مدل سازی بیماری با ارگانوئیدهای کلیه

خلاصه:بیماری های کلیویاغلب فاقد درمان های بهینه است که باعث مرگ میلیون ها نفر در سال می شود. بنابراین، توسعه سیستم های مدل مناسب برای مطالعهبیماری کلیه انساناز اهمیت بالایی برخوردار است. برخی از امیدوارکننده‌ترین مدل‌های کلیه انسان، ارگانوئیدها یا مجموعه‌های بافتی شبیه اندام کوچک هستند که از سلول‌های بنیادی پرتوان القا شده توسط انسان (hiPSCs) مشتق شده‌اند. با این حال، آنها بیشتر شبیه سه ماهه اول هستندکلیه جنیننسبت به یک کلیه بالغ بنابراین، استراتژی های جدیدی برای پیشبرد بلوغ آنها مورد نیاز است. آن‌ها پتانسیل زیادی برای مدل‌سازی بیماری و در نهایت درمان کمکی دارند، اگر بتوانند به مرحله بلوغ برسندکلیه بزرگسالان. در این بررسی، وضعیت فعلی ارگانوئیدهای کلیه را از نظر شباهت آنها به کلیه انسان و استفاده به عنوان یک سیستم مدل سازی بیماری تا کنون مورد بحث قرار خواهیم داد. سپس در مورد مسیرهای بالقوه برای پیشبرد بحث خواهیم کردبلوغ کلیهارگانوئیدها برای مطابقت با کلیه بزرگسالان برای مدل‌سازی دقیق‌تر بیماری انسان.

کلید واژه ها: ارگانوئیدها;کلیه; توسعه؛ متانفروس; حالب; لوله تراشه؛ نفرولوژی؛ مدل سازی بیماری

برای دریافت CISTANCHE برای درمان CKD اینجا را کلیک کنید

1. معرفی

تا همین اواخر، بیماری های انسانی به دو روش زیر مدل سازی می شدند: با حیوانات یا با کشت سلولی دو بعدی. مدل‌های حیوانی امکان مطالعه مسیرهای بیماری و توسعه دارو در کل موجودات را فراهم می‌کنند، اما ساختار ژنتیکی و تشریحی انسان را در نظر نمی‌گیرند. از سوی دیگر، کشت سلول های انسانی به دانشمندان اجازه می دهد تا مکانیسم های بیماری خاص انسان را مطالعه کنند و درمان ها را تا عمق مولکولی بسیار دقیق و دقیق ارزیابی کنند. با این حال، کشت سلولی ساختار سه بعدی و فیزیولوژی پیچیده یک اندام را خلاصه نمی کند.

ارگانوئیدهای انسانی نسخه های ساده شده اندام های انسان با میکروآناتومی سه بعدی واقعی و عملکردهای سطح اندام هستند (به عنوان مثال، تولید اشک در ارگانوئیدهای لاکتیک و رشد مو در ارگانوئیدهای پوست) [1،2]. از طریق فرآیندهای خودسازماندهی، آنها در شرایط آزمایشگاهی از سلول های بافتی یا سلول های بنیادی پرتوان مشتق می شوند. سلول های بنیادی پرتوان القایی (iPSCs)، که در سال 2008 توسط تاکاهاشی و یاماناکا اختراع شد، محبوب ترین سلول ها برای تشکیل ارگانوئید هستند [3]. این به دلیل چندین مزیت قانع کننده ای است که iPSC ها ارائه می دهند. اولا، آنها یک منبع سلولی تجدید پذیر نامحدود را فراهم می کنند و می توانند به انواع سلول های متعدد متمایز شوند. مهمتر از آن، آنها ترکیب ژنتیکی اساسی بیماران را نشان می دهند. بنابراین، iPSCهای انسانی مشتق شده از بیمار (hiPSCs) ممکن است برای مطالعه بیماری از طریق ارگانوئیدها در سطح فردی مورد استفاده قرار گیرند که امکان پیشرفت در پزشکی شخصی را فراهم می کند. تا به امروز، مدل های ارگانوئیدی از اندام های مختلف انسان، مانند قلب و مغز، برای مطالعه بیماری مورد استفاده قرار گرفته است. برای این بررسی، ما بر روی ارگانوئیدهای کلیه تمرکز خواهیم کرد و در مورد چگونگی استفاده از آنها برای مدل سازی کلیه انسان و بیماری های مرتبط با آن، غربالگری سمیت داروها و شاید مکمل عملکرد کلیه بحث خواهیم کرد.

