فعالیت مکمل در گلومرولوپاتی C3 توسط پروتئین های همجوشی IgG-factor H با و بدون دامنه های هدف پروپردین تنظیم می شود.

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

آلیسا سی. گیلمور، یوچون ژانگ، اچ. ترنس کوک، دبورا پی لاوین، سورش کتی، یی وانگ2، کریستا کی. جانسون، سونگ کوون کیم مربع، و متیو سی. پیکرینگ

'مرکز بیماری های التهابی، امپریال کالج لندن، انگلستان. and²Alexion Pharmaceuticals، نیوهیون، کانکتیکات، ایالات متحده آمریکا

C3 گلومرولوپاتیبا تجمع مکمل C3 در گلومرول مشخص می شود. علل شامل، اما نه محدود به، ناهنجاری در فاکتور H، تنظیم کننده منفی اصلی مسیر جایگزین مکمل است. موش های با کمبود فاکتور H (Cfh-/-) C3 ایجاد می کنندگلومرولوپاتیهمراه با کاهش سطح C3 پلاسما. با استفاده از این مدل، ما کارایی دو پروتئین فیوژن حاوی حوزه‌های تنظیمی مسیر جایگزین فاکتور H (FH{1}}) را ارزیابی کردیم.

به یک ایمونوگلوبولین غیر هدفمند موش (IgG-FH1-5) یا یک آنتی بادی ضد پروپردین موش (Anti-P-FH1-5) مرتبط است. هر دو پروتئین C3 پلاسما را افزایش دادند و رسوب C3 گلومرولی را به میزانی معادل کاهش دادند، که نشان می‌دهد برای تغییر فعال‌سازی C3 در پلاسما یا گلومرول‌ها، هدف‌گذاری پروپردین برای FH{10} مورد نیاز نیست. پس از تجویز IgG-FH{13}}، سطح C3 پلاسما به طور موقت با تغییرات در سطوح فاکتور B مرتبط بود در حالی که سطوح C5 پلاسما با تغییرات در سطوح پروپردین پلاسما ارتباط داشت. قابل توجه، افزایش در پلاسما

سطوح C5 و پروپردین برای مدت طولانی‌تری نسبت به افزایش C3 و فاکتور B باقی ماند. در موش‌های Cfh-/- IgG-FH{5}} آسیب کلیوی را در طی نفریت نفروتوکسیک سرم تسریع‌یافته کاهش داد. بنابراین، داده‌های ما نشان می‌دهد که IgG-FH{7}} فعالیت مسیر جایگزین در گردش را بازسازی کرد و رسوب گلومرولی C3 را در موش‌های Cfh-/- کاهش داد و سطح پروپردین پلاسما نشانگر حساس فعالیت C5 کانورتاز در کمبود فاکتور H است. پروتئین FH{12}} کونژوگه با ایمونوگلوبولین، از طریق نیمه عمر نسبتاً طولانی پلاسما، ممکن است یک درمان بالقوه برای C3 باشد.گلومرولوپاتی.

سیستانچ می تواند به گلومرولوپاتی کمک کند

بیانیه ترجمه

C3 گلومرولوپاتی(C3G) یک بیماری کلیوی است که با تجمع غیرطبیعی کمپلمان C3 در گلومرول ها و آسیب گلومرولی مشخص می شود. این به دلیل فعال شدن کنترل نشده مسیر جایگزین مکمل است. پروتئین‌های همجوشی، متشکل از حوزه‌های عملکردی تنظیم‌کننده مسیر جایگزین، فاکتور H (FH)، مرتبط با آنتی‌بادی، تنظیم مجدد مکمل و کاهش C3 گلومرولی در مدل موش C3G. کونژوگاسیون آنتی بادی بدون هدف منجر به نیمه عمر نسبتاً طولانی پروتئین فیوژن پلاسما می شود، و این یا روش های کونژوگاسیون مشابه، می تواند برای تقویت عملکرد FH در درمان C3G استفاده شود.

C3 گلومرولوپاتی(C3G) یک اختلال کلیوی با واسطه مکمل است که با مقادیر غیرطبیعی C3 در گلومرول ها مشخص می شود.1 می تواند به نارسایی کلیه پیشرفت کند و درمان قطعی ندارد.2 C3G با فعال شدن غیر طبیعی مسیر جایگزین مکمل (AP) همراه است. فعال شدن AP منجر به تولید C3bBb (C3 کانورتاز) می شود، آنزیمی که C3 را می شکافد. پس از افزودن یک مولکول C3b دیگر، کمپلکس C3bBbC3b (C5 کانورتاز) حاصل می‌تواند مکمل C5 را شکافت. کنترل نشده

فعال سازی AP در C3G می تواند با کاهش C3، C5، فاکتور B (FB) و پروپردین در گردش همراه باشد. علل فعال‌سازی کنترل‌نشده AP شامل از دست دادن تغییرات عملکرد در تنظیم‌کننده‌های کمپلمان و افزایش تغییرات عملکرد در فعال‌کننده‌های مکمل است. تنظیم‌کننده منفی کلیدی AP فاکتور H (FH) است و کمبود FH در انسان، خوک و موش با C3G مرتبط است. فاکتور نفریت 3 C3، آنتی بادی که AP C3 کانورتاز را تثبیت می کند در C3G مکرر است. فاکتور نفریت C3 ممکن است منجر به کاهش C3 به تنهایی (فاکتور نفریت C3 مستقل از پروتئین) یا کاهش C3 و C5 شود (properdin- فاکتور نفریت C3 وابسته).5،6

اگرچه کمبود پروپردین باعث بهبود سطح C3 پلاسما نشد، سطوح C5 افزایش یافت، که نشان می‌دهد پروپردین برای فعالیت C5 ضروری است، اما نه C3 کانورتاز.

تجویز FH11،12 موش یا انسان به موش های Cfh-/- باعث کاهش رنگ آمیزی C3 گلومرولی و افزایش سطح C3 در گردش شد. سازه‌هایی که فقط شامل حوزه‌های تنظیمی و هدف‌گیری FH (مولکول‌های mini-FH) هستند نیز در این مدل کارآمد هستند. رویکردهای دیگر شامل پروتئین‌هایی است که مکان‌های فعال‌سازی مکمل را هدف قرار می‌دهند. اینها عبارتند از TT30,14 یک پروتئین حاوی دامنه های تنظیم کننده مکمل FH (FH{9}}) مرتبط با حوزه های اتصال به مکمل گیرنده مکمل 2، و مولکول های FH همودیمر، 15 مولکول مینی FH که حاوی دامنه های اتصال مکمل هستند. پروتئین مربوط به فاکتور H 1.

