ترکیب تزریق سلول NK با پپتید آزاد کننده دوپامین سلول های پیر را در موش های مسن کاهش می دهد.

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

مقدمه

پیری یکی از عوامل خطر اصلی برای بسیاری از بیماری ها است [1] و توسعه روش هایی برای مداخله در پیری به طور قابل توجهی خطر ابتلا به یک سری بیماری های مرتبط با افزایش سن مانند بیماری های قلبی عروقی و عروق مغزی [2، 3]، سرطان را کاهش می دهد. [4] و بیماری آلزایمر [5]. سلول‌های پیر (SNCs) به تدریج در طول فرآیند پیری در بافت‌ها تجمع می‌یابند و عامل اصلی بیماری‌های مرتبط با افزایش سن محسوب می‌شوند [6-8]. نشان داده شده است که حذف SNC در مدل‌های موش از اختلال عملکرد بافت جلوگیری یا به تاخیر می‌اندازد و طول عمر سالم را افزایش می‌دهد [9، 10]. در مقابل، پیوند مقادیر کمی از SNC ها باعث اختلال عملکرد فیزیولوژیکی در موش های جوان می شود [1]. این مطالعات درها را برای توسعه روش هایی باز کرده است که حذف SNCs را برای بهبود بیماری های مزمن مرتبط با سن هدف قرار می دهد.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

پاکسازی هدفمند SNC ها، که "سنولیتیک" نامیده می شود، اولین شیمی درمانی بود که با موفقیت در یک مدل in vivo بالینی آزمایش شد و چندین عامل سنولیتیک در حال حاضر وجود دارد [12]. بسیاری از این داروها مسیرهای ضد آپوپتوز تنظیم شده را در SNC ها هدف قرار می دهند تا به طور انتخابی انواع خاصی از SNC ها را پاک کنند و پتانسیل افزایش طول عمر و بهبود عملکرد بدن را نشان داده اند [13، 14].عصاره سیستانچ ضد تشعشععلیرغم برگشت موفقیت آمیز آسیب شناسی مرتبط با سن در مدل های حیوانی، ممکن است برخی از موانع برای استفاده از داروهای سنولیتیک در انسان به دلیل ناهمگونی SNC ها و خطر بالای سمیت وجود داشته باشد [15]. بنابراین، یک روش جایگزین که می تواند با خیال راحت طیف وسیعی از SNC ها را در انسان از بین ببرد، باید مورد بررسی قرار گیرد.

SNP ها را می توان توسط سیستم ایمنی شناسایی و حذف کرد [16]. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که SNC‌ها سلول‌های کشنده طبیعی (NK) را با تنظیم کردن لیگاند فعال‌کننده پروتئین A و B مرتبط با زنجیره اصلی سازگاری بافتی کلاس I فعال می‌کنند [17]. با این حال، با افزایش سن، کارایی سیستم ایمنی کاهش می یابد که می تواند منجر به فرار ایمنی SNC ها شود [18]. روش‌هایی برای غلبه بر فرار سیستم ایمنی ناشی از کاهش عملکرد ایمنی در درمان سرطان مورد بررسی قرار گرفته است [19]. پیشرفت‌های اخیر در انتقال سلول‌های NK برای از بین بردن تومورها صورت گرفته است که تا حدی کارایی را نشان داده است [20]. بنابراین، منطقی بود که فرض کنیم تزریق پذیرفته شده سلول های NK ممکن است سمیت سلولی در SNC ها ایجاد کند.

سیستم عصبی و ایمنی دو سیستم تطبیقی ​​مهم بدن هستند. چندین مطالعه نشان داده اند که دوپامین (DA) به عنوان یک تنظیم کننده سیستم ایمنی، کلید ارتباط عصبی عصبی است [21]. DA عملکردهای بیولوژیکی خود را با تعامل و فعال کردن گیرنده‌های دوپامین (DR) انجام می‌دهد، که به 2 زیر گروه تقسیم می‌شوند، D1-مانند (D1 و D5) و D{5}}مانند (D2، D3، و D4). از نظر عملکردهای مختلف آنها، درگیری D1-مانند DR تولید cAMP را تحریک می‌کند، در حالی که درگیری D{10}}مانند DR تولید cAMP را مهار می‌کند [22]. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که تحریک D{12}شبیه DR سمیت سلولی سلول‌های NK را هم در شرایط آزمایشگاهی [23] و هم در داخل بدن [24] افزایش می‌دهد. با این حال، سطوح DA با افزایش سن انسان کاهش می یابد [25]. بنابراین، ما فرض کردیم که داروهای دوپامینرژیک می توانند سمیت سلولی تزریق پذیرفته شده سلول های NK را افزایش دهند.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

