متابولیت های ثانویه سیانوباکتری به عنوان مواد بیوتکنولوژیکی در لوازم آرایشی ضد پیری طبیعی 2

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

2.3. فعالیت های بیولوژیکی

2.3.1.فعالیت پاکسازی رادیکال

رادیکال آنیون سوپراکسید یک رادیکال آزاد فیزیولوژیکی با اهمیت فوق العاده برای بدن انسان است. هنگامی که تولید بیش از حد این ROS در طول تنفس هوازی وجود دارد، یا زمانی که مکانیسم‌های سم‌زدایی درون زا از کار می‌افتند یا کافی نیستند، خطر آسیب اکسیداتیو با اثرات مضر جدی افزایش می‌یابد. از این نظر، یافتن مکانیسم‌هایی برای مهار اثرات مضر اوز*، نه تنها در زمینه لوازم آرایشی، بلکه در بررسی بهبود و پیشگیری از طیف وسیعی از بیماری‌ها از اهمیت کلیدی برخوردار است. رفتار مهار O2" عصاره سیانوباکتری ها در شکل 1 نشان داده شده است و مقادیر IC در جدول 6 خلاصه شده است.

عصاره های آبی به طور قابل توجهی در مهار اوز*- نسبت به عصاره های استونی موثرتر بودند (جدول 6) و فعالیت وابسته به دوز را نشان دادند (شکل 1)، با سویه های آب شیرین که از سویه های دریایی متمایز بودند. Cephalothorax lacustris LEGE 15493 موثرترین سویه بود که کمترین مقدار ICso را ارائه داد (65.5 میکروگرم عصاره خشک در میلی لیتر، p<0.05), followed="" by="" leptolyngbya="" boryana="" lege="" 15486="" and="" nodosilinea="" nodulosa="" lege="" 06104.="" leptolyngbya="" cf.="" ectocarpi="" lege="" 11479="" was="" the="" only="" strain="" that="" did="" not="" reach="" the="" ic5o="" for="" the="" aqueous="" extract="" (table="" 6).="" on="" the="" other="" hand,="" the="" acetone="" extract="" of="" this="" strain="" was="" the="" most="" effective="" in="" o2*-="">

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

مقایسه ظرفیت های آنتی اکسیدانی در بین سیانوباکتری های مختلف به دلیل روش های مختلف به کار رفته چالش برانگیز است. مورون و همکارانش توانایی مهار رادیکال عصاره‌های اتانولی (70 درصد حجمی) سویه‌های سیانوباکتری [26] را ارزیابی کردند که کمترین مقدار ICso 70/822 میکروگرم در میلی‌لیتر برای Phormidium sp.LEGE 02 05292 بود، در حالی که هیچ فعالیت برای Nodosilinea nodulosa LEGE 06102 شناسایی شد. Lopes و همکاران فعالیت مهار O2 را برای Nodosilinea (Leptolynbbya) Antarctica LEGE13457 و Cuspidothrix issatschenkoi LEGE 03282 LEGE 03282 LEGE 03282 1925 عصاره استون و 29-29 عصاره استون، و 29-29m25 و 2929/29/8 عصاره‌های 200000000000. مانند sp.LEGE 13412 [27]. نویسندگان همچنین اثربخشی بالاتری را در عصاره‌های استونی در مقایسه با عصاره‌های اتانولی گزارش کردند. مطالعه دیگری که توسط Amaro و همکارانش انجام شد، مقادیر IC50 1394 و 826 ug/mL را برای Gloeothece sp نشان داد. و Scenedesmus obliquus (M{21}})، به ترتیب [37]. نتایج به‌دست‌آمده در اینجا برای عصاره‌های استون نسبت به آنچه قبلاً گزارش شده است امیدوارکننده‌تر به نظر می‌رسد، حتی اگر آنها در همان مرتبه بزرگی باشند. از سوی دیگر، عصاره های آبی پتانسیل عظیمی را نشان دادند که ارزش بهره برداری بیشتر در مورد کاربردهای آرایشی در زمینه پیری پوست را دارد.

2.3.2. مهار آنزیم ها

MMPها خانواده ای از آنزیم های وابسته به روی خارج سلولی هستند که عملکرد اصلی آنها بازسازی و تخریب ECM [38] است، یک ماده ژل مانند ضروری برای نگه داشتن سلول ها در کنار هم و ایجاد مسیری برای مواد مغذی و اکسیژن [39]. تغییرات در اجزای ECM، مانند کلاژن و الاستین، ناشی از MMP ها اساس آسیب پوست و تشکیل چین و چروک است [40]. همراه با این آنزیم ها، مرتبط با ساختار پوست و تشکیل چین و چروک، آنزیم دیگری به دلیل فعالیت آن در ملانوژنز، نقش مهمی در روند پیری ایفا می کند: تیروزیناز. در میان عوامل دیگر، قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش به دلیل افزایش تولید ROS، باعث تجمع مقدار غیر طبیعی ملانین می شود. این گونه‌های واکنش‌پذیر بر فعالیت ملانوسیت‌ها تأثیر می‌گذارند که تبدیل تیروزین به ملانین را با اکسیداسیون افزایش می‌دهد و منجر به هیپرپیگمانتاسیون و لکه‌های پوستی نامنظم می‌شود [41].

