تجزیه و تحلیل جامع تنظیم کننده های پیروپتوز و میکرومحیط ایمنی تومور در کارسینوم سلول کلیوی سلول شفاف

برای اطلاعات بیشتر. مخاطبtina.xiang@wecistanche.com

خلاصه

زمینه: شواهد فزاینده نشان می دهد که پیروپتوز می تواند این بیماری را تنظیم کندریزمحیط ایمنی تومور(TIME) بر رشد تومور تأثیر بگذارد. به عنوان یک تومور بسیار ایمنی زا، کارسینوم سلول کلیوی سلول شفاف (ccRCC) می تواند از ایمونوتراپی بهره مند شود، اما تحقیقات مرتبط در مورد پیروپتوز در زمان ccRCCis هنوز کمبود دارد.

روش‌ها: داده‌های موجود به‌دست‌آمده از پایگاه‌های داده TCGA و GEO برای شناسایی پروفایل‌های بیانی مختلف پیروپتوز در ccRCC و بافت‌های طبیعی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و همبستگی تنظیم‌کننده‌های پیروپتوز با TIME در cCRCC ارزیابی شد.

نتایجبر اساس تجزیه و تحلیل خوشه‌بندی اجماع، دو سطح بیان متفاوت از زیرگروه‌ها شناسایی شد که بر پیش آگهی بیمار تأثیر می‌گذارند و به مرحله و درجه بافت‌شناسی تومور مرتبط بودند. سلول های ایمنی توسط الگوریتم CIBERSORT محاسبه شدند. سطوح نفوذ بالاتری از سلول های B ساده، سلول های T در حافظه CD4، سلول های NK در حال استراحت، مونوسیت ها و ماکروفاژها در خوشه 1 مشاهده شد، در حالی که سطوح نفوذ بالاتری از سلول های CD8 به علاوه T، سلول های کمکی فولیکولی T و Tregs در خوشه 2 مشاهده شد. تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه ژن نشان داد که خوشه 2 در چندین مسیر مرتبط با ایمنی، از جمله مسیر سیگنالینگ JAK-STAT غنی شده است. علاوه بر این، بیان بیش از حد هشت ایست بازرسی ایمنی به توسعه ccRCC مربوط بود، به خصوص در خوشه 2. از آنجایی که چهار تنظیم کننده بالقوه کلیدی پیروپتوز، AIM2، CASP5، NOD2، و GZMB تایید شد که در ccRCC توسط تجزیه و تحلیل RT-qPCR تنظیم مثبت شده و بیشتر توسط پایگاه داده HPA تجزیه و تحلیل بیشتر پان سرطان نشان داد که این چهار تنظیم کننده پیروپتوز به طور متفاوت بیان شده و با TIME در سرطان های متعدد مرتبط هستند.

نتیجهمطالعه حاضر یک نمای جامع از تنظیم کننده های پیروپتوز در زمان ccRCC ارائه می کند که ممکن است ارزش بالقوه ای برای ایمونوتراپی ارائه دهد.

کلید واژه ها: کارسینوم سلول کلیوی سلول شفاف، پیروپتوز، ریزمحیط ایمنی تومور، نقاط بازرسی ایمنی، ایمونوتراپی

برای یادگیری گیاه سیستانچ عملکرد کلیه را درمان می کند

زمینه

کارسینوم سلول کلیه(RCC) شایع‌ترین تومور بدخیم بدخیم کلیه در بزرگسالان است که تقریباً 3 درصد از کل بدخیمی‌های بزرگسالان و 90 درصد از بدخیمی‌های کلیوی را تشکیل می‌دهد[1]. در حال حاضر، تعداد مرگ و میر ناشی از RCC در هر سال در سراسر جهان از 1،00،000 فراتر رفته است و میزان عوارض و مرگ و میر هر 10 سال به میزان 2-3 درصد در حال افزایش است. [2]. بر اساس نسخه 2004 طبقه بندی پاتولوژیک RCC WHO، میزان بروز کارسینوم سلول کلیوی سلول شفاف (ccRCC) تقریباً 70 درصد است [3]. اگرچه برداشتن جراحی هنوز بهترین درمان برای ccRCC است، اما در حال حاضر هیچ درمان کمکی موثری پس از عمل وجود ندارد و ccRCC به رادیوتراپی و شیمی درمانی حساس نیست. طبق ادبیات،{12}} درصد بیماران پس از جراحی عود را تجربه می‌کنند [4]. به عنوان یک تومور بسیار ایمنی زا، ccRCC می تواند از ایمونوتراپی بهره مند شود.