بیماری کلیوی 10 درصد از جمعیت جهان را تحت تأثیر قرار می دهد [4]. علیرغم شناسایی علت ژنتیکی زمینه ای برای بسیاری از انواع بیماری های کلیوی، هیچ درمان بهینه ای برای مدیریت آنها وجود ندارد. این وضعیت ناگوار منعکس کننده فقدان سیستم های مدل آزمایشگاهی است که بیماری کلیوی انسان را برای توسعه درمانی هدفمند خلاصه می کند. ارگانوئیدهای کلیوی یک پلت فرم تحقیقاتی مبتنی بر انسان، شخصی‌سازی 3-D برای بررسی بیماری‌های کلیوی ژنتیکی، آسیب کلیه، و سمیت دارویی ارائه می‌دهند. یک ارگانوئید کلیه همراه با ظرفیت خود برای خدمت به عنوان یک سیستم مدل سازی، دارای پتانسیل پیشرفت پزشکی پیوند است. بنابراین، برای به حداکثر رساندن پتانسیل آن در هر دو زمینه، ارگانوئید کلیه باید شبیه ساختار و عملکرد کلیه انسان بالغ باشد. در اینجا، وضعیت کنونی ارگانوئید کلیه انسان مشتق از سلول پرتوان، کاربردهای بالقوه آن و زمینه های بهبود را بررسی خواهیم کرد.

2. کلیه انسان در مقابل ارگانوئیدهای کلیه

HiPSCها به عنوان پروکسی برای PSCهای جنینی عمل می کنند. بنابراین، تشکیل ارگانوئید کلیه از hiPSCها مستلزم تکثیر رشد کلیه جنینی انسان است. در زیر، نحوه ایجاد ارگانوئید کلیه را بررسی خواهیم کرد و آن را با کلیه انسان مقایسه خواهیم کرد.

2.1. توسعه کلیه انسان

خون در طول رشد جنینی در سه مرحله مجزا فیلتر می شود. در مرحله اول، ساختاری به نام پرونفروس در جنین یک هفته‌ای انسان ایجاد می‌شود و خون را در ناحیه گردن رحم تا حدود هفته پنجم پردازش می‌کند [5]. در مرحله بعد، مزونفروس ها در ناحیه قفسه سینه جنین تشکیل می شوند و خون را از ابتدای هفته 5 تا حدود هفته 10 رشد جنینی فیلتر می کنند. در حالی که مزونفروس خون را فیلتر می کند، سیستم تصفیه نهایی که در نهایت تبدیل به خون می شودکلیه بزرگسالان، شروع به شکل گیری می کند (شکل 1). در دو قسمت زیر تشکیل می شود: مزانشیم متانفریک و جوانه حالب. مزانشیم متانفریک تمام قسمت های نفرون به جز مجرای جمع کننده را تشکیل می دهد، در حالی که جوانه حالب مجرای جمع کننده را تشکیل می دهد. این ساختارها یک چرخه القایی متقابل را طی می کنند، که در آن مزانشیم متانفریک و جوانه حالب رشد یکدیگر را تحریک کرده و در هم می آمیزند و ساختاری به نام متانفروس را تشکیل می دهند. متانفروهای تازه تشکیل شده خون را از شاخه های ایلیاک به پایین تا ناحیه لگن فیلتر می کنند. در همان زمان، جوانه حالب منشعب می شود و به انشعاب ادامه می دهد تا مجاری جمع آوری زیادی را در کلیه تشکیل دهد [6،7]. متعاقباً، این ساختارهای متانفریک ذوب شده در حین رشد جنین به ناحیه شکم جنین صعود کرده و از آئورت اولیه خون رسانی می کنند. این فرآیندها در شکل 1 خلاصه شده‌اند. توجه به این نکته مهم است که سلول‌های مزانشیم متانفریک و جوانه حالب ابتدایی هستند و بنابراین پتانسیل چند توانی را حفظ می‌کنند، در حالی که سلول‌های کلیوی تمایز یافته بالغ به دودمان خاص خود متعهد هستند [8].