از آنجایی که کاربرد درمانی مهار فعال سازی مکمل C3 در C3G تحت بررسی است، درک سینتیک رسوب C3 گلومرولی و ارتباط آن با فعال سازی AP در گلومرول ها و گردش خون بسیار مهم است. در مدل‌های گلومرولونفریت با واسطه کمپلکس ایمنی، C3c گلومرولی ظرف 24 ساعت پس از جلوگیری از فعال شدن کمپلمان پاک شد، در حالی که C3d گلومرولی برای هفته‌ها ادامه داشت. ، در حالی که C3d گلومرولی بدون تغییر باقی می ماند.11

در این مطالعه، ما کارایی 2 پروتئین فیوژن جدید را با فعالیت تنظیمی مکمل در مدل موش C3G Cfh-/- بررسی کردیم. پروتئین‌ها حاوی حوزه‌های تنظیمی FH موش (FH1-5) بودند که برای طولانی‌تر کردن نیمه‌عمر بیولوژیکی به Ig موش کونژوگه شد. یکی از پروتئین های همجوشی به نام IgG-FH{5}} به یک آنتی بادی مونوکلونال غیر هدفمند موش کونژوگه شد. دیگری که آنتی P-FH نامیده می شود، به یک آنتی بادی مونوکلونال به پروپردین موش کونژوگه شده بود. این برای آزمایش این فرضیه انجام شد که هدف قرار دادن این پروتئین همجوشی به مکان‌های فعال‌سازی کمپلمان، از طریق تعامل با رسوب پروپردین، تنظیم مکمل بافتی را افزایش می‌دهد. داده‌های ما نشان می‌دهد که هم پروتئین‌های غیرهدف‌گیر (IgG-FH{12}}) و هم پروتئین‌های هدف‌دار پروپردین (ضد P-FH{16}}) تنظیم پلاسما و C3 گلومرولی را در موش‌های Cfh–/– بازسازی کردند. مطالعات دوره زمانی نشان داد که بازیابی سطوح C3 و FB منعکس کننده سطوح پروتئین های همجوشی در گردش خون است. در مقابل، افزایش C5 پلاسما پس از پاک شدن پروتئین های همجوشی از گردش خون ادامه یافت. ما نشان می‌دهیم که IgG-FH{21}} آسیب گلومرولی را در طول نفریت نفروتوکسیک سرم در موش‌های Cfh–/– بهبود می‌بخشد.

سیستانچ می تواند بیماری کلیوی را درمان کند و عملکرد کلیه را بهبود بخشد

نتایج

تولید پروتئین‌های همجوشی و ارزیابی فعالیت در شرایط in vitro و in vivo پروتئین‌های فیوژن با پیوند دادن اولین دامنه‌های تکرار اجماع کوتاه (SCR) FH موش (FH{1}}) به یک آنتی‌بادی ضد پروپردین موش (ضد) ایجاد شدند. -P-FH1-5) یا یک آنتی بادی با دامنه Ig غیر هدفمند (IgG-FH1- 5، شکل تکمیلی S1). فعالیت پروتئین ها با استفاده از روش همولیتیک اختصاصی AP ارزیابی شد (شکل 1a). Anti-P-FH1-5 و IgG-FH1-5 همولیز را به صورت وابسته به دوز با قدرت بیشتر برای anti-P-FH1-5 مهار کردند. آنتی پروپردین (anti-P) همولیز را به روشی وابسته به دوز کاهش داد، اما کنترل IgG هیچ تأثیری نداشت. پس از تزریق هم‌مولار پروتئین‌ها به موش‌های Cfh–/–، پروتئین IgG-FH{26}} تا ۱۱ روز پس از تزریق قابل تشخیص بود، در حالی که ضد P-FH{30}} تا ۴ روز پس از تزریق قابل تشخیص بود. تزریق (شکل تکمیلی S2). برای تعیین اینکه آیا IgG-FH{34}} و anti-P-FH{37}} می‌توانند تنظیم AP پلاسما را در موش‌های Cfh–/– بازگردانند، ما ابتدا سطح C3 پلاسما را پس از تزریق پروتئین‌های فیوژن اندازه‌گیری کردیم (شکل 1b). . تجویز IgG-FH{41}} یا anti-P-FH{44}} به طور قابل توجهی C3 پلاسما را در 24 ساعت و به میزان کمتری در 96 ساعت پس از تزریق افزایش داد (شکل 1b). این داده‌ها نشان دادند که هم IgG-FH{50}} و هم anti-P-FH{53}} می‌توانند به طور موقت تنظیم AP پلاسما را در موش‌های Cfh–/– بازیابی کنند. سپس با مشخص کردن دوره زمانی تغییرات نه تنها در C3 پلاسما، بلکه همچنین در پلاسما C5 و پروتئین های مسیر جایگزین FB و پروپردین، تجزیه و تحلیل دقیقی از این تغییرات انجام دادیم. افزایش سطح C5 و پروپردین در گردش بیشتر از افزایش C3 و FB پس از تجویز IgG-FH{59}} و anti-P-FH1-5 در موش Cfh–/– ادامه دارد.

ما سینتیک تغییرات C3، C5، FB و پروپردین را با اندازه‌گیری پروتئین‌ها در فواصل زمانی تا 27 روز پس از یک بار تزریق IgG-FH{4}} یا anti-P-FH1-5 مقایسه کردیم. شکل 2). پس از تجویز IgG-FH{10}}، اوج افزایش C3، C5، FB، و پروپردین همه در روز 1 پس از تزریق رخ داد. زمان کاهش این تغییرات به سطوح قبل از درمان متفاوت بود. بازگشت به سطوح پیش تیمار بین روزهای 1 و 4 برای FB، بین روزهای 7 و 11 برای C3، و بین روزهای 14 و 21 برای هر دو پروپردین و C5 رخ داد (شکل 2a، c، e، و g). پس از تجویز anti-P-FH{27}}، اوج سطح C3 در روز 1 رخ داد اما بین روزهای 4 و 7 به سطوح قبل از درمان کاهش یافت (شکل 2b). اوج سطح C5 در روز 4 رخ داد و بین روزهای 7 و 11 به سطح قبل از تیمار بازگشت (شکل 2d). اوج افزایش FB در روز 1 رخ داد و بین روزهای 1 و 4 به سطوح قبل از تیمار کاهش یافت (شکل 2f). همانطور که انتظار می رفت، پروپردین پلاسمای آزاد پس از تزریق آنتی P-FH{44}} یا آنتی P تخلیه شد (شکل 2h). سطح پروپردین پلاسمای آزاد تا 7 روز پس از ضد P-FH{50}} و تا 14 روز پس از ضد P پایین باقی ماند (شکل 2h). اگرچه هر دو پروتئین فیوژن به طور موقت تنظیم AP پلاسما را بازسازی کردند، مدت زمان بهبود در سطوح C3، FB، و C5 منعکس کننده مدت زمان تشخیص آنها در پلاسما بود، که برای anti-P-FH{58}} کوتاه‌تر بود (شکل تکمیلی S2) . به طور خلاصه، تغییرات در سطوح C3 و FB پس از تزریق هر یک از پروتئین ها کوتاه تر از C5 و پروپردین بود. این داده ها نشان می دهد که FB پلاسما نشانگر حساس فعالیت C3 کانورتاز در این تنظیمات است، در حالی که پروپردین نشانگر فعالیت C5 کانورتاز است. قابل ذکر است که پس از تزریق آنتی P، C5 در ساعت 24 و 96 و روز هفتم افزایش یافت.

