Danegaptide از آسیب ناشی از TGF 1- در سلولهای اپیتلیال لوله پروگزیمال انسان در کلیه جلوگیری می کند

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصه:مزمنبیماری کلیوی(CKD) یک مشکل بهداشتی جهانی است که با تعدادی از بیماری های همراه همراه است. شواهد اخیر حاکی از افزایش ترشح آدنوزین تری فسفات (ATP) با واسطه همی کانالی در پیشرفت فیبروز توبولو بینابینی، آسیب شناسی اصلی CKD است. در اینجا، ما اثر دانگاپتید را بر مسدود کردن تغییرات نیم کانالی در بیان و عملکرد پروتئین‌های مرتبط با پیشرفت بیماری در اپیتلیال لوله‌ای ارزیابی می‌کنیم.کلیهسلول ها. سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال انسانی اولیه (hPTECs) با ایزوفرم بتا1 فاکتور رشد تبدیل کننده سیتوکین پروفیبروتیک (TGF1) ± دنگاپتید تحت درمان قرار گرفتند. qRT-PCR و ایمونوبلات بیان mRNA و پروتئین را تایید کردند، در حالی که یک آرایه آنتی بادی سیتوکین بیان / ترشح سیتوکین های پیش التهابی و پروفیبروتیک را ارزیابی کرد. جذب رنگ کربوکسی فلوئورسئین و سنجش زیستی ATP فعالیت نیم کانال و انتشار ATP را اندازه‌گیری کردند، در حالی که مقاومت الکتریکی transepithelial برای ارزیابی نفوذپذیری پاراسلولی استفاده شد. Danegaptide جذب رنگ کربوکسی فلورسئین و انتشار ATP را نفی کرد و در برابر تغییرات پروتئین مرتبط با آسیب لوله ای محافظت کرد. مسدود کردن Cx{4}}واسطه ATP با بازیابی جزئی بیان بازدارنده‌های چرخه سلولی، چسبنده‌ها و پروتئین‌های اتصال محکم و کاهش نفوذپذیری پاراسلولی همراه بود. علاوه بر این، دنگاپتید TGF را مهار کرد و باعث تغییرات در بیان و ترشح آدیپوکین‌های کلیدی، سیتوکین‌ها، کموکاین‌ها، فاکتورهای رشد و اینترلوکین‌ها شد. داده ها نشان می دهد که به عنوان یک تعدیل کننده اتصال شکاف و مسدود کننده نیم کانال، دانگاپتید دارای پتانسیل در درمان آینده CKD است.

کلید واژه ها:دانگاپتید; کانکسین نیم کانال; ATP; بیماری مزمن کلیوی؛ التهاب؛ فیبروز؛ hPTECs؛ TGF 1; کلیه، کلیه

سیستانچ بیماری کلیوی/کلیوی را بهبود می بخشد

مقدمه

مزمنبیماری کلیوی(CKD) یک نگرانی رو به رشد سلامتی است که با افزایش خطر بیماری قلبی عروقی و عوارض مرتبط است [1]. تخمین زده می شود که 10 درصد از جمعیت جهان را تحت تأثیر قرار دهد [2]، عوامل خطر شامل سن، دیابت، فشار خون بالا، دیس لیپیدمی و چاقی [3] است. این بیماری با کاهش نرخ فیلتراسیون گلومرولی (GFR)، علاوه بر پروتئینوری، همراه با گلومرولواسکلروز، آتروفی توبولی و فیبروز توبولو بینابینی (TIF)، که تغییرات هیستوپاتولوژیک شایع هستند، مشخص می شود [4]. درمان TIF و CKD پیشرفته که به از دست دادن ثبات اپیتلیال، التهاب مداوم و افزایش رسوب ماتریکس خارج سلولی ختم می شود، نشان دهنده یک نیاز بالینی برآورده نشده است [3]. در نتیجه، رویکردهای درمانی فوری مورد نیاز است. بیان و عملکرد تغییر یافته کانکسین (Cx) در آسیب شناسی اشکال مختلف بیماری (همانطور که در [7] بررسی شد)، از جمله CKD (همانطور که در [8،9] بررسی شد) دخیل است. کانکسین‌ها خانواده‌ای از پروتئین‌های متصل به غشاء هستند که به مجموعه‌های هگزامری که کانکسون نامیده می‌شوند، الیگومریزه می‌شوند [10]. هنگامی که سلول‌های همسایه در یک راستا قرار می‌گیرند، اتصالات متصل می‌شوند تا اتصالات شکافی ایجاد کنند، منافذ پیوسته که از طریق آن‌ها می‌توان مولکول‌های پیام‌رسان را تغییر داد و مسیر مستقیم ارتباط را امکان‌پذیر می‌کند [10]. هنگامی که متصل نمی شوند، کانکسون ها نیم کانال هایی را تشکیل می دهند که از طریق آنها مولکول هایی مانند آدنوزین تری فسفات (ATP) می توانند به فضای خارج سلولی محلی رها شوند تا از طریق فعال شدن گیرنده های پورینور سلول های همسایه را تحت تأثیر قرار دهند [11]. بیان گیرنده P2X7 پورینرژیک (P2X7R) درکلیهلوله های افراد دیابتیبیماری کلیوی[12] و به شدت در پیشرفت فیبروز در هر دو نقش داردکلیه[13-17] و در سایر انواع بافت [18-21]. جای تعجب نیست، هدف قرار دادن سیگنال های پورینرژیک توجه قابل توجهی را به خود جلب کرده است. با این حال، تا به امروز، آزمایش‌های بالینی نتوانسته‌اند اثرات مفید آنتاگونیسم P2X7R را در شرایط التهابی متعدد نشان دهند، اثری که احتمالاً با تنوع ژنتیکی در گیرنده مرتبط است [22]. هدف قرار دادن بالادست انتشار ATP می تواند این مشکلات را دور بزند.

شواهد بیان ناهنجار و/یا فعالیت کانکسین ها را با اشکال مختلف CKD مرتبط می کند [12،{1}}]. مطالعات اولیه توسط عابد و همکاران. گزارش داد که موش های ناهمگن (Cx43 به علاوه /-)، با انسداد یک طرفه حالب (UUO)، رسوب ماتریکس خارج سلولی (ECM) کاهش یافته و التهاب کاهش یافته است [27]، در حالی که Cx43-تقلید خاص، GAP{6} }، توانست چسبندگی مونوسیت را مهار کند و بیان کلاژن I را در مدل موشی ترانس ژن رنین (RenTG) CKD وابسته به رنین کاهش دهد [25]. اخیراً، ما شناسایی کردیم که ایزوفرم کانکسین غالب بیان شده در لوله پروکسی مال، Cx43، در مواد بیوپسی جدا شده از افراد مبتلا به نفروپاتی دیابتی افزایش یافته است، مشاهده ای که با افزایش انتشار ATP واسطه نیمه کانالی در اولیه درمان شده با TGFp همراه است. سلول های لوله پروگزیمال [12]. در ارزیابی تأثیر افزایش‌های موضعی در غلظت‌های ATP خارج سلولی، ما تشخیص دادیم که ارتباط نابجای Cx{13}}واسطه‌شده، جداسازی اتصالات چسبنده (مانند E-cadherin) و مجتمع‌های اتصال محکم (مثلاً Zona Occludens) را از طریق فعال‌سازی P2X7R آغاز می‌کند. این اثرات، که در مدل ناهمگن Cx43 پلاس /- موش UUO [12] رد شد، نشان دهنده ارتباط واضحی بین Cx43 و آسیب لوله‌ای است. در حالی که ابلیشن نسبی Cx43 نقش کانکسین ها را در شروع تغییرات فنوتیپی آسیب لوله ای تایید می کند، مداخله دارویی با پپتید 5 مسدود کننده نیم کانال Cx43 نشان داد که ماهیت محافظتی این فعالیت کاهش یافته Cx43 ناشی از مهار انتشار ATP با واسطه نیم کانال است. استفاده از پپتیدهای تقلیدی برای تأکید بر ماهیت محافظتی پشت مسدود کردن فعالیت همی کانال با موفقیت در سایر مدل‌های بیماری از جمله رتینوپاتی [28]، التهاب عصبی [29]، گلیوما [30،31] و دژنراسیون ماکولا وابسته به سن [32، گزارش شده است. 33]. در نهایت، مطالعات تغییر فعالیت کانکسین را به افزایش التهاب [34-36] و فیبروز [37-40] مرتبط می‌کند و نشان می‌دهد که تثبیت ارتباط با واسطه‌ی همی کانال و/یا اتصال با شکاف (GJIC) ممکن است شروع آسیب را به تاخیر بیندازد. در مدل های مختلف آسیب مشاهده می شود. در نتیجه، مهار همی کانال های کانکسین وسیله ای جذاب برای کاهش التهاب فراهم می کند و از علایق درمانی قابل توجهی برخوردار است.