شکل 1. رشد سیستم ادراری انسان از هفته 4 تا 9 در رحم.

2.2. پروتکل های تولید ارگانوئیدهای کلیه

ارگانوئیدهای کلیه می توانند از سلول های تمایز یافته از بافت یا سلول های بنیادی پرتوان تشکیل شوند. برای ایجاد یک ارگانوئید کلیه از سلول‌های مشتق از بافت، می‌توان سلول‌های بالغ تمایز یافته را در فضایی سه‌بعدی در حالت خارج از بدن مرتب کرد تا از معماری اندام انسان تقلید کند [9]. پروتکل های ارگانوئیدی برای سلول های متمایز مشتق شده از بافت در جاهای دیگر پوشش داده شده است. در این بررسی، ما بر روی ارگانوئیدهای کلیه مشتق از سلول های بنیادی تمرکز خواهیم کرد. برای ایجاد این سیستم‌ها، دانشمندان ممکن است سلول‌های بنیادی پرتوان را در حضور مورفوژن‌های درون‌زا و اجزای خارج سلولی مخصوص کلیه کشت کنند. سلول‌های بنیادی می‌توانند خود به خود در ساختارهای کلیه مانند جمع شوند و از رشد کلیه جنینی تقلید کنند. اندام هایی مانند روده دارای جمعیت سلول های بنیادی درون زا در بافت بالغ هستند که دانشمندان ممکن است با آنها ارگانوئیدها را ایجاد کنند [10]. با این حال، از آنجایی که هیچ شواهد واضحی مبنی بر اینکه کلیه انسان بالغ حاوی یک طاقچه سلول های بنیادی است وجود ندارد، ارگانوئیدهای کلیه مشتق از سلول های بنیادی باید از سلول های بنیادی پرتوان (اعم از جنینی یا hiPSC) ساخته شوند [11].

ارگانوئیدهای کلیه مشتق از سلول های بنیادی را می توان به دو دسته زیر طبقه بندی کرد: ارگانوئیدهای پیش ساز نفرون (NP) و ارگانوئیدهای جوانه حالب (UB). هر دو نوع ارگانوئید به عنوان مدل های بیماری به خوبی تثبیت شده اند. ارگانوئیدهای NP شبیه مزانشیم متانفریک است که حاوی سلول های NP چند توان است. در واقع، یک سلول مزانشیمی متانفریک منفرد می‌تواند تمام سلول‌های اپیتلیال نفرون را به استثنای مجرای جمع‌کننده ایجاد کند [8]. روش‌های تولید ارگانوئیدهای NP مشتق از hiPSC شامل کشت دوبعدی با تجمع بعدی در یک صفحه سوراخ متخلخل (به عنوان مثال، تاکاساتو و همکاران (2016)، موریزان و همکاران (2015)) یا کشت سه بعدی در یک هیدروژل (مثلاً فریدمن و همکاران) است. (2015)) [12-14]. این ارگانوئیدها ساختارهای گلومرولی و لوله ای ایجاد می کنند. ارگانوئیدهای NP مشتق شده از دو مورد از محبوب ترین پروتکل های NP توسط Takasato و Morizane در یک تحلیل omics گسترده توسط Wu و همکاران مقایسه شدند. (2018) [15]. آنها دریافتند که در حالی که پروتکل تاکاساتو حدود 11 درصد سلول های پودوسیت مانند و 21 درصد سلول های خارج از هدف را در هر ارگانوئید تولید می کند، پروتکل موریزان حدود 28.5 درصد سلول های پودوسیت مانند و 14.3 درصد سلول های خارج از هدف را تولید می کند [15]. ارگانوئیدهای تاکاساتو نیز به نظر می رسد که مقدار کمی از مناطق شبیه به UB را ایجاد می کنند، اما عمدتاً از مزانشیم متانفریک تقلید می کنند، بنابراین آنها را به عنوان ارگانوئیدهای NP طبقه بندی می کنند [12]. علاوه بر این، موریزان و همکاران. (2015) و تاکاساتو و همکاران. پروتکل‌ها (2016) فاقد محیط هیدروژل خارج سلولی هستند که در کار فریدمن و همکاران (2015) وجود دارد [14]. گرتا و همکاران (2019) استدلال می کنند که وجود یک هیدروژل در تشکیل ارگانوئید، تشکیل ساختار کلیه را بهبود می بخشد و تولید نشانگرهای اولیه IM، نشانگرهای IM خلفی و نشانگرهای IM قدامی را افزایش می دهد [16].