شکل 1| (الف) مکمل سنجش همولیز وابسته به مسیر جایگزین. آنتی‌بادی‌ها در 2-رقت‌های برابر از 60 نانومولار تا 0.5 نانومتر تیتر شدند. معرف‌های IgG-FH1-5، anti-P-FH1-5 و anti-P همولیز گلبول قرمز خرگوش را به روشی وابسته به دوز کاهش دادند. بدون مهار پروتئین IgG-کنترل استفاده شد. نوارهای افقی نشان دهنده مقادیر میانگین هستند و نوارهای خطا نشان دهنده SD هستند. (ب) مکمل پلاسما C3 در موش Cfh-/- پس از تزریق پروتئین فیوژن. C3 پلاسما قبل و 24 ساعت و 96 ساعت پس از تجویز IgG-FH اندازه گیری شد (مثلث قرمز، n ¼ 5) Anti-P-FH{21}} (مثلث بنفش، n ¼ 6)، Anti -P (نقاط سبز، n ¼ 5)، و IgG-کنترل (نقاط آبی، n ¼ 5). میله های افقی نشان دهنده مقادیر میانگین و سبیل ها نشان دهنده SD هستند. ***P # 0.001 در مقابل مقدار پیش تیمار و برگرفته از 2-راهی آنالیز واریانس با آزمایش مقایسه چندگانه بونفرونی. FH، فاکتور H; پ، پروپردین.

(شکل 2d). همانطور که گزارش شده است، 8،9 نشان می دهد که C5 کانورتاز به پروپردین در موش های Cfh-/- وابسته است.

IgG-FH1-5 و anti-P-FH1-5 C3c گلومرولی را کاهش دادند اما رنگ‌آمیزی C3d را در موش‌های Cfh–/– تغییر ندادند.

بعداً تأثیر IgG-FH{1}} و anti-P-FH{4}} را بر روی پروتئین‌های گلومرولی C3b/iC3b/C3c، C3d، پروپردین و مرتبط با FH (FHR) ارزیابی کردیم. در 96 ساعت پس از تزریق IgG-FH{12}}، رنگ‌آمیزی گلومرولی C3b/iC3b/C3c کاهش یافت، اما رنگ‌آمیزی گلومرولی C3d (شکل 3a) و رنگ‌آمیزی FHR (شکل 3b) کاهش یافت. گلومرولی C3b/iC3b/C3c بدون تغییر با IgG-کنترل یا ضد P باقی ماند. الگوی خطی غیرطبیعی رنگ‌آمیزی پروپردین گلومرولی در موش‌های Cfh-/- درمان نشده ۹۶ ساعت پس از کنترل IgG باقی ماند. در موش‌های Cfh–/– که با آنتی P یا IgG-FH{28}} تزریق شده‌اند، سطح پروپردین گلومرولی در 96 ساعت تقریباً غیرقابل تشخیص بود (شکل 3b). به طور غیر منتظره، تزریق ضد P-FH{33}} منجر به یک الگوی رنگ آمیزی گلومرولی دانه ای با استفاده از آنتی بادی های ضد پروپردین، ضد FH/FHR و ضد IgG شد (شکل 3b). این یافته نشان می دهد که پروتئین ضد P-FH{40}} در گلومرول ها رسوب می کند. تزریق پروتئین ضد P-FH{43}} به موش های نوع وحشی منجر به رنگ آمیزی گلومرولی با آنتی بادی های ضد پروپردین، ضد FH/FHR و ضد IgG در 96 ساعت شد (شکل تکمیلی S3)، که نشان می دهد این معرف با گلومرول های طبیعی تعامل دارد. با این حال، ما حدس زدیم که پروتئین ضد P-FH1-5 همچنین می‌تواند با پروپردین گلومرولی از قبل موجود در موش‌های Cfh–/– تعامل داشته باشد. هنگامی که ما معرف را به موش‌های Cfh-/- تزریق کردیم که از قبل با آنتی P برای حذف پروپردین گلومرولی تحت درمان قرار گرفته بودند، در الگوهای رنگ‌آمیزی دانه‌ای با استفاده از آنتی‌بادی‌های ضد پروپردین، ضد FH/FHR و ضد IgG کاهش یافت. شکل تکمیلی S4). این مشاهدات نشان می‌دهد که تعامل گلومرولی پروتئین ضد P-FH{61}} در موش‌های Cfh–/– تا حدی به پروپردین گلومرولی وابسته است.

IgG-FH{1}} آسیب کلیوی را در طی نفریت نفروتوکسیک سرم تسریع شده در موش Cfh–/– بهبود بخشید

در بیماران مبتلا به C3G، آسیب حاد کلیوی می تواند در زمینه عفونت های میانی ایجاد شود. به عنوان مثال، از دست دادن عملکرد کلیوی در نفروپاتی FHR5 با اپیزودهای هماچوری ماکروسکوپی سینفارنژیتی همراه است. 17 اختلال زمینه ای C3 در بیماران C3G احتمالاً منجر به افزایش آسیب کلیوی ناشی از کمپلمان پس از محرکی می شود که منجر به التهاب کلیه می شود. برای مدل سازی این، ما نفریت نفروتوکسیک سرم را که یک کمپلکس ایمنی است القا کردیم.

شکل 2| دوره زمانی نمایه مکمل پلاسما در موش های Cfh–/– تزریق شده با IgG-FH1-5 و anti-P-FH1-5. پلاسما C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) و properdin (P; g,h) از شروع آزمایشی تا 27 روز پس از تزریق یکبار IgG-FH{1{21 }}}} (a,c,e,g; مثلثهای قرمز, n ¼ 5) یا anti-P- FH1-5 (b,d,f,h؛ مثلثهای بنفش, n ¼ 6). کنترل ها شامل ضد P (نقاط سبز، n ¼ 5) و یک آنتی بادی مونوکلونال همسان با ایزوتیپ (کنترل IgG، نقاط آبی، n ¼ 5) بود. میله های افقی نشان دهنده مقادیر میانگین و سبیل ها نشان دهنده SD هستند. *P # 0.05، **P # 0.01، ***P # 0.001 در مقابل مقدار قبل از تیمار و برگرفته از 2-تحلیل واریانس راه با آزمون مقایسه‌های چندگانه بونفرونی. FB، فاکتور B; FH، فاکتور H.