Danegaptide ((2S, 4R)-1-({{3}aminoacyl)-4-benzamidopyrrolidine2-carboxylic acid) که به نام ZP1609 یا GAP-134 نیز شناخته می‌شود، کوچک است. دی پپتید مشتق شده از روتیگاپتید (AAP10، ZP123). در ابتدا به عنوان یک عامل ضد آریتمی [41] توسعه یافت، با Cx43 [42] تعامل دارد و به عنوان یک اصلاح کننده اتصال شکاف قوی [43] عمل می کند. این ترکیب خواص محافظتی و ضد آریتمی را نشان داده است و قبلاً اثرات قابل توجهی را در مدل‌های بالینی تثبیت شده آسیب‌های ایسکمیک خونرسانی مجدد قلب نشان داده است [44،45]. در حالی که کارآزمایی‌های بالینی انسانی فاز 2، متأسفانه نتوانستند به نقطه پایانی خود برسند [46]، مطالعات گروه‌های دیگر پتانسیل درمانی دانگاپتید را در سایر انواع بافت و مدل‌های بیماری بررسی کرده‌اند [41،47-49]. علاوه بر این، در حالی که اطلاعات کمی از نقش آن در تعدیل فعالیت همی کانالی وجود دارد، نشان داده شده است که دنگاپتید جذب رنگ با واسطه همی کانال را در سلول های گلیوما C6 کاهش می دهد [43]. با وجود این، نقش این ترکیب در مسدود کردن انتشار ATP با واسطه نیم کانال در سایر انواع بافت هنوز تایید نشده است.

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

مطالعه حاضر، پیش از تعیین نقش محافظتی آن در برابر بیان و تغییرات عملکردی که معمولاً با پیشرفت مرتبط است، کارایی داننگاپتید را در نفی انتشار ATP نیم کانالی با واسطه کانکسین در سلول‌های اپیتلیال لوله پروگزیمال انسانی (hPTECs) تحت درمان با TGF بررسی کرد. فیبروز توبولو بینابینی با استفاده از تکنیک‌هایی برای تعیین تغییرات در بیان (qRT-PCR، ایمونوسیتوشیمی، ایمونوبلات، آرایه‌های آنتی‌بادی) و عملکرد (بیوسنینگ ATP، جذب رنگ، مقاومت الکتریکی ترانس اپیتلیال، آرایه‌های آنتی‌بادی)، یافته‌های ما نشان می‌دهد که غلظت‌های نانومولاری داننگاپتید، ATP با واسطه‌ی نیمه کانال Cx را مسدود می‌کند. انتشار و تا حدودی کاهش تغییرات ناشی از TGF 1- در بیان پروتئین‌های چرخه سلولی (مانند p16، p21، cyclin D1) و عوامل محافظ مجدد (مانند Klotho). علاوه بر این، دنگاپتید تغییراتی را که اغلب در آسیب لوله‌ای مشاهده می‌شود، کاهش می‌دهد، از جمله جداسازی اتصالات چسبنده (شامل از دست دادن E-cadherin) و اتصالات محکم (شامل از دست دادن زونا مسدود 1 (ZO{10}}) و کلودین 2). نکته مهم، آرایه پروفیل‌کننده پروتئوم توانایی دانگاپتید را برای بازگرداندن تغییرات در بیان و ترشح پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی، آدیپوکین‌ها، کموکاین‌ها و فاکتورهای رشد القا شده توسط TGF 1 نشان داد. ) می تواند با موفقیت آزادسازی ATP واسطه نیمه کانالی را در hPTEC های اولیه مسدود کند و تا حدی از تغییرات مرتبط با التهاب و فیبروز محافظت کند، همانطور که در مرحله آخر CKD مشاهده شد.

2. نتایج

2.1. Danegaptide بر زنده ماندن سلول های اپیتلیال لوله ای تأثیر نمی گذاردانسانکلیه2 سلول (HK2) در گلوکز کم (5 میلی مولار) به مدت 48 ساعت، قبل از اینکه یک شبه در سرم گرسنگی بمانند، کشت داده شدند و متعاقباً با غلظت بهینه TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر) [12،24] ± داننگاپتید (50) تیمار شدند. nM-1 میکرومولار) به مدت 48 ساعت (شکل 1A، n=3). سنجش 3-(4،{16}}دی متیل تیازول-2-یل){18}}،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) تایید کرد که هیچکدام از TGF 1 (11.7 ± 101.9 درصد) و نه دنگاپتید به تنهایی زنده ماندن سلولی (7 ± 95.2 درصد (50 نانومولار)، 103 ± 5.7 درصد (100 نانومولار) و 96.6 ± 5.3 درصد (1 میکرومولار)) را در مقایسه با گروه شاهد تغییر نداد. هنگامی که سلول های تیمار شده با TGF با دانگاپتید (2.2 ± 104.1 درصد (50 نانومولار)، 93.4 ± 1.6 درصد (100 نانومولار) و 89.3 ± 3.7 درصد (1 میکرومولار) به طور همزمان انکوبه شدند، هیچ اثری مشاهده نشد. برای تأیید این داده‌ها، سنجش کریستال ویولت (CV) و لاکتات دهیدروژناز (LDH) انجام شد. انتشار LDH در سلول های تیمار شده با TGF قابل مقایسه با گروه شاهد بود (11.3 ± 109.3 درصد)، و انکوباسیون همزمان با دانگاپتید هیچ اثر اضافی نداشت (106.4 ± 11.6 درصد (50 نانومولار)، 113.9 ± 15.6 درصد (100n) و 4.3 ± 113.2 درصد (1 میکرومولار)). همانطور که انتظار می رفت، دانگاپتید به تنهایی در مقایسه با گروه شاهد (4.3 ± 104.4 درصد (50 نانومولار)، 95.3 ± 4.7 درصد (100 نانومولار) و 92.6 ± 3.3 درصد (1 میکرومولار)) به طور قابل توجهی آزادسازی LDH را تغییر نداد. رنگ‌آمیزی سلولی با استفاده از کریستال ویولت این یافته‌ها را با داده‌های TGF 1 (10 نانوگرم در میلی‌لیتر؛ 7.3 ± 96.9 درصد) و TGF 1 به علاوه دنگاپتید (50 nM-1 میکرومولار) با کنترل‌ها (0.9 ± 98.2 ± 0.9 مولار) قابل مقایسه است. 1.8 ± 97.5 درصد (100 نانومولار) و 85.8 ± 5.3 درصد (1 میکرومولار) در نهایت، دنگاپتید به تنهایی رنگ‌آمیزی کریستال بنفش را تغییر نداد (2.5 ± 98.3 درصد (50 نانومولار)، 99.6 ± 2.7 درصد (10) 2.2 درصد (1 میکرومولار) از گروه شاهد) با توجه به این داده ها، غلظت 50-100 نانومولار برای مطالعات بعدی انتخاب شد.