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

در جستجوی جایگزین های طبیعی برای مواد ضد پیری تجاری، با تمرکز بر آنزیم های ذکر شده در بالا، فعالیت عصاره سیانوباکتری ها مورد بررسی قرار گرفت (شکل 2). با توجه به HAase، تنها سه سویه قادر به مهار این آنزیم بودند که به صورت وابسته به دوز عمل می کنند: عصاره آبی Leptolyngbya cf. ectocarpiLEGE 11479 (IC{4}} ug/mL)، و عصاره استونی Cephalothrix lacustris LEGE 15493 و Nodosilinea nodulosa LEGE 06104، که دو مورد آخر فقط به IC25 (به ترتیب 832 و 995 میکروگرم در لیتر) می رسند. با وجود اینکه این مقادیر زیاد به نظر می رسند، دامنه فعالیت آنها مشابه داروی مرجع دی سدیم کروموگلیکات (DSCG) (IC{11}} ug/mL) بود. علاوه بر این، لازم به ذکر است که برای بالاترین غلظت آزمایش شده (1 میلی گرم در میلی لیتر)، Leptolyngbya cf. ectocarpi LEGE 11479 این آنزیم را به میزان 80 درصد مهار کرد (شکل 2) که این عصاره را به عنوان یک ماده آرایشی امیدوارکننده می کند.

مطالعات کمی در مورد اثر بالقوه ترکیبات و عصاره‌های سیانوباکتری بر فعالیت هیالورونیداز گزارش شده‌اند، و هر گونه مقایسه بر روی پتانسیل بیولوژیکی عصاره‌ها باید این را در نظر گرفت که متابولیسم سیانوباکتری‌ها بسته به شرایط کشت از تغییرات قابل‌توجهی رنج می‌برد و بر ترکیب شیمیایی عصاره‌ها تأثیر می‌گذارد. مورون و همکاران [26] اثر عصاره اتانولی Tychonema sp را ارزیابی کردند. LEGE 07196 و Cyanobium sp. LEGE 07175 بر روی هیالورونیداز، و یک فعالیت مهاری قوی تری پیدا کرد، با مقادیر ICso به ترتیب 182.74 و 208.36 ug/mL. فعالیت عصاره های اتانولی نیز برای بخش نامحلول Spirulina platensis با IC5o 150 ug/mL گزارش شده است[42]. مطالعه دیگری که توسط Yamaguchi و Koketsu [19] انجام شد، نشان داد که Nostochopsis lobatus MAC0804NAN مقدار زیادی پلی ساکارید با اثر مهاری بالا (IC{13}}.18 میکروگرم در میلی لیتر) تولید می کند. همچنین گزارش شده است که آرتروسپیرا- پپتید مشتق شده ممکن است در مهار هیالورونیداز نقش داشته باشد [4]. این نتایج با هم از پتانسیل ترکیبات و عصاره های سیانوباکتری به عنوان مواد ضد پیری برای کاربردهای آرایشی پشتیبانی می کند.

با در نظر گرفتن الاستاز، تنها عصاره های استونی زیست فعالی جالبی ارائه کردند. Leptolyng-bya ر.ک. ectocarpi LEGE 11479 دوباره فعال ترین بود (شکل 2)، که تنها سویه ای بود که به ICso رسید، با مقدار ug/mL 391. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104، Cephalothrix lacustris LEGE 15493، و Leptolyngbya boryana LEGE 154{9}} تنها به ترتیب به IC25، با مقادیر 126،86 و 99 ug/mL رسیدند. در مورد هیالورونیداز، سویه‌های دریایی امیدوارکننده‌ترین آنها هستند.

با بهترین دانش ما، هیچ گزارش قبلی در مورد فعالیت مهاری الاستاز برای سویه های بررسی شده در اینجا وجود ندارد. با توجه به سویه‌های دیگر، کشف شد که Nostoc minutum پپتیدها و نوستوپپتین‌هایی از نوع میکروویریدین تولید می‌کند، با ICso =1.3 و 11.{4}} ug/mL [44،45]. میکروویریدین‌های B و حاوی میکروسیستیس آئروژینوزا نیز به طور موثری الاستاز را با مقادیر ICso 0 مهار کردند. بنابراین مقایسه با عصاره های سویه های ما دشوار است.

رنگدانه‌های ناهموار پوست، مرتبط با پیری و قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش، همچنان یکی از نگرانی‌های اصلی جمعیت پیر و صنایع آرایشی و بهداشتی است. اکثر مطالعات موجود کم اهمیت هستند و از تیروزیناز قارچ به عنوان یک مدل آنزیمی استفاده می کنند و ترجمه نتایج به محیط انسانی را دشوار می کند، با این وجود، این آنزیم شباهت و همسانی بالایی با تیروزیناز انسانی دارد[47]. بنابراین، از همان مدل آنزیمی در اینجا برای کشف پتانسیل عصاره سیانوباکتری ها در مهار تیروزیناز استفاده شد. همانطور که برای الاستاز، تنها عصاره استون قادر به مهار تیروزیناز بود. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 مؤثرترین بود (شکل 2) و تنها سویه ای بود که به IC#N (989.26±4.3 میکروگرم در میلی لیتر) رسید. زیر آن Leptolyngbya boryana LEGE 15486 بود، با IC{8}±4.33 ug/ میلی لیتر، و در نهایت Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 11479، با امیدوارکننده ترین نتایج برای سویه های دریایی یافت شد.

