تجزیه و تحلیل ترکیب و فعالیت های ایمونولوژیکی الیگوساکاریدهای جدا شده از گیاه سیستانش دسرتیکولا

مخاطب: emily.li@wecistanche.com

خلاصه.یک الیگوساکارید (CDOS) از آن به دست آمدCistanche deserticolaبا استخراج قلیایی (pH{0}})، رسوب اتانول، و تکه تکه شدن به دو بخش خالص شده (یعنی CDOS-1 و CDOS-2) توسط Sephadex G-100 و کروماتوگرافی فیلتراسیون ستون Sephadex G-25. ترکیب مونوساکارید CDOS توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) مورد سنجش قرار گرفت. مشخص شد که CDOS-1 فقط از ساکارز و CDOS-2 عمدتاً از ساکارز، رامنوز و مانیتول با نسبت مولی 1:0.73:3.61 تشکیل شده است. آزمایش‌های ایمونولوژیک نشان داد که CDOS تأثیر قابل‌توجهی بر شاخص طحال موش، افزایش فعالیت فاگوسیتوز ماکروفاژها و تحریک تکثیر سلول‌های تولیدکننده آنتی‌بادی دارد. امید است که CDOS به غذا یا داروی کاربردی تبدیل شود.

کلید واژه ها:سیستانچدسرتیکولاالیگوساکارید، تصفیه، ترکیب، فعالیت های ایمونولوژیکی.

Cistanche deserticola اثرات زیادی دارد، برای اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

سیستانچdeserticola YCMa. (خانواده Orobanchaceae) یک گیاه انگلی کوتاه قد بومی در شمال غربی چین است. گیاه خشک کامل (بدون گل) به عنوان مقوی شناخته می شود و به آن «رو کنگرونگ» می گویند. عملکردنیروبخشراکلیهو مکمل اسانس، مرطوب کننده روده و آرام بخش روده ها [1]-[3]. مطالعه فارماکولوژیک مدرن نشان داد که می تواند سنتز DNA را تحریک کند و روند پیری را به تاخیر بیندازد، آنتی اکسیدان را افزایش دهد [4]، از بیماری های قلبی عروقی پیشگیری و درمان کند [3]. علاوه بر این، همچنین می تواند باعث ایجاد مسکن وضد-التهابیاثرات [5]، یادگیری و حافظه را با القای عوامل رشد عصبی تقویت می کند [6]. برخی از مطالعات نشان داد که عصاره C. deserticola می تواند عملکرد فاگوسیتیک ماکروفاژهای داخل شکمی را در موش فعال کند [7]-[9] وتقویتبدنs مصونیت[10]. طبق مطالعات قبلی، این گیاه حاوی ترکیبات فعال متعددی است که شامل گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید، ایریدوئیدها، لیگنان ها، ساکاریدها، آلکالوئیدها و غیره می باشد.دسرتیکولافنیل اتانوئیدگلیکوزیدهاو پلی ساکاریدها به عنوان اجزای فعال اصلی شناخته شده اند، مطالعات متعددی در طول دهه های گذشته بر ساختار و زیست فعالی آنها متمرکز شده است [12]-[17]. در مورد الیگوساکاریدهای ارزشمند موجود درC. deserticola، گزارش ها کاملاً محدود است. الیگوساکاریدها، یک ساکارید با زنجیره کوتاه حاوی قندهای همو یا هترو، به دلیل اثرات مفیدشان بر زندگی انسان به خوبی شناخته شده اند و برای مدت طولانی به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفته اند [18]. الیگوساکاریدهای عملکردی که دارای عملکرد فیزیولوژیکی مانند پوسیدگی زایی کم و فاکتور رشد بیفیدوباکتری هستند [19]، سلامت انسان و حیوانات را بهبود می بخشند. آنها به عنوان یک ماده غذایی مورد استفاده قرار گرفته اند. اخیراً عملکردهای جدیدی از الیگوساکاریدها که توانایی تعدیل سیستم ایمنی در انسان، حیوانات و ماهی را دارند گزارش شده است [20]. در این مقاله، بخش اول از نتایج برنامه تحقیقاتی، تقسیم بندی را گزارش می کنیم. از کل الیگوساکاریدهای بدست آمده از عصاره قلیایی C. deserticola با ترکیبی از اولترافیلتراسیون و کروماتوگرافی نفوذ ژل، و تجزیه و تحلیل ترکیب آنها توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC). علاوه بر این، ما همچنین فعالیت های ایمنی الیگوساکاریدهای C. deserticola را ارائه می کنیم. تا آنجا که ما می دانیم، گزارش های کمی در مورد مطالعات فعالیت تحریک کننده ایمنی منتشر شده استC. deserticolaالیگوساکاریدها