شکل 1. Danegaptide از افزایش 1-تغییر TGF در جذب رنگ با واسطه نیم کانال جلوگیری می کند. در پانل (A)، انسانکلیه2 سلول (HK2) در گلوکز کم (5 میلی مولار) ± TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر) ± دانگاپتید (50، 100 و 1000 نانومولار) به مدت 48 ساعت کشت داده شدند و زنده ماندن سلول ها بود. ارزیابی شد. نتایج به عنوان میانگین ± SEM (n=3) ارائه شده است. جوجه کشی با TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر ± دانگاپتید (50-1000 نانومولار)) تغییری در 3-(4,{16}}dimethylthiazol{17}}yl)-2، 19} جذب دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT)، آزادسازی لاکتات دهیدروژناز (LDH) یا رنگ‌آمیزی کریستال ویولت (CV). در پانل های (B) و (C)، جذب رنگ کربوکسی فلورسئین برای ارزیابی فعالیت همی کانال در سلول های HK2 و سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال انسان (hPTECs) استفاده شد، با درجه بارگیری رنگ که مستقیماً با باز شدن متناسب است. سلول ها در گلوکز کم (5 میلی مولار) ± TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر) ± دانگاپتید (50 یا 100 نانومولار) به مدت 48 ساعت کشت داده شدند. دانگاپتید از افزایش جذب رنگ کربوکسی فلورسئین در سلول‌های HK2 (پانل (B)) و hPTEC (پانل (C)) جلوگیری کرد. حداقل بارگذاری رنگ در سلول‌های کنترل رخ داد، در حالی که بارگذاری رنگ به طور قابل‌توجهی در سلول‌های تیمار شده با TGF 1 افزایش یافت. افزودن دنگاپتید (50 یا 100 نانومولار) جذب رنگ را کاهش داد و شدت فلورسانس FL را به سطوح کنترل برگرداند. شدت در مقایسه با گروه کنترل کم گلوکز به صورت درصد بیان می شود و نماینده 3 آزمایش جداگانه است. داده ها به عنوان میانگین ± SEM (n=3)، با اهمیت کلیدی نشان داده شده است (** p <0.01، ***="" p=""><0.001؛ anova="" یک="" طرفه="" و="" پس="" آزمون="">

2.2. دانگاپتید TGF را مسدود می کند 1-تغییراتی را در جذب رنگ با واسطه نیم کانال در سلول های اپیتلیال لوله ای ایجاد کردما قبلاً نشان داده‌ایم که TGF 1 باعث افزایش فعالیت نیم کانالی با واسطه Cx و انتشار ATP از سلول‌های اپیتلیال لوله پروگزیمال می‌شود [24]. سنجش جذب رنگ کربوکسی فلورسئین برای تعیین اینکه آیا دنگاپتید می‌تواند جذب رنگ ناشی از TGF را از طریق همی کانال‌ها در سلول‌های HK2 و hPTECs اولیه نفی کند یا خیر، استفاده شد. همانطور که انتظار می‌رفت، TGF 1 (10 نانوگرم در میلی‌لیتر) جذب رنگ را به 32.6 ± 354.9 درصد از گروه‌های کنترل در سلول‌های HK2 افزایش داد، در حالی که انکوباسیون همزمان با دانگاپتید (50 nM و 100 نانومولار) به طور قابل‌توجهی کاهش یافت. پاسخ به 17.9 ± 165.5 درصد و 18.1 ± 147.6 درصد، به ترتیب (شکل 1B؛ p کمتر یا مساوی 0.001، n=4). Danegaptide به تنهایی جذب رنگ را تغییر نداد. جذب رنگ کربوکسی فلوئورسئین توسط TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر) در hPTEC های اولیه (38.6 ± 310.8 درصد از گروه شاهد) افزایش یافت، پاسخی که تا حدی توسط انکوباسیون همزمان دنگاپتید (100 نانومولار؛ 145 ± 19.7 درصد) در مقایسه با گروه شاهد رد شد. (شکل 1C؛ p کمتر یا مساوی 0.01، n=4).

2.3. Danegaptide TGF را نفی می کند 1-آزادسازی ATP ناشی از نیم کانال در سلول های HK2برای تعیین اینکه آیا دانگاپتید (5{10}}-100 nM) می‌تواند از انتشار ATP ناشی از TGF 1 (10 نانوگرم در میلی‌لیتر) جلوگیری کند از hemichannels در سلول‌های HK2، ما از سنجش زیستی ATP [24،5{26}}] استفاده کردیم. TGF 1 (1{29}} نانوگرم در میلی‌لیتر) آزادسازی ATP را از 0.33 ± 0.11 میکرومولار به 3.60 ± {{4{43}}} افزایش داد. }.29 میکرومولار (شکل 2A,B,E؛ p کمتر یا مساوی با 0.001)، اثری که تا حدی توسط دنگاپتید در هر دو 50 نانومولار (0.26 ± 1.90 میکرومولار؛ p کمتر یا مساوی 0.01) تا حدی نفی می‌شود. ) و 100 نانومولار (0.19 ± 0.79 میکرومولار؛ p کمتر یا مساوی 0.001) (شکل 2D،E، n=3، شش تکرار/تعداد نمونه). Danegaptide به تنهایی بر انتشار ATP تأثیری نداشت (شکل 2C، E)، با سطوح ATP در 0.35 ± 0.10 میکرومولار (50 نانومولار) و 0.31 ± 0.09 میکرومولار (100 نانومولار) در مقایسه با گروه شاهد (شکل 2E) ثبت شد.

2.4. Danegaptide تغییرات القایی TGF را 1-در پروتئین‌های چرخه سلولی و نشانگر محافظت مجدد در hPTECs معکوس می‌کند.برای تعیین اینکه آیا دنگاپتید می‌تواند تنظیم نیم‌کانالی چرخه سلولی مشترک و نشانگرهای محافظ مجدد را نفی کند، hPTECs با TGF 1 (10 نانوگرم در میلی‌لیتر) ± دنگاپتید (100 نانومولار) انکوبه شدند. 12 ساعت و بیان mRNA ژن کاندید از طریق تجزیه و تحلیل qPCR ارزیابی شد. افزودن دانگاپتید به hPTECهای تیمار شده با TGF بیان p16 را از 21.1 ± 358.8 درصد به 18.5 ± 193 درصد از گروه شاهد، بیان p21 از 221.8 ± 12.9 درصد به 142.2 ± 21.7 درصد از 21.2 ± 21.2 درصد و بیان p16. درصد به 15.0 ± 132.9 درصد (شکل 3؛ p کمتر یا مساوی 0.001، n=3). علاوه بر این، دنگاپتید تا حدی کاهش کلوتو را از 3.8 ± 43.3 درصد به 11.7 ± 59.9 درصد از کنترل ها معکوس کرد (شکل 3، n=3).

2.5. Danegaptide TGF را بازیابی می کند 1-تغییرات واسطه در چسبنده ها و پروتئین های اتصال محکم و نفوذپذیری پاراسلولی در hPTEC هادرکلیهکاهش چسبندگی سلولی با واسطه E-cadherin (ECAD) مجموعه ای از رویدادها را آغاز می کند که در یک فنوتیپ متناوب مرتبط با تبدیل جزئی اپیتلیال به مزانشیمی به اوج خود می رسد. شروع، جداسازی چسبنده ها و مجتمع های اتصال محکم را تسهیل می کند، که منجر به از دست دادن چسبندگی، کاهش ارتباطات بین سلولی اتصال شکاف و اپیتلیوم نشتی می شود [12،24،51]. برای تعیین اینکه آیا دنگاپتید می‌تواند تغییرات واسطه‌ای در چسبندگی و پروتئین‌های اتصال محکم TGF را خنثی کند یا خیر، hPTECs با TGF 1 (1{37}} نانوگرم در میلی‌لیتر) ± دنگاپتید (1{39}}{41) انکوبه شدند. }} nM) به مدت 48 ساعت و بیان پروتئین های کاندید ارزیابی شد. Danegaptide تا حدی بیان E-cadherin را از 3.3 ± 33.3 درصد به 7.6 ± 89 درصد از گروه شاهد، بیان N-cadherin (NCAD) را از 29.6 ± 224.4 به 27.4 ± 161.9 درصد و بیان ویمنتین را از 212.8 ± 212.8 درصد (1.8 ± 212.8 درصد) بازگرداند. شکل 4A؛ p کمتر یا مساوی با 0.001، p کمتر یا مساوی 0.01 و p کمتر یا مساوی 0.001، n {{43} }). بیان کاتنین توسط مسدود کننده نیم کانال از 11.2 ± 149.2 درصد (TGF 1 به تنهایی) تا 16.8 ± 151.6 درصد باقی مانده است (TGF 1 به علاوه دانگاپتید، شکل 4B؛ p=NS، n=3). ارزیابی اثرات داننگاپتید بر پروتئین‌های اتصال محکم تأیید کرد که تعدیل‌کننده اتصال شکاف تا حدی بیان کلودین{58}} را از 5 ± 44.5 درصد به 5 ± 74.6 درصد از گروه شاهد و ZO-1 از 113 ± 27.8 بازیابی کرد. درصد به 5.4 ± 52.8 درصد در مقایسه با گروه شاهد (شکل 4B؛ p کمتر یا مساوی 0.05، n=3). مطالعاتی که مقاومت الکتریکی ترانس اپیتلیال را مورد بررسی قرار دادند، تأیید کردند که کاهش بیان پروتئین‌های اتصال محکم که با TGF 1 (10 نانوگرم در میلی‌لیتر) مشاهده می‌شود، با از دست دادن مقاومت ترانس اپیتلیال از 1±57.33 برابر است.{83}} Ω·cm2 تا 1.53±10 Ω·· cm2 (p کمتر یا مساوی 0.001، n=3). این افزایش نشتی تا حدی با انکوباسیون همزمان با دنگاپتید (36 ± 2.08 Ω·cm2) اصلاح شد (شکل 4C؛ p کمتر یا مساوی 0.001، n=3).