مورون و همکاران [26] قبلاً فعالیت عصاره های اتانولی سیانوباکتری ها را در همان مدل بررسی کردند، اما هیچ گونه فعالیتی پیدا نکردند. یکی از جنبه های جالب این موضوع این است که یکی از سویه های مورد مطالعه Nodosilinea nodulosa LEGE 06102 بود که بهترین نتایج را در اینجا نشان داد و بار دیگر بر اهمیت حلال های استخراج در به دست آوردن عصاره های فعال زیستی هدفمند تاکید کرد. در مورد سایر آنزیم‌های مورد بررسی، بررسی‌های متمرکز بر سیانوباکتری‌ها نیز برای تیروزیناز کمیاب است. در کار انجام شده توسط یابوتا و تیم او [48]، گزارش شد که عصاره آب گرم Nostochopsis spp. به طور قابل توجهی فعالیت تیروزیناز (IC{4}} ug/mL) را مهار کرد. این یک نتیجه بسیار جالب است، با توجه به اینکه حاصل از عصاره آبی است که در مطالعه حاضر هیچ فعالیتی برای آن یافت نشد. نویسندگان این نتیجه را به ترکیبات با وزن مولکولی کم آزاد شده از PBPs توسط عملیات حرارتی، یعنی یک بخش بیلین که به عنوان یک جاذب رادیکال پراکسیل قوی عمل می کند، نسبت می دهند. مطالعه دیگری فعالیت بازدارندگی عصاره اتانول Arthrospira platensis (IC50=14،{000 ug/mL) و آب (IC{7}}،000 ug/mL) را ارزیابی کرد. مقادیر به حضور ترکیبات فنلی مانند اسیدهای فرولیک و کافئیک در عصاره اتانولی نسبت داده شد [49].

2.3.3. محافظت در برابر اشعه ماوراء بنفش

حتی با وجود اینکه تعداد فزاینده ای از شرکت های آرایشی از مسدود کننده های ضد آفتاب در محصولات خود استفاده می کنند، هنوز متقاعد کردن مصرف کنندگان در مورد مزایای استفاده روزانه از آنها برای کاهش سرعت پیری زودرس پوست دشوار است. اگر از یک طرف استفاده روزانه از ضدآفتاب ها عادتی ریشه دار است، از سوی دیگر ترس خاصی در استفاده از مواد مصنوعی به دلیل خطرات ناخواسته آنها وجود دارد[50]. به دنبال این، تحقیقات در مورد محافظت از نور طبیعی در چند سال اخیر به طور قابل توجهی افزایش یافته است، با توجه به پتانسیل آنها برای تجزیه زیستی و سمیت کمتر، که آنها را برای انسان و محیط زیست مفیدتر می کند. به منظور بررسی عصاره‌های سیانوباکتری‌ها در این زمینه، ظرفیت آن‌ها برای عمل به عنوان ضدآفتاب در شرایط آزمایشگاهی برای UVR-B ارزیابی شد، زیرا مضرترین تشعشعات است. نتایج بدست آمده برای سیانوباکترهای آبی و عصاره استونی در جدول 7 ارائه شده است.

با توجه به عصاره استون، بیشترین مقدار (19.2) برای Leptolyngbya boryana LEGE 15486، و به دنبال آن Leptolyngbya cf.ectocarpiLEGE 1479 (10.7)، هر دو در کمترین غلظت آزمایش شده، 200 ug/mL یافت شد. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 کمترین امید را در بین عصاره های استونی داشت. در عصاره های آبی، امیدوارکننده ترین نتایج برای بالاترین غلظت آزمایش شده به دست آمد، به طوری که Leptolyngbya boryana LEGE 15486 و Cephalothrix lacustris LEGE 15493 به ترتیب با مقادیر SPF in vitro 17.1 و 14.9 برجسته بودند (جدول 7).افزایش عمر cistancheبا بحث در مورد مطالعات قبلی در این زمینه، حسین و تیمش [51] گزارش دادند که مقدار SPF برای عصاره Cephalothrix komarekiana 2.37 بود. گروه دیگری دریافتند که SPF عصاره متانولی Aphanizomenon flos-aquae 4 است [52]. با این حال، اطلاعات مربوط به غلظت عصاره مورد استفاده توسط نویسندگان در دسترس نبود و مقایسه ممکن را دشوار می‌کرد.

با توجه به پتانسیل های این منابع، تعداد سویه های سیانوباکتری که در زمینه لوازم آرایشی و بهداشتی به ویژه در مورد SPF مورد بررسی قرار می گیرند، بسیار کمیاب است. نتایج ارائه شده در اینجا نشان می‌دهد که گونه‌های مورد مطالعه ممکن است گزینه‌های خوبی به‌عنوان محافظ عکس بیولوژیکی باشند و احتمالاً به عنوان تقویت‌کننده سایر ضدآفتاب‌های موجود در بازار عمل کنند و به کاهش غلظت ضدآفتاب‌های مصنوعی در فرمول‌ها کمک کنند. بنابراین، افزایش تحقیقات بر روی این موجودات، به ویژه عصاره‌های فعال زیستی آن‌ها، ضروری است که به دلیل دارا بودن cc هزینه قابل‌توجه کمتر، بازدهی بالاتر و دستیابی سریع‌تر نسبت به ترکیبات جدا شده، سازگار با محیط زیست و از نظر اقتصادی جذاب‌تر هستند.