در اینجا، ما استفاده از nonapeptide Acein را پیشنهاد می کنیم که با یک آنزیم مبدل آنژیوتانسین (ACE I) برای القای ترشح DA [26]، در ترکیب با سلول درمانی سیستمیک NK برای از بین بردن SNC ها تعامل داشت. نتایج آزمایشگاهی نشان داد که سلول‌های NK، SNC‌ها را مستقل از محرک‌های پیری و انواع سلولی حذف کردند.گیاه سیستانچدر یک مدل موش پیر، درمان با سلول های NK در ترکیب با آسئین به طور قابل توجهی تعداد سلول های مثبت گالاکتوزیداز (SA{2}gal) مرتبط با پیری را در چندین بافت کاهش داد و بیان ژن های مرتبط با پیری را در اندام های اصلی کاهش داد. و فنوتیپ های ترشحی مرتبط با پیری (SSPs) را کاهش داد. نتایج این مطالعه بینش هایی را در مورد بازسازی احتمالی نظارت ایمنی SNC های مزمن با استفاده از سلول درمانی NK در ترکیب با آس ارائه می دهد.

نتایج

انفوزیون پذیرفته شده سلول های NK سلول های CD3 به علاوه T پیر را در خون محیطی کاهش می دهد

بیست و شش داوطلب که تزریق سلول NK دریافت کرده بودند برای مطالعه انتخاب شدند. ویژگی ها و ویژگی های سلول NK داوطلبان در جدول 1 ارائه شده است. فاصله زمانی برای یادآوری خون پس از انتقال سلول NK حدود 37 ({3}}) روز بود. نسبت (شکل 1A) و تعداد مطلق (شکل 1B) سلولهای NK در خون محیطی با سن داوطلبان رابطه معکوس داشت. با کمال تعجب، خلوص محصول سلول NK که مجدداً به هر فرد تزریق می شود با سن داوطلبان همبستگی معکوس داشت (شکل 1C).رشد آلت تناسلی سیستانچیاین ممکن است به دلیل کاهش تدریجی تعداد سلول های NK با افزایش سن باشد. به منظور انعکاس اثر ضد پیری تجویز سلول‌های NK، نشانگرهای پیری متعدد در سلول‌های CD3 به علاوه T خون محیطی، که تا حد زیادی فنوتیپ مرتبط با سن بدن [27] را منعکس می‌کنند، قبل و بعد از تزریق سلول‌های NK شناسایی شدند. در مقایسه با نشانگرهای پیری و فاکتور SASP سلول‌های CD3 به علاوه T در خون محیطی قبل و بعد از انفوزیون سلول‌های NK اتولوگ، نسبت سلول‌های T SA{5} gal مثبت پس از انفوزیون به طور قابل‌توجهی کاهش یافت (شکل 1D). سطوح mRNA P16، P21 و بازدارنده فعال کننده پلاسمینوژن 1 (Pai1) به طور قابل توجهی کاهش یافت، در حالی که تغییرات در سطوح mRNA پروتئین جذب کننده شیمیایی مونوسیت (MCP{13}}) و IL{14}} معنی دار نبودند (شکل 1E). تفاوت معنی داری در شاخص های بیوشیمیایی (جدول تکمیلی 1) در خون محیطی وجود نداشت.

سلول های NK انسانی نشانگرهای پیری بافت چربی و ترشح سایتوکاین های پیش التهابی را کاهش می دهند

بافت چربی از سه فرد چاق جمع آوری شد، زیرا چاقی تمایل به تجمع SNC ها دارد [28]. علاوه بر این، بافت چربی در یک محیط شرطی شده از SNC ها برای القای پیری بافت چربی کشت داده شد. بافت چربی کشت شده در محیط مطبوع از غیر SNC به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. بیان پرفورین (شکل 2A) و CD69 (شکل 2B) در سلول های NK پس از انکوباسیون همزمان با بافت چربی پیر در مقایسه با انکوباسیون همزمان با بافت چربی کنترل به طور قابل توجهی تنظیم شد. بیان نشانگرهای پیری p16 و p21 در

بافت چربی پیر به طور قابل توجهی پس از درمان با سلول NK کاهش یافت (شکل 2C، شکل تکمیلی 1A، B). ما همچنین دریافتیم که جزء کلیدی SASP در محیط مطبوع پس از انکوباسیون همزمان با سلول‌های NK در گروه پیر به طور قابل‌توجهی کاهش یافت (شکل 2D). این نتایج نشان داد که سلول های NK می توانند SNC ها را از بافت چربی حذف کرده و فنوتیپ SASP را کاهش دهند.

