کنترل قابل تنظیم سطح بیان ژن با واسطه CRISPRi با RNA تک راهنما مهندسی شده در اشریشیا کلی

خلاصه

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-تا کنید). این sgRNA ها همچنین تنظیم مدولار را با توالی های مختلف DNA هدف فعال می کنند. ما از این سیستم برای توزیع مجدد شار متابولیک برای تولید مشتقات ویولاسین در نسبت قابل پیش بینی و بهینه سازی تولید لیکوپن استفاده کردیم. این سیستم به سرعت بخشیدن به فرآیندهای بهینه سازی شار در مهندسی متابولیک و زیست شناسی مصنوعی کمک می کند.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

معرفی

سیستم تکرارهای کوتاه پالیندرومیک (CRISPR)/همراه با CRISPR (Cas) خوشه‌ای نوع II یک سیستم برش DNA هدایت‌شده با RNA است که از CRISPR RNA (crRNA)، CRISPR RNA فعال‌کننده (tracrRNA) و پروتئین Cas9 تشکیل شده است (1). ، 2). Cas9 از Streptococcus pyogenes به دلیل ویژگی‌های خوب مشخصه آن به طور گسترده در مهندسی ژنوم استفاده شده است (3،4). کمپلکس پروتئین spCas9، tracrRNA و crRNA در حضور موتیف مجاور 5'-NGG-3' protospacer DNA هدف مکمل توالی فاصله دهنده 20 نوکلئوتیدی (nt) crRNA متصل می شود و آن را می شکافد. ) دنباله (5،6). برای ساده‌سازی سیستم، می‌توان از RNA تک راهنمای کایمریک (sgRNA) که در آن crRNA و tracrRNA توسط یک پیوند مصنوعی به نام تترالوپ به هم متصل می‌شوند، استفاده کرد (5). این امکان جایگزینی دو RNA مجزا با یک مولکول RNA را فراهم می کند و سیستم را قابل مدیریت تر می کند. یکی از سیستم های مبتنی بر CRISPR، تداخل CRISPR (CRISPRi)، از Cas9 غیرفعال کاتالیزوری (dCas9) با جایگزینی اسیدهای آمینه خاصی از هر حوزه اندونوکلئاز استفاده می کند (7). این اصلاح یک کمپلکس ریبونوکلئوپروتئین (RNP) می‌سازد که می‌تواند به DNA هدف هدایت و متصل شود و با RNA پلیمراز (RNAP) تداخل ایجاد کند تا از شروع یا ازدیاد طول رونویسی جلوگیری کند (7). بر خلاف ناک اوت توسط سیستم CRISPR/Cas9، CRISPR امکان شکست برگشت پذیر ژن ها را با بیان dCas9 یا sgRNA تحت یک پروموتر القایی فراهم می کند، که امکان انعطاف پذیری بیشتری را در تنظیم ژن فراهم می کند (7). سیستم CRISPRi به طور موثر ژن های هدف را صدها برابر خاموش کرده است (7،8). سرکوب ژنی خاص هدف، فنوتیپ سازی با توان بالا را با استفاده از یک مخزن sgRNA ژنومی (9) یا هدایت شار کربن در باکتری های مهندسی شده به سمت ماده شیمیایی هدف را امکان پذیر می کند (10-12). علاوه بر این، CRISPRi چندگانه در میزبان‌های مختلف با استفاده از روش‌های مختلف برای بیان پایدار sgRNA‌های متعدد، از جمله آرایه‌های crRNA طولانی، یکپارچه‌سازی سوئیچ نگهدارنده پا، و آرایه‌های sgRNA فوق‌العاده غیر تکراری نشان داده شده است (13-16). این تکنیک‌های مهار چندین ژن به طور همزمان برای انجام کارهای پیچیده‌تر، مانند کاهش واسطه‌های سمی یا مسدود کردن مسیرهای رقابتی در تخمیر باکتریایی مورد استفاده قرار گرفته‌اند (13،16-19). با این حال، سرکوب کامل همیشه برای مهندسی متابولیک مطلوب نیست. سطوح بیان ژن باید دقیقاً کنترل شود تا فعالیت آنزیمی بهینه بین مسیرهای رشد و تولید، متعادل شدن در غلظت‌های پیش‌ساز درون سلولی و جلوگیری از تجمع واسطه‌های سمی به دست آید (20-22). تکنیک های مختلفی برای مهندسی کارایی سرکوب CRISPRi توسعه داده شده است. چندین عامل دستکاری شدند، مانند مقدار sgRNA و پروتئین dCas9 یا انتخاب sgRNA. کنترل بیان dCas9 یا هر دو بیان dCas9 و sgRNA با استفاده از یک پروموتر القایی بیان ژن هدف را به ترتیب بیش از 30- برابر یا 300- برابر تنظیم کرد (23،24). با این حال، مشاهده شده است که تعدیل غلظت dCas9 می تواند منجر به راندمان سرکوب متناقض در پروتوسپیسرهای مختلف شود (23). تعداد محدودی از پروموترهای القایی موجود نیز علیرغم تلاش‌های فراوان، چالش‌هایی در طراحی ایجاد می‌کند (25). استراتژی دیگر قرار دادن آپتامر RNA اختصاصی لیگاند در sgRNA است، که در آن یک مولکول کوچک همزاد می‌تواند فاصله‌گذار را در معرض دید قرار دهد، بنابراین کنترل وابسته به دوز CRISPRi را ممکن می‌سازد (26). اگر یک جفت لیگاند و آپتامر مناسب در دسترس باشد، sgRNA اختصاصی لیگاند مفید است. فاصله از محل شروع رونویسی و جهت اتصال dCas9 نیز بر کارایی CRISPri تأثیر می گذارد (7). تنظیم فاصله بین محل اتصال sgRNA و محل شروع رونویسی می تواند مسیر را در مهندسی متابولیک بهینه کند (17،27،28). راندمان هیبریداسیون بین توالی‌های فاصله‌گیر و پروتوسپیسر نیز کارایی اتصال کمپلکس RNP را تغییر می‌دهد (29-31). بنابراین، عدم تطابق طراحی شده در خارج از منطقه بذر برای تغییر انرژی آزاد برای تنوع بخشیدن به کارایی CRISPri معرفی شد (31،32). با این حال، طراحی sgRNA برای هر دنباله هدف جدید مورد نیاز است و دستیابی به تفاوت قابل توجهی در انرژی آزاد تنها از طریق عدم تطابق می تواند چالش برانگیز باشد. علاوه بر این، احتمال افزایش اتصال خارج از هدف وجود دارد (33). با این وجود، همچنان محدود به سرکوب بیان ژن های متعدد به شیوه ای مدولار بدون توجه به توالی هدف است. در این مطالعه، ما یک سیستم CRISPRi قابل تنظیم را توسعه دادیم که بیان ژن را با دقت و قابلیت پیش‌بینی بالا تنظیم می‌کند. با مرتب‌سازی سلولی مبتنی بر فلورسانس مکرر کتابخانه sgRNA که چهارحلقه و ناحیه کناری آن را هدف قرار می‌دهد، حتی زمانی که DNA هدف تغییر می‌کند، به کارایی سرکوب رونویسی تا 45- برابر دست یافتیم. این سیستم امکان توزیع مجدد قابل پیش بینی شار متابولیک را بدون دستکاری ژنوم میزبان یا مسیرهای مصنوعی فراهم می کند و ابزار امیدوارکننده ای برای بهینه سازی مسیرهای متابولیک ارائه می دهد.

مواد و روش ها

سویه های باکتریایی، پلاسمیدها و معرف ها

سویه های اشریشیا کلی و پلاسمیدهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول تکمیلی S1 فهرست شده اند. پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول تکمیلی S2 آمده است. روش های شبیه سازی در روش های تکمیلی توضیح داده شده است. ژن های هدف و توالی های DNA هدف آنها برای سیستم CRISPR در جدول تکمیلی S3 نشان داده شده است. Mach{3}}T1R برای شبیه‌سازی عمومی استفاده شد. کتابخانه با استفاده از NEB 5-آلفا الکتروکامپتنت E. coli (NEB) ساخته شد. کشت‌های معمول برای ساخت پلاسمیدها و سویه‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در براث Luria-Bertani (LB) یا روی صفحه LB آگار حاوی آنتی‌بیوتیک‌های مناسب (34 گرم در میلی‌لیتر کلرامفنیکل، 5{13}} گرم در میلی‌لیتر اسپکتینومایسین) انجام شد. PCR با استفاده از Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) انجام شد. پلاسمیدها و محصولات PCR با استفاده از GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit و Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology) خالص شدند. راندمان سرکوب جهش یافته های sgRNA محیط کشت شبانه به OD600 از 0.05 تجدید شد و تا زمانی که به مقداری بین 0.6 و 0.8 رسید انکوبه شد. سپس محیط کشت به OD600 0.05 با 20ng/ml aTc رقیق شد و به مدت 4 ساعت انکوبه شد. فلورسانس یک کلنی منفرد در طول موج 575 نانومتر/616 نانومتر با استفاده از دستگاه میکروپلیت خوان Hidex Sense (Hidex) اندازه گیری شد و مقدار OD600 با استفاده از اسپکتروفتومتر Jenway 7300 (Jenway) تعیین شد. فلورسانس نسبی به عنوان واحدهای فلورسانس در هر مقدار OD600 با مقدار برای PC به عنوان 100٪ محاسبه شد.

