج در شکل 4B نشان داده شده است. در سلول‌های سوسپانسیون Cistanche deserticola القا شده توسط PEG6000، بیان CtSus در روز ششم پس از القا به‌طور معنی‌داری افزایش یافت و در روز نهم به بالاترین مقدار رسید و سپس به همان سطح شاهد کاهش یافت. گروه های هم سطح نتایج فوق نشان می دهد که تنش خشکی می تواند بیان ژن CtSus را در رده سلولی سوسپانسیون Cistanche deserticola به طور قابل توجهی افزایش دهد که با الگوی تجمع اکیناسید تحت تنش خشکی مطابقت دارد. با این حال، اوج بیان ژن CtSus زودتر از پیک محتوای اکیناسید ظاهر می شود، زیرا دهنده گلیکوزیل فعال سنتز شده توسط کاتالیز CtSus یک پیش ساز مهم برای واکنش گلیکوزیلاسیون چند مرحله ای در مسیر بیوسنتزی بعدی اکیناسید است. بنابراین حدس زده می‌شود که پس از قرار گرفتن در معرض تنش خشکی، ارگانیسم‌ها ترجیحاً ژن‌های مرتبط با متابولیسم اولیه را برای دستیابی به تجمع اهداکنندگان فعال بسیج کرده و سپس به تجمع متابولیت‌های ثانویه مهم دست یابند.

مواد اولیه CISTANCHE با کیفیت بالا

5 مطالعه ساختار سه بعدی پروتئین CtSus و تجزیه و تحلیل سایت های فعال کلیدی

بر اساس عملکرد CtSus در کاتالیز تولید UDP-گلوکز دهنده گلیکوزیل، اساس ساختاری فعالیت کاتالیزوری CtSus بیشتر مورد مطالعه قرار گرفت. ابزار آنلاین SOPMA برای پیش بینی ساختار ثانویه پروتئین استفاده شد. نتایج نشان داد که ساختار ثانویه CtSus حاوی 28/55 درصد مارپیچ، 47/25 درصد سیم پیچ های تصادفی، 80/12 درصد رشته های توسعه یافته و 46/6 درصد چرخش است (شکل 5A)، که نشان می دهد مارپیچ ها مهمترین واحدهای ساختاری ثانویه در پروتئین CtSus هستند. به دنبال آن کویل های تصادفی قرار می گیرند که بخش بزرگی از پروتئین را نیز تشکیل می دهند. رشته ها و چرخش های گسترده در سراسر پروتئین پخش می شوند. طبق مطالعات موجود، ساکارز سنتاز معمولاً به شکل تترامر وجود دارد که شکل فعال آن در نظر گرفته می شود. بنابراین، این مقاله بیشتر از AlphaFold2 برای پیش‌بینی ساختار پروتئین CtSus استفاده کرد و ساختار سه بعدی آن را از تترامرهای پروتئینی بدست آورد. مقایسه پایگاه داده PDB (بانک داده پروتئین) نشان داد که شباهت توالی بین Arabidopsis thaliana ساکارز سنتاز AtSus1 (PDBID 3S28) و CtSus می تواند به 77.93 درصد برسد. ساختار CtSus پیش‌بینی‌شده با ساختار سه‌بعدی AtSus1 مقایسه شد و مقدار میانگین مربعات ریشه (RMSD) پس از برهم‌نهی پروتئین 1.11 Å بود، که نشان می‌دهد ساختارهای فضایی این دو بسیار سازگار هستند (شکل 5B).

ساختار کمپلکس کریستالی پروتئین لیگاند گزارش شده Arabidopsis AtSus1 با UDP و فروکتوز (PDBID3S29) به عنوان یک الگو [16] برای تجزیه و تحلیل حالت اتصال CtSus با UDP و فروکتوز استفاده شد. نتایج اتصال مولکولی در شکل 5C نشان داده شده است. می توان مشاهده کرد که پاکت های اتصال بستر AtSus1 و CtSus از نظر نوع اسید آمینه، توزیع فضایی و پیکربندی بسیار مشابه هستند و همپوشانی زیاد است، که ثابت می کند که توالی ساکارز سنتاز در گیاهان به شدت حفظ می شود. ترکیبات دو لیگاند UDP و فروکتوز در محفظه اتصال سوبسترای پروتئین در شکل 5D نشان داده شده است. مزیت‌ترین ترکیب اتصال مولکولی UDP و CtSus با ترکیب UDP در مجتمع کریستالی AtSus{8}}UDP همپوشانی خوبی دارد که دقت نتایج اتصال مولکولی را ثابت می‌کند. برهمکنش بین UDP و باقی مانده های اسید آمینه کلیدی در پاکت اتصال سوبسترای پروتئین در شکل 5E نشان داده شده است. UDP و CtSus عمدتاً توسط پیوندهای هیدروژنی و فعل و انفعالات آبگریز به یکدیگر متصل می شوند. باقی مانده های اسید آمینه کلیدی در پاکت اتصال سوبسترا عبارتند از: eu294، Gly301، Met576، Arg578، Lys583، Gln646، Asn652، Leu677، Thr678، و Glu681.

مراجع

[1] آهنگ ZH، Lei L، Tu PF. پیشرفت در تحقیق فعالیت دارویی در گیاهان CistancheHoffing. و پیوند [J]. داروهای گیاهی سنتی چین (中草药)، 2003، 34: 113-115.

[2] Liu WJ، Liu Y، Song QQ، و همکاران. مقایسه شیمیایی بین Cistanchetubulosa کشت شده و وحشی با استفاده از طیف‌سنجی 1H-NMR [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志)، 2018، 43:3506-3512.

[3] آهنگ Y، Zeng K، Jiang Y، و همکاران. Cistanches Herba، از یک گونه در حال انقراض تا یک برند بزرگ دارویی چینی [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] لیو یو، وانگ اچ، یانگ ام، و همکاران. پلی ساکاریدهای Cistanche deserticola از سلول های PC12 در برابر آسیب های ناشی از OGD/RP محافظت می کنند [J]. Biomed Pharmacother، 2018، 99: 671-680.

[5] یین یی، هوانگ جی، گو ایکس، و همکاران. تکامل آنزیم های تبدیل نوکلئوتید-قند گیاهی [J].PLoS One، 2011، 6: e27995.

[6] بار-پلد ام، اونیل MA. تشکیل قند نوکلئوتیدی گیاهی، تبدیل متقابل و نجات با بازیافت قند [J]. Annu Rev Plant Biol، 2011، 62: 127-155.

[7] گوا اچ، لی ال، وانگ پی جی. خصوصیات بیوشیمیایی UDP-GlcNAc/Glc4-اپیمراز از Escherichia coli O86:B7 [J]. بیوشیمی، 2006، 45: 13760-13768.

[8] Dong S، Chesnokova ON، Turnbough CL Jr، و همکاران. شناسایی اپی مراز UDP-N-استیل گلوکوزامین4-در گلیکوزیلاسیون پروتئین اگزوسپوریوم در باسیلوس آنتراسیس [J]. J Bacteriol، 2009، 191: 7094-7101.

[9] Li LN، Kong JQ. شناسایی ژن های ساکارز سنتاز در سراسر رونوشت در Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv، 2016، 6: 18778-18792.

[10] Schmölzer K، Gutmann A، Diricks M، و همکاران. ساکارز سنتاز: یک گلیکوزیل ترانسفراز منحصر به فرد برای توسعه فرآیند گلیکوزیلاسیون بیوکاتالیستی [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11] Cardini CE، Leloir LF، Chiriboga J. بیوسنتز ساکارز [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.[12] Stein O, Granot