مدل گلومرولونفریت که شامل مسیرهای مکمل و گیرنده Fc است، 18،19 در موش Cfh-/-. ما قبلاً نشان دادیم که موش‌های Cfh-/- در این شرایط به آسیب کلیوی حساس هستند7 و فرض کردیم که پروتئین FH{4}}، با افزایش تنظیم AP، می‌تواند آسیب کلیوی با واسطه مکمل را در این مدل بهبود بخشد. از آنجایی که داده‌های ما نشان می‌دهد که پروتئین ضد P-FH1-5 در گلومرول‌های طبیعی رسوب می‌کند، ما از IgG-FH1-5 در طی نفریت نفروتوکسیک سرم تسریع شده استفاده کردیم. 24 ساعت قبل از تزریق سرم نفروتوکسیک گوسفند، موش‌ها یک تزریق داخل صفاقی یا IgG-کنترل (n ¼ 7) یا IgG-FH{16}} (n ¼ 8) دریافت کردند. پروتکل آزمایشی در شکل 4a نشان داده شده است. موش ها 6 روز پس از تجویز سرم نفروتوکسیک گوسفند حذف شدند. هر 3 معیار هیستولوژیک آسیب شناسی گلومرولی (نمره شدت، تعداد سلول ها و تعداد ماکروفاژها) به طور قابل توجهی در گروه IgG-FH{22}} کمتر بود (شکل 4b). آسیب توبولو بینابینی نیز در گروه IgG-FH{25}} کمتر بود (شکل 4b). اوره سرم به طور قابل توجهی افزایش یافت

شکل 3| رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی مکمل گلومرولی در موش های Cfh–/– 96 ساعت پس از تزریق IgG-FH{3}} یا anti-P-FH1-5. (الف) تصاویر نمایشی همراه با سنجش کمی گلومرولی C3b/iC3b/C3c و C3d در 4 گروه آزمایشی: IgG-FH{13}} (مثلث قرمز، n ¼ 5)، anti-P-FH{17}} (مثلث های بنفش، n ¼ 6)، ضد P (نقاط سبز، n ¼ 5)، و IgG-کنترل (نقاط آبی، n ¼ 5). سطوح پلاسما C3 در زمان نمایش چشمه در شکل 1. (ب) نقاط داده مقادیر میانه را نشان می دهند و سبیل ها محدوده بین چارکی را نشان می دهند. مقادیر P به دست آمده از آزمون کروسکال-والیس با آزمون مقایسه چندگانه دان. (ب)تصاویر نمایانگر گلومرولی IgG، FHR، و رنگ‌آمیزی در 4 گروه آزمایشی. نوار ¼ 100 میلی‌متر. FH، فاکتور H; پ، پروپردین. برای مشاهده بهینه این تصویر، لطفاً نسخه آنلاین این مقاله را درwww.kidney-international.org.

گروه کنترل IgG، اما تغییرات در آلبومین سرم و نسبت آلبومین به کراتینین ادرار تفاوتی نداشت (شکل 4b). همانطور که انتظار می رفت، C3b/iC3b/C3c گلومرولی به طور قابل توجهی در گروه IgG-FH{8}} کاهش یافت (شکل 4b)، اما IgG گلومرولی موش (شکل 4b) و IgG گوسفند (داده ها نشان داده نشده است) بین گروه ها تفاوتی نداشتند. .

شکل 4| پیش درمانی با IgG-FH{2}} آسیب کلیوی را در طی نفریت نفروتوکسیک سرم تسریع شده در موش Cfh-/- بهبود بخشید. (الف) شماتیک پروتکل نفریت نفروتوکسیک سرم تسریع شده. موش‌هایی که از قبل با IgG گوسفند واکسینه شده بودند، 24 ساعت قبل از تجویز سرم نفروتوکسیک گوسفند، یا IgG-FH{5}} (گروه درمان، n ¼ 8) یا IgG-کنترل (گروه شاهد، n ¼ 7) دریافت کردند. (ب) عملکرد کلیه و بافت شناسی 6 روز پس از القای نفریت نفروتوکسیک سرم در موش های تحت درمان با IgG-FH{12}} (درمان؛ مثلث قرمز، n ¼ 8) یا IgG-کنترل (شاهد، دایره های آبی، n) ¼ 7). میله‌های افقی مقادیر میانه را نشان می‌دهند و سبیل‌ها محدوده بین چارکی را نشان می‌دهند. *P # 0.05، **P # 0.01، ***P # 0.001 در مقابل کنترل و برگرفته از آزمون Mann-Whitney. FH، فاکتور H; پ، پروپردین.

بحث

هر دو IgG-FH1-5 و anti-P-FH1-5 سطوح C3، FB و C5 را در موش های Cfh–/– نرمال کردند. این یافته با این واقعیت مطابقت دارد که حوزه‌های تنظیمی مکمل FH موش در دامنه‌های SCR 1 تا 5 قرار دارند (یک محل اتصال C3b و فعالیت کوفاکتور برای برش C3b با واسطه فاکتور I). 20 حوزه‌های تشخیص سطح، که بر اتصال به هپارین و سلول های اندوتلیال تأثیر می گذارد و محل اتصال دوم C3b را شامل می شود، در دامنه های SCR 18 وجود دارد.

20 (FH18-20) و بنابراین در پروتئین های همجوشی وجود ندارند.20 با این وجود، هر دو پروتئین iC3b/C3b/C3c گلومرولی را کاهش دادند، که نشان می دهد FH18-20 در این تنظیم مورد نیاز نبود. این یافته با داده‌های قبلی مطابقت دارد که نشان می‌دهد موش‌های Cfh–/– دارای پروتئین FH جهش‌یافته متشکل از دامنه‌های SCR 1 تا 15 (Cfh–/–.FHD16-20) رسوب غیرطبیعی C3 گلومرولی نداشتند. با این حال، حیوانات Cfh–/–.FH D{13}} قادر به تنظیم فعال‌سازی C3 در امتداد اندوتلیوم کلیه نبودند و میکروآنژیوپاتی ترومبوتیک ایجاد کردند. این امکان وجود دارد که به دلیل عدم وجود دامنه های FH{15}} سطح هدف، تجویز پروتئین های همجوشی حاوی FH{16}} در کمبود FH می تواند منجر به حساسیت به میکروآنژیوپاتی ترومبوتیک شود. همچنین ممکن است که افزایش تمایل برای اتصال C3b، تحت ساختار دیمری پروتئین‌های همجوشی، برای جبران فقدان دامنه‌های FH{18}} سطح هدف‌دار کافی باشد. با این حال، تشخیص سطح C3b نیز تحت تأثیر تغییرات ساختاری در FH است. یک پروتئین استرپتوکوکوس پنومونیه به FH (PspCN، که دامنه SCR 9 را متصل می‌کند)، باعث ایجاد تغییر ساختاری FH می‌شود و کمپلکس FH-PspCN اتصال C3b را افزایش داده است. افزایش فعالیت تسریع کننده پوسیدگی محل اتصال FH20 C3d در FH در معرض قرار نمی گیرد اما در کمپلکس FH-PspCN در معرض قرار می گیرد. این ممکن است توضیح دهد که چرا FH{30}} با سطح C3d تعامل دارد اما FH اینطور نیست.24،25 ما حدس می زنیم که عوامل ما، از طریق تغییرات ساختاری، ممکن است به طور مؤثری با فاز سیال و سطح C3b تعامل داشته باشند. قابل توجه، هر دو IgG-FH1-5 و anti-P-FH1-5 از گلبول های قرمز در برابر لیز در یک سنجش همولیز وابسته به AP محافظت می کنند.