2.4. تمایز عصاره سیانوباکتری ها با آنالیز PCA

جستجو برای ترکیبات زیست فعال از منابع طبیعی، با پتانسیل برای استفاده به عنوان مواد تشکیل دهنده در زمینه لوازم آرایشی در سال های اخیر رشد کرده است. ترکیبات مشتق شده از سیانوباکتری ها علاوه بر اینکه به طور بالقوه کمتر سمی و کاملاً زیست تخریب پذیر هستند، از منابع تجدیدپذیر در دسترس هستند و می توانند با هزینه کم در یک محیط کنترل شده به دست آیند.cistanche nzطبقه بندی عصاره های فعال زیستی بر اساس ترکیب شیمیایی و فعالیت های بیولوژیکی آنها می تواند برای اشاره به روابط بالقوه ارزشمند باشد. در این راستا، تجزیه و تحلیل اجزای اصلی (PCA) با در نظر گرفتن ترکیب شیمیایی عصاره سیانوباکتری‌ها و زیست فعالی بالاترین غلظت آزمایش‌شده در هر سنجش مورد استفاده قرار گرفت (شکل 3). همانطور که مشاهده می شود، 72.99 درصد از تنوع را می توان با دو بعد اول توضیح داد: PCl 50.41 درصد از واریانس را به خود اختصاص داد، در حالی که PC2 مسئول 22.58 درصد بود. سه گروه از هم متمایز شدند (شکل 3A) ): Gl، شامل عصاره آب Leptolyngbya cf.exocarp LEGE 11479; G2، شامل عصاره‌های آبی Cephalothrix lacustris LEGE 15493، Leptolyngbya boryama LEGE 15486 و Nodosilinea nodulosa LEGE 06104. و G3، شامل تمام عصاره های استون است. مطابق شکل 3B، Gl به دلیل محتوای پلی اتیلن از نظر شیمیایی از سایر نمونه ها متمایز است. عصاره های آبی Cephalothrix lacustris LEGE 15493، Leptolyngbya boryana LEGE 15486، و Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 بر اساس محتوای آنها در پروتئین های PC، APC و کل پروتئین (G2) گروه بندی می شوند، در حالی که تمام عصاره های استونی در یک گروه یافت می شوند (G3) به محتوای آنها در کاروتنوئیدها و کلروفیل a و مشتقات آن. ترکیبات فراتر از فعالیت های آنزیمی، با صفحات تشکیل شده با محور مثبت PCl نمایش داده می شوند (شکل 3B). می توان مشاهده کرد که نمونه هایی با محتوای کلروفیل a و کاروتنوئیدهای بالاتر ارتباط نزدیکی با مهار الاستاز و تیروزیناز دارند. این با همبستگی مثبت قوی بین کاروتنوئیدها و الاستاز نشان داده شده است (0.725, p<0.01) and="" tyrosinase=""><0.01) inhibition,="" with="" similar="" observations="" between="" chlorophyll="" a="" and="" the="" same="" enzymes=""><0.01 and=""><0.05,respectively). on="" the="" other="" hand,="" hyaluronidase="" inhibition="" is="" more="" correlated="" vvith="" pe="" content="" (figure="" 3b),="" with="" a="" significant="" positive="" correlation="" between="" the="" values=""><0.01).the compounds="" responsible="" for="" the="" radical="" scavenging="" activity="" of="" the="" extracts="" are="" displayed,="" with="" the="" planes="" formed="" with="" the="" pcl="" negative="" axis.="" the="" closest="" correlation="" is="" observed="" for="" tpc=""><0.05); other="" compounds="" such="" as="" total="" proteins,="" pc,and="" apc="" also="" contribute="" to="" the="" activity,="" although="" to="" a="" lower="" extent="" (figure="" 3b).regarding="" the="" spf,="" there="" is="" a="" close="" correlation="" between="" the="" activity="" of="" the="" extracts="" and="" their="" pbp="" content,mainly="" apc=""><0.01)and pc="" (0.838,="" p="" <="" 0.01),="" which="" points="" to="" these="" compounds="" as="" predominantly="" responsible="" for="" blocking="" uv-b="" radiation.="" the="" total="" protein="" content="" also="" contributed="" to="" this="" biological="" activity="" (0.670,=""><0.01), with="" the="" lowest="" contribution="" being="" observed="" for="" pe="" (0.210,p="">0.05). به طور کلی، تجزیه و تحلیل PCA امکان گروه بندی عصاره ها را بر اساس فعالیت های بیولوژیکی نشان داده شده در زمینه پیری پوست فراهم می کند، که منجر به این نتیجه می شود که عصاره های استون در مهار آنزیم های مسئول تخریب موثرتر هستند. ماتریکس پوستی و از دست دادن ساختار پوست، در حالی که عصاره های آبی در از بین بردن رادیکال های آزاد و محافظت از پوست در برابر اثرات مضر اشعه UV موثرتر هستند.

تا آنجا که می دانیم، این اولین بار است که رابطه ای بین ترکیب شیمیایی و فعالیت های بیولوژیکی عصاره های این سویه های سیانوباکتری ایجاد شده است.

3.مواد و روش ها

3.1. تولید زیست توده سیانوباکتری ها

چهار سویه سیانوباکتری رشته‌ای، Cephalothrix lacustris LEGE 15493 و Lep-tolyngbya boryana LEGE 15486، از اکوسیستم‌های آب شیرین برزیل، و Leptolyngbya cf. در این مطالعه از ectocarpi LEGE 11479 و Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 از اکوسیستم های دریایی پرتغال استفاده شد. سویه ها در مجموعه فرهنگ بیوتکنولوژی آبی و اکوتوکسیکولوژی (LEGE CC) در مرکز بین رشته ای تحقیقات دریایی و محیطی (CIIMAR) نگهداری شدند. برای اهداف تولید زیست توده، یک طرح کشت افزایش مقیاس تنظیم شد که با 40 میلی لیتر در آزمایشگاه شروع شد. شرایط کنترل شده، به صورت متوالی تا 4 لیتر افزایش یافت. سویه ها در محیط Z8 [53]، با مکمل 10 میکروگرم در لیتر ویتامین B12 و 25 گرم در LNaCl برای سویه های دریایی رشد کردند. کشت‌ها در دمای 25 درجه، با شدت نور 10 میکرومول فوتون بر ثانیه{17}} و با دوره نوری 14 ساعت روشنایی: 10 ساعت تاریکی نگهداری شدند. زیست توده تازه پس از 120 یا 150 روز رشد (بسته به سویه) از طریق فیلتراسیون جمع‌آوری شد و منجمد شد، در انجماد خشک شد و تا زمان آماده‌سازی عصاره در درجه {23}} نگهداری شد.

