میعانات Imd تنظیم شده با تافلاوین کنترل هموستاز روده مگس سرکه و پیری قسمت 2

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

زمینه:فیبروز یکی از شایع ترین ویژگی های پاتولوژیک فرآیند پیری کلیه است و فیبروز در کلیه های پیر نیز روند بیماری مزمن کلیوی (CKD) را تشدید می کند. Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata، CF) یک داروی گیاهی رایج در فرهنگ عامه چینی است. با این حال، مطالعات کمی اثرات دارویی آن را گزارش کرده اند. این مطالعه با هدف بررسی اثر عصاره اتانولی CF بر فیبروز کلیه در موش SAMP8 و شناسایی ترکیبات فعال بالقوه انجام شد.

مواد و روش ها:موش مستعد پیری 8 (SAMP8) به عنوان مدل حیوانی استفاده شد و دوزهای مختلف CF به مدت یک ماه به صورت گاواژ داده شد. برای مشاهده درجه پیری کلیه در موش با استفاده از رنگ آمیزی گالاکتوزیداز. رنگ آمیزی ماسون و سطوح بیان Col-lI، a-SMA و FN برای ارزیابی فیبروز کلیه در موش استفاده شد. سطح بیان پروتئین مسیر Nrf2 و مسیر Wnt/-catenin/RAS در کلیه اندازه‌گیری شد. و گالاکتوزیداز (-gal) سلول های NRK{11}}E را به عنوان یک مدل آزمایشگاهی برای غربالگری اجزای فعال CF القا کرد.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

نتایج:عصاره اتانولی CF به طور قابل توجهی فعالیت گالاکتوزیداز کلیوی و سطح بیان موش های Coll، a-SMA و FNin SAMP8 را مهار کرد و رنگ آمیزی ماسون را در موش SAMP8 بهبود بخشید. CF بطور قابل توجهی پروتئین ادرار، کراتینین، نیتروژن اوره و سطوح سرمی TNF-a و IL{5}} را در موش SAMP8 کاهش داد و سطوح SOD و GSH-Px را به طور قابل توجهی افزایش داد. علاوه بر این، CF مسیر Nrf2 را فعال کرد و مسیر Wnt/ -catenin/RAS را در کلیه‌های موش مسدود کرد. علاوه بر این، 3،{11}}دی هیدروکسی فنیل اتانول (SDC{12}}،16) و (3،{15}}دی هیدروکسی فنیل اتانول{16}}O-[4-O-trans -کافئویل{21}}D-apiofuranosy-(1→3){26}}}}D-glucopyranosyl (1→6)]{30}}}}}D-glucopyranoside (SDC{32}}) از CF جدا شد که باعث کاهش پیری سلولهای NRK{33}}E می‌شود و احتمالاً مواد فعال CF نقش ضد پیری را ایفا می‌کنند.

نتیجه گیری:آزمایش‌های ما نشان داد که عصاره اتانولی CF ممکن است فیبروز کلیه را در موش‌های SAMP8 از طریق مسیر Wnt/-catenin/RAS بهبود بخشد. و SDC-0-14،16 و SDC-1-8 ممکن است مبنای مادی برای CF برای اعمال اثرات ضد پیری کلیوی باشند.

کلید واژه ها:پیری، Corallodiscus flabellata، کلیه، فیبروز کلیه، SAMP8، پیری، Wnt/ -catenin/RAS

مقدمه

شیوع جهانی بیماری مزمن کلیه (CKD) با افزایش سن جمعیت در حال افزایش است و بار قابل توجهی برای جامعه ایجاد می کند [1-3]. شایع ترین تظاهرات پاتولوژیک CKD نوعی فیبروز کلیه است[4]. به همین ترتیب، فیبروز کلیه نیز یکی از علائم پیری کلیه است [2]. مطالعات نشان داده اند که استرس اکسیداتیو، التهاب، Wnt/-catenin، سیستم رنین-آنژیوتانسین-آلدوسترون (RAS) و سیگنال دهی راپامایسین (mTOR) همگی با CKD ناشی از پیری مرتبط هستند [5]. فیبروز کلیوی در کلیه های پیر ارتباط نزدیکی با فعال شدن مسیر سیگنالینگ Wnt/-catenin و RAS دارد [6]. پس از فعال شدن Wnts، -catenin در سیتوپلاسم به هسته منتقل می شود، جایی که به فاکتور اتصال تقویت کننده لنفوئیدی (LEF) / خانواده فاکتور رونویسی فاکتور سلول T (TCF) متصل می شود و رونویسی ژن های هدف پایین دست را آغاز می کند. جالب اینجاست که ناحیه پروموتر ژن RAS همچنین حاوی محل‌های اتصال LEF/TCF است که به -catenin اجازه می‌دهد تا اتصال LEF{14}} را به این سایت‌ها ترویج کند[7].کلسترول سیستانچ،بنابراین، هدف قرار دادن مسیر سیگنالینگ Wnt/ -catenin/RAS می تواند یک استراتژی درمانی بالقوه برای فیبروز کلیه باشد [8،9]. در سال های اخیر، درمان جایگزینی فیبروز کلیه با محصولات طبیعی توجه بسیاری از محققان را به خود جلب کرده است [10]. . Xiaoyan Shen و همکاران دریافتند که جین سنوزید Rgl فیبروز گلومرولی را در طی پیری کلیه با مهار فعال شدن NLRP3 التهابی در موش SAMP8 بهبود می بخشد [11]. این مطالعه به بررسی اثر عصاره C. flabellate (CF) بر فیبروز کلیه در موش SAMP8 از مسیر Wnt / -catenin / RAS پرداخت.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