در مقابل ارگانوئیدهای NP، ارگانوئیدهای UB از جوانه حالب تقلید می کنند که باعث ایجاد سیستم مجرای جمع کننده می شود. روش‌های تولید ارگانوئیدهای UB اخیراً توسعه یافته‌اند و شامل پرورش بدن جنینی و تجمع بعدی در چاه‌های با چسبندگی کم است [17]. این ارگانوئیدها ساختار لوله ای و مجرای جمع آوری دارند. در نهایت، ارگانوئیدهای NP و UB نیز برای تولید ساختارهای هم‌فرهنگ مرتبه بالاتر برای جمع‌بندی انسان بالغ ترکیب شده‌اند.فنوتیپ های کلیه[17]. محبوب ترین پروتکل ها برایارگانوئید کلیهشکل گیری در شکل 2 زیر خلاصه شده است [12-14،17-19].

شکل 2. خلاصه ای از محبوب ترین پروتکل های تشکیل ارگانوئید

2.3. چگونه آنها جمع می شوند: ارگانوئیدهای کلیه در مقابل کلیه های انسان

پروتکل هایی که در بالا توضیح داده شد در درجه اول شامل خودآرایی hiPSCها در ارگانوئیدها هستند. آن‌ها شرایط جنینی را تقلید می‌کنند تا HiPSCها را به دودمان‌های خاص کلیه متمایز کنند و ساختارهای ویژه کلیه را تشکیل دهند. اولین وضعیت جنینی که آنها تکرار می کنند، سیگنال دهی اولیه است. رگه اولیه بخشی از جنین است که قبل از جدا شدن سه لایه جوانه رشد می کند. اکثر پروتکل ها این کار را با استفاده از آگونیست سیگنالینگ WNT CHIR انجام می دهند. در مرحله بعد، برای اشتقاق دودمان NP، مزودرم خلفی میانی (PIM) باید القا شود و برای دودمان UB، مزودرم قدامی میانی (AIM) باید القا شود [17]. جالب توجه است که تاکاساتو و همکاران. (2015) دریافتند که هر چه دوره تجویز CHIR طولانی تر باشد، مزودرم شبیه خلفی بیشتر توسعه می یابد، در حالی که هر چه دوره کوتاه تر باشد، مزودرم شبیه قدامی بیشتر توسعه می یابد [20]. بنابراین، افزایش مدت زمان سیگنال دهی WNT منجر به تولید ساختار گلومرولی و پروگزیمال بیشتر می شود و کاهش مدت زمان سیگنال دهی WNT منجر به تولید ساختار دیستال بیشتر می شود.