پیروپتوز نوعی مرگ برنامه ریزی شده سلولی است که باالتهابناشی از عفونت میکروارگانیسم های بیماری زا یا سایر سیگنال های مضر [5]. پیروپتوز عمدتاً با تورم سلولی، لیز و آزاد شدن محتویات سیتوپلاسمی مشخص می شود. پیروپتوز مناسب مکانیسم مهمی برای مقاومت میزبان در برابر عفونت توسط میکروارگانیسم های بیماریزای خارجی است. با این حال، پیروپتوز بیش از حد برای میزبان مضر یا حتی کشنده است. تعداد فزاینده ای از مطالعات نشان داده اند که پیروپتوز همچنین نقش مهمی در ایجاد تومورها ایفا می کند [6]. پیروپتوز با آزادسازی عوامل التهابی، محیطی برای مهار تومور ایجاد می کند. با این حال، پیروپتوز همچنین می تواند عملکرد ایمنی بدن را در برابر سلول های تومور ضعیف کند و رشد تومورها را در سرطان های مختلف تسریع کند. برخی از مطالعات نشان داده اند که اثر پیش التهابی موثر پیروپتوز با تنظیم ریزمحیط ایمنی تومور مرتبط است [7]. این یافته ها نشان می دهد که پیروپتوز نقش مهمی در توسعه تومور و فرآیند ضد تومور ایفا می کند. با این حال، اثر پیروپتوز بر پیش آگهی ccRCC نامشخص است. هنوز درک جامعی از پیروپتوز در ccRCC وجود ندارد، از جمله تداخل بین تنظیم‌کننده‌های پیروپتوز و ریزمحیط ایمنی تومور.

در مطالعه حاضر، ما یک تجزیه و تحلیل گذشته نگر جامع بر اساس پایگاه داده اطلس ژنوم سرطان (TCGA) و پایگاه داده کلی بیان ژن (GEO) انجام دادیم تا تأثیر پیروپتوز را بر زمان تخمین بزنیم و مکانیسم های اساسی بین پیروپتوز و TIME فردی را بررسی کنیم. خصوصیات بر اساس تجزیه و تحلیل خوشه اجماع. علاوه بر این، مطالعه حاضر همچنین رابطه بین پیروپتوز و بیان نقطه بازرسی داغ ایمنی را تأیید کرد.

مواد و روش ها

اکتساب داده و شناسایی بیان دیفرانسیل

داده‌های توالی‌یابی RNA (RNA-seq) 539 بافت ccRCC و 72 بافت طبیعیکلیهبافت ها و همچنین ویژگی های بالینی مربوطه از پایگاه داده TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov/) به دست آمد. داده های GSE46699 و GSE53757 از پایگاه داده GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) جمع آوری و برای ارزیابی بیان تنظیم کننده پیروپتوز استفاده شد. علاوه بر این، داده‌های بیان ژن پان سرطان TCGA برای 33 نوع تومور بدخیم و اطلاعات بالینی مربوطه، مانند نمرات بنیادی بر اساس mRNA (RNAs) و متیلاسیون DNA (DNAss) و همچنین زیر انواع ایمنی، از دانشگاه به‌دست آمد. پایگاه داده کالیفرنیا سانتا کروز (UCSC Xena، http://xena.ucsc.edu/). 37 تنظیم کننده پیروپتوز در فایل اضافی 4: جدول S1 ارائه شده است و از تحقیقات قبلی استخراج شده است [8، 9]. با استفاده از بسته "limma"، تغییرات بیش از دو برابری و نرخ کشف نادرست (FDR، مقدار p تنظیم شده)<0.05 is="" considered="" differential="" gene="" expression.="" the="" immunohistochemistry="" (ihc)="" staining="" images="" of="" pyroptosis="" regulators="" in="" normal="" kidney="" and="" tumor="" tissues="" were="" analyzed="" and="" obtained="" from="" the="" hpa="" database="" (http://www.proteinatlas.org/).to="" compare="" the="" expression="" between="" normal="" and="" tumor="" samples,="" all="" tissues="" were="" selected="" using="" the="" same="">

خوشه بندی اجماع

تجزیه و تحلیل رگرسیون کاکس تک متغیره برای استخراج تنظیم کننده های پیروپتوز از طریق بسته R "بقا" p-value استفاده شد.<0.05). consensus="" clustering="" was="" performed="" to="" explore="" the="" potential="" molecular="" subtype="" between="" the="" bca="" patients="" using="" the="" r="" package"consensus="" cluster="" plus".="" the="" cluster="" count="" (k)="" was="" set="" from="" 1="" to="" 9,="" and="" the="" best="" optimal="" k="" value="" was="" selected="" for="" further="">