2. تجربی

2.1. مواد

C. deserticola از لیگ Alxa (مغولستان داخلی، چین) کشت و جمع آوری شد. موش کونمینگ (Grade II، شش هفته سن) از مرکز تجربی فارماکولوژی دانشگاه مغولستان داخلی خریداری شد. Sephadex G-100، Sephadex G-25، تری فلورواستیک اسید (TFA)، 1-فنیل-3-متیل-5- پیرازولون (PMP)، D-گلوکز، D- گالاکتوز، D-فروکتوز، D-گزیلوز، D-مانوز، D-گالاکتورونیک اسید، D-گلوکورونیک اسید، ساکارز، رامنوز، مانیتول، فوکوز، رامنوز، از سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. RPMI متوسط{12}} از شرکت Gibco Invitrogen (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. تمام مواد شیمیایی دیگر از درجه تحلیلی بود.

2.2. استخراج الیگوساکاریدها

اجسام خشک شده C. deserticola به قطعات کوچکتر بریده شد و سپس توسط آسیاب با اتانول بی آب (3×5000 میلی لیتر) در دمای 70 درجه به مدت 3 ساعت و تحت فشار اتمسفر به پودر تبدیل شد. یک کندانسور رفلاکس برای حذف لیپیدها ثابت شد. بقایای باقیمانده به مدت 3 بار (هر بار 2 ساعت) با قلیایی (pH{4}}) در دمای 60 درجه استخراج شد. پس از سانتریفیوژ (2000 گرم به مدت 15 دقیقه، در 20 درجه)، مایع رویی تا یک دهم حجم در اواپراتور چرخشی تحت فشار کاهش یافته در 50 درجه غلیظ و فیلتر شد. سپس فیلتر با استفاده از معرف Sevag [21] پروتئین زدایی شد و با کربن فعال رنگ زدایی شد.

2.3. جداسازی و خالص سازی الیگوساکاریدها

اولیگوساکاریدهای خام یخ زده در آب مقطر حل شده، سانتریفیوژ شده و سپس مایع رویی توسط ستون Sephadex G-100 (1×50 سانتی متر)، متعادل شده با آب فوق خالص، خالص شد. پس از بارگیری با نمونه، ستون با آب فوق خالص با سرعت جریان 5 میلی لیتر در دقیقه شسته شد. بخش های مختلف با استفاده از لوله های آزمایش جمع آوری شد. محتوای کربوهیدرات کل هر لوله در طول موج 490 نانومتر با روش فنل-H2SO4 اندازه گیری شد [22]. محلول آب شسته شده به دو بخش CDOS{10}} و CDO-2 جدا شد. دو بخش به ترتیب روی ستون Sephadex G{12}} (2.7×85 سانتی‌متر) با استفاده از آب فوق‌خالص (با سرعت جریان 1 میلی‌لیتر در دقیقه) خالص‌تر شدند. پس از جمع آوری کسر خالص شده، لیوفیلیزه شد.