CF به عنوان یک گیاه دارویی در چین برای اولین بار در "دیان نان بن کائو" ثبت شد. این گیاه کامل معمولاً برای درمان اسهال خونی، انزال زودرس، بیماری وزیکول منی و بیماری کلیوی در مناطق اقلیت قومی چین استفاده می شود [12]. مطالعات فارماکولوژیک در آزمایشگاه ما نشان داد که عصاره CF دارای اثرات دیورتیک و بهبود نارسایی کبدی ناشی از لیپوپلی ساکارید/D-گالاکتوزامین و آسیب مغزی در موش صحرایی است [13، 14] و مطالعات فیتوشیمیایی بر روی نشان داد که گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید و فلاونوئیدها اجزای شیمیایی اصلی CF هستند [15،16].هدف از این مطالعه بررسی اثر عصاره CF بر فیبروز کلیه در موش SAMP8 و روشن کردن مکانیسم احتمالی آن بود تا بتوان آن را ارائه کرد. شواهد تجربی برای درمان بیماری کلیوی با CF شرح داده شده در کتاب های باستانی.

مواد و روش ها

جمع آوری و استخراج مواد گیاهی

"Yunnan Chinese Herbal Medicine" ثبت کرده است که CF را می توان در طول سال برداشت کرد. گیاهان CF مورد استفاده در این آزمایش در شهرستان Xixia، استان هنان، چین در ماه سپتامبر برداشت شدند. توسط پروفسور Suiqing Chen از دانشگاه پزشکی چینی Henan شناسایی شد و نمونه ها در کتابخانه نمونه های آزمایشگاهی ذخیره شدند.عوارض جانبی cistanche deserticolaگیاهان (1 کیلوگرم) با 50 درصد اتانول (3×12 لیتر، هر 1 ساعت) رفلاکس شدند و مخلوط با 16 لایه گاز صاف شد. فیلترهای ترکیبی با تبخیر چرخشی با استفاده از خشک کن انجمادی خشک شدند. در نهایت، درصد بازده عصاره خام اتانولی 50 درصد CF 15.5 درصد بود. عصاره خشک شده تا استفاده بعدی در یخچال نگهداری می شود. مواد تکمیلی داده های مربوطه را در مورد تعیین مواد تشکیل دهنده عصاره CF فهرست می کنند.

فرآیند جداسازی دیگری که قبلا گزارش شده بود در این مطالعه برای به دست آوردن کسر شستشوی آب، کسر شستشوی اتانول 20 درصد، کسر شستشوی اتانول 30 درصد و کسر شستشوی اتانول 40 درصد از CF استفاده شد [13]. بخش 40 درصد اتانول با استفاده از ستون سفادکس LH-20 و سیلیکاژل جدا شد و با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا نیمه آماده‌ای (HPLC) خالص شد تا در نهایت ترکیباتی مانند SDC-0-14،16، SDC به دست آید. {10}}، SDC{11}}(p-هیدروکسی بنزیل الکل).