برآورد ریزمحیط ایمنی تومور

CIBERSORT، یک ابزار تجزیه و تحلیل مبتنی بر امضای ژن ایمنی LM22، برای ارزیابی سطوح نفوذ ایمنی تومور ccRCC استفاده شد. الگوریتم برای 1000 جایگشت و نمونه ccRCC با خروجی P اجرا شد.<0.05 were="" selected="" for="" further="" analysis.="" the="" "estimate"="" package="" in="" r="" was="" used="" to="" evaluate="" the="" immune="" score="" and="" the="" stromal="" score.="" moreover,="" 8="" com-mon="" immune="" checkpoint="" genes,="" including="" pd-1,="" pd-l1,="" pd-l2,="" ctla4,="" siglec15,="" tigit,="" tim3,="" and="" lad3,="" were="" extracted="" and="" evaluated="" for="" their="" correlations="" with="" pyroptosis="" regulators="" in="">

تجزیه و تحلیل غنی سازی عملکردی

آنالیز ژن هستی شناسی (GO) و تحلیل مسیر سیگنالینگ دایره المعارف ژن ها و ژنوم های کیوتو (KEGG) با استفاده از بسته "Cluster Profiler" در R انجام شد. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه ژن (GSEA) برای شناسایی تفاوت ها در مجموعه انجام شد ژن های بیان شده بین دو خوشه در غنی سازی مسیر KEGG. تعداد جایگشت ها 1000 بار برای انجام شد

هر تجزیه و تحلیل، و مسیرها با مقدار p تنظیم شده<0.05 and="" q="" values=""><0.05 were="" considered="" statistically="">

پیش بینی پاسخ دارویی

بر اساس اطلاعات بازیابی شده از پایگاه داده ژنومیک حساسیت دارویی در سرطان (GDSC) (https://www.cancerrxgene.org/)، حساسیت های شیمی درمانی برای ccRCC محاسبه شد. سه داروی بالینی رایج برای پیش‌بینی پاسخ شیمی‌درمانی انتخاب شدند و بسته R "pRRophetic" برای تخمین پاسخ شیمی‌درمانی تعیین‌شده توسط نیمه حداکثر غلظت مهاری (IC50) استفاده شد.

خطوط سلولی و تجزیه و تحلیل RT-qPCR

رده‌های سلولی ccRCC انسانی، 786-O و Caki-1 توسط Haixiang Shen، و رده سلولی اپیتلیال قشر کلیه انسان طبیعی، HK-2، توسط Yanhong Ma.RPMI ارائه شد. برای کشت سلول ها از محیط کشت 1640 (Gibco) همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS, Gibco) استفاده شد. و تمامی سلول ها در دمای 37 درجه با 5 درصد دی اکسید کربن کشت داده شدند. RNA های کل با استفاده از کیت Trizol (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) طبق دستورالعمل سازنده از سلول ها استخراج شد. اولین رشته (cDNA) رونویسی معکوس شد و به عنوان الگوی تجزیه و تحلیل qPCR همانطور که قبلاً توضیح داده شد استفاده شد [10]. سطح بیان تنظیم کننده های پیروپتوز (AIM2، NOD2، GZMB، و CASP5) با استفاده از کیت QPCR سبز SYBR (تاکارا، ژاپن) اندازه گیری شد. نام ژن و توالی های آغازگر در فایل اضافی 5 فهرست شده است: جدول S2. سطوح mRNA تمام ژن ها به GAPDH (یک مرجع عادی سازی درون زا) نرمال شد.

تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار R (http://www.R-project.org، نسخه 4.0.3)، زبان برنامه نویسی PERL (نسخه 5.32.1.1، https://www.perl.org) انجام شد. /)، و GraphPad Prism 8.0. ضرایب همبستگی توسط اسپیرمن و تجزیه و تحلیل همبستگی فاصله محاسبه شد. منحنی‌های کاپلان-مایر رسم شدند و برای محاسبه تفاوت معنی‌دار بقا از آزمون log-rank استفاده شد. برای تجزیه و تحلیل متغیرهای پیوسته از آزمون رتبه علامت دار ویلکاکسون و برای تجزیه و تحلیل داده های مقوله ای از آزمون کای اسکوئر استفاده شد. نتایج RT-qPCR به عنوان میانگین ± SEM بیان شد. تفاوت بین گروه ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و سپس آزمون مقایسات چندگانه Dunnett's ad hoc برای مقایسه با سلول های کلیوی طبیعی مورد ارزیابی قرار گرفت. مقدار p کمتر از 0.05 از نظر آماری معنی دار برای همه تجزیه و تحلیل ها در نظر گرفته شد.

نتایج

شناسایی و طبقه بندی تنظیم کننده های مرتبط با پیروپتوز متفاوت

بیان 37 ژن مرتبط با پیروپتوز در گروه TCGA-KIRC مورد مقایسه قرار گرفت و 11 ژن به عنوان ژن های بیان شده متفاوت شناسایی شدند (شکل 1A). پس از استفاده از دو مجموعه داده مستقل از پایگاه داده GEO برای نشان دادن بیان این 11 ژن در ccRCC، شش تنظیم کننده مرتبط با پیروپتوز (AIM2، CASP5، NLRP3، NOD2، GZMA و GZMB) به شدت در ccRCC بیان می شوند (شکل .1B). همراه با اطلاعات پیش آگهی بیمار دانلود شده از مجموعه داده های TCGA، رگرسیون کاکس تک متغیره سپس برای غربالگری ژن های این 6 تنظیم کننده اجرا شد و چهار مورد از آنها (AIM2، CASP5، NOD2 و GZMB) به طور قابل توجهی با پیش آگهی بیمار ccRCC مرتبط بودند (شکل 1C). . برای بررسی بیشتر رابطه بین بیان این 4 تنظیم‌کننده و زیرگروه‌های ccRCC، تجزیه و تحلیل خوشه‌بندی اجماع با بیماران همگروهی TCGA-KIRC انجام شد. تجزیه و تحلیل خوشه‌بندی اجماع با بیماران ccRCC بر اساس این چهار تنظیم‌کننده پیروپتوز انجام شد و نتیجه نشان داد که متغیر خوشه‌بندی (k) =2 به عنوان بالاترین ثبات خوشه‌بندی از k =1 تا 9 شناسایی شد که نشان‌دهنده آن است. که بیماران ccRCC را می توان به دو خوشه با بیشترین همبستگی درون گروهی و کمترین همبستگی بین گروهی تقسیم کرد (شکل 1D). علاوه بر این، بیماران در خوشه 1 بقای کلی (OS) مطلوبی در مقایسه با بیماران خوشه 2 (شکل 1 E) داشتند.

تجزیه و تحلیل TIME خوشه ها با توجه به تنظیم کننده های پیروپتوز

برای بررسی اینکه کدام مسیرها در خوشه ها غنی شده اند، تجزیه و تحلیل GSEA برای شناسایی مسیرهای مهم KEGG مرتبط با دو خوشه انجام شد. نتایج نشان داد که برهمکنش گیرنده سیتوکین، مسیر سیگنالینگ گیرنده سلول T، پردازش و ارائه آنتی ژن، مسیر سیگنالینگ کموکاین، سمیت سلولی با واسطه سلول های کشنده طبیعی، مسیر سیگنالینگ گیرنده شبه تلفات، مسیر سیگنالینگ گیرنده سلول B، و سیگنال JAK-STAT مسیر به طور قابل توجهی با خوشه 2 مرتبط بود (پرونده اضافی 1: شکل S1)، که نشان می دهد خوشه های حاوی تنظیم کننده های پیروپتوز با ریزمحیط ایمنی تومور مرتبط هستند. بنابراین، برای کشف تفاوت در عملکرد ایمنی بین دو خوشه، امتیازات ESTIMATE محاسبه شد و نشان داد که خوشه 2 امتیازات تخمین، استروما و ایمنی به طور قابل توجهی بالاتری نسبت به خوشه 1 (شکل 2A) دارد و چهار تنظیم کننده پیروپتوز مثبت بودند. مربوط به این امتیازات (شکل 2B). علاوه بر این، دو خوشه تفاوت های قابل توجهی را در نفوذ سلول های ایمنی نشان دادند (شکل 2C). خوشه 1 دارای سطوح نفوذ بالاتری از سلول های B ساده، سلول های T سلول های CD4 در حال استراحت، سلول های NK در حال استراحت، مونوسیت ها، ماکروفاژهای M{15}}، ماکروفاژهای M2، سلول های دندریتیک فعال و ماست سل ها در حال استراحت بودند، در حالی که خوشه 2 بالاتر بود. مربوط به سلول های پلاسما، سلول های T CD8، حافظه سلول های T فعال شده، سلول های T کمک کننده فولیکولی، سلول های T تنظیم کننده (Tregs)، سلول های T گاما دلتا، و سلول های NK فعال شده است. تجزیه و تحلیل ارتباط بین چهار تنظیم کننده و انواع سلول های ایمنی نشان داد که چهار تنظیم کننده با اکثر انواع سلول های ایمنی همبستگی مثبت یا منفی دارند (شکل 2D). جالب توجه است، تحقیقات بیشتر در مورد بیان متفاوت ژن‌های ایمنی بین دو خوشه نشان داد که توده‌ای از ژن‌های ایمنی در خوشه 2 تنظیم می‌شوند در حالی که تنها 5 ژن کاهش می‌یابند (پرونده اضافی 2: شکل S2A). 10 ژن بیشتر تنظیم شده و پایین تنظیم شده برای تجزیه و تحلیل همبستگی انتخاب شدند و نتیجه در فایل اضافی 2 نشان داده شده است: شکل S2B. تجزیه و تحلیل GO فرآیندهای بیولوژیکی نشان داد که بیان متفاوت ژن های ایمنی بین خوشه ها در فعال کردن مسیر سیگنالینگ گیرنده سطح سلول و انتقال سیگنال غنی شده است.پاسخ ایمنی. تجزیه و تحلیل اجزای سلولی نشان داد که ژن های ایمنی بیان شده متفاوت در کمپلکس ایمونوگلوبولین فراوان بودند. تجزیه و تحلیل عملکرد مولکولی نشان داد که ژن های ایمنی بیان شده متفاوت درگیر اتصال آنتی ژن هستند. تجزیه و تحلیل KEGG نشان داد که ژن های ایمنی بیان شده متفاوت در برهمکنش گیرنده سیتوکین-سیتوکین غنی شده بودند (پرونده اضافی 2: شکل S2C، D). این نتایج نشان داد که خوشه 2 و چهار تنظیم کننده در ریزمحیط ایمنی تومور نقش دارند.

ارتباط تنظیم‌کننده‌های پیروپتوز با مهارکننده‌های ایمون بازرسی و حساسیت‌های دارویی هدفمند درمان‌های بازدارنده نقطه بازرسی ایمنی (ICI) به عنوان یک گزینه درمانی قوی برای انواع تومورهای مختلف ایجاد شده‌اند، در حالی که تنها بخشی از بیماران از چنین درمانی سود می‌برند. بنابراین، بیان متفاوت ICIs در زیرگروه‌های مختلف بیشتر مورد بررسی قرار گرفت. هشت ژن نقطه بازرسی ایمنی داغ (SIGLEC15، TIGIT، PD-L1، TIM3، PD{4}}، CTLA4، LAG3، و PD-L2) با خوشه 2 ارتباط مثبت داشتند (شکل 3A، B). جالب توجه است، چهار تنظیم کننده به شدت با بیشتر ICI ها مرتبط بودند، در حالی که هیچ رابطه معنی داری بین GZMB و SIGLEC15 وجود نداشت (شکل 3C). علاوه بر این، با توجه به ارزش درمان بالینی در حساسیت به داروهای هدف، Sunitinib و Temsirolimus حساسیت بیشتری را در خوشه 1 نشان دادند، در حالی که Axitinib ارتباط نزدیکی با خوشه 2 داشت (شکل 3D-F). این نتایج نشان داد که این طبقه بندی ممکن است یک مقدار مرجع معین برای داروی بالینی بیماران مختلف ccRCC ارائه دهد.

تجزیه و تحلیل طبقه‌بندی ابزار بالینی خوشه‌ای برای بررسی بیشتر ارزش بالینی رابطه بین این طبقه‌بندی و ویژگی‌های بالینی مختلف، بیماران ccRCC بر اساس سن، جنسیت، درجه و مرحله بیماری به گروه‌های مختلف تقسیم شدند. شایان ذکر است که مرحله بالاتر بیماری بیشتر با بیماران در خوشه 2 و همچنین درجه پاتولوژیک مرتبط بود (جدول 1؛ شکل 4B). تجزیه و تحلیل بیشتر از رابطه بین تنظیم‌کننده‌های پیروپتوز و ویژگی‌های بالینی نشان داد که سطح بیان چهار تنظیم‌کننده با افزایش مرحله بیماری و درجه پاتولوژیک افزایش می‌یابد، در حالی که تنها AIM2 در مردان بیشتر از زنان بیان می‌شود. تفاوت معنی داری بین بیان چهار تنظیم کننده و سن بیمار وجود نداشت (شکل 4A).

تأیید تجربی بیان چهار تنظیم کننده بر اساس تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک بیان این چهار تنظیم کننده، ما سطوح بیان mRNA و پروتئین را تجزیه و تحلیل کردیم. در مقایسه با سلول های نرمال، سطح بیان این 4 ژن به درجات مختلف در دو رده سلولی ccRCC افزایش یافت (شکل 5A). به همین ترتیب، الگوهای بیان پروتئین AIM2، NOD2، و GZMB از پایگاه داده HPA نشان داد که تنظیم کننده ها نیز در بافت ccRCC در مقایسه با بافت طبیعی بیش از حد بیان می شوند (شکل 5B).

چهار الگوی بیان تنظیم کننده پیروپتوز در سرطان های متعدد

بررسی بیشتر الگوی بیان این چهار تنظیم کننده پیروپتوز در پان سرطان نشان داد که چهار تنظیم کننده پیروپتوز به طور متفاوتی در سرطان های متعدد بیان می شوند (شکل 6A). AIM2 به طور متفاوت در سرطان های متعدد از جمله مثانه، پستان، مری، کلیه، کبد بیان می شود. ریه، معده، و آندومتر، و همچنین CASP5، NOD2، و GZMB (شکل 6A). تجزیه و تحلیل بیشتر نشان داد که AIM2 بیشترین ارتباط مثبت را با HNSC داشت، در حالی که CASP5 با COAD ارتباط منفی داشت (شکل 6B). و AIM2 و GZMB دو ژن با مهمترین ارتباط مثبت بودند (ضریب همبستگی =0.59, Fig.6C).

در طول پیشرفت سرطان، سلول‌های تومور می‌توانند به تدریج یک فنوتیپ تمایز یافته را از دست بدهند و ویژگی‌های پیش‌ساز و سلول‌های بنیادی را به دست آورند[11]. به طور کلی، RNA ها و DNA ها می توانند برای ارزیابی بنیادی سلول های بنیادی سرطانی استفاده شوند [12]. بنابراین، ارتباط بین تنظیم‌کننده‌های پیروپتوز با ساقه تومور اندازه‌گیری شده توسط RNAs و DNAs مورد بررسی قرار گرفت. چهار تنظیم کننده به طور قابل توجهی به طور مثبت یا منفی با RNA ها و DNAss در بسیاری از پان سرطان ها همبستگی داشتند (شکل 6D). قابل‌توجه، در KIRC، AIM2 و GZMB به ترتیب با RNA ها ارتباط مثبت یا منفی داشتند، در حالی که NOD2 به طور منفی با DNAss مرتبط بود (پرونده اضافی 3: شکل S3).

ارتباط چهار تنظیم کننده پیروپتوز با ریزمحیط ایمنی تومور در پان سرطان

بر اساس اثر تنظیمی مهم ژن‌های پیروپتوز بر انواع مختلف سلول‌های ایمنی، چهار تنظیم‌کننده بیشتر در محیط میکرو پان سرطان مورد بررسی قرار گرفتند. جالب توجه است، به جز اینکه AIM2 با DLBC و CASP5 ارتباط منفی با COAD و READ در امتیاز ESTIMATE و امتیاز استرومایی داشتند، بقیه به طور مثبت با سرطان در امتیاز ایمنی، امتیاز استرومایی و امتیاز ESTI-MATE مرتبط بودند (شکل 7A) ). برای بررسی بیان چهار تنظیم کننده پیروپتوز در زیرگروه های مختلف ایمنی در پان سرطان، انفیلترات های ایمنی برای تجزیه و تحلیل به شش نوع تقسیم شدند که به ترتیب از محرک تومور تا سرکوب کننده تومور، شامل ترمیم زخم، IFN-y غالب، التهابی، لنفوسیتی مطابقت دارند. تهی شده، از نظر ایمونولوژیکی آرام، و TGF- غالب است. جالب توجه است، چهار تنظیم کننده پیروپتوز همه به طور قابل توجهی با زیرگروه های ایمنی مرتبط بودند، و چهار تنظیم کننده پیروپتوز بیشتر در IFN-y غالب و به دنبال آن TGF- غالب بیان شدند (شکل 7B). در KIRC، با این حال، بیان چهار تنظیم کننده پیروپتوز در C2 به همان اندازه تجزیه و تحلیل پان سرطان بالاترین بود. AIM2، که دومین بیان بالاتر را در زیرگروه های ایمنی داشت، مربوط به Cl بود، در حالی که NOD2، CASP5 و GZMB مربوط به C6 بود (شکل 2E).

بحث

برداشتن جراحی اولین درمان برای کارسینوم سلول کلیه در عمل بالینی ما است. با این حال، حذف متاستاز کارسینوم سلول کلیه هنوز دشوار است. کارسینوم متاستاتیک سلول کلیوی به پرتودرمانی و درمان سیستمیک از جمله هورمون درمانی و شیمی درمانی مقاوم است [13]. یک کارآزمایی بالینی نیولوماب، یک مهارکننده نقطه بازرسی ایمنی ضد PD-L1، برای درمان ccRCC متاستاتیک (CheckMate{4}}) نشان داده است که nivolumab دارای سیستم عامل، نسبت خطر، ORR و میزان پاسخ کلی به طور قابل‌توجهی است. 14]. این مطالعات نشان می دهد که کاربرد ایمونوتراپی در درمان ccRCC چشم انداز زیادی دارد. تجزیه و تحلیل عمیق ناهمگونی CCRCC TIME ممکن است به ارائه مدیریت ایمونوتراپی دقیق و فردی برای بهبود اثر درمان و کیفیت بقای پیش آگهی بیمار کمک کند. در اینجا، بیماران ccRCC به دو زیرگروه مولکولی مستقل با ویژگی‌های بالینی مختلف، بیان ژن ایمنی، و TIME از طریق خوشه‌بندی اجماع برای چهار تنظیم‌کننده اصلی پیروپتوز جدا شدند. بر اساس مطالعه حاضر، خوشه 2 پیش آگهی بدتری نسبت به خوشه 1 داشت، اما خوشه 2 حساسیت بیشتری به ایمونوتراپی داشت.