2.4. تجزیه و تحلیل ترکیب مونوساکارید

ترکیب مونوساکارید CDOs با تجزیه و تحلیل HPLC به دست آمد. CDOها (2 میلی گرم) ابتدا با متانول بی آب حاوی 2 مولار HCl در 8{18}} درجه به مدت 16 ساعت در اتمسفر نیتروژن و سپس با 2 مولار TFA در 120 درجه به مدت 1 ساعت هیدرولیز شدند. پس از حذف TFA توسط تبخیر، هیدرولیزها متعاقباً طبق روش گزارش شده [23] با PMP مشتق شدند و با HPLC آنالیز شدند. جداسازی HPLC بر روی سیستم EF{8}} HPLC (شرکت KNAUER، آلمان) انجام شد. مشتقات PMP با استفاده از حجم Sugar-PAK (6.5×300mm، لیوان های شرکت آب، آمریکا) کروماتوگرافی شدند و جذب در 245 نانومتر اندازه گیری شد. حجم تزریق 20 میکرولیتر بود و فاز متحرک، متشکل از PBS (حلال A) و استونیتریل (حلال B) برای شستشوی ایزوکراتیک با نسبت حجمی 82 درصد (A) تا 18 درصد (B) استفاده شد. کل زمان اجرای HPLC 40 دقیقه و سرعت جریان 0.5 میلی لیتر در دقیقه بود.

2.5. فعالیت های ایمونوبیولوژیکی

2.5.1. عملکرد فاگوسیتیک مونوسیت-ماکروفاژ

شصت موش کونمینگ (Grade II، شش هفته سن) از مرکز تجربی فارماکولوژی دانشگاه مغولستان داخلی خریداری شدند و به مدت 1 هفته قبل از استفاده سازگار شدند. همه موش ها به طور تصادفی به چهار گروه شامل یک گروه کنترل سالین، گروه با دوز بالا، گروه با دوز متوسط ​​و گروه با دوز کم CDO تقسیم شدند. به موش‌ها یک بار در روز به مدت 5 روز، محلول الیگوساکارید 5.5 میلی‌لیتری 0 به صورت داخل صفاقی تزریق شد. گروه دوز CDOهای بالا، متوسط ​​یا پایین به ترتیب 10{{10}}، 50 یا 25 میلی‌گرم/کیلوگرم/BW CDO دریافت کردند. و به گروه شاهد 0.5 میلی لیتر سالین تزریق شد. طبق گفته Hou [24]، در روز هفتم آزمایش پاکسازی ذرات کربن انجام شد و شاخص طحال و شاخص تیموس اندازه‌گیری شد. به طور خلاصه، 0.05 میلی لیتر / 10 گرم بر وزن جوهر هند از طریق ورید دمی به هر موش تزریق شد، سپس 20 میکرولیتر خون از ورید اوربیتالیس خلفی 3 و 7 دقیقه پس از تزریق به دست آمد. نمونه های خون در لوله هایی با 2 میلی لیتر Na2CO3 0.1 درصد قرار داده شد و مقادیر OD در طول موج 600 نانومتر اندازه گیری شد. شاخص ترخیص کالا از گمرک (K)، شاخص فاگوسیتیک ( ) و شاخص اندام ایمنی به ترتیب زیر (1)، t2 و t1 به ترتیب 7 دقیقه و 3 دقیقه محاسبه شد.

2.5.2. تکثیر سلولی تولید کننده آنتی بادی

گروه‌های موش کونمینگ (پنج تا در هر گروه) با تزریق داخل صفاقی 7 SRBC در 1.0 میلی‌لیتر PBS اضافه شده با 50 گرم از مواد آزمایش (هیچ‌کدام در گروه شاهد) ایمن شدند. یک هفته بعد، سلول‌های طحال (106 سلول در هر 2 میلی‌لیتر در هر چاهک) از موش‌های کونمینگ با یا بدون مواد آزمایشی به مدت 72 ساعت در محیط کشت 10 درصد RPMI 1640 زیر 5 درصد CO2 در هوا، در سه تکرار برای هر کشت کشت داده شدند. تعداد PFC در برابر SRBC در هر 106 سلول طحال تعیین شد [25]، [26].