اثرات Cistanche tubulosa-درمان یبوست

غربالگری کتابخانه sgRNA

از همان روش فرهنگی که در بالا توضیح داده شد استفاده شد. محیط کشت به [سلول] رقیق شد<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

استخراج RNA

RNA کل با استفاده از کیت RNeasy Mini (Qiagen) تنها زمانی استخراج شد که کیت miRNeasy Mini (Qiagen) برای تعیین کمیت sgRNA، پس از درمان با RNAprotect باکتری معرف (Qiagen) و ذخیره در دمای -80 درجه سانتیگراد. هضم DNA روی ستون با استفاده از مجموعه DNase بدون RNase (Qiagen) در طول فرآیند استخراج انجام شد. آلودگی DNA از طریق PCR بدون رونویسی معکوس تأیید شد. غلظت و خلوص هر نمونه با استفاده از NanoDrop One (Thermo Scientific)، و کیفیت با استفاده از یک تراشه DNA 5K/RNA/CZE 24 (PerkinElmer) روی یک LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer) ارزیابی شد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

تجزیه و تحلیل RT-qPCR

پرایمرهای RT-qPCR یا از موجودی آزمایشگاهی تهیه شده اند یا با استفاده از ابزار Primer3Plus (34) طراحی شده و در جدول تکمیلی S4 فهرست شده اند. ژن CysG به عنوان یک ژن مرجع (35) برای تمام آزمایشات RT-qPCR استفاده شد. یک منحنی استاندارد با 10-رقیق کردن یک الگو از 1{39}}7 نسخه در لیتر به 10-1 کپی در لیتر ایجاد شد. حد کمیت با برازش تعداد کپی و نرخ تقویت مثبت به یک تابع سیگموئید و محاسبه مقدار عدد کپی مثبت 95٪ تعیین شد. محدوده دینامیکی خطی به عنوان کمترین تعداد کپی تعریف شد که در آن تغییرات Cq محاسبه‌شده عقب کمتر از 35٪ است. مقادیر Cq بالاتر از 30 یا آنهایی که در کنترل غیرالگوی تقویت نشده بودند، اعتبارسنجی شدند. داده های منحنی استاندارد در جدول تکمیلی S5 و شکل تکمیلی S1 موجود است. در مجموع 2.5 نانوگرم از RNA کل در یک واکنش RT-qPCR 10 لیتری با کیت تک مرحله ای RT-qPCR Luna® Universal (NEB) استفاده شد. RT-PCR در سه نسخه بر روی StepOnePlus™ RealTime PCR System (Applied Biosystems) با مراحل زیر انجام شد: (i) رونویسی معکوس در دمای 55 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه، و به دنبال آن دناتوراسیون در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه. (ii) 40 چرخه حرارتی در دمای 95 درجه سانتیگراد برای 10 ثانیه و 60 درجه سانتیگراد برای 1 دقیقه. (iii) تجزیه و تحلیل منحنی مذاب در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه و دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، به دنبال آن یک رمپ از 60 درجه سانتیگراد تا 95 درجه سانتیگراد با نرخ 0.3 درجه سانتیگراد در دقیقه. کمیت نسبی RNA با استفاده از روش delta-deltaCt (36) تعیین شد و با نرم افزار StepOnePlus™ (Applied Biosystems) آنالیز شد.

توالی یابی RNA (RNA-seq) و تجزیه و تحلیل داده ها

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 بر اساس FPKM (قطعات در هر کیلوپایه رونوشت در هر میلیون مطالعه نقشه‌برداری شده). ژن‌های بیان‌شده متفاوت از آستانه 1.5 (بر اساس log{4}) و 0.01 (q-value) به‌دست آمدند.

تولید و نمونه برداری پروویولاسین و پرودئوکسی ویولاسین

برای تولید ویولاسین و پرودئوکسی ویولاسین از ترکیب محیط زیر استفاده شد: 10.7 گرم در لیتر K2HPO4، 5.2 گرم در لیتر KH2PO4، 1 گرم در لیتر NaCl، 1 گرم در لیتر NH4Cl، 1 گرم در لیتر MgSO4، { {17}}.2 گرم در لیتر عصاره مخمر و 1{{20}} گرم در لیتر گلوکز. یک محیط کشت یک شبه به OD600 از 0.1 بازنگری شد و تا زمانی که OD600 بین 0.6 و 0.8 برسد، کشت داده شد. محیط کشت سپس به OD600 0.1 رقیق شد و با 500 نانوگرم در میلی لیتر aTc، 0.05 میلی مولار IPTG و 0.1 گرم در لیتر L-تریپتوفان به حجم نهایی 5 میلی لیتر اضافه شد. 300 لیتر از محیط کشت نمونه برداری شد و با سرعت {35}} دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد تا یک گلوله سلولی برای آنالیز HPLC بدست آید و 300 لیتر از محیط کشت برای استخراج RNA نمونه برداری شد.

تجزیه و تحلیل HPLC

برای تجزیه و تحلیل مسیر بیوسنتزی ویولاسین، گلوله سلولی مجدداً در {{0}}متانول حجمی معلق شد، به مدت 5 دقیقه فراصوت شد، سانتریفیوژ شد و از طریق یک فیلتر نایلونی 0.{3}}m فیلتر شد. تجزیه و تحلیل HPLC از روش (42) با Poroshell 120 EC-C18، 4.6 × 150 mm، ستون 4 m (Agilent) پیروی کرد. دو فاز متحرک، A با 0.1٪ اسید فرمیک در DDW و B با 0.1٪ اسید فرمیک در استونیتریل، با سرعت جریان 0.6 میلی لیتر در دقیقه با مشخصات گرادیان زیر استفاده شد: 95٪ A برای 1.5 دقیقه، افزایش سطح A از 95 ٪ تا 2٪ برای 4 دقیقه، حفظ 2٪ A برای 2 دقیقه، ramping A از 2٪ به 95٪ برای 30 ثانیه، و حفظ 95٪ A برای 10 دقیقه. نمونه ها با استفاده از یک آشکارساز PDA شناسایی شدند و ناحیه HPLC در طول موج 600 نانومتر برای ویولاسین و 610 نانومتر برای پرودئوکسی ویولاسین تعیین شد.

تولید و نمونه برداری لیکوپن

برای تولید لیکوپن از ترکیب محیط زیر استفاده شد: 13.56 گرم در لیتر Na2HPO4، 6 گرم در لیتر KH2PO4، 2 گرم NH4Cl، 1 گرم NaCl، 2 میلی لیتر از 1 MgSO4، 0.1 میلی لیتر از 1 مولار CaCl2 و 4 گرم در لیتر گلوکز (22). 27 گرم در میلی لیتر کلرامفنیکل و 5{22}} گرم در میلی لیتر اسپکتینومایسین استفاده شد. یک محیط کشت یک شبه به OD600 از 0.1 تا حجم نهایی 5 میلی لیتر تازه شد. زمانی که OD600 بین 0.5 و 0.6 رسید، aTc به غلظت نهایی ng/ml 500 اضافه شد و زمانی که OD600 بین 0.9 و 1 رسید، IPTG به غلظت نهایی 0.02 میلی‌مولار اضافه شد. لیکوپن با استفاده از استون استخراج شد، همانطور که در مرجع (22) توضیح داده شد. غلظت لیکوپن از جذب در 475 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر Jenway 7300 با استفاده از منحنی استاندارد به دست آمد. 300 لیتر از محیط کشت برای استخراج RNA نمونه برداری شد.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