حیوانات و اداره

در این مطالعه از موش‌های نر شش ماهه SAMP8 و مقاوم به پیری 1 (SAMR1) از اولین بیمارستان وابسته دانشگاه طب سنتی چینی تیانجین (تیانجین، چین) استفاده شد. حیوانات تحت شرایط نور کنترل شده (12- ساعت چرخه نور/تاریکی)، دما ({7}} درجه سانتیگراد) و رطوبت (45-55 درصد) قرار گرفتند و رژیم غذایی استاندارد و آگهی آب دریافت کردند. آزادانه در مجموع 48 موش SAMP8 به چهار گروه آزمایشی (n=12/گروه) تقسیم شدند: موش‌های مدل SAMP8 (M)، موش‌های SAMP8 تیمار شده با عصاره اتانول CF با دوز پایین (CF-L، 387.5 میلی‌گرم بر کیلوگرم، داخل معده)، موش SAMP8 تحت درمان با عصاره اتانول CF با دوز متوسط ​​(CF-M, 775 mg/kg، داخل معده) و موش SAMP8 تحت درمان با عصاره اتانول CF با دوز بالا (CF-H, 1550 mg/) کیلوگرم، داخل معده). موش‌های گروه شاهد SAMRI (Con, n{29}}) و مدل SAMP8 (M) با سالین فیزیولوژیک (9/0 درصد) تیمار شدند. تمام موش ها به مدت 1 ماه به صورت خوراکی تحت درمان قرار گرفتند. همه آزمایش‌های حیوانی توسط کمیته اخلاق دانشگاه پزشکی چینی هنان تأیید شد و تحت دستورالعمل‌های سازمانی (هنان، شماره تأیید چین: HACTCM-2018009060-19) انجام شد. در طول آزمایش، یک مرگ موش در هر یک از گروه های Con و M وجود داشت و دو موش در گروه CF-H مردند.

مجموعه نمونه

در پایان آزمایش، موش‌ها به‌صورت جداگانه در قفس‌های متابولیک برای 12- ساعت جمع‌آوری ادرار قرار گرفتند. سپس موش ها با ایزوفلوران بیهوش شدند و نمونه های خون از طریق خونریزی رترو-اوربیتال جمع آوری شد. سپس کلیه‌های هر موش با عمل جراحی برداشته شد و در دمای 80 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

کشت سلولی و مطالعه آزمایشگاهی

سلول‌های NRK{0}E خریداری شده از بانک سلولی آکادمی علوم چین (شانگهای، چین) برای بررسی تأثیر عصاره CF بر پیری سلولی ناشی از D-گالاکتوز (D-gal، S11050، Yuanye، شانگهای، چین). سلول‌های NRK{4}}در اصلاح Dulbecco از محیط Eagle Dulbecco (DMEM,12,100,046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA) با 10 درصد سرم جنین گاوی در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و در حضور 5 رشد کردند. درصد، سلول‌های CO. در 96-صفحه‌های چاهکی یا 6-صفحه‌های چاهک تا 80-85 درصد تلاقی رشد کردند و سپس با محیط‌های رشد حاوی ترکیبات مختلف دارویی تیمار شدند: Media + D-gal ( 20 میلی‌گرم در میلی‌لیتر، مدیا به‌علاوه D-gal به‌علاوه CF (10، 25،50، 100 میکروگرم در میلی‌لیتر) یا مدیا به‌علاوه D-gal به‌علاوه ترکیب مونومر (10 میکرومولار) به‌ترتیب برای 48 ساعت. پس از آن، متیل تیازولیل تترازولیوم ( روش MTT) برای تشخیص زنده ماندن سلول، و رنگ آمیزی -گالاکتوزیداز برای مشاهده پیری سلول استفاده شد.

رنگ آمیزی گالاکتوزیداز مرتبط با پیری

کلیه‌های یخ‌زده موش‌هایی که به بخش‌هایی با ضخامت 10-μm و سلول‌های NRK{2}} بریده شده بودند با گالاکتوزیداز مرتبط با پیری رنگ‌آمیزی شدند (SA{5}gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) پیروی از پروتکل های سازنده

تجزیه و تحلیل بافت شناسی

مقاطع کلیه با 4 درصد پارافورمالدئید بافر تثبیت شدند و مقاطع پارافینی با ضخامت 10- میکرومتر با تری کروم ماسون (G1{9}}06، سرویس، ووهان، چین) رنگ آمیزی شدند و به صورت میکروسکوپی مشاهده شدند. نواحی آبی رنگ در مقاطع رنگ آمیزی شده با تری کروم ماسون به صورت کمی از شش میدان به طور تصادفی انتخاب شده اندازه گیری شد و با نرم افزار Image-Pro Plus 6.0 تجزیه و تحلیل شد.

اندازه گیری های بیوشیمیایی

نمونه‌های هموژنه سرم و کلیه تا دمای اتاق ذوب شدند و سطوح سوپراکسید دیسموتاز (SOD، CSB-E08556m، ووهان هوآمی، ووهان، چین)، گلوتاتیون پراکسیداز (GSH-Px، A{3}}، نانجینگ جیان‌چنگ، نانجینگ، چین)، اینترلوکین-1 (IL{5}}، RK00006، ABclonal، ووهان، چین)، فاکتور نکروز تومور- (TNF-، RK00027، ABclonal، ووهان، چین)، نیتروژن اوره (C{ {10}}، Nanjing Jiancheng، Nanjing، چین)، کراتینین (Cr، C{11}}، Nanjing Jiancheng، Nanjing، چین) در سرم موش، پروتئین کل ادرار (C035-2-1)، Nanjing Jiancheng، Nanjing ، چین) در ادرار موش و سطح بیان کلاژن نوع I (Col-I، MU30364، Bio-Swamp، ووهان، چین)، اکتین عضلات صاف (-SMA، MU30359، Bio-Swamp، ووهان، چین)، فیبرونکتین (FN، MU30179، Bio-Swamp، ووهان، چین) در بافت کلیه موش به ترتیب طبق پروتکل سازنده کیت سنجش اندازه گیری شد.

تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی

آنالیز ایمونوهیستوشیمی با استفاده از روش معمول [17] انجام شد. آنتی بادی های مورد استفاده شامل موارد زیر بودند: Wnt4 (14371-1-AP، Proteintech، شیکاگو، ایالات متحده آمریکا)، -catenin (17565-1-AP، Proteintech، شیکاگو، ایالات متحده)، گیرنده های آنژیوتانسین II نوع 1 (AGTR1،{{{{ 7}}AP، Proteintech، شیکاگو، ایالات متحده)، اریتروئید فاکتور p-هسته‌ای 2-مربوط به فاکتور 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, UK), pc-Fos(ab27793,Abcam,Cambridge, UK فاکتور رشد بافت همبند (CTGF، GB11078، سرویس، ووهان، چین). مقاطع زیر میکروسکوپ (المپوس، توکیو، ژاپن) مشاهده شدند.دوز cistanche redditمساحت و چگالی نوری یکپارچه (IOD) ناحیه را با بیان قهوهای مایل به زرد با استفاده از نرم افزار Image-Pro Plus 6 اندازه گیری کنید.0 و میانگین چگالی نوری (MOD، MOD=IOD/مساحت) نیمه را محاسبه کنید. -تجزیه و تحلیل کمی.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

سنجش وسترن بلات همانطور که در مطالعه قبلی توضیح داده شد [18] انجام شد. به طور خلاصه، بافت‌های کلیه در بافر لیز همگن شدند و با استفاده از کیت سنجش پروتئین برادفورد (AR0197، Boster Biological Technology، ووهان، چین) کمی شدند. سپس هموژن ها تحت الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات- پلی آکریل آمید قرار گرفتند، به غشای پلی وینیلیدین فلوراید منتقل شدند و به مدت 90 دقیقه در بافر مسدود کننده (4 درصد شیر خشک بدون چربی) مسدود شدند. آنها سپس با آنتی بادی های اولیه (Wnt4؛ رنین؛ AGTR1؛ p-Nrf2؛ pc-Fos؛ پروتئین مرتبط با ECH 1 شبه کلچ (Keapl، GB11847، Service-bio، ووهان، چین) انکوبه شدند؛ -اکتین (AC026، Abclonal، ووهان، چین؛ و گلیسرآلدئید{17}}فسفات دهیدروژناز (GAPDH، AC033، Abclonal، ووهان، چین)) یک شبه در دمای 4 درجه، و پس از آن انکوباسیون با آنتی بادی ثانویه کنژوگه با حضور فلوئو به مدت 1 ساعت در دمای اتاق . پروتئین های مورد نظر با یک اسکنر IR Odyssey (LI-COR Biosciences، نبراسکا، ایالات متحده آمریکا) اسکن شدند و شدت سیگنال با استفاده از نرم افزار Image Studio اندازه گیری شد. سطح پروتئین در برابر -اکتین یا GAPDH نرمال شد.

تجزیه و تحلیل UPLC-Q-TOF-MS برای نمونه های کلیه

بافت‌های کلیوی در سالین فیزیولوژیک سرد یخی وزن و همگن شدند (w/v{1}}:1). سپس 1 میلی‌لیتر استونیتریل به 200 میکرولیتر نمونه‌های هموژنه بافت اضافه شد و پس از آن استخراج اولتراسونیک به مدت 30 دقیقه انجام شد. عصاره در 12،{7}} گرم و 4 درجه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی برای تجزیه و تحلیل به داخل ویال برده شد. جداسازی کروماتوگرافی بر روی کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده (UPLC) (Dionex Ultimate 3000 System، Thermo Scientific، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا) انجام شد، با سیستم LC که شامل ستون Acclaim RSLC 120 C18 (2.2 میکرومتر، 2.1×100 میلی متر) بود. Thermo Scientific).فواید عصاره سیستانچفاز متحرک شامل حلال A (استونیتریل) و آب با {0}}.1 درصد اسید فرمیک (B) بود. جداسازی با شستشوی گرادیان به شرح زیر انجام شد:10-70 درصد A از 0 به 3 دقیقه،70-78 درصد A از 4 تا 13 دقیقه،78-90 درصد A از 14 تا 15 دقیقه، 90 درصد -10 درصد A از 15 تا 16 دقیقه، و 10 درصد A از 16 تا 20 دقیقه. حجم تزریق نمونه آزمایشی 2μL بود. تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی (MS) با استفاده از منبع ESI در شرایط زیر انجام شد: ولتاژ مویرگی در حالت مثبت 3.5 کیلو ولت و ولتاژ مویرگی در حالت منفی 3.2 کیلو ولت بود. فشار نبولایزر 2.0 بار، دمای گاز خشک 230 درجه و سرعت جریان 8 لیتر در دقیقه بود.