2.6. تحلیل آماری

داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد. تفاوت بین گروه های مورد آزمایش و کنترل با استفاده از آزمون t-test مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. P < 0.05="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

3. نتایج و بحث

3.1. جداسازی و خالص سازی الیگوساکاریدها

CDOها از عصاره قلیایی اجسام خشک شده C. deserticola با عملکرد 3.{14}}7 درصد جدا شدند. دو بخش از CDOS-1 و CDOS-2 به ترتیب از آب مقطر توسط ستون Sephadex G-100 جدا شد (شکل 1). کسرهای خالص شده CDOS-1 و CDOS-2 یک پیک منفرد را در ستون Sephadex G-25 نشان دادند که نشان می‌دهد هیچ الیگوساکارید دیگری در نمونه وجود ندارد. نتایج ترکیبات مونوساکاریدی نشان داد که CDOS{9}} فقط از ساکارز (شکل 2) و CDOS{11}} عمدتاً از ساکارز، رامنوز و مانیتول (شکل 3) با نسبت مول تشکیل شده است. از 1:0.73:3.61.

3.2. فعالیت های ایمونوبیولوژیک CDOs

بسیاری از شواهد in vivo و in vitro نشان داده اند که الیگوساکاریدهای طبیعی با تحریک سلولی و هومورال عملکرد تعدیل کننده ایمنی را نشان می دهند.مصون پاسخ[27]، [28]. در این مقاله، 1{15}}0 میلی‌گرم/کیلوگرم/BW CDO باعث افزایش شاخص طحال موش شد، اما تفاوت معنی‌داری در شاخص تیموس بین گروه‌های تحت درمان و گروه کنترل وجود نداشت (جدول 1). ماکروفاژها جزء مهمی از دفاع میزبان در برابر عفونت ویروسی با مهار تکثیر داخل سلولی ویروس ها و از بین بردن سلول های آلوده به ویروس هستند [29]. هنگامی که فعال می شود، انواع واسطه های اکسیژن یا نیتروژن و سیتوکین ها از ماکروفاژها آزاد می شوند و در عملکردهای مختلف بیولوژیکی مهم، مانند فعالیت های ضد التهابی و ضد تومور شرکت می کنند [30]-[32]. بنابراین، فعالیت فاگوسیتیک ماکروفاژها یک شاخص مهم برای عملکردهای ایمنی ارگانیسم است. در این مطالعه، دوزهای متوسط ​​و بالای CDOs باعث افزایش فعالیت فاگوسیتوز ماکروفاژها شد (جدول 1). تکثیر سلول های تولید کننده آنتی بادی ناشی از CDO ها با بررسی افزایش PFC همولیتیک در طحال موش های کونمینگ که با SRBC به علاوه نمونه آزمایش ایمن شده بودند مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که دوزهای متوسط ​​و بالا CDOs به طور قابل توجهی تکثیر سلولی تولید کننده آنتی بادی را افزایش می دهد (جدول 2). دوزهای بالای CDO باعث افزایش بسیار قابل توجهی در تعداد PFC شد (01/0 > P).

منابع

[1] J. Li، Y. Jiang، R. Fan. تشخیص سیگنال بیولوژیکی مخلوط بر اساس تجزیه و تحلیل موجک. در: Y. Jiang, et al (eds). Proc. کارگاه مهندسی ورزشی انگلستان و چین. لیورپول: اتحادیه جهانی آکادمیک 2007، ص. 1-8.