پس از تکمیل پروتکل NP، ارگانوئیدهایی با هر دو ناحیه گلومرولی و لوله ای ایجاد می شوند. با این حال، آنها نابالغ هستند. مطالعات نشان داده اند که ارگانوئیدهای کلیه مشتق از hiPSC از جنین سه ماهه اول تقلید می کنند [20]. یکی از گسترده‌ترین تحلیل‌ها در این زمینه توسط سوبرامانیان و همکاران انجام شد. (2019)، که از RNA-seq برای مقایسه ارگانوئیدهای کلیه با کلیه های انسان 8-هفته، 17-هفته و بالغ استفاده کرد. آنها به این نتیجه رسیدند که ارگانوئیدهای کلیه در هفته های 8 و 17 در جنین بیشتر از کلیه های بالغ شبیه کلیه های انسان هستند [21]. علاوه بر این، ارگانوئیدهای کلیوی رنگ آمیزی نشانگرهای چند توان اولیه مانند SIX{10}} را در سرتاسر کلیه نشان می دهند، در حالی که کلیه انسان بالغ تمایز یافته چنین نشانگرهایی را بیان نمی کند [22]. بنابراین، برای استفاده از ارگانوئید کلیه به عنوان جایگزینی برای کلیه انسان بالغ برای مطالعه بیماری، باید در سن حاملگی پیشرفت کند.

ارگانوئیدهای کلیوی نه تنها ممکن است از متانفروس اولیه بیشتر از کلیه انسان بالغ تقلید کنند، بلکه ممکن است در صورتی که غلظت مورفوژن به درستی تنظیم نشود، حتی شباهت بیشتری به مزونفروس نسبت به متانفروس دارند [23]. تسوجیموتو و همکاران با پرداختن به این نگرانی ها. (2020) تمایز hiPSC را در شرایط آزمایشگاهی به NPs مزونفریک، NPs متانفریک و سلول‌های UB بررسی کرد [24]. این مطالعه چندین عامل را شناسایی کرد که این سه اصل و نسب را متمایز می کند و بنابراین ممکن است برای مطالعه آینده این سه سیستم متمایز استفاده شود [24]. دیگر پیشرفت‌های کلیدی در بلوغ ارگانوئیدی شامل برهمکنش‌های NP-UB و عروق‌سازی است. برخی از برجسته ترین مطالعات برای پرداختن به این مسائل توسط تاگوچی و نیشیناکامورا (2017) و تسوجیموتو و همکاران انجام شده است. (2020) [17،24]. این مطالعات ارگانوئیدهای MM-UB را تولید کردند و آنها را به موش پیوند زدند، جایی که آنها عروقی شدند. تولید این ساختارهای مرتبه بالاتر متانفریک به طور قابل توجهی شباهت ساختار کلیه مشتق شده از سلول های بنیادی را به کلیه های واقعی انسان ارتقا داد. با این حال، حتی این سیستم های پیشرفته قادر به خلاصه کردن انشعاب گسترده تر UB که در طول سه ماهه دوم و آخر در داخل بدن رخ می دهد، نبودند [24]. این یافته‌ها بر نیاز به تکثیر عملکردها و فعل و انفعالات درون‌زای کلیه بالغ که ارگانوئیدهای فعلی فاقد آن هستند، مانند جریان مایع، تأکید می‌کند.

3. ارگانوئیدهای کلیه به عنوان سیستم های مدل

شباهت ارگانوئیدهای کلیه به کلیه های انسان آنها را برای مدل سازی بیماری و غربالگری دارویی مناسب می کند. آنها ممکن است در کمتر از یک ماه ساخته شوند، برای یک فرد شخصی سازی شوند و به صورت عمده تولید شوند [12-14،17-19]. علاوه بر این، آنها ممکن است در شرایط آزمایشگاهی کشت شوند یا به موش، موش صحرایی، یا تخم مرغ پیوند زده شوند تا مدل های کامل in vivo را تشکیل دهند. در زیر، تجزیه و تحلیل هایی را که ممکن است با ارگانوئیدهای کلیه انجام شود و همچنین استفاده های فعلی و آتی ارگانوئیدهای کلیه در تحقیقات زیست پزشکی را بررسی خواهیم کرد.