تحلیل آماری

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; برای مقایسه بین گروه ها از تحلیل واریانس یک طرفه استفاده شد. مقدار AP کمتر از 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج

CF باعث بهبود پیری و فیبروز کلیه ها در موش SAMP8 شد

برای بررسی اثر CF بر کلیه‌های موش SAMP8، فعالیت SA{1} gal در کلیه‌ها اندازه‌گیری شد. در شکل la، فعالیت SA{2}}گال در بافت کلیه به طور قابل توجهی در گروه M (افزایش آبی) افزایش یافت. تجویز CF-L و CF-M به طور قابل‌توجهی فعالیت گالاکتوزیداز را در کلیه‌های موش SAMP8 مهار کرد در حالی که بهبود با CF-H معنی‌دار نبود. همچنین، شاخص کلیه گروه مدل به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل بود (شکل 1b، P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

CF عملکرد کلیه، استرس اکسیداتیو و سطوح التهاب را در موش SAMP8 بهبود بخشید

علاوه بر این، شاخص‌های عملکرد کلیوی هر گروه از موش‌ها مورد آزمایش قرار گرفت که شامل حجم ادرار در موش‌ها به مدت 12 ساعت، سطوح کروم و نیتروژن اوره در سرم و سطح پروتئین ادرار بود. همانطور که در شکل 2a-d نشان داده شده است، سطح پروتئین ادرار، کروم سرم و نیتروژن اوره سرم گروه مدل به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل بود (شکل 2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">سیستانچ چنگیز خاندر مرحله بعد، اینکه آیا CF به طور مفیدی استرس اکسیداتیو و التهاب را در کلیه‌های موش‌هایی که به سرعت پیر می‌شوند تعدیل می‌کند، مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 2e-h نشان داده شده است، سطوح SOD و GSH-Pxin در کلیه های گروه M به طور معنی داری کمتر از گروه Con و سطوح IL{3}} به طور قابل توجهی بالاتر از کلیه های گروه M بود. گروه Con. پس از درمان CF، شاخص های فوق بهبود یافته است، به خصوص اثر بهبود CF-L و CF-M بهتر است.

CF مسیر Nrf2 را در کلیه موش SAMP8 فعال کرد

سطح بیان p-Nrf2 در بافت کلیه اندازه گیری شد تا بررسی شود که آیا مسیر Nrf2 در اثر محافظتی CF (شکل 3a-c) در مطالعه حاضر نقش دارد یا خیر. سطح بیان p-Nrf2 به تنهایی در گروه SAMP8 به طور قابل توجهی کاهش یافت (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

CF فعال سازی سیگنالینگ Wnt/-catenin/RAS را در کلیه موش های SAMP8 ضعیف کرد.

به منظور بررسی بیشتر مکانیسم بالقوه CF که اثر ضد فیبروز را اعمال می کند. محلی سازی پروتئین با استفاده از روش ایمونوهیستوشیمی انجام شد. همانطور که در شکل 4a نشان داده شده است، سطح بیان Wnt4 و

کاتنین عمدتاً در سلول های توبولار کلیوی القا شد. نتایج مشابهی زمانی مشاهده شد که AGTR1، اهداف مسیر پایین دست سیگنالینگ Wnt، ارزیابی شد (شکل 4a). پس از آن، سطح بیان پروتئین کمی‌سازی شد و نتایج نشان داد که پروتئین‌های Wnt4، -catenin، رنین و AGTR1 در بافت کلیه موش‌های گروه مدل انباشته شده‌اند، در حالی که CF به طور قابل‌توجهی این تغییرات را مهار می‌کند (شکل 4b-f). ). علاوه بر این، سطح بیان CTGF نیز قرار گرفت و به صورت کمی آنالیز شد. مطابق با نتایج فوق الذکر، CTGF عمدتاً در لوله های کلیوی بیان شد و CF بطور قابل توجهی فعالیت CTGF را مهار کرد (شکل 4d g).

CF و ترکیبات آن از پیری سلول‌های NRK{0}} القا شده توسط D-gal جلوگیری می‌کنند.