هیچکدام از پروتئین های فیوژن باعث کاهش رنگ آمیزی C3d گلومرولی نشدند، شاید به دلیل ماهیت پایدار C3d گلومرولی. در نفریت کمپلکس ایمنی تجربی، C3c گلومرولی ظرف 24 ساعت پس از توقف فعال سازی کمپلمان برطرف شد، اما C3d برای هفته ها باقی ماند.16 علاوه بر این، C3d گلومرولی در نفریت لوپوس پایدار است. تزریق‌های مکرر FH انسانی در موش‌های Cfh–/– کاهش C3d گلومرولی را طی 10 روز نشان داد.11 احتمالاً دوز مکرر IgG-FH{13}} ممکن است C3d گلومرولی را در این مدل کاهش دهد. همچنین تغییری در رنگ‌آمیزی FHR گلومرولی مشاهده نشد. اطلاعات کمی در مورد عملکرد پروتئین های FHR موش وجود دارد، اما آنها می توانند با هر دو C3b27،28 و C3d تعامل داشته باشند.27 در واقع، میل ظاهری FHR-A و FHR-B برای C3d قوی تر از FH.27 است. ما حدس می زنیم که پروتئین های FHR گلومرولی تنها زمانی از گلومرول ها پاک می شوند که C3d حذف شده باشد. در این زمینه، قابل توجه است که در C3G انسانی، پروتئین 5 مربوط به فاکتور H با C3d گلومرولی مرتبط است.

همانطور که انتظار می رود، پروتئین ضد P-FH{2}} سطح پروپردین آزاد پلاسما را تخلیه می کند زیرا قسمت ضد پروپردین این پروتئین همجوشی می تواند فعالیت AP را (به دلیل تخلیه پروپردین) به مدت 8 روز پس از یک بار تزریق مسدود کند. داده‌های ما نشان داد که کارایی FH{6}} در افزایش سطح C3 پلاسما و کاهش رنگ‌آمیزی C3b/iC3b/C3c گلومرولی بین دو پروتئین فیوژن قابل مقایسه بود (یعنی مستقل از هدف‌گیری پروپردین بود). علاوه بر این، رنگ آمیزی غیرطبیعی پروپردین گلومرولی پس از تجویز آنتی P یا IgG-FH به طور قابل توجهی کاهش یافت. بدیهی است که بر خلاف پروتئین های C3d و FHR، پروپردین گلومرولی به راحتی پس از بازیابی تنظیم C3 پاک می شود. پروپردین گلومرولی پس از تجویز پروتئین ضد P-FH{19}} الگوی خود را تغییر داد، اما این با مشاهده اینکه ما رسوب این پروتئین فیوژن را در گلومرول‌های Cfh–/– و نوع وحشی شناسایی کردیم، پیچیده شد. این تا حدی به دلیل برهمکنش با پروپردین گلومرولی بود، اما رسوب در گلومرول‌های نوع وحشی نشان داد که تا حدی کاملاً به مکمل گلومرولی وابسته نیست و احتمالاً به ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی پروتئین فیوژن مربوط می‌شود.

داده‌های جنبشی ما یافته‌های جدیدی را در مورد تغییرات زمانی در FB، C5 و پروپردین نشان داد که با افزایش C3 در موش‌های Cfh-/- پس از تزریق پروتئین‌های همجوشی همراه است. سطح FB پس از تزریق به سرعت افزایش یافت

و در زمانی که هر دو سطح C5 و پروپردین بالا باقی ماندند، به سطح پایه بازگشتند. سطح پروپردین در موش‌های Cfh–/– در ابتدا کاهش یافت و پس از تزریق IgG-FH به سطح نرمال (20 میلی‌گرم در میلی‌لیتر 30) افزایش یافت و حداقل به مدت 14 روز در این سطوح باقی ماند. یک دوره زمانی مشابه برای افزایش سطح C5 پلاسما مشاهده شد. به طور قابل توجهی، IgG-FH{8}} عمدتاً در 11 روز از گردش خون غایب بود، که نشان می‌دهد که تشکیل C5 کانورتاز در موش‌های Cfh–/– کندتر از C3 کانورتاز است (زیرا سطح C3 به حالت اولیه باز می‌گردد. 7 و 11 روز). پلاسما C5 پس از درمان ضد P افزایش یافت و با پروتئین anti-P-FH{19}} افزایش یافت. از این رو، هم هدف‌گیری پروپردین و هم اثرات FH{20}} به افزایش سطوح C5 کمک می‌کنند و نشان می‌دهند که C5 کانورتاز تا حدی وابسته به پروپردین در موش‌های Cfh–/– است. این یافته با بهبود اختلال در تنظیم C5 در موش‌های دارای کمبود ترکیبی FH و پروپردین مطابقت دارد. سطوح پروپردین در گردش را می‌توان در C3G کاهش داد و به نظر می‌رسد که با فعالیت C5 کانورتاز سطحی در مقایسه با C5 پلاسما یا C5b محلول مرتبط باشد. {30}}.31،32 داده‌های ما از پیوند صمیمی بین سطوح پروپردین و فعالیت کانورتاز C5 پشتیبانی می‌کنند و از استفاده از سطوح پروپردین به‌عنوان نشانگر زیستی فعال‌سازی مداوم گلومرولی C5 پشتیبانی می‌کنند.

قابل توجه است که پروتئین IgG-FH1-5 هنوز تا ۱۱ روز پس از یک بار تزریق در گردش خون قابل تشخیص بود. این بسیار طولانی‌تر از آن چیزی است که قبلاً برای پروتئین FH{4}} موش مزدوج نشده، که در عرض 24 ساعت از گردش خون خارج شد، گزارش کردیم. پروتئین {9}} از کونژوگاسیون آنتی بادی به دست می آید. نیمه عمر پلاسمایی پروتئین IgG-FH{12}} نیز بیشتر از آنچه قبلاً برای FH تمام طول مشاهده کرده بودیم بود. به عنوان مثال، FH انسان 96 ساعت پس از یک بار تزریق از گردش خون خارج شد. در موش‌های Cfh–/– همراه با داده‌های ما که کارآیی پروتئین IgG-FH{19}} را در تنظیم مکمل نشان می‌دهد، در نظر می‌گیریم که ترکیب پروتئین FH{20}} برای طولانی‌تر کردن نمایه فارماکوکینتیک آن دارای پتانسیل درمانی است. ابزار در C3G

به طور خلاصه، ما نشان می‌دهیم که، علی‌رغم نداشتن حوزه‌های تشخیص سطح، پروتئین‌های همجوشی FH{0}} در کاهش فعال‌سازی C3 گلومرولی و بازیابی تنظیم مکمل پلاسما در کمبود FH مؤثر بودند. هیچ مزیت آشکاری در کونژوگه کردن دامنه‌های FH1-5 با آنتی پروپردین وجود نداشت و پروتئین IgG-FH1-5 آسیب کلیوی را در نفریت تجربی کاهش داد. برخلاف چالش‌های موجود در تولید آماده‌سازی‌های FH در مقیاس بزرگ برای استفاده درمانی، تولید در مقیاس بزرگ درمان‌های مبتنی بر آنتی‌بادی به خوبی تثبیت شده است که IgG-FH{10}} را به یک درمان بالقوه جذاب برای C3G تبدیل می‌کند.