3.1. تجزیه و تحلیل ارگانوئید کلیه

3.1.1. سنجش های آزمایشگاهی

سنجش های مختلف فیزیولوژیکی، مولکولی و عملکردی ممکن است بر روی ارگانوئیدهای کلیه انجام شود. از نظر سنجش های مولکولی، آنالیزهای مختلف رونویسی با موفقیت در ارگانوئیدهای کلیه انجام شده است [25]. به عنوان مثال، تاکاساتو و همکاران. (2015) RNA را از ارگانوئیدها استخراج کرد و توالی یابی RNA و تجزیه و تحلیل qRTPCR را انجام داد [20].

دیگران، مانند وو و همکاران. (2018) جداسازی هسته و توالی یابی snRNA را علاوه بر توالی یابی scRNA DropSeg در ارگانوئیدهای کلیه انجام داده اند. علاوه بر سطوح RNA، سطوح مختلف پروتئین از لیزات ارگانوئید کلیه از طریق ایمونوبلات کمیت و مقایسه شده است (به عنوان مثال، کروز و همکاران، 2017؛ مورایس و همکاران، 2022) [26،27]. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل ایمونوسیتوشیمی به طور معمول در ارگانوئیدهای کلیه برای بررسی ساختارهای نفرون خاص انجام شده است. این اغلب به عنوان رنگ آمیزی کل ارگانوئید انجام می شود. متناوبا، مقاطع بافتی نیز برای کاوش استفاده شده است (مثلا تاکاساتو و همکاران، 2015؛ کروز و همکاران، 2017) (20،26). این مطالعات نشان داده اند که ارگانوئیدهای کلیه گلومرول، لوله پروگزیمال، توبول دیستال، غشای پایه، و ترتیب مجرای جمع‌آوری (20،27). شکل 3 زیر نمونه‌ای از ارگانوئیدهای کلیوی انسانی تعبیه‌شده و برش داده شده با پارافین تولید شده با استفاده از پروتکل تاکاساتو و همکاران (2016) را نشان می‌دهد (12) این بخش برای توبول‌های گلومرولی، پروگزیمال و دیستال رنگ‌آمیزی شده است. پروتئین‌های نشانگر توبول و ساختارهای نفرونیک گلومرولی تا توبول دیستال را نشان می‌دهد. علاوه بر ساختارها، ارگانوئیدهای کلیه نیز عروقی را نشان می‌دهند. با این حال، محدود است، به سرعت پسرفت می‌کند و مانند یک کلیه معمولی سازمان‌یافته نیست (28).

سنجش‌های عملکردی متعدد نیز ممکن است در ارگانوئیدهای کلیه انجام شود. به عنوان مثال، همانطور که توسط Freedman و همکارانش توضیح داده شده است. (2022)، ارگانوئیدهای کلیه ممکن است در معرض سنجش‌های تعقیب و گریز پالس قرار گیرند، که در آن مولکول‌های فلورسنت مختلف ممکن است قبل از جایگزینی با رسانه‌های فاقد فلورسنت جدید به محیط اضافه شوند [29]. سپس ممکن است ارگانوئیدها برای جذب این مولکول ها تجزیه و تحلیل شوند و اطلاعات حاصل می تواند برای استنباط اطلاعات در مورد تجمع، تورم، فیلتراسیون، غدد درون ریز یا آسیب استفاده شود [29]. با این حال، یکی از مسائل مربوط به این سنجش در پلتفرم‌های ارگانوئیدی این است که مولکول‌ها ممکن است از بیرون به ساختارهای لوله‌ای بسته وارد شوند، به‌جای اینکه از طریق سطح آپیکال وارد شوند، همانطور که در داخل بدن اتفاق می‌افتد. از این رو، مولکول های فلورسنت ممکن است از غشای قاعده جانبی خارجی جذب شوند، زیرا هیچ راهی برای کنترل جایی که این مولکول ها ممکن است در هنگام ورود شدید به محیط وارد شوند وجود ندارد. علاوه بر این، حمل و نقل مولکول ها را می توان با انتشار در ارگانوئیدها محدود کرد و روندهای متفاوتی در تجمع در یک ارگانوئید ایجاد کرد.