نتایج و بحث

اثرات جهش در sgRNA بر راندمان سرکوب سیستم CRISPR

هنگامی که کمپلکس سه تایی dCas9-sgRNA-DNA به شدت به یکدیگر متصل می شود، سیستم CRISPRi می تواند بیان ژن را سرکوب کند. ما فرض کردیم که راندمان سرکوب سیستم CRISPRi را می توان با تعدیل تشکیل کمپلکس RNP به سطح خاصی تغییر داد. برای تعیین کمیت راندمان سرکوب سیستم CRISPR، ما یک سیستم گزارش فلورسانس را بر اساس مدار ژنتیکی طراحی کردیم که در آن dCas9 از S. pyogenes توسط انیدروتتراسیکلین (aTc) القا می‌شود، و هر دو نوع ژن گزارشگر (mCherry) و sgRNA به طور اساسی بیان می‌شوند (شکل) 1A). هنگامی که aTc به محیط اضافه می شود، کمپلکس سه تایی dCas9-sgRNA-DNA رونویسی ژن گزارشگر را مسدود می کند و سطح فلورسانس به طور معکوس نشان دهنده کارایی سرکوب سیستم CRISPR است. sgRNA در مجموع حاوی 96 نوکلئوتید (NTS) است. ناحیه اسپیسر (20 nts اول) به دنباله DNA هدف متصل می شود و 76 nts دیگر به تشکیل کمپلکس و پایداری کمک می کند. از آنجایی که عدم تطابق در ناحیه اسپیسر ممکن است ویژگی خود را از دست داده و اثرات خارج از هدف را در سیستم مبتنی بر CRISPR افزایش دهد (33،43)، حداکثر طول sgRNA قابل مهندسی 76 nts است. در این مورد، اندازه کتابخانه 476 (تقریباً 1045) باید به دست آید، اما برای ساخت آن بسیار بزرگ است. بنابراین، لازم است اندازه کتابخانه با تعیین موقعیت های خاص در sgRNA کاهش یابد. ما ابتدا بررسی کردیم که چگونه جهش در sgRNA در هر منطقه بر سرکوب در سیستم CRISPR تأثیر می گذارد. مطالعه قبلی گزارش داد که جهش در حلقه ساقه 1 (sg mut01 و sg mut02) منجر به کاهش قابل توجهی در فعالیت هسته Cas9 شد، در حالی که جهش در حلقه ساقه 2 (sg mut03) یا ساقه-حلقه 3 (sg) mut04) بر فعالیت آن تأثیری نداشت (44). یک sgRNA بازسازی شده (sg mut05) حاوی جهش در ناحیه ساقه-حلقه 1 و تکرار، تترالوپ، ضد تکرار و ساقه-حلقه 2 نیز فعالیت نوکلئاز را کاهش داد (44). با این حال، در سیستم CRISPRi، هر پنج نوع sgRNA در مقایسه با sgRNA نوع وحشی (sg WT) تأثیر کمی بر کارایی سرکوب داشتند، با هر گونه که سطح فلورسانس 2-4٪ را در مقایسه با کنترل مثبت بدون ناحیه فاصله‌گذار نشان داد. sg PC) (شکل 1B). این نتایج نشان می‌دهد که تشکیل کمپلکس dCas9-sgRNA بر خلاف سیستم CRISPR/Cas9 نسبت به اصلاح توالی در ناحیه ساقه-حلقه 1 در سیستم CRISPRi حساسیت کمتری دارد. ما فرض کردیم که حذف مناطق مربوط به پایداری مجموعه می‌تواند نقطه شروعی برای کنترل بیشتر بیان در سطوح مختلف باشد. برای این منظور، ما یک sgRNA کوتاه (sg trcSL1) ساختیم که فاقد پیوند دهنده، حلقه ساقه 2 و حلقه ساقه 3 است. سیستم Cas9 (5،44). هنگامی که در سیستم CRISPRi آزمایش شد، این جهش معیوب یک سطح فلورسانس 8 درصدی را در مقایسه با sg PC نشان داد، که نشان می‌دهد همچنان می‌تواند به dCas9 متصل شود و ژن مورد نظر را در سطح خاصی سرکوب کند حتی با کاهش پایداری کمپلکس سه‌گانه (شکل 1B). تجزیه و تحلیل ساختاری کمپلکس RNP نشان می دهد که ناحیه پیوند دهنده، ساقه-حلقه 2 و ساقه-حلقه 3 از sgRNA مسئول تثبیت کمپلکس از طریق برهمکنش های خود با حوزه نوکلئاز dCas9 هستند که منجر به کاهش قابل توجهی در indel می شود. کارایی در سیستم CRISPR/Cas9 (44). در مقابل، تکرار: ناحیه ضد تکرار و ساقه-حلقه 1 از sgRNA عمدتاً با حوزه شناسایی و دامنه تعامل با PAM dCas9 در تعامل هستند و به طور قابل توجهی بر کارایی indel در سیستم CRISPR/Cas9 تأثیر نمی‌گذارند (44). این نتیجه از مشاهدات حمایت می کند که sg trcSL1 کاهش قابل توجهی در فعالیت نوکلئاز در سیستم CRISPR/Cas9 نشان می دهد در حالی که فقط کمی بر میل اتصال در سیستم CRISPRi تأثیر می گذارد.

شکل 1. ساخت سیستم و تأثیر بر راندمان سرکوب توسط جهش sgRNA. (الف) سیستم دو پلاسمید برای کمی سازی راندمان سرکوب. یک پلاسمید با منشاء p15A حاوی ژن dCas9 تحت یک پروموتر القایی با aTc و ژن mCherry تحت یک پروموتر سازنده است. پلاسمید دیگر با منشا cloDF13 حاوی sgRNA نوع وحشی یا جهش یافته تحت یک پروموتر سازنده است. (B) فلورسانس نسبی هر جهش sgRNA (sg mut01 ~ sg mut05 و sg trcSL1) و sg WT در مقایسه با sg PC. +1 تا + 20 توالی فاصله‌دهنده‌ای هستند که به ژن mCherry متصل می‌شوند. sg PC: sgRNA بدون فاصله به عنوان یک کنترل مثبت، sg WT: sgRNA نوع وحشی. نوارهای خطا نشان دهنده انحراف معیار (n=3) است. مقادیر P با آزمون t غیر جفت تعیین شد. ns: مهم نیست، **ص< 0.01