3.2. آماده سازی عصاره ها

دو عصاره مختلف به ترتیب از هر سویه تهیه شد: استون و آبی. ابتدا عصاره استون با استفاده از 2 گرم زیست توده خشک تهیه شد. زیست توده در استون تعلیق شد و به مدت 10 دقیقه در حمام اولتراسونیک (Fishebrand[FB15053، Loughborough، UK) استخراج شد. پس از استخراج استون، گلوله به دست آمده در هود بخار خشک شد و سپس با 70 میلی لیتر آب مقطر استخراج شد. بقایای سلولی با سانتریفیوژ در 10، 00×× گرم Gs به مدت 5 دقیقه در 4 درجه، در میکروسانتریفیوژ HERAEUS MegafugeTM 16R (Thermo ScientificTM, Waltham, MA, USA) حذف شد. سوپرناتانت‌ها از هر استخراج با کاهش تبخیر شدند. فشار (BUCHIR{9}} Rotary Evaporator) (عصاره استون)، یا منجمد و لیوفیلیزه (عصاره آبی). استخراج با سوپرنات مربوطه 3 بار تکرار شد. عصاره های خشک تا آنالیز شیمیایی و بیولوژیکی بعدی در درجه -20 نگهداری شدند.

3.3. سنجش سلولی

3.3.1. کشت سلولی

کراتینوسیت‌های انسانی HaCAT (ATCC)، فیبروبلاست‌های موش 3L1 (ATCC)، و سلول‌های اندوتلیال انسان hCMEC (ارائه‌شده توسط دکتر POCouraud (INSERM)) برای ارزیابی سیتوتوکس-سیتی مورد استفاده قرار گرفتند. رده‌های سلولی در محیط Eagle اصلاح‌شده Dulbecco (DMEM GlutaMAXTM، Gibco، Glasgow، UK)، مکمل با 1{9}} درصد (v) سرم جنین گاوی (Gibco)، 1 درصد پنی‌سیلین-استرپتومایسین (Pen-Strep 100 IU) کشت شدند. /mL و 10 mg/ml به ترتیب (Gibco) و 0.1 درصد آمفوتریسین B (Gibco). نگهداری و سنجش سلولی در دمای 37 درجه در اتمسفر مرطوب شده با CO2 5 درصد انجام شد و محیط کشت هر دو روز یکبار تجدید شد. در 80-90 درصد تلاقی سلولی، سلول های چسبنده با سالین بافر فسفات (PBS، Gibco) شسته شدند، با آنزیم اکسپرس TrypLEX (1×) (Gibco) جدا شدند، برای نگهداری منتقل شدند و برای سنجش های برنامه ریزی شده بذر شدند.

3.3.2. سمیت سلولی - سنجش MTT

زنده ماندن سلولی با کاهش {{{0}}(4،{2}}دی متیل تیازول{3}}یل){4}}،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTI، سنجش سیگما آلدریچ، آلمان، همانطور که قبلا گزارش شد [26]. تمام رده های سلولی (سلول های اندوتلیال، فیبروبلاست ها و کراتینوسیت ها) به ترتیب در صفحات چاهک با تراکم 1.0 × 10 سلول / میلی لیتر، 3.3 × 104 سلول / میلی لیتر و 2.5 × 104 سلول / میلی لیتر، در صفحات چاه کاشته شدند.اندازه آلت تناسلی سیستانچپس از 24 ساعت از چسبندگی سلولی، محیط کشت برداشته شد و سلول ها به مدت 24 و 48 ساعت در معرض محیط تازه حاوی عصاره های مختلف سیانوباکتری ها در پنج غلظت متوالی از 12.5 تا 200 میکروگرم بر میلی لیتر قرار گرفتند. برای عصاره‌های استون، محلول‌های موجود در دی متیل سولفوکسید (DMSO) (Gibco) تهیه شد و قبل از قرار گرفتن در معرض سلول‌ها با DMEM رقیق شد به طوری که حداکثر غلظت DMSO از 1 درصد تجاوز نکند. عصاره های آبی در PBS تهیه و با DMEM قبل از قرار گرفتن در معرض سلول رقیق شدند. کنترل منفی PBS و کنترل مرگ سلولی DMSO 20 درصد بود. پس از انکوباسیون، سنجش سمیت سلولی MIT انجام شد. به طور خلاصه، 20 میکرولیتر محلول MTT به هر چاهک اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 3 ساعت انکوبه شد. پس از انکوباسیون، محیط به دقت برداشته شد و نمک های فورمازان ارغوانی رنگ در DMSO حل شدند. جذب در 550 نانومتر با یک میکروپلیت خوان چندگانه Synergy HT (Biorek، Bad Friedrichshall، آلمان) که توسط نرم افزار GEN51M کار می کند، قرائت شد. آزمون به صورت چهار تکراری و میانگین انجام شد. برای تکرارپذیری، هر سنجش به طور مستقل حداقل سه بار تکرار شد. سمیت سلولی به عنوان درصد زنده ماندن سلول، با در نظر گرفتن 100 درصد زنده ماندن در کنترل حلال بیان شد.