در میان مکانیسم های مرگ ذاتی سلول ها، پیروپتوز توجه فزاینده ای را به خود جلب کرده است. پیروپتوز یک نوع جدید شناخته شده مرگ سلولی التهابی برنامه ریزی شده است که از طریق مسیرهایی با واسطه کاسپازهای کلاسیک-1 التهابی یا کاسپازهای غیرکلاسیک-4، کاسپاز-5 و کاسپاز{{4} فعال می شود. } [15]. اخیراً، شواهد در حال ظهور نقش مهم پیروپتوز را در تومورزایی بدخیمی های انسانی گزارش کرده اند [16،17]. پیروپتوز رشد تومور را در سرطان کولورکتال، سرطان کبد و سرطان پوست مهار می‌کند، اما تأثیری دو طرفه روی سرطان سینه دارد [18-20]. در ccRCC، نحوه تعامل ژن‌های مرتبط با پیروپتوز و ارتباط آنها با زمان بقای بیمار ناشناخته باقی مانده است. بیان بیشتر ژن‌های تنظیم‌کننده پیروپتوز همبستگی مثبتی دارد و نقش پیش‌آگهی مهمی در ccRCC دارد. این یافته ها نشان می دهد که تنظیم کننده های پیروپتوز ممکن است نقش کلیدی در تنظیم تومورزایی و توسعه ccRCC داشته باشند. در مطالعه حاضر، چهار تنظیم کننده پیروپتوز که در سرطان کلیه به شدت بیان می شوند و باعث پیش آگهی ضعیف می شوند، شناسایی شدند. AIM2 یک گیرنده ایمنی ذاتی سیتوزولی است که DNA دو رشته ای (dsDNA) آزاد شده در طول اختلال سلولی و حمله بیماری زا را تشخیص می دهد. AIM2 فعال شده مسیر کلاسیک پیروپتوز را از طریق کاسپاز فعال می‌کند{14}} [21]. AIM2 ممکن است نقش منحصر به فردی را در انواع مختلف سرطان ایفا کند [22-25]، و مطالعه حاضر نشان داد که AIM2 نقش ارتقاء دهنده سرطان در ccRCC دارد. کاسپاز{20}}(CASP5)، مشابه کاسپاز-4 و کاسپاز-1l، یک پروتئین اجرایی از کاسپاز-1-پیروپتوز مستقل [26] است. GZMB توسط لنفوسیت های سیتوتوکسیک به عنوان یک سلاح مولکولی برای دفاع در برابر سلول های میزبان آلوده به ویروس و بدخیم تبدیل شده استفاده می شود[27]. بیان کم GZMB مربوط به متاستاز اولیه در سرطان کولورکتال است که نشان دهنده نفوذ عروق خونی و اعصاب است [28]. جالب توجه است، تجزیه و تحلیل ما نشان داد که GZMB یک ژن همبستگی مثبت در سرطان کلیه است. NOD2 یک گیرنده تشخیص الگو است که می تواند پاسخ ایمنی ذاتی میزبان را تنظیم کرده و از التهاب، استئاتوز و چاقی جلوگیری کند [29]. هیستون H3 خارج سلولی القا شده توسط LPS می تواند باعث پیروپتوز در طی سپسیس از طریق مسیرهای NOD2 و VSIG4/NLRP3 شود [30]. ناشناخته باقی مانده است که چگونه این ژن ها در طول پیروپتوز سلولی در ccRCC با یکدیگر تعامل دارند.

در عمل بالینی ما، مهارکننده‌های تیروزین کیناز گیرنده فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGFR-TKIs)به استاندارد مراقبت برای mRCC تبدیل شده‌اند [31]. Sunitinib، یک مهارکننده طیف وسیع گیرنده تیروزین کینازها، به طور گسترده به عنوان استاندارد درمان برای درمان خط اول ccRCC پیشرفته استفاده شده است [32]. با این حال، همه بیماران RCC به درمان سانیتینیب حساس نیستند و اکثر بیماران پس از چند ماه از درمان، مقاومت به سانیتینیب ایجاد می کنند. بنابراین، کلید انتخاب سانیتینیب برای درمان، انتخاب بیمارانی است که به سانیتینیب حساس هستند. مطالعه حاضر نشان داد که خوشه 1 به سونیتینیب حساس تر است، در حالی که خوشه 2 به اکسیتینیب حساس تر است.