سلول‌های NK موش می‌توانند علیه SNC‌ها فعال شوند و سمیت سلولی ایجاد کنند

ما ابتدا پیری سلول های پیش ساز چربی موش را با تابش یا آدریامایسین همانطور که قبلاً توضیح دادیم القا کردیم [29]. برای تعیین اینکه آیا سلول های NK به طور خاص توسط SNC ها فعال شده اند یا خیر، سلول های کنترل نشده یا SNC های تابیده شده به مدت 24 ساعت با سلول های NK انکوبه شدند. فلوسایتومتری نشان داد که سطح بیان CD69 (شکل 3A) و IFN-y (شکل 3B) در سلول های NK به طور قابل توجهی در سلول های هدف SNC نسبت به سلول های هدف کنترل افزایش یافته است. در همین حال، پس از انکوباسیون همزمان با سلول‌های NK، سطح آپوپتوز SNCs به‌طور معنی‌داری بالاتر از سلول‌های شاهد بود (شکل 3C). در مرحله بعد، ما بیان لیگاندهای فعال کننده و مهارکننده سلول NK را در SNC ها شناسایی کردیم. نتایج qPCR نشان داد که سطح بیان لیگاندهای فعال در سلول‌های NK به طور قابل‌توجهی نسبت به سلول‌های کنترل افزایش یافته است و سطح بیان برخی لیگاندهای بازدارنده مانند میکروگلوبولین بتا 2 (2m) نسبت به سلول‌های کنترل کاهش یافته است. .3D). ما همچنین توانایی سلول های NK را برای از بین بردن SNC ها در داخل بدن بررسی کرده ایم.فواید سالسا سیستانچسلول‌های کنترل نشاندار شده با DiR و SNC‌های نشاندار شده با DiR به حفره شکمی موش‌ها پیوند زده شدند و سلول‌های NK از طریق ورید دمی تزریق شدند. نتایج تصویربرداری in vivo نشان داد که شدت فلورسانس در موش‌های پیوند شده با SNC پس از درمان سلول‌های NK به طور قابل‌توجهی ضعیف‌تر از موش‌های پیوند شده با سلول‌های کنترل بود (شکل 3E). این نشان داد که توانایی سلول های NK برای کشتن SNC ها به طور قابل توجهی بالاتر از SNC ها در داخل بدن بود. در مرحله بعد، ما تعیین کردیم که آیا سمیت سلولی سلول‌های NK در برابر SNC‌ها وابسته به دوز و اختصاصی به سلول است یا خیر. در همان زمان، ما همچنین از پیری ناشی از دوکسوروبیسین برای تعیین اینکه آیا سمیت سلولی سلول‌های NK در برابر SNCs محدود به القای تشعشع است، استفاده کردیم. نتایج نشان داد که سلول‌های NK فعالیت سیتوتوکسیک قابل‌توجهی در برابر SNCs به صورت وابسته به دوز دارند، اما سمیت سلولی کمی در برابر سلول‌های کنترل دارند. روش های مختلف تحریک پیری هیچ تاثیری بر توانایی سلول های NK در کشتن SNC ها نداشتند (شکل 3F). این نتایج نشان می دهد که سلول های NK می توانند به طور خاص توسط SNC ها فعال شوند و سمیت سلولی قابل توجهی در برابر SNC ها در شرایط آزمایشگاهی و درون تنی ایجاد کنند.

DA سمیت سلولی سلول‌های NK موش را در برابر SNC‌ها از طریق گیرنده‌های{0}شبیه D افزایش می‌دهد.

با توجه به عملکرد مهم ارتباط عصبی ایمنی DA [30]، ما ارزیابی کردیم که آیا DA می تواند سمیت سلولی سلول های NK موش را در برابر SNC ها افزایش دهد یا خیر. سلول های NK با SNC های القا شده با تشعشع انکوبه شدند و غلظت های مختلف DA به محیط کشت اضافه شد. نتایج نشان داد که DA می تواند سمیت سلولی سلول های NK را در برابر SNC ها افزایش دهد (شکل 4A, B). برای مشخص کردن مسیر سیگنالینگ که توسط آن DA اثر کشتن سلول‌های NK را بر روی SNC ها افزایش می‌دهد، تغییرات در بیان DR، محتوای cAMP، و فسفوریلاسیون پروتئین متصل به عنصر پاسخ cAMP (CREB) در سلول‌های NK مورد ارزیابی قرار گرفت. در سلول های NK که با SNC ها همراه با DA انکوبه شده اند، محتوای cAMP (شکل 4C) و سطح فسفوریلاسیون CREB (شکل 4D، شکل تکمیلی 2A) به طور قابل توجهی در مقایسه با سلول های NK و انکوباسیون مشترک SNC افزایش یافته است. بدون DA. به منظور روشن شدن اینکه چرا DA باعث افزایش فعالیت کشتن سلول‌های NK در برابر SNC‌ها می‌شود، ما تغییرات DR را در سلول‌های NK پس از انکوبه شدن همزمان سلول‌های NK با سلول‌های SNC یا کنترل مقایسه کردیم. نتایج نشان داد که سطح بیان D1 و D5 DR به طور قابل‌توجهی پس از انکوبه شدن سلول‌های NK با سلول‌های SNC در مقایسه با سلول‌های شاهد به طور قابل‌توجهی افزایش یافت (شکل 4E). سپس، DA و D{15}}آنتاگونیست های گیرنده یا D{16}}مانند