تغییر کارایی تشکیل کمپلکس برای کنترل بیان چند سطحی

Tetraloop یک پیوند مصنوعی است که crRNA و tracrRNA را در سیستم CRISPR-Cas9 به هم متصل می کند (5). ساختار بلوری کمپلکس سه تایی که از dCas9، crRNA و tracrRNA تشکیل شده است، نشان داده است که تترالوپ و نواحی 5 و 3 طرفین آن تماس کمی با dCas9 دارند (44). در عین حال، مناطق تکرار: ضد تکرار و ساقه-حلقه 1 برای مجموعه عملکردی حیاتی هستند (44). از آنجایی که به طور مستقیم با dCas9 تعامل ندارد، تترالوپ و نواحی کناری آن به عنوان مکان‌های بالقوه برای مهندسی sgRNA با اجزای اضافی، مانند ترکیب توالی آپتامر برای جذب پروتئین‌های اضافی به sgRNA مورد بررسی قرار گرفته‌اند (45،46). این قابل قبول است که جهش در این منطقه می تواند میل اتصال بین sgRNA و dCas9 را بدون ایجاد اختلال کامل در مجموعه متنوع کند. یک کتابخانه تصادفی تصادفی 12- (به ترتیب 4 nt از ناحیه چهار حلقه و 4 nt از 5 و 3 ناحیه کناری) با استفاده از sg trcSL1 به عنوان یک الگو برای کاهش بیشتر بازده تشکیل کمپلکس بین sgRNA و dCas9 ساخته شد (شکل 2A ). ما یک استراتژی مرتب‌سازی دو مرحله‌ای را برای به دست آوردن جهش‌های مختلف sgRNA اعمال کردیم که کارایی سرکوب بین sg WT (حالت سرکوب کامل) و sg PC (حالت غیر سرکوب‌کننده) را پوشش می‌دهند. ما کتابخانه اصلی را به کتابخانه‌های کوچک‌تر با دامنه‌های شدت فلورسانس متفاوت تقسیم کردیم و سپس به‌صورت جداگانه فلورسانس هر گونه sgRNA را از کتابخانه کوچک‌تر شناسایی کردیم. توزیع فلورسانس کتابخانه اصلی به دست آمده توسط فلوسیتومتری تقریباً با sg PC یکسان بود (شکل 2B). با این حال، پس از سه مرحله مرتب‌سازی متوالی، هر کتابخانه (بالا، متوسط ​​و کم) به ترتیب 63، 24 درصد و 14 درصد سطوح فلورسانس متوسط ​​در مقایسه با sg PC داشت (شکل 2B). هشتاد و دو مستعمره از این کتابخانه های کوچکتر با سطوح فلورسانس از 8٪ تا 104٪ جدا شدند (شکل 2C). این نتایج نشان می دهد که تترالوپ جهش یافته و ناحیه کناری آن از sgRNA می تواند میل اتصال بین dCas9 و sgRNA را برای کارایی های مختلف سرکوب تعدیل کند. تجزیه و تحلیل PCR کمی رونویسی معکوس (RT-qPCR) 10 جهش یافته sgRNA (sg trcSL1c1-sg trcSL1c10، جدول تکمیلی S6) با سیگنال های فلورسانس مختلف بین sg WT و sg PC در بین 82 کلونی sgRNA به طور قابل توجهی افزایش سطح اسکریپت sgRNA را افزایش داد که fluorescripts در کلنی های C افزایش یافت. ، نشان می دهد که سیستم CRISPRi ما بیان ژن را در سطح رونویسی کنترل می کند (شکل تکمیلی S2). سیستم CRISPRi قابل تنظیم ما از sgRNA های مهندسی شده استفاده می کند، که می تواند تا 45-کنترل سرکوب را به دست آورد، و امکان تنظیم دقیق راندمان سرکوب را بدون تغییر مقدار dCas9 یا sgRNA فراهم می کند. یک مزیت قابل توجه سیستم ما این است که می تواند کارایی سرکوب را از طریق انواع خاص sgRNA بدون پتانسیل عواقب ناخواسته تنظیم کند، حتی اگر شبیه سازی اضافی مورد نیاز باشد. علاوه بر این، منحنی رشد نشان می دهد که سیستم ما بار سلولی قابل توجهی را تحمیل نمی کند (شکل تکمیلی S3). علاوه بر این، RNA-Seq در سه نوع sg trcSL1 با سطوح مختلف کارایی سرکوب نشان داد که بیان 51 تا 83 ژن تغییر کرده است، برخلاف 262 ژن تغییر یافته در sg WT (شکل تکمیلی S4). این نتایج نشان می دهد که انواع sg trcSL1 حتی اثرات خارج از هدف کمتری نسبت به سیستم CRISPRi معمولی داشتند. این امر به ویژه در کاربردهای مهندسی متابولیک، که در آن بهینه سازی مسیرهای متابولیک اغلب شامل دستکاری چندین ژن می شود، مرتبط است. توانایی تنظیم دقیق بیان ژن بدون ایجاد عوارض جانبی منفی می تواند به طور قابل توجهی روند بهینه سازی را تسریع کند و کارایی و بهره وری کلی سیستم را بهبود بخشد.

شکل 2. ساختار کتابخانه sgRNA و غربالگری کتابخانه. (الف) داربست sgRNA مورد استفاده در این مطالعه. 12-مر حاوی چهارحلقه و توالی طرفین آن به طور تصادفی از sg trcSL1 جهش داده می شود تا یک کتابخانه sgRNA به دست آید. (ب) توزیع فلورسانس از فلوسیتومتری قبل از مرتب سازی (چپ) و بعد از (راست) بدست می آید. هر توزیع شامل 100،{4}} سلول است. (ج) فلورسانس کلنی های منفرد به دست آمده از (B). نوارهای خطا نشان دهنده انحراف استاندارد (n=2) است.

اثرات کمیت dCas9 و sgRNA بر راندمان سرکوب

از آنجایی که تعدیل مقدار dCas9 یا sgRNA می تواند راندمان سرکوب سیستم CRISPRi را تغییر دهد (23،24)، بررسی تأثیر کمیت dCas9 و sgRNA بر کارایی سرکوب ضروری است. ما عملکرد سیستم خود را تحت شرایط مختلف با تغییر مقادیر dCas9 و sgRNA با استفاده از ده جهش sgRNA (sg trcSL1c1-sg trcSL1c10) آزمایش کردیم. برای بیان dCas9 از سه غلظت مختلف (20، 100 و 500 نانوگرم در میلی‌لیتر) از القاکننده استفاده شد. در مقایسه با سطح mRNA dCas9 هنگامی که 20 نانوگرم در میلی لیتر القاء استفاده شد، این مقدار بیشتر 15- برابر (100 نانوگرم در میلی لیتر) و 22- برابر (500 نانوگرم در میلی لیتر) افزایش یافت (شکل تکمیلی S5A). ). نگرانی هایی در مورد بیان بیش از حد dCas9 وجود دارد زیرا سطح بالای dCas9 می تواند برای سلول ها سمی باشد (47،48) یا گاهی اوقات نه (49). با این حال، نرخ رشد با توجه به منحنی‌های رشد در غلظت‌های مختلف القاکننده، زمانی که تا 500 نانوگرم در میلی‌لیتر aTc استفاده شد، کمتر از 10 درصد کاهش یافت (شکل تکمیلی S6). این نشان می دهد که مقدار dCas9 تحت شرایط آزمایش شده اثر سمی بر E. coli ندارد. زمانی که مقدار متفاوت dCas9 بیان شد، کارایی سرکوب اندکی تغییر کرد (شکل 3A). با مطالعه قبلی که سیستم CRISPRi به حداکثر راندمان سرکوب در [aTc] رسیده بود سازگار بود.< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

شکل 3. خصوصیات و مدولار بودن سیستم CRISPRi قابل تنظیم. (الف) فلورسانس نسبی تحت غلظت های مختلف aTc (20، 100 و 500 نانوگرم در میلی لیتر). (ب) فلورسانس نسبی تحت پروموترهای مختلف (J23100 و UPJ23119). (C) فلورسانس نسبی تحت پروتوسپیسرهای مختلف. محور x فلورسانس نسبی mCherry و محور y نشان دهنده فلورسانس نسبی lacI33-mCherry (قرمز) و araC33-mCherry (آبی) است. 33 جفت باز توالی اضافی از lacI و araC به 5- انتهای mCherry اضافه شد (56). (د) انرژی آزاد 12-مر و فلورسانس نسبی. خطوط چین نشان دهنده یک فاصله پیش بینی 95٪ و خطوط ثابت نشان دهنده یک خط رگرسیون است. مقدار dG sg trcSL1c2 را نمی توان با استفاده از mFold به دست آورد و بنابراین از تجزیه و تحلیل حذف شد. (A–D) همه نوارهای خطا نشان دهنده انحراف معیار (n=3) هستند.