3.4. پروفایل شیمیایی عصاره سیانوباکتری ها

3.4.1. محتوای فنلی کل (TPC)

برای تعیین TPC عصاره ها، از روش رنگ سنجی بر اساس روش Folin-Ciocalteu [54] با تغییرات جزئی استفاده شد. عصاره های استونی در DMSO و عصاره های آبی در آب حل شدند. به طور خلاصه، 25 میکرولیتر از هر عصاره (10mg/mL) به طور کامل با 25 میکرولیتر معرف Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich)20{{2{26}}}} مخلوط شد. میکرولیتر محلول NagCO3 و 500 میکرولیتر آب دیونیزه. برای قسمت خالی، معرف Folin-Ciocalteu با آب دیونیزه شده جایگزین شد. جذب محصول رنگی تشکیل شده در 725 نانومتر، با استفاده از یک میکروپلیت خوان Multi-detection Synergy HT (Biotek، Bad Friedrichshall، آلمان) که از طریق نرم افزار GEN51M کار می کرد، اندازه گیری شد. منحنی‌های استاندارد برای کمی‌سازی TPC با استفاده از هفت غلظت اسید گالیک (GA) (0.025 تا 0.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)، تهیه‌شده در همان حلال عصاره‌های مورد آزمایش (y{18}}.097x~0.01560 R²{{{{ 22}}.9989، برای استون، و y=2.204x＋0.01401، R{28}}.9982، برای آب، که در آن "y" به جذب و "x" به غلظت اشاره دارد) . سه تعیین مستقل در دو نسخه انجام شد. محتوای فنلی کل به عنوان ug معادل GA (GAE) در هر میلی گرم عصاره خشک بیان شد.

3.4.2. پروتئین کل

غلظت پروتئین کل با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA (#23227، Thermo-Scientific) تعیین شد. عصاره های آبی در آب و عصاره استون در DMSO تهیه شد. 25 میکرولیتر از هر عصاره (1 میلی گرم بر میلی لیتر) با 200 میکرولیتر از معرف کار مخلوط شد. جذب در 562 نانومتر، با استفاده از یک میکروپلیت خوان Multi-detection Synergy HT (Biotek، Bad Friedrichshall، آلمان) که از طریق نرم افزار GEN5IM کار می کند، اندازه گیری شد. یک منحنی استاندارد(y=-126.87x3＋547.73.353 -10.017; R{18}}.999, and y=162.87x3-248.51x²＋932.13x -11.715;R2=0.99، که در آن "y" به جذب اشاره دارد و "x" به غلظت اشاره دارد) برای هر عصاره، با استفاده از 9 غلظت آلبومین (BSA) (25 تا 2000 ug/mL) برای تعیین کمیت پروتئین ها. سه آزمایش مستقل در سه تکرار انجام شد. محتوای پروتئین کل به عنوان ug از آلبومین سرم گاوی (BSA) معادل در هر میلی گرم عصاره خشک بیان شد.

3.4.3. رنگدانه ها

رنگدانه‌های موجود در عصاره‌های آبی و استونی به روش اسپکتروفوتومتری اندازه‌گیری شدند. کلروفیل a و مشتقات آن با استفاده از منحنی کالیبراسیون به دست آمده با استاندارد تجاری (Sigma-Aldrich): y=8 کمی سازی شدند.0791x-0.0{{19} }22 (R2=0.996)، که در آن "y" به جذب و "x" به غلظت اشاره دارد. کل کاروتنوئیدها به عنوان -کاروتن (سیگما-آلدریچ)، از طریق منحنی کالیبراسیون آن (y{10}}.133x＋0.0099) تعیین شد. R²=0.990، که در آن "y" به جذب و "x" به غلظت اشاره دارد). غلظت کل کاروتنوئید به عنوان ug از کاروتن در هر میلی گرم عصاره خشک بیان شد. منحنی‌های کالیبراسیون برای هر دو استاندارد با استفاده از پنج غلظت مختلف (0.001 تا 0.025 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) به دست آمد. یک میکروپلیت خوان با تشخیص چندگانه Synergy HT (Biotek، Bad Friedrichshall، آلمان) که از طریق نرم افزار GEN5TM کار می کند.

محتوای PBP با اندازه‌گیری جذب عصاره‌های آبی در طول موج‌های مختلف (562615 و 645 نانومتر) و استفاده از فرمول‌های مربوطه، همانطور که قبلاً توسط Pagels و همکاران توضیح داده شد، به روش اسپکتروفتومتری تعیین شد. [34]: عصاره های آبی تا غلظت نهایی 5/0 میلی گرم 0 مجدداً معلق شدند. آزمایش در سه تکرار انجام شد و نتایج بر حسب ug/mg عصاره خشک بیان شد. 3.5. فعالیت های بیولوژیکی

3.5.1. رادیکال آنیون سوپراکسید (O2*-).