سلول‌های NRK{2}} القا شده با D-gal برای غربالگری برخی از مواد فعال در CF، برای تعیین مبنای مادی برای درمان کلیه‌های پیر با عصاره CF مورد استفاده قرار گرفتند. نتایج نشان داد که CF زنده‌مانی سلولی را به صورت وابسته به دوز و ترکیبات افزایش می‌دهد

SDC-0-14، 16 و SDC-1-8 جدا شده از CF اثرات بهتری بر تکثیر سلولی داشتند. علاوه بر این، 25 ug/mL CF و ترکیبات SDC{4}}، 16 و SDC-1-8 همگی اثر مهار فعالیت -گالاکتوزیداز را نشان دادند (شکل 5).

CF تجزیه و تحلیل PCA بافت کلیه را در موش SAMP8 بهبود بخشید. تجزیه و تحلیل اجزای اصلی (PCA) برای بررسی اثرات CF بر روی موش SAMP8 انجام شد. همانطور که در شکل 6a نشان داده شده است، یک گروه بندی آشکار بین گروه کنترل و مدل وجود دارد (R2X{4}}.542؛ Q{2=0.38)، که نشان می دهد متابولیت های درون زا موش SAMP8 با SAMR1 متفاوت است. موش ها، که باعث انحراف آنها از گروه SAMR1 می شود. همانطور که در شکل 6b نشان داده شده است، گروه های CF مختلف نیز در کلاس های مختلف از گروه های کنترل و مدل قرار گرفتند و گروه های CF به گروه کنترل نزدیک تر شدند، که نشان می دهد

متابولیت های درون زا از موش SAMP8 با CF مداخله شبیه به آن از موش SAMR1 بود.

بحث

پیری نقش مهمی در پیشرفت CKD دارد [19]. همانطور که فیبروز CKD پیشرفت می کند، سلول های پیر فاکتورهای پیش فیبروتیک (TGF-، CTGF و غیره) و عوامل پیش التهابی (IL{4}}، IL-6، TNF- و غیره را بیان و ترشح می کنند. ) که فاکتورهای فنوتیپ ترشحی مرتبط با پیری هستند و در نتیجه فیبروز کلیه را تسریع می کنند [20، 21]. در حال حاضر، طب سنتی چینی نتایج خوبی در درمان فیبروز کلیه با عوارض جانبی کمتر به دست آورده است [22]. این مطالعه به بررسی اثرات مداخله ای عصاره CF بر فیبروز کلیه در موش SAMP8 پرداخت. سویه موش انتخاب شده برای این مطالعه SAMP8 بود که بر اساس طول عمر، پیری و امتیازات درجه بندی فنوتیپی پاتولوژیک موش های AKR/ توسعه یافت و یک مدل پیری تسریع شده تنها با منشاء ژنتیکی بود [23،24]. مطالعات نشان داده اند که تغییرات در آسیب شناسی کلیه موش SAMP8 (9 ماه) شامل فیبروز توبولو بینابینی و گلومرولواسکلروز سگمنتال کانونی است [25]. و مشخص شد که فیبروز کلیه در موشهای SAMP8 مربوط به سن است [6]. بنابراین، ما فعالیت -گالاکتوزیداز و

سطح فیبروز کلیه در موش SAMP8 و دریافت که CF-L و CF-M فیبروز کلیه و فعالیت -گالاکتوزیداز را در موش SAMP8 بهبود بخشیدند (شکل 1). و همچنین خروجی ادرار موش ها را آزمایش کردیم. مطابق با مطالعات منتشر شده قبلی که نشان می دهد CF به دست آمده توسط دو فرآیند مختلف دارای اثرات دیورتیک است [13]، عصاره به طور قابل توجهی حجم ادرار موش SAMP8 را افزایش داد. همچنین، مطالعه حاضر نشان داد که مکمل CF باعث بهبود عملکرد کلیه، فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی و سطوح فاکتورهای التهابی در موش SAMP8 شد (شکل 2).

سیستم Keap{0}}Nrf2 در سال‌های اخیر به دلیل خواص آنتی‌اکسیدانی و ضد التهابی‌اش مورد توجه بسیاری از محققان قرار گرفته است. پتانسیل دارویی آن در درمان بیماری های کلیوی به طور گسترده در مطالعات غیر بالینی و بالینی مورد مطالعه قرار گرفته است [26]. Nrf2 یک تنظیم کننده رونویسی اصلی برای ژن های مربوط به وضعیت ردوکس و اثرات آنتی اکسیدانی است [27]. مطالعات نشان داده اند که فسفوریلاسیون برای فعال سازی Nrf2 و القای ژن هدف مورد نیاز است [28]. فعال کردن Nrf2 با جلوگیری از استرس اکسیداتیو و حفظ هموستاز ردوکس سلولی، پیشرفت CKD را بهبود بخشید [29]. به عنوان یک فاکتور رونویسی کلیدی، Nrf2 با تنظیم آنتی اکسیدان های پایین دست و آنزیم های سم زدایی خود، نقش مهمی در دفاع در برابر استرس اکسیداتیو ایفا می کند [30]. کیم و همکاران گزارش داد که رسوراترول، به عنوان یک فعال کننده قوی Nrf2، آسیب پیشرونده کلیوی مرتبط با افزایش سن را بهبود می بخشد [31]. در مطالعه حاضر، CF تضعیف Nrf2 را در کلیه موش‌های SAMP8 بدون تأثیر بر سطح بیان Keapl بهبود بخشید، که نشان می‌دهد عصاره خام CF ممکن است با فعال کردن مسیر Nrf2 آسیب اکسیداتیو در کلیه‌ها را بهبود بخشد (شکل 3).

فیبروز کلیه با رسوب بیش از حد ماتریکس خارج سلولی (ECM) مشخص می شود که منجر به تشکیل اسکار در پارانشیم کلیه می شود [32]. تصور می شود که فاکتور رشد تبدیل کننده (TGF-) یک سیتوکین کلیدی در فعال سازی بیش از حد فیبروبلاست باشد [33، 34]. البته هدف قرار دادن تنها مسیر سیگنالینگ TGF- برای کاهش فیبروز کلیه کافی نیست. برخی از مطالعات نشان داد که CTGF، Wnt/-catenin، سیستم رنین-آنژیوتانسین، استرس اکسیداتیو و غیره در فیبروز کلیه نقش دارند [35-37]. Wnt/-catenin یک مسیر سیگنالینگ حفظ شده تکاملی است که در تنظیم هموستاز بافتی، رشد اندام ها و ترمیم آسیب دخیل است[38]. سیسترناس و همکاران در مورد اثر فیبروتیک سیگنالینگ Wnt هم در عضله اسکلتی و هم در کلیه بحث کرد [39]. شواهد در حال افزایش نشان می دهد که مسیر سیگنالینگ Wnt/ -catenin نقش مهمی در تنظیم توسعه و پیشرفت ضایعات فیبروتیک کلیه به دنبال آسیب دارد [{16}}]. سیگنال Wnt/-catenin در کلیه بزرگسالان سالم نسبتاً خاموش است و هنگامی که کلیه ها در معرض انواع آسیب قرار می گیرند فعال می شود [43].

در پستانداران، خانواده Wnt حداقل 19 عضو خانواده حیاتی برای رشد کلیه دارد. و حداقل 15 نفر از این اعضای خانواده به طور متفاوت در کلیه پیری تنظیم می شوند، از جمله Wnt4 [6]. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که سطح بیان پروتئین Wnt4 در کلیه موش‌های SAMP8 به‌طور قابل‌توجهی بالاتر از موش‌های SAMR1 بود که توسط وسترن بلات و آنالیزهای ایمونوهیستوشیمی تأیید شد (شکل 4a، d، و f). به طور تصادفی، سطح بیان پروتئین -catenin نیز تنظیم مثبت شد. همچنین، هر دو Wnt4 و -catenin در سلول های اپیتلیال لوله های کلیوی بیان شدند، همانطور که توسط تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی نشان داده شد (شکل 4a و f). Wnt/ -catenin با القای چندین ژن فیبروژنیک مانند اجزای RAS، ماتریکس متالوپروتئیناز{13}} (MMP{14}})، مهارکننده فعال کننده پلاسمینوژن 1 (PAI{16}})، و حلزون، فیبروز کلیه را برانگیخت. ]. ژو و همکاران Wnt/-catenin را به عنوان تنظیم کننده اصلی بالادست توصیف کرد که بیان تمام اجزای RAS آزمایش شده را در کلیه ها کنترل می کند [44]. ژو و همکاران از مدل نفرکتومی 5/6 (5/6 NX) موش برای نشان دادن سطوح بیان اجزای اصلی RAS در مغز و کلیه ها مانند آنژیوتانسینوژن، آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین و آنژیوتانسین II AT استفاده کردند. }}گیرنده به طور قابل توجهی تنظیم مثبت شد. سطح بیان تنظیم شده توسط یک مسدود کننده مرکزی Wnt که یک ناقل ویروس مرتبط با آدنو بود که ژن DKK1 را بیش از حد بیان می کرد، مهار شد [45]. به طور مشابه، مطالعه حاضر نشان داد که AGTR1 هنوز در اپیتلیوم لوله‌ای کلیوی بیان می‌شود، و سطح بیان رنین و AGTRl در بافت کلیه موش‌های SAMP8 به طور قابل‌توجهی بیشتر از موش‌های SAMR1 بود (شکل 4a و dg). این نتایج نشان داد که مسیر سیگنالینگ Wnt/-catenin/RAS در کلیه موش‌های SAMP8 فعال شد و CF به طور موثری از فعال‌سازی این مسیر جلوگیری کرد.

CTGF عملکردهای بیولوژیکی متعددی از جمله ترویج میتوز سلول های کموتاکتیک، القای چسبندگی و ترویج تکثیر سلولی و سنتز ECM را اعمال می کند [35،46]. CCN2 (CTGF) سیگنال دهی Wnt را با اتصال به پروتئین مرتبط با گیرنده لیپوپروتئین با چگالی کم 5/6 (LRP5/6) تعدیل کرد تا فیبروز را میانجیگری کند [39، 47]. مطالعات دیگر از خاموش کردن ژن برای کشف و تأیید اینکه Nrf2 مسیر Wnt را با تنظیم سطح بیان CTGF تنظیم می‌کند و بر بیماری بینابینی کلیوی تأثیر می‌گذارد، استفاده کردند. همچنین، Nrf2 سطح رونویسی CTGF را عمدتاً از طریق تنظیم‌کننده رونویسی CTGF c-Fos تنظیم می‌کند [48]. تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی نشان داد که CTGF و pc-Fos به طور عمده در سلول های اپیتلیال لوله کلیوی بیان شد، و pc-Fos نیز در گلومرول توزیع شد. تجزیه و تحلیل کمی نشان داد که سطح بیان هر دو پروتئین توسط CF مهار شد (شکل 3b و e و 4a و c). در نهایت، تجزیه و تحلیل PCA برای تأیید بیشتر اینکه CF آسیب کلیه را در موش SAMP8 بهبود می بخشد استفاده شد (شکل 6). مطالعه حاضر شواهدی را ارائه کرد که نشان می‌داد CF نه تنها سیگنال‌دهی Nrf2 را فعال می‌کند، بلکه به Nrf2 برای متعادل کردن استرس اکسیداتیو و التهاب، مهار سیگنال‌دهی Wnt/-catenin/RAS و بهبود پیری کلیه و فیبروژنز کلیه متکی است. با این حال، ما همچنین بهبود متناقضی را در اثر CF بر روی رنگ‌آمیزی Masson و SA{27}}گال در این آزمایش یافتیم. حدس زده می شود که این ممکن است به دلیل پیشرفت ناسازگار پیری کلیه و فیبروز کلیه در موش SAMP8 باشد. درجه پیری کلیه در موش ها در این آزمایش ممکن است جدی تر از فیبروز باشد. بنابراین، اثر بهبود CF-H بر پیری کلیه در موش SAMP8 به اندازه فیبروز کلیوی آشکار نبود.

به عنوان یک مونوساکارید کاهنده، D-گالاکتوز به طور گسترده در بیماری های مختلف مرتبط با سن در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی استفاده می شود. مشخص شد که D-gal باعث پیری و آسیب در سلول‌های NRK{3}}E [49]، القای پیری سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای پروگزیمال کلیه انسان (سلول‌های HKC{5}}) و افزایش سطح بیان دو کلیوی می‌شود. پروتئین های نشانگر فیبروز FN و a-SMA [6]. در این مطالعه از D-gal برای القای سلول های NRK-52E در شرایط آزمایشگاهی استفاده شد. با استفاده از روش MTT و رنگ‌آمیزی -گالاکتوزیداز برای شناسایی ترکیبات جدا شده از CF، مشخص شد که SDC{11}}،16 و SDC{13}} زنده‌مانی سلولی ناشی از D-gal و مهار D-gal القا شده را افزایش می‌دهند. پیری سلولی (شکل 5). اینها پیشنهاد کردند که SDC-0-14،16 و SDC-1-8 ممکن است مبنای مادی برای CF برای به تاخیر انداختن پیری کلیه باشند. SDC{21}} یکی از گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی است. گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید با اثرات ضد پیری [51] و محافظت عصبی [{25}}] طول عمر Caenorhabditis Elegans [50] را افزایش می‌دهند. اینها جهتی برای مطالعه بعدی ما در مورد اثرات فارماکولوژیک CF فراهم می کند.

نتیجه گیری

در نتیجه، مطالعات in vivo نشان داد که CF فیبروز کلیه را در موش‌های مسن کاهش می‌دهد. برخی از مواد فعال بالقوه در آزمایشات آزمایشگاهی یافت شد. این یافته ها حمایت دارویی برای درمان بیماری کلیوی با استفاده از CF و جهتی برای تحقیقات بیشتر در مورد مواد فعال CF ارائه می دهد.

این مقاله از Cao و همکاران استخراج شده است. BMC Complementary Medicine and Therapies (2022) 22:52