مواد و روش ها

پروتئین های فیوژن

IgG-FH1-5. اولین 5 دامنه FH SCR ماوس (mFH1-5) پیوند داده شد

به یک IgG1 موش غیر هدفمند (یک آنتی بادی ضد ایدیوتیپی که علیه یک آنتی بادی مونوکلونال موش ایجاد شده است).

Anti-P-FH1-5. موش FH1-5 مرتبط با آنتی بادی ضد پروپردین موش (ضد-P)، 30 ارائه شده به Alexion توسط W. Song، دانشگاه پنسیلوانیا).

کنترل ها کنترل‌ها Ig غیرهدف‌گیر موش (کنترل IgG) و ضد پروپردین موش (ضد P) همسان با ایزوتیپ بودند (شکل S1 تکمیلی). پروتئین ها با استفاده از وکتورهای pVEK و سلول های Expi293 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) تولید شدند که با استفاده از پروتئین A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA) خالص شدند.

سنجش همولیتیک اختصاصی AP

20 درصد سرم موش نرمال تیتر شده از 60 نانومولار تا 0.5 نانومولار با گلبول های قرمز خرگوش (1.{4}} سلول در میلی لیتر) در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. انتشار هم به روش اسپکتروفتومتری اندازه گیری شد (چگالی نوری 415 نانومتر). 100 درصد لیز سرم بدون مهارکننده بود.

FB و FH پلاسما

پلاسما پس از سانتریفیوژ خون جمع آوری شده در لوله های حاوی اتیلن دی آمین تترااستیک اسید (Sarstedt، Nordrhein-Westfalen، آلمان) به دست آمد. پروتئین ها با روش ایمونواسی الکتروفورز مویرگی (WES، ProteinSimple، San Jose، CA) اندازه گیری شدند. آنتی بادی های مورد استفاده آنتی بادی FH ضد موش پلی کلونال (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) و آنتی بادی ضد FB موش (Abcam, Cambridge, UK) بودند. ماژول تشخیص ضد خرگوش WES (ProteinSimple، San Jose، CA) استفاده شد. سیگنال‌های نورتابی شیمیایی با نرم‌افزار Compass برای SW (ProteinSimple، نسخه 5.{6}}.1) تجزیه و تحلیل شدند، به‌عنوان مناطق اوج اندازه‌گیری شدند و برای کنترل سنجش نرمال شدند.

موش

همه موش ها در شرایط خاص عاری از پاتوژن قرار گرفتند. رویه ها بر اساس دستورالعمل های سازمانی و تایید شده توسط دفتر داخلی انگلستان انجام شد. موش‌های نوع وحشی C57BL/6 از آزمایشگاه جکسون (بار هاربر، ME) خریداری شدند و موش‌های Cfh-/- همانطور که قبلاً توضیح داده شد تولید شدند. 7 موش‌ها از نظر سن و جنس همسان شدند. دوزهای هممولار پروتئین ها از طریق تزریق داخل صفاقی (1 میلی گرم برای آنتی پروپردین و کنترل IgG؛ 1.4 میلی گرم برای IgG-FH{11}} و anti-P-FH1-5) تجویز شد. نفریت نفروتوکسیک سرم تسریع شده با تزریق داخل وریدی سرم نفروتوکسیک گوسفند به موش هایی که از قبل با IgG گوسفند ایمن شده بودند القا شد. تجویز پروتئین های فیوژن 24 ساعت قبل از القای سرم نفروتوکسیک گوسفند انجام شد (شکل 4a).

C3، C5، و پروپردین آزاد C3 پلاسما با روش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم اندازه‌گیری شد. سطوح پروپردین و C5 «بدون» پلاسما با استفاده از روش‌های ایمنی الکتروشیمیلومینسانس (Meso Scale Discovery [MSD]، Meso Scale Diagnostics)، با آنتی‌بیوتیک Rockville، اندازه‌گیری شد. - پروپردین یا یک C5 ضد موش سفارشی که روی صفحات MSD با اتصال بالا پوشش داده شده است. پروپردین "آزاد" و C5 با آنتی پروپردین (از W. Song) یا ضد C5 مونوکلونال بیوتینیله (Alexion) همراه با استرپتاویدین-SULFO (MSD، Meso Scale Diagnostics) شناسایی شدند. سیگنال نورتابی شیمیایی با استفاده از تصویرگر SECTOR S 6000 (MSD، Meso Scale Diagnostics) به دست آمد و با نرم افزار MSD Discovery Workbench (Meso Scale) آنالیز شد.

تشخیص، نسخه 4.0.12.1). پروپردین موش نوترکیب و C5 به عنوان استاندارد استفاده شد.

عملکرد کلیه و بافت شناسی

هماچوری و پروتئینوری با استفاده از Hema-Combistix (Bayer، Reading، UK) ارزیابی شد. اوره پلاسما اندازه‌گیری شد و بافت کلیه همانطور که قبلاً توضیح داده شد پردازش شد. 9 کراتینین ادرار بر روی نمونه‌های ادرار نقطه‌ای با استفاده از سنجش پروتکل کراتینین Companion (#1{7}}12؛ Excell, Philadelphia, PA) و ادرار نقطه‌ای تعیین شد. آلبومین پلاسما با روش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (#E99-134؛ Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) اندازه‌گیری شد. مقاطع کلیوی رنگ آمیزی شده با اسید-شیف دوره ای به صورت کور ارزیابی شدند و بر اساس شدت آسیب گلومرولی و توبولو بینابینی (0 [هیچ]، 1 [خفیف]، 2 [متوسط]) رتبه بندی شدند. ده گلومرول در هر بخش برای تعیین میانگین تعداد سلول های گلومرولی ارزیابی شد. رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس روی انجمادهای 5- میلی‌متری نصب شده با محیط Vectashield با DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) انجام شد. آنتی بادی های مورد استفاده عبارت بودند از فلورسئین ایزوتیوسیانات (FITC) کونژوگه بز پلی کلونال ضد موش C3b/C3c/iC3b (1:200؛ #55500؛ MP Biomedical, Santa Ana, CA)9. IgG ضد موش بز پلی کلونال کونژوگه با زنجیره انجیر خاص (1:400؛ #F5387؛ سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، MO). IgG ضد بز/گوسفند موش مونوکلونال کونژوگه با FITC (1:100؛ #F5137؛ Sigma-Aldrich); یا پروپردین ضد انسان بز کونژوگه با FITC (1:50؛ #GAHu/PPD/FITC، آزمایشگاه‌های ایمنی نوردیک، کپنهاگ، دانمارک). ، مینیاپولیس، MN) روی مقاطع مسدود شده با بیوتین (سیستم مسدود کننده بیوتین؛ Agilent Dako، سانتا کلارا، CA)، با آنتی بادی ثانویه AF488 استرپتاویدین (1:200؛ #S{49}}؛ Thermo Fisher Scientific) استفاده شد. FH در بخش‌های مسدود شده ضد موش CD16/CD{52}(1:100؛ BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) با استفاده از FH ضد انسان بز (1:1000؛ #A312؛ Quidel, San Diego) مشاهده شد. ، CA) و آنتی بادی ثانویه مونوکلونال ضد بز IgG-FITC (1:100؛ کلون GT-34؛ F4891؛ Sigma-Aldrich). ماکروفاژهای گلومرولی با استفاده از CD68 ضد موش موش کونژوگه با FITC (FA{69}} کلون GTX43518؛ GeneTex، Irvine، CA) شناسایی شدند. تجزیه و تحلیل کمی ایمونوفلورسانس با استفاده از میکروسکوپ نوری Leica DM4B همراه با دوربین دیجیتال Leica DFC700T (Leica Microsystems، Wetzlar، آلمان) و نرم افزار Image-Pro Plus (Media Cybernetics، Rockville، MD، نسخه 7) انجام شد. 10 گلومرول در هر بخش مورد بررسی قرار گرفت و میانگین شدت آن در واحدهای علم فلورس دلخواه بیان شد.