ماژولار بودن سیستم CRISPRi قابل تنظیم

رویکرد ما با استفاده از انواع sgRNA خاص برای حفظ سطح بیان مشخصی برای DNA هدف، پتانسیل استفاده به عنوان یک سیستم مدولار را دارد. برای نشان دادن امکان‌پذیری سیستم CRISPRi قابل تنظیم برای هدف‌گیری فضاسازهای مختلف، دو ژن همجوشی (lacI{{{0}}mCherry و araC33-mCherry) را با افزودن 33 bps توالی از lacI و araC ساختیم. تا 5 -پایان mCherry (56). ژنوم E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP{32}}01509.3) حاوی دو نسخه از توالی protospacer برای lacI33- mCherry و یک نسخه برای araC33-mCherry است. با این حال، این توالی‌های کروموزومی دارای توالی PAM نیستند و بنابراین، نمی‌توانند توسط کمپلکس dCas{11}}sgRNA (43) مورد هدف قرار گیرند. هنگامی که siRNA ها برای هدف قرار دادن هر پروتو اسپیسر طراحی شدند، کارایی سرکوب به طور پیوسته برای تمام فضاپیماها از lacI33، araC33 و mCherry حفظ شد (شکل 3C). این یافته‌ها نشان می‌دهند که سیستم CRISPRi قابل تنظیم ما می‌تواند به طور موثر بیان ژن را در سطح معینی بدون توجه به توالی فضاپیما تنظیم کند. یک توضیح بالقوه برای رابطه مشاهده شده بین تشکیل کمپلکس RNP و راندمان سرکوب، تغییر در انرژی آزاد هنگام تشکیل کمپلکس است. پیوند دهنده چهارحلقه مصنوعی و ناحیه کناری آن شامل دو جفت پایه A: U و G: C واتسون-کریک و یک جفت پایه غیر واتسون-کریک A:G است (44). از آنجایی که اتصال crRNA و tracrRNA برای تشکیل کمپلکس بسیار مهم است، جهش‌هایی که تترالوپ را هدف قرار می‌دهند می‌توانند بر میل اتصال بین dCas9 و sgRNA تأثیر بگذارند. این قرابت را می توان از تفاوت انرژی آزاد بین حالت های محدود و نامحدود محاسبه کرد. با این حال، محاسبه انرژی آزاد حالت های محدود چالش برانگیز است (57). ما فرض کردیم که ساختار کلی و پایداری حالت محدود تغییر نمی کند زیرا sgRNA های مرتب شده از کتابخانه به طور کامل عملکرد آن را مختل نکردند. علاوه بر این، تترالوپ و ناحیه کناری آن تماس کمی با dCas9 دارند (44). بنابراین، میل اتصال بین dCas9 و sgRNA عمدتاً تحت تأثیر پایداری ساختار ثانویه تترالوپ و توالی طرفین آن قرار می‌گیرد. بر اساس این ایده، انرژی آزاد تترالوپ و دنباله های کناری آن را با استفاده از قالب (58) محاسبه کردیم. تفاوت انرژی آزاد تاخوردگی ناشی از جهش ها به عنوان تفاوت بین انرژی آزاد توالی های جهش یافته و نوع وحشی تعریف می شود. می‌توان آن را مستقیماً از انرژی آزاد چین‌خوردگی جهش‌یافته محاسبه کرد، زیرا انرژی تاشوی توالی نوع وحشی در -4.3 کیلوکالری در مول ثابت است. با افزایش انرژی آزاد تا شدن، سیگنال فلورسانس افزایش یافت (شکل 3D). راندمان سرکوب زمانی بالاتر بود که انرژی تاشو ناحیه حاوی چهار حلقه نزدیک یا کمتر از 0 کیلوکالری در مول بود و به صورت خطی کاهش یافت زیرا انرژی تاشو از 0 کیلو کالری در مول فراتر رفت. این مشاهدات نشان می‌دهد که کارایی تشکیل کمپلکس بین dCas9 و sgRNA توسط ساختار ثانویه منطقه چهار حلقه تعیین می‌شود، که به توضیح مدولار بودن سیستم ما کمک می‌کند. کارآیی سرکوب 85 sgRNA اضافی با توالی‌های 12-مر مختلف از کتابخانه برای اعتبارسنجی بیشتر این رابطه اندازه‌گیری شد. همچنین همبستگی مشاهده شده از انواع sg trcSL1 (شکل 3D و جدول تکمیلی S7) را نشان داد، که نشان می دهد پیوند دهنده چهارحلقه نقش مهمی در تشکیل کمپلکس RNP ایفا می کند و جهش در این ناحیه می تواند بر کارایی سیستم CRISPR تأثیر بگذارد. علاوه بر این، این رابطه امکان طراحی مبتنی بر کامپیوتر انواع sgRNA با کارایی سرکوب مطلوب را نشان می‌دهد.

استفاده از یک سیستم CRISPRi قابل تنظیم برای توزیع مجدد شار در مسیر بیوسنتزی ویولاسین در E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>وقتی از منحنی‌های استاندارد محاسبه می‌شود، 100- برابر) در مقایسه با ژن‌های دیگر. در مقابل، بیان سایر آنزیم‌های تنظیم‌نشده در مسیر ویولاسین (vioA، vioB و vioE) بدون تغییر باقی ماند. این نتایج نشان می‌دهد که سیستم ما می‌تواند به طور خاص بیان ژن‌های فردی را بدون تأثیر بر سایر ژن‌ها در مسیر هدف قرار داده و تعدیل کند. کمیت مستقیم PV و PDV به دلیل فقدان استانداردهای تجاری موجود برای آنالیز HPLC ممکن نبود. بنابراین ما تیترها را در واحدهای دلخواه با استفاده از ناحیه پیک HPLC اندازه گیری کردیم. تیتر محصول در 8 ساعت پس از القا به حداکثر می رسد و سپس به تدریج کاهش می یابد (شکل تکمیلی S8)، احتمالاً به دلیل تبدیل محصول به سایر محصولات جانبی مانند کروموویریدان ها با مکانیسمی ناشناخته (42،64). پیک های جزئی مشاهده شده در طیف HPLC نشان دهنده وجود محصولات جانبی جزئی اضافی بود. تحقیقات قبلی نشان داده است که لگاریتم تیتر هر محصول در واحدهای دلخواه را می توان با ترکیبات خطی قدرت پروموتر هر ژن درگیر در مسیر بیوسنتزی ویولاسین پیش بینی کرد (42). این مدل رگرسیون لاگ خطی در سیستم ما نیز معتبر بود و افزایش رونوشت های vioD با افزایش تولید PV همراه بود (شکل 4B). مشخص است که مهندسی پروموتر یا 5 -UTR هر ژن درگیر در مسیر بیوسنتزی ویولاسین، توزیع مجدد شار و بهینه‌سازی مسیر را ممکن می‌سازد (65،66). سیستم ما می تواند به عنوان یک روش جایگزین برای نشان دادن کنترل رونویسی بدون دستکاری پروموتورهای درگیر در مسیر با استفاده از sgRNA های مصنوعی، که کوتاه هستند و می توانند با روش های یک مرحله ای مونتاژ شوند، کار کند. غربالگری از طریق سیستم CRISPRi قابل تنظیم، هدایت مسیر را با یک شار قابل پیش بینی قبل از دستکاری مستقیم سویه‌های میزبان یا کاست‌های ژن امکان‌پذیر می‌سازد و به طور بالقوه روند را تسریع می‌کند.

استفاده از سیستم CRISPRi قابل تنظیم برای متعادل کردن شار کربن در E. coli تولید کننده لیکوپن

تولید موثر ترکیبات با ارزش در مهندسی متابولیک مستلزم متعادل کردن شار کربن است. مسیر متیل اریتریتول 4-فسفات (MEP) یک مسیر متابولیک است که از پیش سازهای ساده مانند پیروات و گلیسرآلدئید 3-فسفات (GAP) برای تولید بلوک های ساختمانی ایزوپرنوئید، دی متیل آلیل پیروفسفات و ایزوپنتنیل پیروفسفات (676،6) استفاده می کند. . این مولکول ها ژرانیل پیروفسفات را سنتز می کنند که به فارنسیل پیروفسفات (FPP) تبدیل می شود (67،68). لیکوپن، یک کاروتنوئید بسیار ارزشمند با خواص آنتی اکسیدانی قوی و کاربردهای متنوع در صنایع مختلف (69)، از طریق یک سری واکنش های آنزیمی از crtE، crtB و crtI (شکل 4C) از FPP سنتز می شود (22،70). پیش ساز GAP نه تنها برای مسیر MEP بلکه برای مسیر گلیکولیز نیز ضروری است (22). نشان داده شده است که کاهش بیان ژن gapA که گلیسرآلدئید{11}فسفات دهیدروژناز (GAPDH) را در مسیر گلیکولیز کد می‌کند، تولید لیکوپن را با افزایش مخزن GAP افزایش می‌دهد (22). بنابراین، ما gapA را با پنج نوع، از جمله سه نوع sg trcSL1 (sg trcSL1c2، sg trcSL1c5، و sg trcSL1c6) که کارایی سرکوب‌های مختلف، sg PC و sg WT را نشان می‌داد، مورد هدف قرار دادیم. با این حال، gapA یک ژن ضروری است که نمی توان آن را به طور کامل از بین برد (71،72). تلاش برای سرکوب gapA با CRISPRi معمولی با استفاده از sg WT حتی با نشتی کم dcas9 تحت پروموتر tet ناموفق بود (73). از سوی دیگر، سرکوب چند سطحی بیان ژن gapA با استفاده از سیستم CRISPRi قابل تنظیم بدون نقص رشد به دست آمد و منجر به افزایش 2.{26} برابری با sg trcSL1c6 در تولید لیکوپن در مقایسه با سویه‌ای که به طور کامل ژن gapA را بیان می‌کند، شد. پس از 15 ساعت کشت (شکل 4D و شکل تکمیلی S9). گزارش شده است که تنها 10 درصد از بیان طبیعی ژن gapA منجر به افزایش مخزن GAP بدون تغییر قابل توجهی در متابولیت های پایین دست در مسیر گلیکولیز، مانند 2-فسفوگلیسرات و 3-فسفوگلیسرات می شود. 22). در مجموع، این نتایج نشان می‌دهد که CRISPRi قابل تنظیم می‌تواند دقیقاً بیان ژن را در سطوح مختلف بدون مهندسی کروموزوم سرکوب کند.

شکل 4. کاربرد سیستم CRISPRi قابل تنظیم برای مسیر بیوسنتزی ویولاسین. (الف) مسیر بیوسنتزی ویولاسین و ساخت پلاسمید. پنج ژن (vioA، vioB، vioC، vioD، و vioE) که مسئول تولید ویولاسین هستند در یک پلاسمید بیان کننده dCas{1} کلون شدند. چهار محصول اصلی (ویولاسین، پروویولاسین، دئوکسی ویولاسین و پرودئوکسی ویولاسین) تولید می شود. sg WT برای vioC و پنج نوع sg trcSL1 (sg trcSL1c2، sg trcSL1c5، sg trcSL1c6، sg trcSL1c8 و sg trcSL1c9) برای vioD، که کارایی‌های سرکوب متفاوتی را نشان می‌دهند، در پلاسمید دیگر کلون شدند. Trp: L-تریپتوفان، V: ویولاسین، PV: پروویولاسین، PDV: پرودئوکسی ویولاسین، DV: دئوکسی ویولاسین، PDVA: پروتودیوکسی ویولاسینیک اسید، PVA: پروتوویولاسینیک اسید. (B) ارتباط بین رونوشت‌های vioD، فلورسانس mCherry، و تیتر PDV و PV. محور x نشان دهنده RNA نسبی vioD بدست آمده از RT-qPCR، محور y در سمت چپ فلورسانس نسبی mCherry را از شکل 3، و محور y در سمت راست نسبت ناحیه HPLC را نشان می دهد. نمونه هایی با بالاترین مقدار vioD RNA برای نرمال سازی روی 100% تنظیم شدند. (C) مسیر بیوسنتزی لیکوپن و ساخت پلاسمید. سه ژن (crtE، crtB، crtI) مسئول تولید لیکوپن در پلاسمید بیان کننده dCas{20}کلون شدند. gapA با انواع sg trcSL1 (sg trcSL1c2، sg trcSL1c5، sg trcSL1c6) مورد هدف قرار گرفت و sg PC در پلاسمید دیگر کلون شد. Glc: گلوکز، GAP: گلیسرآلدئید 3-فسفات، 1،{30}}BPG: 1،3-بیس فسفوگلیسرات، DMAPP: دی متیل آلیل پیروفسفات، IPP: ایزوپنتنیل پیروفسفات، FPP. (د) ارتباط بین رونوشت‌های gapA، فلورسانس mCherry و تولید لیکوپن. محور x نشان دهنده RNA شکاف نسبی بدست آمده از RT-qPCR، محور y در سمت چپ فلورسانس نسبی mCherry را از شکل 3، و محور y در سمت راست نشان دهنده تیتر لیکوپن است. (B, D) همه نوارهای خطا نشان دهنده انحراف معیار (n=3) است.

نتیجه

ما یک سیستم CRISPRi قابل تنظیم طراحی کردیم که می تواند بیان ژن را به طور دقیق در سطح مورد نظر کنترل کند. با جهش تترالوپ و ناحیه کناری آن، sgRNA های مصنوعی که توالی های مختلف پروتوسپیسر را هدف قرار می دهند، می توانند ژن را در سطح مشخصی تنظیم کنند. ما با موفقیت از این سیستم برای تغییر مسیر شار متابولیک مورد علاقه در مسیر بیوسنتزی ویولاسین برای تولید مشتقات ایندول در یک نسبت قابل پیش بینی استفاده کردیم. علاوه بر این، ما نشان دادیم که استفاده از CRISPRi قابل تنظیم منجر به افزایش 2.{1}} برابری در تولید لیکوپن شد و تطبیق پذیری سیستم ما برای بهبود تولید سایر ترکیبات ارزشمند را برجسته کرد. این سیستم فرآیندهای بهینه سازی شار را قبل از دستکاری دائمی اطلاعات ژنتیکی میزبان، مانند جایگزینی پروموتر یا توالی های 5-UTR، تسریع می کند.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

منابع

1. Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P. و سیکسنیس، وی. (2011) سیستم Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas ایمنی را در اشریشیا کلی ایجاد می کند. Nucleic Acids Res.، 39، 9275-9282.

2. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. و سیکسنیس، وی. (2012) کمپلکس ریبونوکلئوپروتئین Cas{2}crRNA واسطه برش DNA خاص برای ایمنی تطبیقی ​​در باکتری ها است. Proc. Natl. آکادمی علمی USA, 109, E2579–E2586.

3. Cong، L.، Ran، FA، Cox، D.، Lin، S.، Barretto، R.، Habib، N.، Hsu، PD، Wu، X.، Jiang، W.، Marraffini، LA و همکاران . (2013) مهندسی ژنوم چندگانه با استفاده از سیستم‌های CRISPR/Cas. علم، 339، 819-823.

4. Ran، FA، Hsu، PD، Wright، J.، Agarwala، V.، Scott، DA و Zhang، F. (2013) مهندسی ژنوم با استفاده از سیستم CRISPR-Cas9. نات. Protoc., 8, 2281-2308.

5. Jinek، M.، Chylinski، K.، Fonfara، I.، Hauer، M.، Doudna، JA و Charpentier، E. (2012) یک اندونوکلئاز DNA با هدایت دوگانه قابل برنامه ریزی در ایمنی باکتریایی سازگار. علم، 337، 816-821.

6. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A. و جینک، ام. (2014) اساس ساختاری تشخیص DNA هدف وابسته به PAM توسط اندونوکلئاز Cas9. طبیعت، 513، 569-573.

7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP and Lim,WA (2013) استفاده مجدد از CRISPR به عنوان یک پلت فرم هدایت شده با RNA برای کنترل توالی خاص بیان ژن. سلول، 152، 1173-1183.

8. Larson، MH، Gilbert، LA، Wang، X.، Lim، WA، Weissman، JS and Qi، LS (2013) تداخل CRISPR (CRISPRi) برای کنترل توالی خاص بیان ژن. نات. Protoc., 8, 2180-2196.

9. McGlincy، NJ، Meacham، ZA، Reynaud، KK، Muller، R.، Baum، R. و Ingolia,NT (2021) یک کتابخانه راهنمای تداخل CRISPR در مقیاس ژنوم، پروفایل فنوتیپی جامع در مخمر را قادر می سازد. BMC Genomics، 22، 205.

10. یون، جی. و Woo,HM (2018) مهندسی متابولیک با واسطه تداخل CRISPR Corynebacterium glutamicum برای تولید همو بوتیرات. بیوتکنول. Bioeng.، 115، 2067-2074.

11. Cleto, S., Jensen, JV, Wendisch, VF and Lu, TK (2016) مهندسی متابولیک Corynebacterium glutamicum با تداخل CRISPR (CRISPRi). ACS Synth. Biol., 5, 375-385.

12. Zhang,GQ, Ren,XN, Liang,XH, Wang,YQ, Feng,DX, Zhang,YJ, Xian,M. و Zou, HB (2021) بهبود تولید میکروبی اسیدهای آمینه: از رویکردهای مرسوم تا روندهای اخیر. بیوتکنول. Bioproc. E, 26, 708-727.

13. Kim, SK, Seong, W., Han, GH, Lee, DH and Lee, SG (2017) سرکوب مولتی پلکس با هدایت تداخل CRISPR ژن های مسیر رقابت درون زا برای تغییر جهت شار متابولیک در اشریشیا کلی. میکروب. Cell Fact., 16, 188.

14. الیس، NA، کیم، بی، تونگ، جی. و Machner, MP (2021) یک ابزار تداخل چندگانه CRISPR برای بازجویی ژن حدت در لژیونلا پنوموفیلا. اشتراک. Biol., 4, 157.

15. Siu، KH و Chen، W. (2019) gRNA با دریچه نگهدارنده ریبوتنظیم شده برای عملکرد CRISPR-Cas9 قابل برنامه ریزی. نات. شیمی. Biol., 15, 217-220.

16. Reis, AC, Halper, SM, Vezeau, GE, Cetnar, DP, Hossain, A., Clauer, PR and Salis, HM (2019) سرکوب همزمان چندین ژن باکتری با استفاده از آرایه‌های sgRNA بسیار طولانی غیر تکراری. نات. بیوتکنول.، 37، 1294-1301.

17. Tian,T., Kang,JW, Kang,A. و Lee,TS (2019) هدایت شار متابولیک از طریق سرکوب ترکیبی چندگانه با واسطه CRISPRi برای تولید ایزوپنتنول در اشریشیا کلی. ACS Synth. Biol., 8, 391-402.

18. گوتام، آر، سیبولد، جنرال موتورز، مولر، پی، ویل، تی، ویس، تی، هندریک، آر. و Eikmanns, BJ (2019) یک سیستم تداخل CRISPR القایی دوگانه ساده برای هدف قرار دادن ژن های متعدد در Corynebacterium glutamicum. پلاسمید، 103، 25-35.

19. Yao, L., Cengic, I., Anfelt, J. و هادسون، EP (2016) سرکوب ژنی چندگانه در سیانوباکتری ها با استفاده از CRISPRi. Acs Synth. Biol., 5, 207-212.

20. Lim,HG, Noh, MH, Jeong, JH, Park, S. and Jung,GY (2016) تعادل مجدد بهینه مسیر تولید اسید هیدروکسی پروپیونیک از گلیسرول در اشریشیا کلی. ACS Synth. Biol., 5, 1247-1255.

21. Yang,Y., Lin,Y., Li,L., Linhardt,RJ و Yan,Y. (2015) تنظیم متابولیسم مالونیل-CoA از طریق RNA های آنتی سنس مصنوعی برای بیوسنتز افزایش یافته محصولات طبیعی. متاب. Eng., 29, 217-226.

22. Jung, J., Lim, JH, Kim, SY, Im, DK, Seok, JY, Lee, SV, Oh, MK and Jung, GY (2016) تعادل مجدد پیش ساز دقیق برای تولید ایزوپرنوئیدها با کنترل دقیق بیان gapA در اشرشیاکلی متاب. Eng., 38, 401-408.

23. Li, XT, Jun, Y., Erickstad, MJ, Brown, SD, Parks, A., Court, DL and Jun, S. (2016) tCRISPRi: قابل تنظیم و برگشت پذیر، کنترل یک مرحله ای بیان ژن. علمی Rep., 6, 39076.

24. Fontana, J., Dong, C., Ham, JY, Zalatan, JG and Carothers, JM (2018) بیان تنظیم شده sgRNA ها CRISPRi را در E. coli تنظیم می کند. بیوتکنول. J., 13, e1800069.

25. Kim, NM, Sinnott, RW and Sandoval, NR (2020) حسگرهای زیستی مبتنی بر فاکتور رونویسی و سیستم‌های القایی در باکتری‌های غیرمدل: پیشرفت فعلی و جهت‌گیری‌های آینده. Curr. نظر. بیوتکنول.، 64، 39-46.

26. Kundert، K.، Lucas، JE، Watters، KE، Fellmann، C.، Ng، AH، Heineike، BM، Fitzsimmons، CM، Oakes،BL، Qu،J.، Prasad،N. و همکاران (2019) کنترل CRISPR-Cas9 با sgRNA های فعال شده با لیگاند و غیرفعال شده با لیگاند. نات. Commun., 10, 2127.

27. فریرا، آر، اسکرکاس، سی، هدین، آ.، سانچز، بی جی، سیورز، وی، نیلسن، جی. و دیوید، اف. (2019) تنظیم دقیق متابولیسم کربن مرکزی در مخمر به کمک مدل از طریق تنظیم مبتنی بر dCas{4}}. ACS Synth. Biol., 8, 2457-2463.

28. سو، تی، گو، کیو، ژنگ، ی.، لیانگ، کیو، وانگ، کیو. و Qi، Q. (2019) تنظیم دقیق hemB با استفاده از CRISPRi برای افزایش تولید اسید آمینه لوولینیک در اشریشیا کلی. جلو. Microbiol., 10, 1731.

29. ژنگ، تی، هو، ی، ژانگ، پی، ژانگ، زی، ژو، ی.، ژانگ، ال.، نیو، ال.، یانگ، ی.، لیانگ، دی، یی، اف . و همکاران (2017) پروفایل اختصاصی RNA تک راهنما یک توالی هسته حساس به عدم تطابق را نشان می دهد. علمی Rep., 7, 40638.

30. جیانگ، دبلیو، بیکارد، دی، کاکس، دی، ژانگ، اف. و Marraffini, LA (2013) ویرایش ژنوم باکتری ها با هدایت RNA با استفاده از سیستم های CRISPR-Cas. نات. بیوتکنولوژی،

31، 233-239. 31. ون گستل، جی.، هاوکینز، جی اس، تودور، اچ. و Gross, CA (2021) خط لوله محاسباتی برای طراحی RNA های راهنما برای عدم تطابق-CRISPRi. STAR Protoc, 2, 100521.

32. هاوکینز، جی اس، سیلویس، ام آر، کو، بی ام، پیترز، جی ام، اسادنیک، اچ.، جوست، ام.، هرن، سی سی، ویزمن، جی اس، تودور، اچ. و Gross,CA (2020) عدم تطابق-CRISPRi روابط متغییر بیان و تناسب اندام ژن‌های ضروری را در Escherichia coli و Bacillus subtilis نشان می‌دهد. Cell Syst.، 11، 523-535.

33. Fortin, J.-P., Tan, J., Gascoigne, KE, Haverty, PM, Forrest, WF, Costa, MR and Martin, SE (2019) هدف گیری چند ژن و تحمل عدم تطابق می تواند تجزیه و تحلیل ژنوم را مخدوش کند. صفحه نمایش های CRISPR جمع شده گسترده. ژنوم بیول.، 20، 21.

34. روزن، اس. و اسکالتسکی، اچ. (2000) Primer3 در WWW برای کاربران عمومی و برای برنامه نویسان زیست شناس. روش ها مول. Biol., 132, 365-386.

35. ژو، ک.، ژو، ال.، لیم، کیو، زو، آر، استفانوپولوس، جی. و Too,HP (2011) ژن های مرجع جدید برای تعیین کمیت پاسخ های رونویسی اشریشیا کلی به بیان بیش از حد پروتئین توسط PCR کمی. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak, KJ and Schmittgen, TD (2001) تجزیه و تحلیل داده های بیان ژن نسبی با استفاده از PCR کمی زمان واقعی و روش 2 (-Delta Delta C(T)). روش ها، 25، 402-408.

37. اندروز، اس. (2010) FastQC: ابزار کنترل کیفیت برای داده‌های توالی عملیاتی بالا. نسخه 0.11.9 ویرایش

38. Langmead,B., Trapnell,C., Pop,M. و سالزبرگ، SL (2009) هم ترازی فوق سریع و حافظه کارآمد توالی های DNA کوتاه با ژنوم انسان. Genome Biol., 10, R25.

39. Danecek, P., Bonfield, JK, Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham, A., Keane, T., McCarthy, SA, Davies, RM et al. (2021) دوازده سال SAMtools و BCFtools. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell,C., Williams,BA, Pertea, G., مرتضوی, A., Kwan, G., Van Baren, MJ, Salzberg, SL, Wold, BJ and Pachter, L. (2010) مونتاژ و کمی سازی رونوشت توسط RNA-Seq رونوشت های بدون حاشیه و تغییر ایزوفرم را در طول تمایز سلولی نشان می دهد. نات. بیوتکنول.، 28، 511-515.

41. Trapnell, C., Hendrickson, DG, Sauvageau, M., Goff, L., Rinn, JL and Pachter, L. (2013) تجزیه و تحلیل افتراقی تنظیم ژن در وضوح رونوشت با RNA-seq. نات. بیوتکنول.، 31، 46-53.

42. Lee, ME, Aswani, A., Han, AS, Tomlin, CJ and Dueber, JE (2013) بهینه سازی سطح بیان یک مسیر چند آنزیمی در غیاب سنجش با توان بالا. Nucleic Acids Res.، 41، 10668-10678.

43. Hsu,PD, Scott,DA, Weinstein,JA, Ran,FA, Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, EJ, Wu, X., Shalem, O. و همکاران (2013) ویژگی هدف گیری DNA نوکلئازهای Cas9 هدایت شده با RNA. نات. بیوتکنول.، 31، 827-832.

44. نیشیماسو، اچ.، ران، اف.، هسو، پی.، کونرمان، اس.، شهاتا، اس.، دوهما، ن.، ایشیتانی، آر.، ژانگ، اف. و نورکی، او. (2014) ساختار کریستالی Cas9 در کمپلکس با RNA راهنما و DNA هدف. Cell, 156, 935-949.

45. داربست های Fu,Y., Rocha,PP, Luo,VM, Raviram,R., Deng,Y., Mazzoni,EO and Skok,JA (2016) CRISPR-dCas9 و sgRNA تصویربرداری زنده دو رنگی از توالی های ماهواره ای را امکان پذیر می کند. و جایگاه های فردی غنی شده با تکرار. نات. Commun., 7, 11707.

46. ​​خسروی، اس.، شیندل، پی، گلادیلین، ای.، دونمان، اف.، روتن، تی، پوچتا، اچ. و هوبن، ا. (2020) استفاده از آپتامرها تصویربرداری زنده مبتنی بر CRISPR از تلومرهای گیاهی را بهبود می بخشد. جلو. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen, AA and Voigt, CA (2014) مدارهای ژنتیکی CRISPR/Cas چند ورودی که میزبان شبکه های نظارتی هستند. مول. سیستم Biol., 10, 763.

48. Lee, YJ, Hoynes-O'Connor, A., Leong, MC and Moon, TS (2016) کنترل قابل برنامه ریزی بیان ژن باکتری با 44, 2462-2473.

49. Vigouroux, A., Oldewurtel, E., Cui, L., Bikard, D. و ون تیفلن، اس. (2018) تنظیم توانایی dCas9 برای مسدود کردن رونویسی، نابودی قوی و بی‌صدا ژن‌های باکتریایی را ممکن می‌سازد. مول. سیستم Biol., 14, e7899.

50. Zhang,Y., Shang, X., Lai, S., Zhang, G., Liang,Y. و ون، تی. (2012) توسعه و کاربرد یک سیستم بیان القایی با آرابینوز با تسهیل جذب القا کننده در Corynebacterium glutamicum. Appl. محیط زیست Microbiol.، 78، 5831-5838.

51. تامپسون، ام جی، صداقتیان، ن.، باراجاس، جی اف، ورز، ام.، بیلی، سی بی، کاپلان، ن.، هیلسون، نیوجرسی، موخوپادحیای، آ. and Keasling,JD (2018) جداسازی و شناسایی جهش‌های جدید در منشا pSC101 که تعداد کپی را افزایش می‌دهد. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke, PM, Link, T., Gatgens, J., Sonntag, C., Otto, M., Bott, M. و پولن، تی. (2020) یک پلاسمید بیانی قابل تنظیم ال-آرابینوز برای باکتری اسید استیک گلوکونوباکتر اکسیدانز. Appl. میکروبیول. بیوتکنول.، 104، 9267-9282.

53. نگوین، TT، نگوین، NH، کیم، ی.، کیم، جی آر و پارک، اس. (2021) خصوصیات in vivo سیستم پروموتور القائی 3-هیدروکسی پروپیون دهیدروژناز در سودوموناس دنیتریفیکانس. بیوتکنول Bioproc E، 26، 612-620.

54. مک کارتی، NS، گراهام، AE، Studena، L. و لدسما-آمارو، آر. (2020) فناوری های CRISPR چندگانه برای ویرایش ژن و تنظیم رونویسی. نات. کمون، 11، 1281.

55. یان، س. و Fong, SS (2017) مطالعه اثرات اتصال رونویسی در شرایط آزمایشگاهی و نویز با استفاده از پروموترهای سازنده ترکیب شده با توالی عناصر UP در اشریشیا کلی. جی بیول. مهندس، 11، 33.

56. Seo,SW, ​​Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE,Kim,S. و Jung, GY (2013) طراحی پیش‌بینی‌کننده منطقه شروع ترجمه mRNA برای کنترل کارایی ترجمه پروکاریوتی. متاب. Eng., 15, 67-74. 57. Kappel، K.، Jarmoskaite، I.، Vaidyanathan، PP، Greenleaf، WJ، Herschlag، D. و داس، آر. (2019) تست های کور پیش بینی میل اتصال به پروتئین RNA. Proc. Natl. آکادمی علمی USA, 116, 8336–8341.

58. زوکر، ام. (2003) وب سرور Mfold برای پیش بینی تاشو و هیبریداسیون اسید نوکلئیک. Nucleic Acids Res.، 31، 3406-3415.

59. Xiong، B.، Zhu، Y.، Tian، D.، Jiang، S.، Fan، X.، Ma، Q.، وو، اچ. و Xie, X. (2021) توزیع مجدد شار متابولیسم کربن مرکزی برای تولید کارآمد ال-تریپتوفان در اشریشیا کلی. بیوتکنول. Bioeng., 118, 1393-1404.

60. Yao, R., Li, J., Feng, L., Zhang, X. و هو، اچ. (2019) (13) مهندسی متابولیک هدایت شده با تجزیه و تحلیل شار متابولیک C از Escherichia coli برای بهبود تولید استول از گلیسرول. بیوتکنول. سوخت های زیستی، 12، 29.

61. دوران، ن. و Menck,CF (2001) Chromobacterium violaceum: مروری بر دیدگاه‌های دارویی و صنعتی. کریت Rev. Microbiol., 27, 201-222.

62. Balibar, CJ and Walsh, CT (2006) بیوسنتز آزمایشگاهی ویولاسین از L-تریپتوفان توسط آنزیم VioA-E از Chromobacterium violaceum. بیوشیمی، 45، 15444-15457.

63. Gwon, DA, Seok, JY, Jung, GY and Lee, JW (2021) تکامل آزمایشگاهی تطبیقی ​​با کمک حسگر زیستی برای تولید ویولاسین. بین المللی جی. مول. Sci., 22, 6594.

64. سانچز، سی، برانا، AF، مندز، سی. و سالاس، JA (2006) ارزیابی مجدد مسیر بیوسنتزی ویولاسین و رابطه آن با بیوسنتز ایندولوکاربازول. شیمی. بیوگرافی شیمی، 7، 1231-1240.

65. Jones, JA, Vernacchio, VR, Lachance, DM, Lebovich, M., Fu, L., Shirke, AN, Schultz, VL, Cress, B., Linhardt, RJ and Koffas, MA (2015) ePathOptimize: a رویکرد ترکیبی برای تعادل رونویسی مسیرهای متابولیک علمی Rep., 5, 11301.

66. Zhang,Y., Chen,H., Zhang,Y., Yin,H., Zhou,C. و وانگ، ای. (2021) مهندسی مستقیم RBS از خوشه ژن بیوسنتزی برای بهره وری کارآمد ویولاسین ها در E. coli. میکروب. Cell Fact., 20, 38.

67. Hunter، WN (2007) مسیر غیر موالونات بیوسنتز پیش ساز ایزوپرنوئید. جی بیول. شیمی، 282، 21573-21577.

68. رومر، ام. (1999) کشف یک مسیر مستقل از موالونات برای بیوسنتز ایزوپرنوئید در باکتری ها، جلبک ها و گیاهان عالی. نات. تولید Rep., 16, 565-574.

69. Muller,L., Caris-Veyrat,C., Lowe,G. و بوهم، وی. (2016) لیکوپن و نقش آنتی اکسیدانی آن در پیشگیری از بیماری های قلبی عروقی - یک بررسی انتقادی. کریت Rev. Food Sci. Nutr.، 56، 1868-1879.

70. Miura، Y.، Kondo، K.، Saito، T.، Shimada، H.، Fraser، PD و Misawa، N. (1998) تولید کاروتنوئیدهای لیکوپن، بتاکاروتن و آستاگزانتین در مخمر غذایی Candida utilis. Appl. محیط زیست Microbiol.، 64، 1226-1229.

71. Goodall,ECA, Robinson, A., Johnston, IG, Jabbari, S., Turner, KA, Cunningham, AF, Lund,PA, Cole,JA and Henderson,IR (2018) ژنوم ضروری Escherichia coli K{ {2}}. Mbio، 9، e{4}}.

72. بابا، تی.، آرا، تی، هاسگاوا، ام.، تاکای، ی.، اوکومورا، ی.، بابا، م.، داتسنکو، کا، تومیتا، ام، وانر، بی ال و موری، اچ. (2006) ساخت Escherichia coli K-12 در قاب، جهش یافته تک ژنی: مجموعه Keio. مول. سیستم Biol., 2, 2006.0008.

73. برترام، آر. و هیلن، دبلیو. (2008) کاربرد سرکوبگر Tet در تنظیم و بیان ژن پروکاریوتی. میکروب. بیوتکنول.، 1، 2-16.