درک بیان تنظیم کننده های پیروپتوز در ccRCC قبل از درمان ممکن است به طراحی گزینه های درمانی هدفمند بهینه تر به نفع بیماران کمک کند. برخی از مطالعات نشان داده اند که اثر پیش التهابی موثر پیروپتوز با تنظیم ریزمحیط ایمنی تومور مرتبط است [33]. با این حال، نقش بالقوه پیروپتوز در ریزمحیط ایمنی ccRCC هنوز مبهم است. بر اساس ویژگی‌های بیان تنظیم‌کننده‌های پیروپتوز، مطالعه حاضر نشان داد که بیماران در خوشه‌های مختلف همبستگی متفاوتی با ارتشاح‌های ایمنی مختلف دارند. سطوح نفوذ بالاتری از سلول های B ساده، سلول های T سلول های CD4 در حال استراحت، سلول های NK در حال استراحت، مونوسیت ها، ماکروفاژهای M{2}} و ماکروفاژهای M2 در خوشه 1 مشاهده شد. از طرف دیگر، خوشه 2 نسبت به CD8 پلاس بیشتر بود. سلول های T، Tregs و سلول های کمکی فولیکولی T. Tregs می تواند انواع سیتوکین های سرکوب کننده ایمنی ترشح کند که منجر به فرار ایمنی سلول های تومور می شود. مطالعات نشان داده اند که Tregs به طور موثری از تکثیر سلول های T موثر جلوگیری می کند و سطح بالای نفوذ سلول های CD8-T یک عامل پیش آگهی نامطلوب برای ccRCC است [34،35]. پیش آگهی ضعیف خوشه 2 و نتیجه گیری این دو نتیجه متقابل همخوانی دارند. خوشه 2 با هشت ICI داغ همبستگی مثبت دارد (SIGLEC15، TIGIT، PD-L1، T IM3، PD{16}}، CTLA4، L AG3، و PD-L2). بر اساس این یافته ها، نتایج ضعیف بقای خوشه 2 ممکن است ناشی از کاهش سطح ایمنی ضد تومور باشد و خوشه 2 ممکن است در ایمونوتراپی مفیدتر باشد. نتایج GSEA نشان می دهد که خوشه 2 با انواع مسیرهای سیگنالینگ تنظیم کننده ایمنی مرتبط است. نکته مهم این است که مسیر سیگنالینگ JAK-STAT با سرطان زایی و نفوذ ایمنی ccRCC مرتبط است. بنابراین، ما حدس زدیم که پیروپتوز ممکن است ترکیب ریزمحیط ایمنی تومور را تنظیم کند. مطالعه ما نشان داد که ccRCC با بیان بالای این 4 ژن ممکن است به ایمونوتراپی حساس تر باشد.

سطح بیان چهار تنظیم کننده با افزایش مرحله بیماری و درجه پاتولوژیک افزایش یافت و تفاوت معنی داری بین بیان چهار تنظیم کننده و سن بیمار وجود نداشت که با پیش آگهی بدتر خوشه 2 مطابقت داشت.

با توجه به اینکه پیروپتوز به طور گسترده در فرآیندهای بیولوژیکی مختلف درگیر است، ما بررسی کردیم که آیا این چهار تنظیم کننده پیروپتوز در خوشه 2 همچنین نقش مهمی در سایر انواع سرطان دارند یا خیر. آنالیز پان سرطان متعاقبا انجام شد و نتایج نشان داد که این چهار تنظیم کننده پیروپتوز ارتباط نزدیکی با امتیاز استرومایی، امتیاز ایمنی و امتیاز تخمینی در انواع مختلف سرطان دارند. این نتایج نشان داد که این چهار تنظیم کننده پیروپتوز اهداف بالقوه ای برای انواع ایمونوتراپی سرطان هستند و به ccRCC محدود نمی شوند.

در آینده، تجزیه و تحلیل تایید قابل اعتماد بیشتری در یک گروه بزرگتر مورد نیاز است. علاوه بر این، آزمایش‌های اضافی در شرایط in vitro و in vivo برای روشن شدن مکانیسم تنظیمی بین تنظیم‌کننده‌های پیروپتوز و ریزمحیط ایمنی تومور مورد نیاز است.

نتیجه گیری

به طور خلاصه، این مطالعه به طور سیستماتیک پروفایل بیان تنظیم کننده های پیروپتوز در ccRCC و ارتباط آن با نقاط بازرسی ایمنی و نقش در ریزمحیط ایمنی تومور را تجزیه و تحلیل کرد. بیان تنظیم کننده های پیروپتوز به طور قابل توجهی با نقاط بازرسی ایمنی مانند PD-L1 و CTLA4 مرتبط است. دو زیرگروه مستقل نیز از طریق خوشه‌بندی مداوم تنظیم‌کننده‌های پیروپتوز ایجاد شد. ناهمگونی تومور و تفاوت در بیان نقاط بازرسی ایمنی و ریزمحیط ایمنی تومور بین دو زیرگروه مشاهده شد که به طبقه بندی خطر و درمان دقیق بیماران ccRCC کمک می کند. تجزیه و تحلیل پان سرطان یک مرحله ای نشان داد که این تنظیم کننده های پیروپتوز ارتباط نزدیکی با امتیاز استرومایی، امتیاز ایمنی، و امتیاز تخمینی در بسیاری از انواع سرطان دارند. مهمتر از همه، آزمایشات بالینی آینده و تحقیقات پایه به تعیین اهداف برای بهبود اثربخشی ایمونوتراپی سرطان کمک خواهد کرد.