علاوه بر این، ترمیم کلیه نیز ممکن است در پلتفرم‌های ارگانوئیدی ارزیابی شود، بنابراین بینش‌هایی در مورد مکانیسم‌های برگشت آسیب کلیوی و مبنای ژنتیکی که ممکن است بیماران را مستعد ابتلا به بیماری‌های کلیوی کند، می‌دهد. به عنوان مثال، مطالعاتی مانند گوپتا و همکاران. (2022) مسیرهای ژنی را بررسی کرده اند که در حضور مواجهه منفرد یا چندگانه با سیس پلاتین، یک مولکول آسیب کلیوی، در پلتفرم های ارگانوئیدی کلیه تنظیم مثبت می شوند [30]. در نهایت، تشکیل کیست ممکن است در ارگانوئیدها به منظور مطالعه بیماری کلیه پلی کیستیک (PKD) از طریق فعال سازی cAMP تجزیه و تحلیل شود [26]. کیست‌ها می‌توانند اندازه‌گیری، کمیت‌سازی شوند و به‌عنوان نماینده‌ای برای کیست‌های کلیه انسان درمان شوند.

3.1.2. تجزیه و تحلیل In Vivo

یک اشکال مهم در استفاده از ارگانوئیدهای کلیه در شرایط آزمایشگاهی به عنوان یک سیستم مدل عدم تعامل آنها با بقیه ارگانیسم است. بسیاری از شرایطی که بخش‌های دوردست بدن را تحت تأثیر قرار می‌دهند می‌توانند بر کلیه و بالعکس تأثیر بگذارند. به عنوان مثال، تغییرات در فشار خون می تواند فشار گلومرولی را به شدت تغییر دهد، که کلیه به نوبه خود می تواند آن را تنظیم کند. با این حال، در شرایط آزمایشگاهی، سیستم های ارگانوئیدی این فعل و انفعالات سیستمیک را در نظر نمی گیرند. بنابراین، رویکردهای پیوندی که شامل ارگانوئیدهای کلیه مشتق از انسان در موش، موش صحرایی، و تخم مرغ است، مورد بررسی قرار گرفته است. در چنین مطالعاتی، بافت‌های انسانی و حیوانی از طریق رنگ‌آمیزی آنتی‌ژن هسته‌ای انسانی یا تراز خواندن کروموزوم Y با مرجع ژنوم ترکیبی تشخیص داده می‌شوند [21]. علاوه بر این، ارگانوئیدها را می توان از طریق داربست (به عنوان مثال، ابریشم) پیوند زد تا سطح بالاتری از یکپارچگی ساختاری را فراهم کند [31]. این رویکرد ممکن است امکان تجزیه و تحلیل آسان‌تر بافت ارگانوئیدی پس از پیوند را فراهم کند.

یک مزیت کلیدی پیوند ارگانوئیدهای کلیه این است که به ارگانوئیدها اجازه می دهد عروقی شوند، بالغ شوند و حتی ادرار را فیلتر کنند. ون دن برگ و همکاران (2018) نشان داده اند که پس از پیوند کلیه ساب کپسولی به موش، گلومرول ها و توبول های ارگانوئید کلیه به طور قابل توجهی بالغ می شوند [32]. در مطالعه دیگری، سوبرامانیان و همکاران. (2019) نشان داده اند که پیوند ارگانوئیدهای مشتق شده از hiPSC به موش منجر به افزایش بلوغ توبول های پروگزیمال و دیستال و کاهش حضور جمعیت های سلول خارج از هدف در داخل ارگانوئید می شود [21]. مهمتر از آن، پس از پیوند، ارگانوئیدهای کلیه می توانند عملکرد نهایی کلیه را انجام دهند و خون را فیلتر کنند. پس از پیوند زیر جلدی در موش، ارگانوئیدهای کلیه ساختارهای فیلتر کننده ادرار را تشکیل دادند که با انتقال دکستران نشاندار شده با FITC [33] مشهود است. بنابراین، پیوند نه تنها به فرد اجازه می دهد تا اثرات یک جهش در یک ارگانوئید کلیه را در داخل بدن مطالعه کند، بلکه شباهت ارگانوئید را به کلیه انسان بهبود می بخشد و آن را تا حدودی یک سیستم عملکردی می کند.