تحلیل آماری

GraphPad Prism، ​​نسخه 8.{1}} (GraphPad, San Diego, CA) برای تجزیه و تحلیل آماری استفاده شد. برای تجزیه و تحلیل واریانس با اندازه‌گیری‌های مکرر 2-تحلیل واریانس با آزمون مقایسه‌های چندگانه بونفرونی (عوامل زمان و درمان) استفاده شد. هنگام مقایسه چند گروه از آزمون مقایسه چندگانه کروسکال والیس با دان و برای دو گروه از آزمون من ویتنی استفاده شد.

افشای

MCP هزینه های مشاوره را از Alexion، ChemoCentryx، Novartis، Gyroscope و Achillion Pharmaceuticals دریافت کرده است. HTC هزینه های مشاوره را از Alexion، Novartis، Aurinia و Achillion Pharmaceuticals دریافت کرده است. YZ، YW، KKJ، و SK-K کارمندان Alexion Pharmaceuticals هستند. اس‌کی کارمند سابق الکسیون داروسازی است و در حال حاضر در شرکت داروسازی جمینی استخدام می‌شود. همه نویسندگان دیگر هیچ علاقه رقیبی را اعلام نکردند.

قدردانی

MCP یک همکار ارشد Wellcome Trust در علوم بالینی است (مرجع کمک هزینه 212252/Z/18/Z)، و ACG و DPL توسط این بورسیه پشتیبانی می شوند. YZ، SK، YW، KKJ، و SK-K توسط Alexion Pharmaceuticals تامین مالی شدند.

مواد تکمیلی

فایل تکمیلی (PDF)

شکل S1. Fusionproteinsusedinthisstudy.IgG-FH1-5 حاوی 5 حوزه اول فاکتور H ماوس (FH{4}}) است که به یک Ig موش غیر هدفمند مرتبط شده است. Anti-P-FH1-5 متشکل از mFH1-5 است که به آنتی بادی ضد پروپردین موش خنثی کننده متصل شده است (ضد P؛ به Miwa و همکاران 30 مراجعه کنید). پروتئین‌های کنترل شامل یک Ig غیرهدف‌گیر موش همسان با ایزوتیپ (کنترل IgG) و آنتی‌بادی ضد پروپردین موش خنثی‌کننده (Anti-P) بود. شکل S2. تجزیه و تحلیل WES blot برای تشخیص FH{19}} در نمونه‌های پلاسمایی موش‌های دارای کمبود FH که با (A) IgG-FH{22}} یا (B) Anti-P-FH{25}} تزریق شده‌اند. پروتئین 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH{29}}) تا 11 روز پس از تزریق IgG-FH{32}} و حداکثر تا 4 روز پس از تزریق پروتئین ضد P-FH{36} (قرمز) قابل شناسایی است از موش‌های نوع وحشی که در آن‌ها پروتئین فاکتور H تمام قد شناسایی می‌شود (FH، جعبه‌های سیاه، خط C1) و موش‌های فاقد FH تزریق‌شده، که در آن هیچ FH مشهود نیست، کنترل شده است (جعبه‌های سیاه، خط C2). همانطور که انتظار می‌رفت، FHnorFH{43}} در نمونه‌های پلاسمایی موش‌هایی که با کنترل Anti-P یا IgG تزریق شده‌اند، قابل تشخیص نیست.

شکل S3. رنگ آمیزی ایمنی مکمل گلومرولی 96 ساعت پس از تزریق IgG-control یا anti-P-FH{5}} در موش های نوع وحشی. تصاویر گلومرولی نماینده نشان داده شده است (نوار ¼ 100 میلی متر).

شکل S4. نقش پروپردین در رسوب ضد P-FH{3}} در گلومرول موش های فاقد FH. به موش‌های Cfh–/– یا IgG- شاهد یا anti-P (درمان 1) تزریق شد که 24-ساعت بعد توسط کنترل IgG یا ضد P-FH{12}} (درمان 2) انجام شد. حیوانات 120 ساعت پس از درمان اول معدوم شدند و رنگ آمیزی گلومرولی از نظر IgG، پروپردین و FH/FHR ارزیابی شد. تصاویر نماینده نشان داده شده است. تزریق Anti-P به طور قابل توجهی باعث کاهش رنگ پروپردین (ردیف 1، ستون 2) شد اما رنگ‌آمیزی FH/FHR (بدون تغییر باقی می‌ماند) یا IgG (فقدان باقی می‌ماند). تجویز آنتی P-FH{20}ساعت پس از کنترل IgG منجر به ایجاد رنگ‌آمیزی دانه‌ای با آنتی‌بادی‌های ضد IgG، anti-FH/FHR و anti-P شد که پس از تزریق anti-P-FH مشاهده شد. 1-5 به تنهایی (شکل 3b را ببینید). این رنگ‌آمیزی دانه‌ای زمانی کاهش می‌یابد که قبل از تزریق ضد P-FH{31}} تزریق ضد P انجام شود، که هم گردش خون را کاهش می‌دهد (شکل 1h) و هم گلومرولی را (نگاه کنید به شکل 3b). رنگ‌آمیزی گلومرولی با anti-IgG فقط در موش‌هایی که آنتی P-FH تزریق شده بودند (ردیف 3، ستون‌های 3 و 4) مشهود بود و در موش‌هایی که anti-P-FH دریافت کردند به‌طور قابل‌توجهی کمتر بود{44} قبل از ضد P. ما به این نتیجه رسیدیم که رسوب anti-P-FH{48}} در گلومرول‌های موش Cfh–/– تا حدی به پروپردین وابسته است. میله‌های افقی نشان‌دهنده مقادیر میانه هستند و سبیل‌ها محدوده بین چارکی را نشان می‌دهند. P-value از آزمون من ویتنی به دست آمد. میله ¼ 100 میلی متر.