2.6. Danegaptide از TGF جلوگیری می کند 1-تغییر برانگیخته پروتئین های ماتریکس خارج سلولی در hPTECناشی از عدم تعادل بین تشکیل و تخریب، تجمع ECM یکی از مشخصه های اصلی CKD است. نقش TGF 1 در این فرآیند به خوبی مشخص شده است [52]، و درک چگونگی نفی این تغییرات پیامدهای روشنی برای پیشرفت بیماری دارد. برای بررسی اثر دنگاپتید بر تغییرات ایجاد شده در بیان پروتئین‌های ECM، hPTEC‌ها در گلوکز پایین (5 میلی‌مولار) به مدت 48 ساعت کشت داده شدند، در طول شب از گرسنگی سرم استفاده کردند و با TGF 1 (1{{{{{ 28}} نانوگرم در میلی لیتر) ± دنگاپتید (1{45}}0 nM) به مدت 48 ساعت. در مقایسه با گروه شاهد، TGF 1 بیان پروتئین های ECM کلاژن I (14/30 ± 6/334 درصد)، کلاژن IV (9/16 ± 5/354 درصد)، فیبرونکتین (4/50 ± 7/301 درصد) و لامینین (شکل 5/6 ± 4/334 درصد) را افزایش داد. B؛ p کمتر یا مساوی 0.001، n=3). جوجه کشی مشترک با دنگاپتید به طور قابل توجهی این تغییرات را کاهش داد و بیان را به 27.3 ± 180.7 درصد (کلاژن I)، 164 ± 6.9 درصد (کلاژن IV)، 161.3 ± 4 درصد (فیبرونکتین) و 149 ± 20.4 درصد (لام اینچ) (لام اینچ) برگرداند. از یا مساوی 0.001؛ n=3 در هر مورد). Danegaptide (100 نانومولار) همچنین تغییرات ناشی از TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر) را در کیناز 1 متصل به اینتگرین (ILK1) از 16.8 ± 378.9 درصد به 33 ± 251.8 درصد کاهش داد (p کمتر یا مساوی 0.001) اما حداقل اثر را داشت. بر روی ماتریکس متالوپروتئیناز 3 (MMP3)، بیان را از 19.6 ± 185.3 درصد با سیتوکین به تنهایی به 147.1 ± 12.2 درصد در هنگام انکوبه همزمان با دنگاپتید کاهش می دهد (شکل 5B)

2.7. Danegaptide TGF را کاهش می دهد 1-تغییرات برانگیخته در بیان آدیپوکین ها، کموکاین ها، فاکتورهای رشد و اینترلوکین ها از hPTECs

پاسخ التهابی در داخل و اطراف لوله های پروگزیمال شامل فعال شدن انواع سلول های متعدد و ترشح نشانگرهای التهابی متعدد است. به طور خاص، کموکاین‌های محلول، سیتوکین‌ها و فاکتورهای رشد سلول‌های ایمنی در حال نفوذ را جذب و فعال می‌کنند و فیبروبلاست‌های ساکن را تحریک می‌کنند. فعال شدن مداوم این سلول ها باعث فیبروز توبولو بینابینی می شود. ما از آرایه پروفیل‌کننده پروتئوم برای تعیین اینکه آیا دنگاپتید تغییرات القای TGF در بیان و ترشح واسطه‌های التهابی اصلی را نفی می‌کند یا خیر، استفاده کردیم. هتل های اولیه، همانطور که در بالا توضیح داده شد، کشت داده شدند و با TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر) ± دنگاپتید (100 نانومولار) به مدت 48 ساعت تیمار شدند. لیستی از تغییرات در لیزات (شکل 6) و مایع رویی (شکل 7) برای 31 پروتئین کاندید ارائه شده است که بر اساس عملکرد اولیه گروه بندی شده اند.

3. بحث

در سال 2017، بروز جهانی بیماری مزمن کلیه 697.5 میلیون مورد بود که این بیماری به عنوان دوازدهمین علت مرگ و میر در سراسر جهان شناخته شد [53]. تا به امروز، هیچ گزینه درمانی درمانی برای مرحله نهایی وجود نداردبیماری کلیوی(ESRD). علاوه بر این، با نرخ پایین بقای دیالیز و کمبود جهانیکلیهاهداکنندگان، نیاز مبرمی به توسعه درمانی وجود دارد که بتواند از پیشرفت بیماری مزمن کلیه جلوگیری کند و کیفیت زندگی بیمار را بهبود بخشد. در بیماری مزمن کلیه، شدت التهاب در لوله پروگزیمال تعیین می کند که چقدر سریع aکلیهشکست خواهد خورد. به نظر می رسد که تا حدی به واسطه فعال شدن انواع سلول های متعدد، ارتباط سلول به سلول با واسطه کانکسین را شامل می شود [9]. کانکسین ها ارتباط سلولی مستقیم و محلی با واسطه پاراکرین را از طریق توانایی خود در الیگومریزه شدن به کانکس های هگزامری تسهیل می کنند. هنگامی که سلول‌های همسایه در یک راستا قرار می‌گیرند، اتصالات متصل می‌شوند تا اتصالات شکافی را تشکیل دهند [10]. این کانال‌های پیوسته مسیر مستقیمی را برای انتقال اطلاعات فراهم می‌کنند و به سلول‌ها اجازه می‌دهند در فرکانس خاصی قفل شده و فعالیت را همگام‌سازی کنند. برخلاف اتصالات شکاف، که معمولاً تحت شرایط فیزیولوژیکی باز می‌شوند، کانکس‌های بدون اتصال که به آنها نیم کانال نیز می‌گویند، احتمال باز شدن کمی دارند و در پاسخ به آسیب باز می‌شوند [10]. فعالیت نیمه کانال تغییر یافته با پاتوفیزیولوژی وضعیت های بیماری های متعدد همراه است، با شواهدی که ارتباط سلول به سلول تغییر یافته را با افزایش پیری [54]، التهاب [34،55،56] و فیبروز [18-21] مرتبط می کند. داده های آزمایشگاه خودمان نشان می دهد که ایزوفرم کانکسین غالب در لوله پروگزیمال (Cx43) در CKD پیشرفته تنظیم شده است و با سطوح بالا TGF 1 و شدت فیبروز و التهاب مرتبط است [24]. علاوه بر این، این بیان تغییر یافته به از دست دادن ارتباط بین سلولی پیوند شکاف ترجمه می‌شود که با افزایش انتشار ATP با واسطه نیم کانال و تغییراتی که نشان‌دهنده آسیب اولیه لوله‌ای است، همراه است. در نتیجه، مسدود کردن انتشار ATP نیم کانالی با واسطه Cx{20}ممکن است یک هدف قابل دوام برای درمان آسیب مرحله آخری باشد که در افراد مبتلا به CKD ایجاد می‌شود.

Danegaptide یک پپتید درمانی کوچک است که تا همین اواخر در ظرفیت خود برای بازگرداندن جفت اتصال شکاف در چندین مدل آسیب، از جمله ایسکمی [43،44] و رتینوپاتی [49] استفاده می شد. نشان داده شده است که Danegaptide فعالیت همی کانال و جذب رنگ را در سلول های گلیوما C6 مسدود می کند [43]. با این حال، نقش این ترکیب در مسدود کردن انتشار ATP با واسطه نیم کانال هنوز تایید نشده است، و هیچ مطالعه ای هنوز اثرات دنگاپتید را بر آسیب دیدگان ارزیابی نکرده است.کلیهلوله ها در مطالعه کنونی، ما شواهد قانع‌کننده‌ای ارائه کردیم که نشان می‌دهد دانگاپتید آزادسازی ATP با واسطه‌ی نیمه‌کانالی TGF را 1-در سلول‌های اپیتلیال لوله پروگزیمال انسانی اولیه مسدود می‌کند. علاوه بر این، این ترکیب TGF را بازیابی کرد 1-تغییراتی را در بیان و ترشح پروتئین‌های مرتبط با التهاب و فیبروز ایجاد کرد. در CKD، فیبروز توبولو بینابینی در پاسخ به تغییرات مورفولوژیکی و فنوتیپی مختلف، از جمله انتقال اپیتلیال به مزانشیمی (EMT)، نفوذ سلول های التهابی، فعال شدن فیبروبلاست و بازسازی ماتریکس خارج سلولی (ECM) ایجاد می شود [57]. شواهد اخیر نشان می دهد که پیری سلولی ممکن است نقش کلیدی در پیشرفت مزمن داشته باشدبیماری کلیوی[58]، با پیری مرتبط با EMT، یک ترشح پیش التهابی، و رسوب ماتریکس خارج سلولی [59-62]. پیری نشان دهنده توقف رشد پرولیفراتیو برگشت ناپذیر با تغییرات مرتبط در سازمان کروماتین، رونویسی ژن و ترشح پروتئین است [63،64]. در نتیجه، سلول‌های پیر به افزایش بیان مهارکننده‌های کیناز وابسته به سیکلین (CDK) (CKIs)، از جمله p21Cip1 (p21) و p16Ink4a (p16) و بیان تغییر یافته Klotho محافظ رینوز نشان می‌دهند [65-68]. در مطالعه حاضر، بیان mRNA مهارکننده‌های CDK p16، p21 و cyclin D1 به طور قابل‌توجهی در سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای تحت درمان با TGF افزایش یافت، در حالی که پروتئین ضد پیری محافظ reno-محافظت‌کننده Klotho بیان کمتری نسبت به گروه کنترل نشان داد. جالب توجه است، بیان p16، p21 و cyclin D1 زمانی که سلول‌ها با دنگاپتید انکوبه شدند، بهبود یافت. اهمیت این مشاهدات توسط بسیاری از مطالعات in vivo [69،70]، از جمله کار اخیر در مدل موش دوگانه P16 INK4a پشتیبانی می‌شود. هنگامی که با UUO برای نشان دادن التهاب و فیبروز پیشرفته بینابینی، این موش ها کاهش آپوپتوز، پیری، کاهش سطح سیگنالینگ TGF 1/Smad و کاهش نفوذ سلول های التهابی را در مقایسه با حیوانات نوع وحشی نشان دادند [70]. علاوه بر این، سلول های لوله پروگزیمال جدا شده از مدل UUO سطوح افزایش یافته p21 را نشان دادند، که سرکوب آن با کاهش نشانگرهایی که معمولاً با EMT مرتبط است، همراه است [71،72]. یک پیوند مستقیم با پیری سلولی و القای EMT قبلاً ایجاد شده است [73].

از دست دادن چسبندگی سلولی با واسطه E-cadherin یک محرک شروع EMT است، با افزایش همزمان N-cadherin (سوئیچ cadherin)، همراه با جداسازی محل اتصال چسبنده ها و کسب پروتئین هایی که معمولاً با یک فنوتیپ فیبروبلاست مرتبط هستند، به عنوان مثال. ویمنتین و پروتئین اختصاصی فیبروبلاست [74]. درکلیه، به خوبی ثابت شده است که آسیب لوله ای تعدادی از تغییرات مورفولوژیکی و فنوتیپی را برمی انگیزد که مشخصه EMT جزئی یا کامل نیست. مطالعات اخیر ما نشان داد که گلوکز با تنظیم تغییرات در بیان پروتئین (ECAD، NCAD، -catenin) و اتصال محکم (ZO-1) باعث ایجاد تغییرات در TGF 1 در جداسازی قطعات چسبنده و مجتمع اتصال محکم می شود. علاوه بر این، تجویز در شرایط آزمایشگاهی ATP غیر قابل هیدرولیز، بیان E-cadherin را در پروگزیمال کاهش داد.کلیهسلول‌هایی که از دست دادن آنها با کاهش نیروهای بستن بین سلولی، کاهش رویدادهای پارگی تتر و بازسازی اسکلت سلولی همراه بود [51]. با واسطه P2X7R، اثرات در مدل ناهمگن Cx43 plus /- UUO معکوس شد [12]. بر اساس این یافته‌ها، اثربخشی دانگاپتید بر نقش محافظتی برای مسدود کردن انتشار ATP با واسطه همی کانال در جلوگیری از تغییر بیان اپیتلیال کلیدی (ECAD، -catenin، ZO-1، کلودین 2) و مزانشیمی (NCAD، ویمنتین) تاکید می‌کند. پروتئین هایی که پیامدهای آن از نظر درمانی اهمیت دارد.

سیستانچ درد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

محل اتصال چسبنده هنگامی که دم سیتوپلاسمی E-cadherin به -catenin متصل می شود، جمع می شود و اتصال به شبکه اسکلت سلولی را واسطه می کند و اطمینان می دهد که قطبیت و معماری سلول حفظ می شود [75]. علیرغم نقشی که در حفظ قطبیت سلولی دارد، جداسازی این اتصالات باعث آزادسازی -کاتنین به داخل سیتوزول می‌شود، که وقتی توسط پروتئین‌های Wnt یا سایر تنظیم‌کننده‌های بالادستی مانند کیناز متصل به اینتگرین (ILK) فعال می‌شود، می‌تواند به هسته منتقل شود. و اثرات اختصاصی سلول را تنظیم می کند. کیناز مرتبط با اینتگرین یک سرین/ترئونین-پروتئین کیناز درون سلولی است که نقش اساسی در تنظیم چسبندگی سلولی، بقا، تکثیر و رسوب ماتریکس خارج سلولی (ECM) دارد [76]. نکته مهم این است که مهار ILK کاهش می یابدکلیهفیبروز در مدل های متعدد CKD [77]. در مطالعه حاضر، افزایش‌های ناشی از TGF در بیان ILK1 تا حدی زمانی که سلول‌ها با دانگاپتید انکوبه شدند بازسازی شد، اثری که به موازات کاهش بیان -catenin و پروتئین‌های مرتبط با ECM بود. جالب توجه است، در حالی که دانگاپتید نتوانست به طور قابل توجهی افزایش 1-القای TGF در بیان -catenin را تغییر دهد، مهم است که توجه داشته باشیم که عدم تغییر در بیان منعکس کننده عدم وجود عملکرد آن در سلول نیست. مسیر Wnt متعارف شامل جابجایی هسته‌ای -catenin و فعال‌سازی ژن‌های هدف از طریق گروهی از فاکتورهای رونویسی به نام فاکتورهای سلول T/فاکتورهای تقویت‌کننده لنفوئیدی (TCF/LEF) است [78]. به طور معمول، سیگنال دهی Wnt/-catenin بی صدا است، اما پس از آسیب در تعدادی از مدل های مختلف مزمن دوباره فعال می شود.بیماری کلیوی[79،80]. علاوه بر این، سیگنال دهی نابجای Wnt/-catenin به شدت با شروع پیری مرتبط است، اثری که به موازات از دست دادن بیان Klotho، یک پروتئین ضد پیری است که به عنوان یک تنظیم کننده منفی مسیر Wnt متعارف عمل می کند [81]، و در مطالعه کنونی در سلول‌های تحت درمان با TGF کاهش یافت (شکل 3). در نتیجه، فعال سازی مداوم سیگنال دهی Wnt/-catenin با پیشرفت فیبروز در هر دو ارتباط دارد.کلیهو سایر انواع بافت [79،82،83]. پس از انتقال به هسته، -catenin با افزایش بیان فاکتور رونویسی SNAIL و ماتریکس متالوپروتئیناز MMP7 همراه است. جالب توجه است که این رویدادها با سرکوب رونویسی و ریزش غشای دامنه خارج سلولی E-cadherin همراه است، که مورد دوم شاهد افزایش مخزن سیتوپلاسمی کاتنین آزاد است [84]. بر این اساس، سیگنالینگ Wnt یک فعال کننده کلیدی EMT در شرایط آسیب است [85]. علاوه بر این، با شواهدی مبنی بر اینکه سیگنال دهی Wnt/-catenin بیان ژن های متعددی از جمله فیبرونکتین، FSP1، Snail1، MMP7 و cyclin D1 را ترویج می کند، تعجب آور نیست که تضعیف این آبشار سیگنالینگ با بهبود همراه باشد.عملکرد کلیه، EMT را کاهش داد [86] و التهاب [87] و فیبروز را کاهش داد [80،88]. در نتیجه، می‌تواند تا حدی دلیل افزایش بیان و ترشح پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی (شکل 5)، سیتوکین‌های پیش التهابی و کموکاین‌های مشاهده‌شده در این مطالعه (شکل‌های 6 و 7) ناشی از TGF باشد (شکل‌های 6 و 7). افزایش رسوب ECM و ترشح مولکول های پیش التهابی از نشانه های فیبروز توبولو بینابینی با انواع مختلف سلول، از جملهکلیهسلول های اپیتلیال لوله ای شناخته شده به ترشح تعداد زیادی از عوامل که در مجموع به عنوان فنوتیپ ترشحی مرتبط با CKD (CASP) تعریف می شوند. این CASP که توسط مولکول‌های متعددی از جمله اینترلوکین‌ها، پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی و کموکاین‌ها مشخص می‌شود، شباهت‌های قابل توجهی با فنوتیپ ترشحی مرتبط با پیری (SASP) دارد، با اجزای CASP که به شدت با آسیب‌شناسی فیبروز توبولو بین‌ستشیال مرتبط است [89]. هنگامی که آزاد می شوند، این عوامل پیش التهابی بر روی سلول های سالم همسایه به روش پاراکرین عمل می کنند و در نتیجه باعث پیشرفت فیبروز در CKD می شوند. همانطور که بسیاری از عوامل مرتبط با CASP برای القای فیبروز در بدن شناخته شده استکلیه(به عنوان مثال، TGF، اینترلوکین (IL)-1، و اینترلوکین (IL)-6)، هدف قرار دادن بالادست این واسطه های سیگنالینگ التهابی ممکن است یک استراتژی جایگزین موثر برای درمان CKD باشد. با استفاده از یک آرایه پروفایل پروتئوم، مایع رویی سلول از سلول های تیمار شده با دانگپتید ± TGF 1 بر روی یک غشای سلولی پیش جذب شده با آنتی بادی های ایجاد شده علیه پروتئین های التهابی کلیدی انکوبه شد. همانطور که در شکل های 6 و 7 مشخص شده است، انکوباسیون همزمان سلول ها با TGF 1 و دنگاپتید بیان و ترشح تعدادی از پروتئین های کاندید را که نقش آنها دربیماری کلیویبه عنوان مضر (فاکتور نکروز تومور-آلفا، اینترلوکین 1-آلفا، اینترفرون-گاما) یا محافظ (فاکتور رشد هپاتوسیت) به خوبی ثابت شده است. علاوه بر این، در بیماری مزمن کلیه، کموکاین‌های محلول، مولکول‌های چسبندگی و فاکتورهای رشد، سلول‌های ایمنی نفوذی و فیبروبلاست‌های ساکن را برای واسطه‌گری التهاب و فیبروز در مصدوم جذب و فعال می‌کنند.کلیه. داده‌های آرایه‌ای ما تأیید می‌کند که تعدیل Cx43 و مسدود کردن آزادسازی ATP با واسطه نیم‌کانالی در سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای، به طور جزئی یا کامل، ترشح بسیاری از واسطه‌های التهابی، از جمله کموکاین‌ها، پروتئین شیمی‌جذب مونوسیتی (MCP1) و تنظیم‌شده در فعال‌سازی، T طبیعی را خنثی می‌کند. بیان و ترشح سلولی (RANTES)، که هر دو در جذب مونوسیت نقش دارند. هم در انسان و هم در تجربی ارتقا یافته استبیماری های کلیویترشح MCP1 توسط اینترلوکین-1، فاکتور نکروز تومور-آلفا [90] و اینترفرون-گاما [91] تحریک می‌شود، که همگی در مدل ما توسط TGF 1 القا شده‌اند، اما با استفاده همزمان با دنگاپتید مسدود می‌شوند. علاوه بر این، دنگاپتید همچنین برای جلوگیری از ترشح القایی TGF از مولکول چسبندگی سلولی بین سلولی (ICAM1) [92]، فاکتور تحریک کننده کلنی گرانولوسیت-ماکروفاژ (GM-CSF) [93] و پپتید فعال کننده نوتروفیل اپیتلیال مشاهده شد. (ENA78) [94]. در مجموع، اینها با پیشرفت CKD و سایر پروتئین‌های بیماری‌زای کلیدی، از جمله دی پپتیدیل پپتیداز 4 (DPPIV) [95] و فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF) [96] مرتبط شده‌اند و به عنوان اهداف درمانی بالقوه شناسایی شده‌اند. علی‌رغم این مشاهدات، تجزیه و تحلیل آرایه تعدادی از پروتئین‌ها را در 48 ساعت شناسایی کرد، جایی که به نظر می‌رسید تنظیم القای TGF 1- مستقل از انتشار ATP با واسطه نیمه‌کانال باشد. همانطور که با بیان لیگاند FLT3 در لیز سلولی مشهود است، داننگاپتید نتوانست به طور قابل توجهی تغییرات ناشی از TGF 1- را در بیان کل سلول تغییر دهد. لیگاند FLT3 در ابتدا به عنوان یک پروتئین متصل به غشاء سنتز می شود که باید برای تبدیل شدن به یک فاکتور رشد محلول شکافته شود. در سلول‌های تحت درمان با TGF، افزایشی در FLT3L متصل به غشاء در مقایسه با گروه شاهد در لیز سلولی مشاهده شد، پاسخی که زمانی که سلول‌ها با دانگاپتید انکوبه شدند بی‌تأثیر بود. اگرچه اطلاعات کمی در مورد آنزیم درگیر در شکاف پروتئولیتیک و آزادسازی FLT3L وجود دارد، مطالعه ای توسط Horiuchi و همکارانش. نشان داد که ریزش FLT3L و آزاد شدن از غشاء وابسته به متالوپروتئاز است و این اثر در فیبروبلاست ها به آنزیم تبدیل کننده TNF (TACE) وابسته است [97]. در حالی که ما فقط می‌توانیم حدس بزنیم، ممکن است مسدود کردن انتشار ATP با واسطه Cx، فعالیت پروتئین(های) مورد نیاز برای ریزش غشای FLT3 و بنابراین در غیاب آزادسازی FLT3L، سطح FLT3L در مایع رویی را کاهش دهد. در سلول های تیمار شده با TGF 1 به علاوه دانگاپتید در مقایسه با گروه شاهد تحت تیمار TGF 1- به طور قابل توجهی کمتر هستند. جالب توجه است، در حالی که به نظر نمی‌رسد دانگاپتید افزایش القای TGF در لیز سلولی FLT3L را معکوس کند، اما تأثیری بر شکل ترشح شده پروتئین دارد.

گیرنده محلول برای محصولات نهایی گلیکاسیون پیشرفته (RAGE) یک نشانگر زیستی بالقوه التهاب و استرس اکسیداتیو است [98]. این به عنوان یک گیرنده فریب عمل می کند که از اتصال محصولات نهایی گلیکاسیون پیشرفته به RAGE و اثرات مضر مرتبط با RAGE به غشاء جلوگیری می کند. در مطالعه حاضر، ما افزایش 70 درصدی در ترشح sRAGE با TGF 1 مشاهده کردیم، اثری که توسط دنگاپتید به کنترل بازگردانده شد. sRAGE عملکردی است و قادر به القای اثر در هنگام ترشح است. پتانسیل دانگاپتید برای نفی قابل توجهی این ترشح از علایق درمانی واضحی است. جالب توجه است، با این حال، ما افزایش در lysate RAGE در 48 ساعت با TGF 1 ± danegaptide مشاهده نشد. در حالی که این آزمایش ها در سلول های لوله پروگزیمال اولیه انسان انجام شده است، محدودیت های مدل ما ممکن است اثرات وابسته به سلول، زمان و غلظت داشته باشد. در نتیجه، در حالی که درک بهتری از مکانیسم عمل دانگاپتید مورد نیاز است، یافته‌های این مطالعه شواهد اولیه مهمی در مورد مزایای استفاده از دنگاپتید برای نفی تغییرات ناشی از TGF در نشانگرهای التهاب و آسیب لوله‌ای از طریق مسدود کردن انتشار ATP با واسطه نیم کانال ما قبول می کنیم که داده های آزمایشگاهی ما یک مدل حداقلی از رویدادهای چند عاملی که منجر به فیبروز توبولو بینابینی می شود ارائه می دهد و توصیه می کنیم در ترجمه این یافته های جدید به وضعیت in vivo احتیاط کنیم، به ویژه در جایی که مطالعات روی گونه های دیگر و مدل های آسیب اثرات متغیر را نشان داده است. [41،44،46-49]. اکنون مطالعات بیشتری برای تعیین گزینش پذیری این نیم کانال ها و توانایی دارو در مدل های بالینی آسیب مزمن، قبل از آزمایش اثربخشی در آزمایشات بالینی انسانی مورد نیاز است.

4. مواد و روش ها

4.1. مواد

انسان کلونالکلیه2 سلول اپیتلیال (HK2) و سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال انسانی اولیه (hPTECs) از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (ATCC) (استانداردهای LGC) خریداری شدند. منابع کشت بافت از Invitrogen (Paisley، انگلستان) خریداری شد. غشای Immobilon-FL PVDF از Millipore (واتفورد، انگلستان) بود و بافر مسدود کننده Odyssey و آنتی بادی های فلورسنت FL ثانویه از LI-COR (کمبریج، انگلستان) خریداری شدند. آنتی بادی برای E-cadherin، N-cadherin، ILK1، MMP-3، -catenin، vimentin و ZO-1 از Cell Signaling Technologies (Hertfordshire، UK)، در حالی که claudin{10}}، آنتی بادی های لامینین، کلاژن I و کلاژن IV از ABCAM (کمبریج، انگلستان) به دست آمدند. آنتی بادی فیبرونکتین از سانتا کروز (سانتا کروز، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. hTGF 1 نوترکیب از سیگما (Poole، UK) و سایر مواد شیمیایی عمومی به دست آمد. Danegaptide توسط Zealand Pharmaceuticals ارائه شده است. بیوسنسورهای ATP از شرکت Sarissa Biomedical Ltd. (کاونتری، انگلستان) و ظروف آرد از WPI (Hertfordshire، UK) بودند. فیلترهای Transwell از Corning (ناتینگهام شایر، انگلستان) خریداری شد. کیت آرایه سیتوکین انسانی Proteome Profiler از R&D Systems (آکسفوردشایر، انگلستان) بود.

4.2. فرهنگ بافت

سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال انسانی اولیه (hPTECs) در یک نگهداری شدندکلیهمحیط پایه سلول های اپیتلیال از ATCC، تکمیل شده با 0.5 درصد سرم جنین گوساله (FCS wt/vol، تری یدوتیرونین (10 نانومولار)، rhEGF (10 نانوگرم در میلی لیتر)، هیدروکورتیزون همی سوکسینات (100 نانوگرم در میلی لیتر)، rhInsulin (5 میکروگرم در میلی لیتر)، اپی نفرین (1 میکرومولار)، ترانسفرین (5 میکروگرم در میلی لیتر) و ال-آلانیل-گلوتامین (2.4 میلی مولار)، در یک اتمسفر مرطوب در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 درصد CO2. سلول ها یک شبه تحت تأثیر قرار گرفتند. گرسنگی سرم قبل از درمانکلیه2 سلول (HK2) (معابر 18 تا 30) در محیط کشت دولبکو اصلاح شده عقاب (DMEM)/Hams F12، مکمل با 10 درصد وزنی بر حجم FCS، گلوتامین (2 میلی مول در لیتر) و فاکتور رشد اپیتلیال (EGF) رشد کردند. 5 نانوگرم در میلی لیتر)، در اتمسفر مرطوب در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 درصد CO2. سلول‌های HK2 با انتقال ژن‌های E6/E7 ویروس پاپیلومای انسانی 16 (HPV{13}}) جاودانه شدند و عاری از مایکوپلاسما بودند. در تمام آزمایش‌ها، سلول‌ها در DMEM/F12 با گلوکز کم (5 میلی‌مول در لیتر) به مدت 48 ساعت کاشته شدند و سپس قبل از درمان یک شبه در سرم گرسنگی قرار گرفتند.

4.3. سنجش MTT سنجش 3-(4،{4}}دی متیل تیازول-2-یل)-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) همانطور که قبلاً توضیح داده شد، برای ارزیابی انجام شد. اثرات سیتوتوکسیک دانگاپتید بر تکثیر سلولی [99]. سلول‌های HK2 در صفحات چاهی کاشته شدند و در DMEM/F12 کم گلوکز (5 میلی‌مولار) به مدت 48 ساعت، قبل از گرسنگی سرم یک شبه کشت داده شدند، و سپس به مدت 48 ساعت با TGF 1 (10 نانوگرم در میلی‌لیتر) تحریک شدند. ) ± دانگاپتید (50-1000 نانومولار). اندازه گیری رنگ سنجی تولید فرمازان با تعداد سلول های زنده مطابقت دارد.

4.4. سنجش لاکتات دهیدروژنازانتشار لاکتات دهیدروژناز (LDH) در محیط در نتیجه آسیب غشای پلاسمایی معمولاً برای ارزیابی مرگ سلولی یا سمیت سلولی استفاده می شود. سلول‌های HK2 در {1}صفحه‌های چاهی کاشته شدند و در DMEM/F12 کم گلوکز (5 میلی‌مولار) به مدت 48 ساعت قبل از گرسنگی سرم یک شبه کشت داده شدند. سپس سلول ها به مدت 48 ساعت با TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر) ± دنگاپتید (50-1000 نانومولار) تحریک شدند. کیت سنجش سمیت سلولی LDH II (Abcam) برای تعیین کمیت LDH مطابق دستورالعمل سازنده استفاده شد.

4.5. سنجش کریستال ویولتاین روش ساده برای اندازه گیری تراکم نسبی سلول های چسبیده به ظروف چند چاهی استفاده می شود. کریستال بنفش DNA را رنگ آمیزی می کند و پس از حل شدن می توان آن را با رنگ سنجی کمی تعیین کرد. سلول‌های HK2 در 12-صفحه‌های چاهی کاشته شدند و در DMEM/F12 کم گلوکز (5 میلی‌مولار) به مدت 48 ساعت، قبل از گرسنگی سرم یک شبه کشت داده شدند و سپس به مدت 48 ساعت با TGF 1 (1{16) تحریک شدند. }} ng/ml) ± دنگاپتید (50-1000 نانومولار). این سنجش قبلاً توضیح داده شده است [99]. به طور خلاصه، سلول ها با استفاده از پارافورمالدئید به مدت 10 دقیقه تثبیت شدند، با سالین بافر فسفات (PBS) شسته شدند و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق (RT) در محلول کریستال بنفش 0.1 درصد انکوبه شدند. پس از چندین بار شستشو، لکه با استفاده از 1 درصد SDS حل شد و میزان جذب توسط دستگاه پلیت خوان اندازه گیری شد.