به گفته باربوسا و همکارانش [55]، سنجش مهار رادیکال آزاد Oz*- برای ارزیابی پتانسیل آنتی اکسیدانی عصاره های سیانوباکتری ها با تغییرات جزئی انجام شد. عصاره های آبی در آب و عصاره های استونی در DMSO تهیه شدند. پنج رقت سریال برای هر عصاره تهیه و به منظور ارزیابی رفتار عصاره ها و مقادیر IC مورد آزمایش قرار گرفت. همه معرف ها در بافر فسفات (19 میکرومولار، pH7.4) حل شدند. حجم 50 میکرولیتر از هر رقت با 50 میکرولیتر محلول 166 میکرومولار نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید احیا شده (NADH) و 150 میکرولیتر 43 میکرومولار کلرید آبی نیتروتترازولیوم (NBT) در یک صفحه چاهی مخلوط شد. پس از افزودن 50 میکرولیتر از 2.7 میکرومولار فنازین متوسولفات (PMS)، فعالیت مهار رادیکال نمونه‌ها با یک میکروپلیت خوان Multi-detection Synergy HT (Biotek، Bad Friedrichshall، آلمان) که از طریق نرم‌افزار GEN51M، در عملکرد جنبشی کنترل می‌شود، بررسی شد. در دمای اتاق به مدت 2 دقیقه در 562 نانومتر. سه سنجش مستقل در سه تکرار انجام شد. GA به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. نتایج به عنوان درصد مهار رادیکال در مقایسه با شاهد تیمار نشده بیان شد. نتایج برای مقادیر IC محاسبه‌شده به‌عنوان میانگین ± SD (ug/mL) حداقل سه سنجش مستقل در تکرار بیان شد. مقادیر IC و منحنی‌های دوز-پاسخ مربوطه با نرم‌افزار Graphpad Prism@ (سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده؛ نسخه 9، برای MacOS) محاسبه شد.

3.5.2. مهار هیالورونیداز

سنجش مهار هیالورونیداز کمی نسبت به آنچه که توسط Ferreres و همکاران ارائه شده بود، اصلاح شد.【56】. به طور خلاصه، 25 میکرولیتر از هر عصاره (9 میلی گرم در میلی لیتر)، 175 میکرولیتر هیالورونیک اسید (HA) ({4}}.7 میلی گرم در میلی لیتر) و 25 میکرولیتر هیالورونیداز (HAase) (9{8}}{{{ 14}} U/mL در NaCl0.9 درصد در یک لوله واکنش مخلوط شد. عصاره های آبی در آب و عصاره های استونی در DMSO تهیه شدند. پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای 37 درجه، واکنش با افزودن 25 میکرولیتر دی سدیم تترابورات (8/0 مولار در آب) متوقف شد و سپس 3 دقیقه در دمای 90 درجه در حمام آب انکوبه شد. لوله‌های واکنش قبل از افزودن 375 uL محلول DMAB[{19}}(Dimethylamino)benzaldehyde] تا دمای اتاق سرد شدند. پس از 20 دقیقه انکوباسیون در دمای 37 درجه، جذب محصول رنگی تشکیل شده در طول موج 560 نانومتر، در دستگاه میکروپلیت خوان HT Multi-detection Synergy (Biotek، Bad Friedrichshall، آلمان) با نرم افزار GEN5IM اندازه گیری شد. کنترل منفی در غیاب عصاره انجام شد. دی سدیم کروموگلیکات (DSCG) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

سه سنجش مستقل در سه تکرار انجام شد و نتایج به عنوان درصد مهار آنزیم در مقایسه با شاهد تیمار نشده بیان شد.

3.5.3. مهار الاستاز

سنجش مهار الاستاز پانکراس خوک بر اساس موتا و همکاران [57] با تغییرات جزئی انجام شد. عصاره‌های آبی در آب و عصاره‌های استونی در DMSO تهیه شدند. به طور خلاصه، در یک صفحه چاهی، 50 میکرولیتر از عصاره با 90 uL بافر HEPES (0.1 M) مخلوط شد. 10 میکرولیتر سوبسترای N-سوکسینیل-آلا-آلا-آلا پی-نیتروآنیلید (100 میکرومولار)، 70 میکرولیتر بافر استات (200 میلی مولار)، و 30 میکرولیتر الاستاز (1 U/mL) صفحه در دمای 37 درجه انکوبه شد. 10 دقیقه، و جذب محصول واکنش در 405 نانومتر، در یک میکروپلیت خوان Multi-detection Synergy HT (Biotek، Bad Friedrichshall، آلمان) که از طریق GEN51M کار می‌کرد، اندازه‌گیری شد. کنترل منفی در غیاب عصاره انجام شد و از اسید اسکوربیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.پودر سیستانچسه سنجش مستقل در سه تکرار انجام شد. نتایج به عنوان درصد مهار آنزیم در مقایسه با شاهد تیمار نشده بیان شد.

3.5.4. مهار تیروزیناز

سنجش مهار تیروزیناز بر اساس Adhikari و همکاران انجام شد.[58] با تغییرات جزئی به طور خلاصه، در یک 96-صفحه چاهی، 20 میکرولیتر از هر عصاره با 100 میکرولیتر تیروزیناز (30 U/mL در بافر فسفات) مخلوط شد. عصاره های آبی در آب و عصاره های استونی در DMSO تهیه شدند. مخلوط در دمای 30 درجه به مدت 8 دقیقه انکوبه شد. سپس، 80 میکرولیتر محلول L-DOPA (L-3،{10}}دی هیدروکسی فنیل آلانین) (2.5 میلی‌مولار در بافر فسفات) اضافه شد و جذب (T0، جذب در زمان "صفر") بلافاصله انجام شد. اندازه‌گیری شده با یک میکروپلیت‌خوان چندگانه Synergy HT (Biotek، Bad Friedrichshall، آلمان) که از طریق نرم‌افزار GEN5TM، در 475 نانومتر کار می‌کند. تعیین میزان جذب در T0 (قبل از تشکیل محصول واکنش) امکان حذف تداخلات احتمالی به دلیل رنگ طبیعی عصاره های مورد مطالعه را فراهم کرد. پس از 8 دقیقه انکوباسیون در دمای 30 درجه، جذب مجدد اندازه گیری شد (T8). درصد مهار تیروزیناز در حضور عصاره سیانوباکتری ها در مقایسه با کنترل تیمار نشده (منفی) محاسبه شد که در آن تفاوت بین جذب ها (T {21}}T0) با 100 درصد فعالیت آنزیم مطابقت دارد. کنترل منفی در غیاب عصاره انجام شد و از اسید کوجیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. سه سنجش مستقل در سه تکرار انجام شد. نتایج به عنوان درصد مهار آنزیم در مقایسه با شاهد تیمار نشده بیان شد.