منابع

1.FakhouriF، Frémeaux-Bacchi V، Noöl LH، و همکاران C گلومرولوپاتی∶ دسیفیکاسیون جدید. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripathy-درک بیماری واقعی نادر ناشی از مکمل. Nat ReyNephrol.{4}}

3. Pickering MC، Cook HT. مجموعه مروری کوتاه ترجمه‌ای در مورد فاکتور H مکمل: بیماری‌های کلیوی مرتبط با فاکتور H مکمل بینش‌های جدید از انسان‌ها و حیوانات. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF، عامل C3nechritic (C3NeF)∶تثبیت فاز مایع و مسیر جایگزین کانورتاز متصل به سلول. J Immunol 1976؛ 116: 1-7.

5. Mollnes TE، Ng YC، Peters DK، و همکاران اثر یک عامل نفریتی بر C3 و در مسیر پایانی کمپلمان در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی. Oin Exp Immunol. 1986؛ 65: 73-79.

6. Nq YC، Peters DK. فاکتور نفریت G3 (C3NeF): تفکیک تثبیت فاز مایع و متصل به سلول در مسیر جایگزین C3 کانورتاز. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J, et al. فعال سازی کنترل نشده C3 باعث گلومرولونفریت غشایی پرولیفراتیو در موش هایی با کمبود فاکتور مکمل H. Nat Genert.2002:31;424-428 می شود.

8. Lesher AM، Zhou L، Kimura Y، و همکاران. ترکیبی از جهش فاکتور H و کمبود پروپردین باعث گلومرولونفریت شدید C3 می شود. جی ام سوک نفرول. 2013؛ 24:53-65.

9. Ruseva MM، Veron KA، Lesher AM، و همکاران. از دست دادن پروپردین باعث تشدید گلومرولوپاتی C3 ناشی از کمبود فاکتور H می شود. جی ام سوک نفرول. 2013؛ 24: 43-52.

10. Paixao-Cavalcante D، Hanson S، Botto M، و همکاران. فاکتور H با کنترل فعال سازی C3 در فاز سیال، پاکسازی iC3b متصل به GBM را تسهیل می کند. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11فاخوری اف، دو خورخه ای.گ. Brune F و همکارانش درمان با فاکتور H مکمل انسانی به سرعت رسوب کمپلمان کلیوی را در موش های دارای کمبود فاکتور H معکوس می کند. Kidney Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S، Parsons J، Bohlender Ll، و همکاران، فاکتور انسانی H بهینه شده با گلیکوزیلاسیون تولید شده توسط خزه برای کاربرد درمانی در اختلالات کمپلمان. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM، Barbour TD، Pappworth Y، و همکاران. کلیه های داخلی 201588: 1314-1322.

14. Ruseva MM، Peng T، Laser MA، et al. Efficacy of targeted complement inhibition in C3 glomerulopathy تجربی. جی ام سوک نفرول. 2016؛ 27: 405-416.

15. Yang Y، Denton H، Davies OR، و همکاران یک ساختار مهندسی شده فاکتور H برای درمان گلومرولوپاتی C3. جی ام سوک نفرول. 2018؛ 29: 1649-1661.

16. Schulze M، Pruchno CJ، Burns M، و همکاران، کلوکالیزاسیون گلومرولی C3 نشان دهنده تشکیل رسوب ایمنی مداوم و فعال سازی مکمل در گلومرولونفریت تجربی است. J PatholL هستم. 1993: 142179-187.

17. Athanasiou Y، Voskarides K Gale DP، و همکاران گلومرولوپاتی خانوادگی C3 مرتبط با جهش های CFHRS ویژگی های بالینی 91 بیمار در 16 شجره نامه. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y، Nimmer动hn F، Madaio MP، و همکاران پاتولوژی و حفاظت در نفریت نفروتوکسیک با درگیری انتخابی گیرنده های Fc ​​خاص تعیین می شود. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS، Springall T، Carroll MC، و همکاران. محافظت در برابر غشای پایه ضد گلومرولی (نفریت ناشی از GBM در موش‌های دارای کمبود C3- و C4-. C Exp Immunol. 1997; 110:403-409.

20. Cheng ZZ Hellwae J، Seeberger H و همکاران. مقایسه شناسایی سطح و خواص اتصال C3b فاکتور مکمل موش و انسانی H.Mol Immunol.2006;43.972-979.

21dp قلیه EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al. ایجاد سندرم اورمیک همولیتیک معمولی به مکمل C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145 بستگی دارد.

22. Pdkering MC، de Jorge EG.Martinez-Barricarte Ry و همکاران سندرم اورمیک همولیتیک خود به خودی که توسط فاکتور مکمل H فاقد حوزه های تشخیص سطح ایجاد می شود. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23 هربرت AP. Mike E, Chen ZAet aL فرار از مکمل با واسطه افزایش فاکتور H گرفته شده: پیامدهایی برای محافظت از سطوح خود از مکمل. J Immunol. 2015؛ 195: 4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH, et al. Dimerization از پروتئین های مرتبط با فاکتور مکمل H باعث تعدیل فعال شدن کمپلمان می شود. Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ، Bai H Lin Z، و همکاران. مهندسی منطقی یک مهارکننده ایمنی به حداقل رسیده با خواص منحصر به فرد هدف گیری سه گانه. جی ایمونول. 2013؛ 190: 5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC, et al. کمپلکس حمله غشای گلومرولی یک نشانگر قابل اعتماد برای فعال سازی مداوم C5 در نفریت لوپوس نیست. کلیه های داخلی 2019. 95655-665.

27. Antonioli AH White J, Crawford F, et al تعدیل مسیر جایگزین مکمل توسط پروتئین های مرتبط با فاکتور H موشی. جی ایمونول. 2018؛ 200: 316-326.

28. Cserhalmi M، CsincsiALMezei Z، و همکاران. پروتئین FHR-B مربوط به فاکتور H موشی باعث فعال شدن مکمل می شود. Front Immunol.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR، Moffett H، Lomax-Browne HJ و همکاران پروتئین 5 مرتبط با فاکتور مکمل گلومرولی H (FHR5) در گلومرولوپاتی C3 بسیار شایع است و با اختلال کلیوی Kdney Int Ren مرتبط است. 2019؛ 4: 1387-1400.

30. Miwa T، Sato S، Gullipalli D، و همکاران. مسدود کردن پروپردین، مسیر جایگزین، و گیرنده های آنافیلاتوکسین آسیب ایسکمی-خونرسانی مجدد کلیوی را در موش های فاکتور تسریع کننده پوسیدگی و CD59 بهبود می بخشد. جی ایمونول. 2013؛ 190: 3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P, et al. مصرف سرمی پروپردین به عنوان نشانگر زیستی اختلال در تنظیم کنورتاز C5 در گلومرولوپاتی C3. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM، Zhou L Kimura Y، و همکاران. ترکیبی از جهش فاکتور H و کمبود پروپردین باعث گلومرولونفریت شدید C3 می شود.JAm Soc Nephrol.2013;{10}}.

32. zhang Y، Nester OM Martin B.et al. تعریف پروفایل بیومارکر مکمل گلومرولوپاتی C3. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.