[2] J. Ouyang، XD Wang، B. Zhao، و همکاران. اثرات عناصر خاکی کمیاب بر رشد سلول‌های سیستانش کویر و تولید گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی. JB io-technol، 2003، 102 (2): 129-134

[3] خو ژائوهوی، یانگ جونشان، لو رویمیان، و همکاران. محصول طبیعی جدید از Cistanche deserticola YCMA. مجله علوم دارویی چینی، 1999، 8 (2):61-63.

[4] X. Wang، L. Li، Muhuyati، X. Wanag، N. Du. اثر آنتی اکسیدانی گلیکوزیدهای سیستانچ در بافت موش. ژونگگو ژونگ یائو زا ژی. 1998، 23(9):554-5.

[5] Lin LW، Hsieh MT، Tsai FH، Wang WH، Wu CRA فعالیت ضد درد و ضد التهابی ناشی از Cistanche deserticola در جوندگان. جی اتنوفارماکول. 2002، 83(3):177-82.

[6] چوی، جی جی. ماه، م. جئونگ، HU; کیم، ام سی؛ کیم، سی. اوه، MS Cistanches Herba با القای فاکتور رشد عصبی، یادگیری و حافظه را تقویت می کند. تحقیقات مغز رفتاری. 2011، 216 (2): 652-8.

[7] Zong G، He W، Wu G، Chen M، Shen X، Shi M. مقایسه بین Cistanche deserticola YC Ma و C، tubulosa (Shenk) Wight بر روی برخی اقدامات دارویی. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996، 21 (7): 436-7.

[8] He W، Shu XF، Zeng GZ، و همکاران. بررسی تقویت قوای جنسی C. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ، He W، Wu GL، و همکاران. مقایسه وزن Cistanche deserticola YC Ma و C.tubulosa بر روی برخی از اقدامات دارویی. جی چین مد. 1996، 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL، Zheng YF، Lu ZL اثرات تعدیل کننده ایمنی پلی ساکارید Cistanche deserticola YC Ma. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002، 31 (4): 284- 287.

[11] لی یوان، آهنگ یوانیوان، ژانگ هونگ کوان. پیشرفت در تحقیقات ترکیبات شیمیایی و فعالیت دارویی سیستانچ. منابع گیاهی وحشی چینی، 2010، 29(1):7-11.

[12] دو NS، وانگ اچ، یی YH. جداسازی و شناسایی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی از Cistanche deserticola. Nat Prod R & D، 1993، 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS، Liu JL تعیین گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید در Cistanche deserticola توسط طیف سنجی رزینی ماکرو مشبک. Nat Prod R & D، 1993، 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB، Tezuka Y، Kaneko T، و همکاران. مهار اکسید نیتریک توسط فنیل اتانوئیدها در ماکروفاژهای فعال شده

مجله اروپایی فارماکولوژی، 2000، 400: 137- 144.

[15] ژائو وی، یان هونگ، لیانگ ژونگ یان، و همکاران. تجزیه و تحلیل ساختاری پلی ساکارید محلول در آب SPA جدا شده از ساقه Cistanche Deserticola Ma. مجله شیمی دانشگاه های چین، 2005، 26(3):461-463.

[16] وانگ شیانگیان. مطالعه بر روی فارماکولوژی ایمنی و ویژگی جذب پلی ساکاریدهای گیاه سیستانش دسرتیکولا. 2011، شماره S1، پزشکی و علوم بهداشتی، E{3}}.

[17] Xiong Q، Hase K، Tezuka Y، Tani T، Namba T، Kadota S. فعالیت محافظتی کبدی فنیل اتانوئیدها از Cistanche deserticola. Planta Med. 1998، 64 (2): 120-5.

[18] کتابچه راهنمای آمیلازها و آنزیم های مرتبط (ویرایش انجمن تحقیقات آمیلاز ژاپن)، چاپ پرگامون (1988)

[19] آرایا، اس. (ویرایش) مجموعه مقالات پنجمین کنفرانس پوسیدگی دندان و قند جفت شده (به ژاپنی)، موسسه ملی بهداشت، توکیو (1980)

[20] کودو اوتاکا. الیگوساکارید عملکردی و جنبه جدید آن به عنوان تعدیل ایمنی جی بیول. ماکرومول. 2006، 6(1)، 3-9.

[21] Navarini L، Gilli R، Gombac V، Abatangelo A، Bosco M، Toffanin R. پلی ساکاریدهای حاصل از عصاره آب گرم دانه های قهوه بو داده شده: جداسازی و خصوصیات. کربوهیدرات. Polym.1999، 40:71-81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. روش رنگ سنجی برای تعیین قندها و مواد مرتبط. مقعدی شیمی. 1956، 28:350-356.

[23] Yang X، Zhao Y، Wang Q، Wang H، Mei Q. تجزیه و تحلیل اجزای مونوساکارید در پلی ساکاریدهای گلپر با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا. علم مقعد 2005، 21:1177-1180.

[24] یوفانگ هو، یوبائو هو، لیو یانیان، و همکاران. استخراج و خالص سازی لکتین از لوبیا قرمز و مطالعات اولیه عملکرد ایمنی لکتین و چهار پلی ساکارید گیاهی چینی. مجله زیست پزشکی و بیوتکنولوژی، 2010:1-9.

[25] کانینگهام، ای جی، و آ.زنبرگ. پیشرفت های بیشتر در تکنیک پلاک برای تشخیص سلول های منفرد تشکیل دهنده آنتی بادی. Immunology.1968, 14: 599-600.

[26] هاروهیکو تاکادا، توموهیکو اوگاوا، فومینوبو یوشیمورا، و همکاران. فعالیت های ایمونوبیولوژیکی یک بخش پورین جدا شده از Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. عفونت و ایمنی. 1988، 56 (4): 855-863.

[27] Wang MQ، Guilbert LJ، Ling L، Li J، Wu YQ، Xu SR، Pang P، Shan JJ فعالیت سیستم ایمنی CVT-E002: یک عصاره اختصاصی از جینسنگ آمریکای شمالی (Panax quinque folium). J Pharmacol.2001, 53:1515-1523.

[28] Nergard CS، Kiyohara H، Reynolds JC، Thomas-Oates JE، Matsumoto T، Yamada H، Patel T، Petersen D، Michaelsen TE، Diallo D، Paulsen BS ساختارها و روابط ساختار-فعالیت سه میتوژنیک و تثبیت مکمل آرابینوگالاکتان پکتیک از گیاهان ضد زخم مالی Cochlospermum tinctorium A. Rich و Vernonia kotschyana Sch Bip. والپ سابق بیوماکرومولکول ها 2006، 7:71-79.

[29] E.-M. چوی، A.-J. کیم، Y.-O. کیم، و جی.-کی. هوانگ، فعالیت تعدیل کننده ایمنی آرابینوگالاکتان و فوکویدان در شرایط آزمایشگاهی. مجله غذای دارویی. 2005، 8 (4): 446-453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan، D. Qian، و همکاران. ارزیابی و مقایسه فعالیت تنظیم ایمنی چهار فراکسیون محلول در آب گلپر گلپر Sinensis در شرایط آزمایشگاهی بر روی ماکروفاژهای صفاقی در موش ICR. ایمونوفارماکولوژی بین المللی 2010، 10:422-430.

[31] YS Lee، OK Han، CW Park، و همکاران. بیان ژن سیتوکین پیش التهابی و تنظیم اکسید نیتریک ریشه آستراگالی استخراج شده آبی در سلول های ماکروفاژ RAW 264.7. مجله اتنوفارماکولوژی. 2005، 100 (3): 289-294.

[32] کی لی و وای جی جئون. پلی ساکارید جدا شده از اسکلروتیوم Poria cocos باعث تحریک NF-κB/Rel و بیان iNOS در ماکروفاژهای موش می شود. ایمونوفارماکولوژی بین المللی 2003، 3(10-11):1353-1362.