3.5.5. فاکتور محافظت در برابر آفتاب (SPF)

فاکتور محافظ خورشید در شرایط آزمایشگاهی با توجه به Rohr و همکاران [59] با تغییرات جزئی تعیین شد. عصاره های آبی در آب و عصاره های استون در استون تهیه شدند. به طور خلاصه، جذب 2 میلی لیتر از هر عصاره (20 و 1000 میکروگرم بر میلی لیتر)، در دستگاه اسپکتروفتومتر (از 290 تا 320 نانومتر، 5 در 5 نانومتر) اندازه گیری شد. SPF با استفاده از فرمول پیشنهادی منصور [60] محاسبه شد: جایی که EE (A) طیف اثر اریتمی است، I (A) طیف شدت خورشید است، Abs (λ) جذب عصاره است و CF اصلاح است. فاکتور (28) با استفاده از یک ضد آفتاب تجاری با مقدار SFP شناخته شده 30 تعیین می شود.

3.6. تجزیه و تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار آماری IBM SPSS (نسخه 23.{1}} برای macOS، IBM Corporation، New York, NY, USA, 2015) انجام شد. داده ها برای نرمال بودن و همگنی واریانس ها توسط Kolmogorov-Smirnov و Leven's تجزیه و تحلیل شدند. آزمون‌ها، سپس به یک ANOVA یک‌طرفه با استفاده از HSD Tukey (تفاوت معنی‌دار) به‌عنوان آزمون پس‌دکتر یا به آزمون t غیر جفت‌شده ارسال شدند. از آزمون همبستگی پیرسون برای مقایسه داده‌های بیان نرمال شده بین پروفایل‌های شیمیایی و فعالیت‌های بیولوژیکی عصاره‌های سیانوباکتری استفاده شد.

3.7. تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA)

PCA برای تبدیل تعدادی از متغیرهای بالقوه همبسته به تعدادی متغیر نسبتاً مستقل مورد استفاده قرار گرفت، که می‌توان آن‌ها را بر اساس سهم آنها در توضیح تغییرات کل مجموعه داده رتبه‌بندی کرد[61]. اجزای نسبتاً مهم الگوهای با ابعاد بالا را می توان با موفقیت شناسایی کرد. داده‌های اولیه با ابعاد بالا را می‌توان در فضایی با ابعاد پایین‌تر ترسیم کرد، و بنابراین پیچیدگی یک مسئله طبقه‌بندی الگوی با ابعاد بالا تا حد زیادی کاهش می‌یابد [62]. برای مطالعه حاضر، تشخیص الگو بر اساس PCA با استفاده از نرم افزار آماری IBM SPSS (نسخه 23.{6}} برای macOS، IBM Corporation، نیویورک، نیویورک، ایالات متحده آمریکا، 2015) انجام شد. ماتریس داده شامل متابولیت‌های موجود در عصاره‌های آبی و استونی چهار سویه سیانوباکتری و فعالیت آن‌ها در بالاترین غلظت آزمایش شده بود.

4. نتیجه گیری

فعالیت بیولوژیکی نشان‌داده‌شده توسط عصاره‌های سیانوباکتری‌های مورد تجزیه و تحلیل در اینجا ثابت شد که به وضوح همبستگی دارد. با توجه به وجود PBP های زیست فعال، عصاره های آبی موثرترین برای محافظت در برابر اشعه ماوراء بنفش بودند که همراه با ظرفیت مهار رادیکال آنها، آنها را به عنوان مواد امیدوارکننده ای برای استفاده در فرمولاسیون های ضد پیری با هدف جلوگیری از پیری پوست که توسط عوامل خارجی تشدید می شود، پیشنهاد می کند. از سوی دیگر، عصاره استون در مهار فعالیت آنزیم‌های مسئول تخریب ماتریکس پوستی و از بین رفتن ساختار پوست مؤثرتر بود، بنابراین برای پیری پوست مرتبط با سن مناسب‌تر است.عصاره سالسا سیستانچطرح استخراج متوالی که ما پیشنهاد می‌کنیم می‌تواند سودمند باشد و به دست آوردن عصاره‌های فعال زیستی مختلف شیمیایی از طریق پولی‌سازی زیست توده سیانوباکتری‌ها اجازه می‌دهد و این فرآیند را پایدارتر و از نظر اقتصادی جذاب‌تر می‌کند. در مجموع، عصاره سیانوباکتری ها ارزش بهره برداری بیشتر در زمینه پیری پوست را دارند و جستجوی مواد طبیعی، ایمن و پایدار برای فرمولاسیون های آرایشی را هدف قرار می دهند.

این مقاله از Mar. Drugs 2022, 20, 183 استخراج شده است. https://doi.org/10.3390/md20030183 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs