جداسازی هدایت شده با حذف دی گلیکوزیدهای جدید جایگزین شده با فنیل پروپانوئید از سیستانچ سالسا و فعالیت بازدارنده آنها بر تولید NO در ماکروفاژها

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای بیشتر

خلاصه:

جداسازی امکان شناسایی سریع ترکیبات شناخته شده و ناشناخته در عصاره های گیاهی را فراهم می کند. در این مطالعه، ما حذف بر اساس کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی (LC-MS) با استفاده از داده‌های ESI به علاوه QTOF-MS برای تجزیه و تحلیلگلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید، اجزای اصلی فعال Cistanche salsa (CA Mey.) Beck. با استفاده از TOF-MS به تنهایی، زیرساخت های این ترکیبات را می توان به طور واضح بر اساس الگوهای تکه تکه شدن مشخصه تولیدات مختلف تایید کرد. پروفیل بر اساس HPLC-MS از C. salsa نیز امکان تشخیص موارد جدید را فراهم کردفنیل پروپانوئید-جایگزین شدگلیکوزیدها ازاین گیاه از آنها، پنج فنیل پروپانوئید جدید جایگزین شدنددی گلیکوزیدهاسیستانسالسایدهای A-E (5، 6، 12، 17 و 18)، جداسازی شدند. ساختار آنها از طریق روش های طیف سنجی از جمله آنالیز NMRand MS مشخص شد. تمام جدایه ها برای فعالیت بازدارنده خود در برابر تولید NO در سلول های RAW 264.7 تحریک شده توسط LPS مورد آزمایش قرار گرفتند. از ترکیبات مورد آزمایش، ترکیبات 5، 11، 13 و 18 فعالیت بازدارندگی متوسطی بر روی NO سنتاز القایی نشان دادند. ترکیبات 11، 13 و 18 نیز فسفوریلاسیون NF-kB را در ماکروفاژها مهار کردند. هیچ یک از ترکیبات قابل توجهی نشان داده نشدسمیت سلولی. 

کلید واژه ها:تکثیر دی گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید؛ سالسا سیستانچ; ضد التهاب

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا کلیک کنید

مقدمه

Cistanche salsa (CA Mey.) Beck، متعلق به خانواده Orobanchaceae، یک گیاه انگلی است که تغذیه خود را از ریشه Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) و سایر گیاهان بیابانی تامین می کند [1]. این گیاه در طب سنتی برای درمان نوراستنی، اختلالات جنسی و نارسایی کلیه مورد استفاده قرار گرفته است [2،3]. در مطالعات فیتوشیمیایی قبلی، گزارش شده است که کل گیاه C. salsa حاوی انواع مختلفی از ترکیبات از جمله گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید و گلیکوزیدهای ایریدوئید است [4-7]. گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید، مانند اکتئوزید و اکیناکوزید، اجزای اصلی فعال گیاه هستند [8]. عصاره C. salsa خواص مفیدی از جمله فعالیت های تعدیل کننده ایمنی، ضد سرطانی و ضد التهابی را نشان داد [9،10]. جداسازی فرآیندی است که در آن مخلوط های نمونه برای تمایز اجزای ناشناخته از ترکیبات شناخته شده آزمایش می شوند. استراتژی‌های تکثیر بر اساس تکنیک‌های تحلیلی و جستجوی پایگاه داده برای شناسایی متابولیت‌های ثانویه در مراحل اولیه تحقیقات فیتوشیمیایی است [11]. از تکنیک‌های تحلیلی، ESI-QTOF-MS (یونیزاسیون الکتروسپری-چهار قطبی-زمان طیف‌سنجی جرمی پرواز) می‌تواند اطلاعات ارزشمندی در مورد ساختارهای شیمیایی متابولیت‌های ثانویه ارائه دهد. نشان داده شده است که تکه تکه سازی هدایت شونده بر پایه LC-MS استخراج و خالص سازی متابولیت های هدف را از عصاره خام گیاهان با کارایی بالا امکان پذیر می کند [12-15]. این مطالعه حذف تکثیر مبتنی بر LC-MS را با استفاده از داده های ESI به علاوه TOF-MS برای تجزیه و تحلیل دی گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید، اجزای اصلی فعال C. salsa انجام داد. داده‌های TOF-MS می‌تواند زیرساخت‌های این ترکیبات را بر اساس الگوهای تکه تکه شدن مشخصه یون‌های محصول مختلف نشان دهد. بر اساس این replication، پروفایل LC-MS از بخش اتیل استات (EtOAc) و بخش محلول در آب تجزیه و تحلیل شد. بخش EtOAc برای جداسازی بیشتر تحت استراتژی replication dereplication قرار گرفت که منجر به جداسازی پنج دی گلیکوزید جدید جایگزین شده با فنیل پروپانوئید و 13 ترکیب شناخته شده شد (شکل 1). تایید شد که ساختارهای آزمایشی پیش‌بینی‌شده دی‌گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید به درستی با ساختارهای واقعی خود مطابقت داشتند. علاوه بر این، فعالیت های ضد التهابی جدایه ها مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج و بحث

دی گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید جدا شده از C. salsa معمولاً ساختارهایی مبتنی بر گلیکوزیدهای دی ساکارید دارند که از یک گلوکز و یک رامنوز با پیوند Rha (1 → 3) Glc و یک جایگزین سیناموئیل مانند اسید کوماریک (Cou)، کافئیک تشکیل شده است. اسید (Caf) و اسید فرولوئیل (Fer)، در موقعیت C-4 یا C-6 گلوکز. آگلیکون معمولاً در موقعیت C{5}} گلوکز متصل می شود. ساختارهای دی گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید با یک گروه استیل در C{7}} گلوکز اغلب گزارش شده است [6،12،16]. برای انجام تکثیر، الگوهای تکه تکه شدن MS این ترکیبات با حالت مثبت ESI-QTOF-MS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. در طیف های MS، همه دی گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید پیک های یون اضافی را در [M به علاوه NH4] به علاوه، [M به علاوه K] به علاوه و [M به علاوه Na] به علاوه تولید کردند که وزن مولکولی و فرمول را ارائه می کرد. الگوی یون های قطعه را می توان با از دست دادن متوالی باقیمانده های آگلیکون و گلیکوزید ([M به علاوه H - آگلیکون] به علاوه، [M به علاوه H - آگلیکون - Rha] به علاوه و [M به علاوه H - آگلیکون - شکل 1) پیدا کرد. ساختار ترکیبات 1-18. 2. نتایج و بحث دی گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید جدا شده از C. salsa معمولاً دارای ساختارهایی مبتنی بر گلیکوزیدهای دی ساکارید هستند که از یک گلوکز و یک رامنوز با پیوند Rha (1→3) Glc و یک جایگزین سینامویل تشکیل شده است. مانند اسید کوماریک (Cou)، اسید کافئیک (Caf) و اسید فرولوئیل (Fer)، در موقعیت C{22}} یا C-6 گلوکز. آگلیکون معمولاً در C{24 متصل می‌شود. }} موقعیت گلوکز. ساختارهای دی گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید با یک گروه استیل در C{26}} گلوکز اغلب گزارش شده است [6،12،16]. برای انجام تکثیر، الگوهای تکه تکه شدن MS این ترکیبات در طيف MS، تمام دي گليكوهاي جايگزين شده با فنيل پروپانوئيد طرف‌ها پیک‌های یون اضافی را در [M به علاوه NH4] به علاوه، [M به علاوه K] به‌علاوه و [M به علاوه Na] به‌علاوه تولید کردند که وزن مولکولی و فرمول را ارائه می‌کرد. الگوی یون های قطعه را می توان با از دست دادن متوالی آگلیکون و باقیمانده های گلیکوزید ([M به علاوه H - آگلیکون] به علاوه، [M به علاوه H - آگلیکون - Rha] به علاوه و [M به علاوه H - آگلیکون - Rha - Glc (یا استیل) پیدا کرد. -Glc)] plus ) که برای پیش بینی نوع جانشین سیناموئیل و قندها مفید بودند. یون های قطعه در m/z 163 از گروه کافئویل، m/z 147 از گروه کوماروئیل یا m/z 177 از گروه فرولویل، سیگنال مشخصه ای از یک جایگزین سیناموئیل در دی گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید می دهند [4،15] ( شکل 2). تجزیه و تحلیل یون های قطعه اطلاعات مفیدی را برای شناسایی ساختارهای دی گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید ارائه می دهد. با این حال، ایزومرهای آنها را نمی توان تنها با طیف سنجی MS متمایز کرد. برای شناسایی دقیق ساختار کامل آنها، طیف NMR مورد نیاز است.

تمام جدایه ها برای اثرات بازدارندگی آنها بر تولید NO القا شده با LPS در سلول های RAW 264.7 مورد آزمایش قرار گرفتند. دگزامتازون به عنوان کنترل مثبت استفاده شد و IC50 آن 7.{18}} میکرومولار بود. از ترکیبات آزمایش شده، ترکیبات 5 (IC{7}}.7 ± 6.6 μM)، 11 (IC50 37.3 ± 2.2 μM)، 13 (IC50 40).{{2{{ 24}}}} ± 4.0 میکرومولار) و 18 (IC{22}}.9 ± 0.8 میکرومولار) فعالیت مهاری متوسطی را بر روی NO سنتاز القایی نشان دادند، در حالی که سایر ترکیبات در این سنجش غیرفعال بودند (IC50). مقادیر > 100 میکرومولار). برای بررسی اینکه آیا این ترکیبات دارای سمیت سلولی هستند، زنده ماندن سلول با استفاده از روش MTT اندازه‌گیری شد. در نتیجه هیچ یک از آنها سمیت سلولی قابل توجهی نشان ندادند (شکل تکمیلی S{28}}). این چهار ترکیب برای ارزیابی فعالیت مهاری آنها در برابر مسیر NF-kB در سلول‌های RAW 264.7 تحریک‌شده با LPS انتخاب شدند. تحریک سلول های RAW 264.7 با LPS باعث فسفوریلاسیون IκB و NF-κB (P65) پس از 0.5 ساعت انکوباسیون شد. فسفوریلاسیون NF-kB (p65) با پیش تیمار با ترکیبات 11، 13 و 18 به طور قابل توجهی کاهش یافت، همانطور که توسط آنالیز وسترن بلات نشان داده شده است (شکل 5). بنابراین، ترکیبات 11، 13 و 18 ممکن است از طریق مهار NF-kB در ماکروفاژها، اثرات ضد التهابی داشته باشند.

مواد و روش ها

چرخش‌های نوری با یک قطب‌سنج دیجیتال Jasco P{0} (جاسکو، توکیو، ژاپن) اندازه‌گیری شد. طیف‌های UV بر روی یک طیف‌سنج Chirascan به علاوه دایره‌ای دایره‌ای (Chirascan، APL، UK) ثبت شد. طیف IR با استفاده از اسپکتروفتومتر Jasco FT/IR{1}} ثبت شد. طیف سنجی جرمی چهار قطبی یونیزاسیون الکترواسپری با وضوح بالا (HR-ESI-qTOF-MS) بر روی Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS مجهز به سری Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc.) انجام شد. ، پالو آلتو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا)، و ستون مورد استفاده یک ستون Jasco SFCpak Crest C18T{14}} (id150 × 4.6 mm, 5 um) بود. برای جمع آوری داده ها از نرم افزار MassHunter Workstation استفاده شد.

طیف NMR 1D (H و 13C) و 2D ('H-1H COSY، HSQC، HMBC، NOESY) با Jeol LA 300 (Jeol، توکیو، ژاپن)، Bruker AVANCE-400 به دست آمد، طیف‌سنج‌های بروکر AVANCE-500، Bruker AVANCE-600 و Bruker AVANCE 800 همراه با کرایوپروب (بروکر، اتلینگن، آلمان). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA, USA) به عنوان حلال NMR و پیک های مرجع (6H 2.50 و δc 39.5) استفاده شد. کروماتوگرافی ستونی (CC) با استفاده از Sephadex LH{16}}({17}} um; Pharmacia, Uppsala, Sweden) یا Kieselgel 60 silicagel (40-63 um,230-400 mesh, Art) انجام شد 9385؛ مرک، دارمشتات، آلمان). کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) بر روی صفحات از پیش پوشش داده شده Kieselgel 60 سیلیکاژل F254 (Art.5715;Merck) انجام شد. لکه های روی TLC با استفاده از UVlamp در 254 نانومتر و 365 نانومتر (VL{29}5) شناسایی شد. /254؛ ویلبر لورمات، تورسی، فرانسه). کروماتوگرافی مایع با فشار متوسط ​​(MPLC) بر روی یک ستون RediSep 120 گرمی سیلیکا فلاش (lsco، لینکلن، NE، ایالات متحده آمریکا) و سیلیکاژل Kiesegel 60 ({34}} um،230-400 مش، Art.9385; Merck انجام شد. )با استفاده از یک همراه Combiflash (Isco). سیستم کروماتوگرافی مایع با فشار بالا (HPLC) یک HPLC گیلسون مجهز به پمپ Gilson 321 و آشکارساز UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, USA) بود که با استفاده از ستون‌های ODS نیمه آماده (Luna 5 um C18 (2） 100) بود. Å، شناسه ۲۵۰×۱۰ میلی‌متر، ۵ میکرومتر، Phenomenex Inc، تورنس، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا؛ Hypersil GOLDrM aQ 175A,id250×10mm,5 um, Thermo ScientificTM, Hennigsdorf,Germany;Inno C18column 120 A,id250× 10mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korecal RP- analyt. سیستم HPLC یک سیستم اتحاد Waters 2695 با آشکارساز 996 Photodiode Array (PDA) بود (Waters Corp, Milford, MA, USA) و ستون مورد استفاده یک ستون HypersilTM BDS C18 (130 A, id150×4.6 میلی متر, 5 میکرومتر, ترمو) بود. ScientificTM）. اسید فرمیک از Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (سئول، کره) خریداری شد. حلال های درجه HPLC از Fisher Scientific Korea Ltd. (سئول، کره) خریداری شد. حلال های HSOA، Na، CO و درجه یک برای استخراج، تفکیک و جداسازی از شرکت Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (سئول، کره) خریداری شد. L- و D-سیستئین متیل استر هیدروکلراید و o-tolylisothiocvanate از صنعت شیمیایی توکیو (توکیو، ژاپن) خریداری شد.

نتیجه گیری

در این مطالعه، ما ساختارهای پنج دی‌گلیکوزید جدید جایگزین شده با فنیل پروپانوئید، به نام‌های سیستانسالید AE (5،6، 12، 17 و 18) را جداسازی و روشن کردیم، علاوه بر جداسازی و شناسایی 13 ترکیب شناخته شده، با استفاده از استراتژی حذف تکثیر. ترکیبات شناخته شده به صورت لیپدوزید AI(1) [21]، 2'-acetylakteoside (2) [22]، ایزوسیستانوزید C(3) [15]، اسمانتوزید B (4) [21]، اپی مریدینوزید A(7) تعیین شد. [15]، سیستانوزید D(8) [23]، سالساید B(9) [6l، توبولوزید E (10) [16] سیستانوزید M(11) [15]، ایزومارتینوزید(13) [24]، سالسااید C(14 )[6]، جیونوسید C(15) [25] و سالسااید F (16) [6]. ساختار آنها از طریق تجزیه و تحلیل داده های طیف سنجی گسترده و با مقایسه با داده های گزارش شده در ادبیات ایجاد شد. تایید شد که ساختارهای آزمایشی پیش‌بینی‌شده دی‌گلیکوزیدهای جایگزین شده با فنیل پروپانوئید به درستی با ساختارهای واقعی خود مطابقت داشتند.

In NO inhibitory assay, compounds 5 （IC50 42.7±6.6μM）, 11（IC50 37.3±2.2μM）,13 （IC{11}}.{12}} ±4.0 میکرومولار) و 18(ICs0 27.9±0.8uM فعالیت های بازدارندگی متوسطی را نشان دادند. از بین این ترکیبات، ترکیبات 11،13 و 18 برای مهار فسفوریلاسیون NF-kB در ماکروفاژها یافت شد و در نتیجه ممکن است یک فعالیت ضد التهابی اعمال کند که باید در آزمایش‌های بعدی ثابت شود.

استخراج از: https://creativecommons.org/licenses/by/4.{1}}/ ("مجوز"). با وجود شرایط و ضوابط ProQuest، می توانید از این محتوا مطابق با شرایط مجوز استفاده کنید.