4.6. وسترن بلاتینگتهیه پروتئین سیتوزولی از سلولهای HK2 و hPTECها، جداسازی آنها با الکتروفورز ژل SDS و انتقال آنها به غشاهای Immobilon-FL PVDF قبلا توضیح داده شده است [12]. غشاها با استفاده از بافر مسدودکننده Odyssey (LI-COR) مسدود شدند و سپس یک شبه با آنتی‌بادی‌هایی علیه E-cadherin (1:1000)، N-cadherin (1:1000)، claudin{10}} (1:500)، ZO بررسی شدند. -1 (1:1000)، کلاژن I (1:1000)، کلاژن IV (1:2000)، فیبرونکتین (1:2000)، لامینین (1:500)، ILK1 (1:500)، -کاتنین (1:2000)، ویمنتین (1:500) و MMP3 (1:500). باندها با استفاده از OdysseyFC تجسم شدند و با استفاده از ImageStudio (v5.2، LI-COR، لینکلن، NE، ایالات متحده آمریکا) نیمه کمی شدند.

4.7. مقاومت ترانس اپیتلیالسلول‌های HK2 (6 × 104 سلول در میلی‌لیتر) روی فیلترهای Transwell (قطر 12 میلی‌متر، اندازه منافذ 0.4 میکرومولار؛ کورنینگ، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) کاشته شدند و در DMEM/F12 کم گلوکز (5 میلی‌مولار) کشت داده شدند. 48 ساعت، یک شبه از گرسنگی سرم گذشت و متعاقباً با TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر) ± دنگاپتید (100 نانومولار) به مدت 48 ساعت تحریک شد. مقاومت الکتریکی transepithelial (TER) با استفاده از دستگاه EVOM (World Precision Instruments، Sarasota، FL، USA) اندازه‌گیری شد. یک مقاومت خالی اندازه گیری شده از یک چاه با محیط به تنهایی از هر قرائت مقاومت کم شد.

4.8. مطالعات جذب رنگسلول های HK2 و hPTEC ها روی فلورودیشن ها (قطر 22 میلی متر) کاشته شدند و در DMEM/F12 کم گلوکز (5 میلی مول در لیتر) به مدت 48 ساعت کشت داده شدند. به دنبال گرسنگی شبانه سرم، سلول ها با TGF 1 (1{12}} نانوگرم در میلی لیتر) ± دانگاپتید (5{17}}-100 نانومولار) به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. برای مراحل بعدی، یک محلول نمک متعادل (BSS، pH 7.0) متشکل از NaCl (137 میلی‌مولار)، KCl (5.4 میلی‌مولار)، MgSO4 (0.8 میلی‌مولار)، Na2HPO4 (0.3 میلی‌مولار)، KH2PO4 (0.4 میلی‌مولار)، NaHCO3 (4.2 میلی‌مولار) از HEPES (10 میلی مولار) و گلوکز (5 میلی مولار) استفاده شد. برای القای جذب رنگ، سلول ها به مدت 10 دقیقه در معرض Ca2 به اضافه BSS بدون Ca2 (صفر CaCl2 به اضافه EGTA (1 میلی مولار)) به اضافه کربوکسی فلورسئین (200 میکرومولار) قرار گرفتند و به دنبال آن یک دوره 5 دقیقه در BSS حاوی Ca2 به اضافه (1.3 میلی مولار) قرار گرفتند. به علاوه کربوکسی فلورسئین (200 میکرومولار). سپس ظروف با BSS حاوی Ca2 پلاس (12 میلی لیتر) شسته شدند. تصاویر با دوربین Cool Snap HQ CCD (Roper Scientific، گوتینگن، آلمان) و نرم افزار Metamorph (Universal Imaging Corp., Marlow, Bucks, UK) به دست آمد. ImageJ برای تعیین کمیت جذب رنگ استفاده شد، جایی که یک ناحیه مورد نظر (ROI) در اطراف هر سلول ترسیم شد (تقریباً 10-15 سلول در ظرف) و میانگین شدت پیکسل اندازه‌گیری شد. مقدار فلورسانس پس زمینه از هر ROI کم شد.

سیستانچ دیالیز کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

4.9. ATP Biosensingحسگرهای زیستی ATP (Sarisa Biomedical، Coventry، UK) در یک تنظیم آمپرومتریک با ثبت دوگانه همزمان، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، استفاده شد [12]. یک بیوسنسور تهی برای محاسبه مصنوعات غیر اختصاصی الکتریکی استفاده شد و از ردیابی ATP کسر شد. گلیسرول (2 میلی‌مولار) در تمام محلول‌های ضبط برای فعال کردن تشخیص ATP گنجانده شد. سلول‌های HK2 روی ورقه‌های شیشه‌ای (قطر 10 میلی‌متر) در DMEM/F12 با گلوکز کم (5 میلی‌مول در لیتر) به مدت 48 ساعت قبل از گرسنگی سرم یک شبه کاشته شدند. سپس سلول ها با TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر) ± دنگاپتید (100 نانومولار) به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. ورقه های پوششی به محفظه ای حاوی Ca2 پلاس حاوی BSS که با سرعت 6 میلی لیتر در دقیقه (37 درجه سانتیگراد) پرفیوژن شده بود منتقل شدند و به مدت 10 دقیقه برای سازگاری باقی ماندند. ATP و بیوسنسورهای پوچ خم شده و پایین آمدند تا الکترود به موازات تک لایه سلولی قرار گیرد. هنگامی که یک خط پایه پایدار رخ داد، پرفیوژن Ca2 به علاوه BSS بدون باز شدن نیم کانال را تحریک کرد. پس از انتشار ATP، BSS حاوی Ca2 به علاوه برای بستن نیم کانال ها و به دنبال آن یک محلول کالیبراسیون ATP (10 میلی مولار) استفاده شد. ضبط ها با فرکانس 4 هرتز با رابط Micro CED (Mark2) با استفاده از نرم افزار Spike (v8.03) به دست آمد.

4.10. آرایه آنتی بادی التهاب،یک آرایه آنتی بادی التهابی (RnD Systems) تنظیم القا شده از TGF 31 نشانگر التهابی را 1- ارزیابی کرد. آرایه با پیروی از دستورالعمل های سازنده انجام شد. به طور خلاصه، hPTEC ها در DMEM/F12 با گلوکز کم (5 میلی مولار) به مدت 48 ساعت، قبل از گرسنگی سرم یک شبه کشت داده شدند، و سپس به مدت 48 ساعت با TGF 1 (10 نانوگرم در میلی لیتر) ± داننگاپتید (100 نانومولار) تحریک شدند. لیزات سلولی و مایع رویی جمع‌آوری و در طول شب با غشاهای از پیش مسدود شده که در دو نسخه با آنتی‌بادی‌های جذب لکه‌دار شدند، انکوبه شدند. یک مخلوط کوکتل فلورسنت استرپتاویدین/بیوتینیله 800 CW برای تجسم کمپلکس‌های پروتئین بیان/آنتی‌بادی با استفاده از Odyssey FC و نیمه کمی‌سازی با استفاده از ImageStudio (v5.2، LI-COR) استفاده شد.

4.11. PCR کمی در زمان واقعیRNA با استفاده از کیت کوچک RNeasy (QIAGEN) استخراج و رونویسی معکوس (Invitrogen) انجام شد. Real-time PCR (SYBR GreenER، Invitrogen) با استفاده از ابزار StepOne Plus (Applied Biosystems Inc، Foster City، CA، USA) انجام شد. بیان cDNA با مقایسه با منحنی استاندارد cDNA رقیق شده سریالی به دست آمد. The following primers were used: p16 (forward: CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA, reverse: GGTCG GCGCAGTTGGGCTCC), p21 (forward: AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG, reverse: TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG), cyclin D1 (forward: TCTACACCGACAACTCCATCCG, reverse: TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG), Klotho (forward: CCTCCTTTACCTGAAAATCAGCC, reverse CAGGTCGGTAAACTGAGACAGAG) و GAPDH (به جلو: GTCTC CTCTGACTTCAACAGCG، معکوس: ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA). تجزیه و تحلیل منحنی مذاب ویژگی پرایمر را تأیید کرد و آلودگی بالقوه را بررسی کرد.

4.12. تحلیل و بررسیبرای همه آزمایش‌ها، کنترل کم گلوکز (5 میلی‌مولار) به 100 درصد نرمال شد و سایر شرایط با کنترل‌های مربوطه مقایسه شد. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آزمون ANOVA یک طرفه با پس آزمون مقایسه چندگانه توکی انجام شد. داده ها به صورت میانگین ± SEM بیان می شوند که n نشان دهنده تعداد نمونه است. مقدار p کمتر یا مساوی 0.05 معنی‌دار آماری است.