آنتاگونیست های گیرنده در سیستم انکوباسیون همزمان سلول های NK و SNC ها با هم اضافه شدند. در مقایسه با افزودن DA به تنهایی، سطح آپوپتوز SNC ها با افزودن DA به علاوه SCH{1}}(آنتاگونیست گیرنده شبیه D{{2}) کاهش یافت (شکل 4F، G). در همین حال، محتوای cAMP (شکل 4H) و سطح فسفوریلاسیون CREB (شکل 4l، شکل تکمیلی 2B) در سلول‌های NK کاهش یافت. در مقابل، افزودن DA به علاوه هالوپریدول (آنتاگونیست گیرنده D2) به طور قابل توجهی سطح آپوپتوز SNC ها، محتوای cAMP و فسفوریلاسیون CREB در سلول های NK را در مقایسه با افزودن DA به تنهایی تغییر نداد. این نتایج نشان داد که DA فعالیت کشتن سلول‌های NK موش را در برابر SNC‌ها از طریق D1-مانند Drs افزایش می‌دهد.

آس همراه با سلول های NK موش به طور قابل توجهی پاکسازی SNC ها را در داخل بدن افزایش می دهد

مطالعه قبلی نشان داده است که دوپامین با افزایش سن در انسان کاهش می یابد [22]. ما ابتدا سطح دوپامین محیطی را در موش‌های پیر و جوان اندازه‌گیری کردیم. نتایج نشان داد که سطوح دوپامین پلاسما در موش‌های پیر کمتر از موش‌های جوان بود (شکل 5A). سپس، آزادسازی دوپامین محیطی پس از تزریق داخل صفاقی آسئین در موش‌های پیر مورد بررسی قرار گرفت. ما دریافتیم که سطوح دوپامین پلاسما پس از تزریق 10 میلی گرم بر کیلوگرم آسئین به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 5B، شکل تکمیلی 3). با توجه به این، ما سلول‌های NK موش را با Acein ترکیب کردیم تا موش‌های مسن را درمان کنیم. ما وضعیت سلول‌های NK را در خون محیطی موش‌ها پس از درمان شناسایی کردیم و دریافتیم که تعداد سلول‌های NK در خون محیطی تزریق سلول‌های NK به تنهایی یا سلول‌های NK ترکیب شده با آسئین به طور قابل‌توجهی بیشتر از گروه تیمار شده با آس بود و گروه PBS، در حالی که تعداد سلول های NK بین گروه تیمار شده با سلول های NK و سلول های NK ترکیب شده با گروه تیمار شده با آسئین تفاوت معنی داری نداشت (شکل 5C، D).دوز cistanche tubulosa redditتشخیص بیشتر سطح فعال‌سازی سلول‌های NK نشان داد که سطح بیان CD69 در سلول‌های NK خون محیطی در گروه تیمار شده ترکیبی به طور قابل‌توجهی نسبت به گروه تیمار شده با سلول‌های NK افزایش یافته است (شکل 5E). در مرحله بعد، SNC ها را در بافت ارزیابی کردیم. ما دریافتیم که تزریق سلول های NK به تنهایی بیان برخی از نشانگرهای پیر را در مقایسه با گروه PBS و گروه تحت درمان با آسئین کاهش می دهد، در حالی که تزریق سلول های NK همراه با آسئین به طور قابل توجهی سلول های SA{2} gal مثبت را کاهش می دهد (شکل 5F). و همچنین سطح بیان P16 و P21 (شکل 5G، شکل تکمیلی 4A، B) در بافت چربی، در مقایسه با درمان سلول های NK به تنهایی. تعداد Ki67BrdUcells در بافت چربی نیز به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 5H) که بیشتر ثابت کرد که محتوای SNCs در بافت چربی در گروه تیمار شده ترکیبی کمتر بود. رنگ آمیزی SA{11}}گال برش های کبد، ریه، کلیه و چربی نیز کمترین سطح SNC را در گروه درمان ترکیبی نشان داد (شکل تکمیلی 5A-D). این نتایج نشان داد که سلول‌های NK همراه با درمان با آسئین، سطح فعال‌سازی سلول‌های NK را در موش‌ها افزایش داده و باعث حذف قابل‌توجهی SNCs در داخل بدن می‌شوند.

آس همراه با سلول های NK فنوتیپ های مرتبط با سن را در موش های مسن کاهش می دهد

برای تایید بیشتر فنوتیپ‌های مرتبط با سن در موش‌ها، بافت‌های کبد، ریه، کلیه، چربی و چشم برای شناسایی انواع نشانگرهای پیری از جمله فاکتورهای P16، P21 و SASP جمع‌آوری شدند. این نمونه‌ها به این دلیل انتخاب شدند که این بافت‌ها با افزایش سن احتمال پیری بیشتری دارند [31]. در هر بافت، پس از تزریق سلول های NK به تنهایی، سطوح mRNA فاکتورهای P16، P21 و SASP به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل بود، در حالی که سطوح نشانگرهای پیری در بافت های کبد، چربی و حوا در تیمار ترکیبی گروه در مقایسه با گروهی که تنها با انفوزیون سلول NK درمان شده بود کاهش بیشتری داشت (شکل 6A). به طور مشابه، ما همچنین فاکتور اصلی SASP را در سرم موش ها شناسایی کرده ایم و نتایج با نتایج در بافت ها مطابقت دارد (شکل 6B). علاوه بر این، ما همچنین سطوح NAD را در کبد و بافت چربی بررسی کرده‌ایم که با پیری مرتبط است [32]. ما دریافتیم که تزریق سلول های NK به تنهایی یا در درمان ترکیبی به طور قابل توجهی محتوای NAD را در کبد و بافت چربی افزایش می دهد، سطح بهبود به طور قابل توجهی در گروه درمان ترکیبی بالاتر است (شکل 6C). برخی از شاخص های بیوشیمیایی سرم از جمله ALT، AST، CREA، UA، CHOL و BUN با سطوح پیری مرتبط هستند [33]. ما دریافتیم که تنها UA به طور قابل توجهی در سرم موش‌های گروه تحت درمان با ترکیب کاهش یافت، در حالی که سایر شاخص‌های کلیدی بیوشیمیایی کاهش یافت.

مواد و روش ها تزریق سلول های NK انسان

انفوزیون سلول NK اتولوگ توسط بیمارستان سرطان شانگهای منگچائو (شانگهای، چین) انجام شد و همه پروتکل‌ها توسط کمیته اخلاقی آن‌ها (شماره 05،2020، کمیته اخلاق پزشکی بیمارستان سرطان شانگهای منگچائو) تأیید شد. همه داوطلبان برای دریافت خون محیطی رضایت آگاهانه امضا شده ارائه کردند. به طور خلاصه، 50 میلی‌لیتر خون محیطی از هر فرد استخراج شد، پس از آن سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (PBMCs) جداسازی و به یک فلاسک T75 با ExCellerate" Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems، USA) حاوی 1×Cloudz CD2/NKp46 منتقل شدند. , IL نوترکیب انسانی-2(27ng/mL), نوترکیب Human L-12 (10ng/mL), IL نوترکیب انسانی-18 (10ng/mL, and Human L recombinant{{ 13}}(10ng/mL)(R&D Systems, USA) به مدت 48 ساعت و سپس با محیط فعال (270ng/mL recombinant Human IL{17}}, 20ng/mL recombinant Human IL{19}} جایگزین شد. 20 نانوگرم در میلی لیتر IL نوترکیب انسانی-18 و 20 نانوگرم در میلی لیتر IL نوترکیب انسانی-21) برای کشت بیشتر. تراکم سلولی در 10×1 درجه سلول در میلی لیتر حفظ شد. در روز 28 کشت تعداد کمی سلول NK اتولوگ برای کنترل کیفیت جمع‌آوری شد و به همراه سلول‌های NK اتولوگ با تراکم 4.15×10 درجه (3.{31}}.87×10)، با زمان انفوزیون 30 دقیقه مجدداً داخل وریدی تزریق شد. فرآیند آزمایشی به صورت آکوردا انجام شد با عمل بالینی خوب. فاصله زمانی برای خونگیری دوم حدود 37 (25-57) روز بود.

جداسازی سلول‌های T خون محیطی انسان و سلول‌های NK خون تازه از داوطلبان سالم پس از ارائه رضایت آگاهانه گرفته شد و پروتکل توسط هیئت بازبینی سازمانی دانشگاه دارویی چین تأیید شد (شماره مجوز: SYXK2016-0011). Lymphoprep (STEMCELL Technologies، کانادا) برای جداسازی PBMC های انسانی استفاده شد. سلول های CD3 به علاوه T انسانی از PBMC ها با استفاده از دانه های مغناطیسی مرتب سازی سلول های CD3 انسانی (Miltenyi Biotec، آلمان) مطابق با پروتکل سازنده به دست آمد. سلول‌های NK با استفاده از کوکتل غنی‌سازی سلول‌های NK انسانی RosetteSep (STEMCELL Technologies) طبق پروتکل سازنده از خون محیطی جداسازی شدند.

جداسازی و گسترش سلول‌های NK موش در شرایط آزمایشگاهی

سلول‌های NK طحال موش با استفاده از کیت جداسازی سلولی NK (Miltenyi Biotec) طبق دستورالعمل سازنده جداسازی شدند. به طور خلاصه، طحال موش به دست آمد، سلول‌های طحال با استفاده از فیلتر سلولی 70 میکرومتری فیلتر شدند و لنفوسیت‌های طحال با سانتریفیوژ گرادیان چگالی با استفاده از کیت جداسازی لنفوسیت طحال موش (Solarbio، چین) به‌دست آمدند. لنفوسیت های طحال برای به دست آوردن سلول های NK با خلوص بالا با استفاده از دانه های مغناطیسی برای جداسازی سلول های NK موش جمع آوری شدند. سلول‌های NK طحال جدا شده در محیط نگهدارنده RPMI{2}} حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (FBS)، 1 درصد ال-گلوتامین، 1 درصد پنی‌سیلین/استرپتومایسین، 1 درصد محیط‌زیست حداقل ضروری (MEM) غیرغیر کشت داده شدند. اسید آمینه ضروری، 1 درصد اسید پیروات سدیم و 50 میکرومولار مرکاپتواتانول (همه از Life Technologies، ایالات متحده). علاوه بر این، 200 واحد بین‌المللی در میلی‌لیتر اینترلوکین نوترکیب 2 (RL{13}}) (PeproTech، ایالات متحده آمریکا) و 10 نانوگرم در میلی‌لیتر موش I-15(ml-15) (PeproTech) به متوسط. سپس سلول‌های NK 10 درجه و لنفوسیت‌های طحال تحت تابش 10 درجه جمع‌آوری شدند و محیط تقویتی 5 میلی‌لیتری (محیط نگهدارنده حاوی 1000 IU/mL rlL{21}}، 10ng/mL ml-15 و 30ng/ml anti آنتی بادی NKp46 (PA{27}}، Invitrogen، USA)) بود

شکل 3 SNC ها سلول های NK را فعال می کنند و توسط سلول های NK کشته می شوند. فلوسیتومتری برای تشخیص بیان (A) CD69 و (B) IFN-y پس از 24 ساعت انکوباسیون همزمان با سلول‌های NK موش و پره‌آدیپوسیت‌ها یا پیش‌آدیپوسیت‌های ناشی از تابش انجام شد. n =3. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه می شوند. تفاوت ها با استفاده از آزمون t ناپارامتریک جفت نشده دو دنباله ارزیابی شد. **پ<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

استخراج پیش آدیپوسیت ها و سلول های ماهواره ای ماهیچه ای

پرآدیپوسیت ها همانطور که قبلا توضیح داده شد استخراج شدند [11]. به طور خلاصه، چربی انسان یا موش تحت شرایط استریل برداشته شد و به قطعات 1-2 میلی متری بریده شد، دو بار با PBS شسته شد و با کلاژناز ll (Solarbio) در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت هضم شد. سپس سلول‌ها با فیلتر سلولی 100 میکرومتری فیلتر شدند و در 300 گرم به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ و جمع‌آوری شدند. سلول های چسبنده در a-MEM حاوی 20 درصد FBS به مدت 12 ساعت کشت داده شدند و برای جمع آوری سلول های چسبنده با تریپسین هضم شدند. سلول های ماهواره ای ماهیچه ای همانطور که قبلاً توضیح داده شد جدا شدند [34]. عضله چهار سر ران به قطعات 1-2 میلی متر بریده شد و 5 میلی لیتر کلاژناز ll برای هضم در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 12 دقیقه اضافه شد. مخلوط با یک پیپت مخلوط شد و یک محیط کامل 5 میلی لیتری پس از هضم اضافی به مدت 12 دقیقه اضافه شد. سلول ها با استفاده از فیلتر سلولی 70 میکرومتری فیلتر شدند و در 300 گرم به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. سپس سلول ها بودند

کشت با 5 میلی لیتر محیط کشت به مدت 4 روز. سلول های چسبنده با پیپت دمیده شدند و به مدت 5 دقیقه در 2000×g سانتریفیوژ شدند. پس از هضم تریپسین در دمای 37 درجه به مدت 5 دقیقه، سلول ها به مدت 5 دقیقه در گرما 2000 سانتریفیوژ و جمع آوری شدند. سپس 5 میلی لیتر F{9}} محیط ژامبون حاوی 20 درصد FBS و 4 نانوگرم در میلی لیتر فاکتور رشد پایه فیبروبلاست (PeproTech) اضافه شد.

سمیت سلولی سلول‌های NK طحال موش به SNC با استفاده از روش لاکتات دهیدروژناز شناسایی شد.

SNC ها توسط 0.2 میکرومولار آدریامایسین (MedChemExpress، ایالات متحده) به مدت 24 ساعت یا با ادامه کشت به مدت 20 روز پس از تابش اشعه ایکس 10 گری القا شدند. سپس 5000 SNC در یک صفحه قرار داده شد و سلول‌های NK طحال (قابلیت زنده‌مانی سلول: 93.{8}}.1 درصد) در نسبت‌های اثرگذار به هدف 50:1،25:1،12.5:1، 6.25 اضافه شدند: 1،3.125:1، و 1.563:1. مواد رویی پس از کشت همزمان در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت جمع آوری شدند و از کیت تشخیص سمیت سلولی لاکتات دهیدروژناز (LDH) (Cayman Chemical، USA) برای تشخیص استفاده شد. سمیت سلولی با فرمول زیر محاسبه شد: سمیت سلولی (درصد)=(آزمایش سلولی مخلوط- سلول خود به خودی-اثرگر خود به خودی سلول هدف)/(سلول هدف حداکثر- سلول هدف خودبخودی)× 100.

تصویربرداری زنده

دوازده موش C57BL/6 10- هفته‌ای از Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (جیانگ سو، چین) خریداری شدند. سپس کنترل دارای برچسب 1×10 درجه 1,1'-octadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine iodide (DiR) (Invitrogen)

پیش‌آدیپوسیت‌ها یا پیش‌آدیپوسیت‌های پیری ناشی از تشعشع در 200 uL سالین بافر فسفات (PBS) مجدداً معلق شدند و با یک سوزن 22 به داخل حفره شکمی موش‌ها تزریق شدند. پس از سه روز، سلول‌های NK آلوژنیک 5×10 درجه (بیندگی سلولی: 93.{7}}.2 درصد) در 100 میکرولیتر PBS از طریق ورید دم تزریق شد. در روز دهم، موش ها با ایزوفلوران بیهوش شدند. فلورسانس با استفاده از MS 100 Series In Vivo Imaging System (PerkinElmer, MA, USA) شناسایی شد.

فلوسیتومتری

برای تشخیص آپوپتوز SNC های انکوبه شده با سلول های NK طحال نشاندار شده با DiR (بیندگی سلولی: 91.{3}}.2 درصد)، SNC های 1×10 درجه با دقت در دمای 37 درجه به مدت 10 دقیقه هضم شدند و سپس رنگ آمیزی شدند. با کیت رنگ آمیزی آپوپتوز Annexin V و Propidium Iodide (PI) (Multisciences Biotech, Ltd., China) طبق پروتکل سازنده. SNC ها در موقعیت DiR منفی قرار گرفتند. برای آزمایش فعال‌سازی سلول‌های NK، سلول‌های NK موش جمع‌آوری شدند و با mNK1 رنگ‌آمیزی شدند. 17}}PE-Cy7) (H1.2F3) (Biolegend، ایالات متحده آمریکا) در 4 درجه به مدت 30 دقیقه. سپس سلول‌ها با کیت CytodexCytoperm Plus (BD Biosciences، USA) پردازش شدند و با اینترفرون موش گاما برلیانت بنفش 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) در دمای 4 درجه به مدت 30 دقیقه رنگ‌آمیزی شدند. رنگ‌آمیزی پرفورین-APC(S16009A) سلول‌های NK انسانی با استفاده از همان پروتکل مورد استفاده برای رنگ‌آمیزی خارج سلولی (CD{35}}فلورسئین ایزوتیوسیانات [FITC] (5.1H11)، CD{39}}PE (FN50) انجام شد. ) و رنگ آمیزی داخل سلولی (پرفورین-APC) (Biolegend).

برای شناسایی سلول‌های NK خون محیطی، 100 میکرولیتر خون ضد انعقاد جمع‌آوری شد. برای خون محیطی موش، CD3-FITC، NK1.1-APC، و CD69-PE-Cy7 اضافه شد. برای خون محیطی انسان، CD{7}}BV421 (OKT3) و CD{10}}FITC اضافه شد و به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.

سپس 400 میکرولیتر 1× lysate گلبول قرمز (BD Biosciences) اضافه شد و به مدت 3 دقیقه انکوبه شد و سپس سه بار شستشو با PBS انجام شد. برای تشخیص تکثیر سلولی در بافت چربی، 200 میکرولیتر 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر برومودئوکسی‌اوریدین (BrdU) 24 و 72 ساعت قبل از اتانازی به موش‌ها به صورت داخل صفاقی تزریق شد. پس از اتانازی، ذخایر چربی مغبنی خارج شده و به قطعات بریده شد، در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه با کلاژناز ll و DNase هضم شد و با استفاده از فیلتر سلولی 100 میکرونی فیلتر شد. سلول‌ها با کیت Cytofix/Cytoperm Plus پردازش شدند و با BrdU-FITC (3D4) و Ki{13}}PE (16A8) رنگ‌آمیزی شدند. فلوسیتومتری بر روی فلوسایتومتر CytoFLEX انجام شد. کیت رنگ آمیزی سلول های مرده بنفش LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Stain (Thermo Fisher Scientific, USA) برای حذف سلول های مرده در تمام آزمایش ها استفاده شد. داده ها با استفاده از نرم افزار FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA) تجزیه و تحلیل شد.

رونویسی معکوس - کمی PCR

RNA با استفاده از معرف تریزول استخراج شد و با استفاده از کیت سنتز cDNA رشته اول مو (Yepsen Biotechnology، چین) معکوس و به cDNA رونویسی شد. PCR کمی (qPCR) با استفاده از مخلوط واکنش SYBR Green (Yepsen Biotechnology) روی سیستم PCR Real-Time ABC QuantStudio 3 (Applied Biosystems، ایالات متحده آمریکا) انجام شد که GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی عمل می کند. داده ها با استفاده از روش 2-△ACt تجزیه و تحلیل شدند. لیست توالی آغازگر در مواد تکمیلی (جدول 2-3) گزارش شده است.

رنگ آمیزی گالاکتوزیداز مرتبط با پیری

برای رنگ‌آمیزی سلول، سلول‌ها یک بار با PBS شسته شدند، در محلول گالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA{2}}gal) (Cell Signaling Technology، USA) در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه ثابت شدند، سه بار با PBS شسته شدند و انکوبه شدند. یک شب در محلول رنگ‌آمیزی SA{4}}گال در دمای 37 درجه سانتی‌گراد. صفحه با پارافیلم مهر و موم شد تا از تبخیر محیط رنگ‌آمیزی جلوگیری شود. سلول ها

با PBS شسته و با میکروسکوپ مشاهده شدند. برای رنگ‌آمیزی بخش یخ‌زده، بخش‌ها در دمای 37 درجه به مدت 3{11}}دقیقه خشک و در دمای اتاق در محلول تثبیت SA{2}} به مدت 15 دقیقه ثابت شدند. مقاطع سه بار با PBS شسته و به مدت یک شب در محلول رنگ آمیزی SA{4}gal در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. سپس به مدت 1 دقیقه با ائوزین رنگ آمیزی شدند و به مدت 2 دقیقه با آب شستشو داده شدند. داده‌های رنگ‌آمیزی SA{8} با استفاده از نرم‌افزار Image-Pro Plus 6.0 تجزیه و تحلیل شد.

ریزنمونه های بافت چربی انسانی

بافت چربی از سه فرد با لیپوساکشن به دست آمد. یکی از آزمودنی ها مرد و دو نفر زن بودند. میانگین سنی افراد مورد مطالعه 57 سال بود.{1}}±7.6 سال (میانگین±انحراف معیار: محدوده، 50-65). میانگین BMI 40.5±5.1 کیلوگرم بر متر مربع (میانگین ± SD) بود. محدوده، 36.{10}}.2）. کمیته اخلاق بیمارستان سرطان شانگهای منگچائو (شماره 05، 2020، کمیته اخلاق پزشکی بیمارستان سرطان شانگهای منگ چائو) طرح آزمایشی را تأیید کرد. رضایت آگاهانه برای همه داوطلبان اخذ شد. بافت چربی به قطعات کوچک با قطر حدود 2 میلی متر بریده شد. پنج تکه بافت در هر چاهک از یک صفحه چاهک، و 200 میکرولیتر از پیش‌آدیپوسیت‌ها یا محیط مطبوع از پیش‌آدیپوسیت‌های پیر ناشی از تشعشع، با 10 درصد سرم AB انسانی، 1 درصد ال-گلوتامین، 1 قرار داده شد. درصد پنی سیلین/استرپتومایسین، 1 درصد اسیدهای آمینه غیر ضروری MEM و 1 درصد اسید پیروات سدیم، به مدت 24 ساعت به کشت همزمان اضافه شد. سپس محیط با محیط تازه حاوی سلول‌های NK اتولوگ 5×10 درجه (زنده‌پذیری سلول: 92.{30}}.7 درصد 6) جایگزین شد و به مدت 48 ساعت دیگر کشت داده شد و پس از آن سلول‌های NK برای فلوسیتومتری جمع‌آوری شدند. بافت چربی پنج بار با PBS شسته شد و همان محیط برای کشت بیشتر به مدت 48 ساعت اضافه شد. مایع رویی (100 uL) برای تشخیص چند عاملی استفاده شد. پیش‌آدیپوسیت‌ها یا پیش‌آدیپوسیت‌های پیری ناشی از تشعشع از بافت چربی همان فرد مشتق شده‌اند.

این مقاله از مرگ سلولی و بیماری (2022) 13:305 استخراج شده است