در حالی که موش‌های دارای نقص ایمنی اغلب برای پیوند ارگانوئید کلیه hiPSC استفاده می‌شوند، میزبان‌های دیگری مانند غشاهای کوریوآلانتوئیک جوجه (CAM) نیز مورد استفاده قرار گرفته‌اند. یک CAM به طور طبیعی نقص ایمنی دارد و برای عروقی کردن ارگانوئید مفید است [16]. با این حال، فاقد سیستم‌های اندام پستانداران معمولی است و باعث می‌شود که ارگانوئیدهای کلیه برخلاف موش‌ها از سایر سیستم‌ها جدا شوند. علیرغم مشکلات مربوط به میزبان، تولید کایمرا با ارگانوئیدهای کلیه مشتق شده از انسان امکان مطالعه in vivo گسترده بیماری کلیوی انسان را در یک پلت فرم بسیار تاثیرگذار فراهم می کند.

3.2. مطالعات مدلسازی بیماری تاکنون انجام شده است

3.2.1. ارگانوئیدهای کلیه به عنوان مدل های بیماری ژنتیکی

ارگانوئیدهای کلیه برای مطالعه بیماری های کلیوی ژنتیکی لوله ای و گلومرولی استفاده شده است [26،34،35]. در انسان، مهمترین بیماری های لوله ای شامل بیماری کلیه پلی کیستیک کودکان (PKD) است که ناشی از جهش های اتوزومال مغلوب در ژن فیبروکیستیک (PKHD1) و PKD بزرگسالان است که ناشی از جهش های اتوزومال غالب در پلی سیستین است{4}} و -2 ژن [36-38]. این جهش ها ممکن است به طور مصنوعی از طریق فناوری های ویرایش ژن مانند سیستم CRISPR-Cas 9 به hiPSC ها وارد شوند. hiPSCهای ویرایش شده ممکن است متعاقباً به ارگانوئیدهای کلیه انسان با مدل‌سازی PKD رشد کرده و از طریق رنگ‌آمیزی پروتئین و پروفایل RNA آنالیز شوند. برای مثال، فریدمن و همکاران. (2015) و کروز و همکاران. (2017) ژن های پلی سیستین را در خطوط hiPSC با استفاده از سیستم CRISPR/Cas9 و متعاقباً ارگانوئیدهای مشتق شده که فنوتیپ کیستیک موجود در داخل بدن در بیماران بیمار را تقلید می کنند، از بین بردند [14،26]. این مطالعات نشان می‌دهد که ارگانوئیدهای کلیه ممکن است به عنوان پلتفرم‌های قابل مشاهده و مرتبط با بیماری برای مطالعه PKD استفاده شوند. علاوه بر این، ارگانوئیدهای ساخته شده از رده های سلولی مشتق شده از بیمار، بینشی در مورد جهش های خاص بیمار و احتمال توسعه بیماری را امکان پذیر می کند. برای مثال، Low و همکاران. (2019) ارگانوئیدهای کلیه مشتق شده از بیماران مبتلا به جهش PKHD1 را توسعه داد و آنها را با ارگانوئیدهای نوع وحشی مقایسه کرد [39]. ارگانوئیدهای بیمار به طور قابل توجهی تشکیل کیست بیشتری را نشان دادند، بنابراین پتانسیل ارگانوئیدهای کلیه را برای پیش بینی تظاهرات بیماری از ژنوتیپ نشان دادند [39]. در مطالعه دیگری، هرناندز و همکاران. (2021) hiPSCها را از بیماران مبتلا به جهش در ژن کمپلکس اسکلروز توبروس{26}} مشتق کرد که بیمار را مستعد ایجاد تومور کلیه می‌کند [40]. آنها سپس جهش بیمار را با سیستم CRISPR/Cas9 تصحیح کردند. ارگانوئیدهای کلیه از این خطوط جهش یافته ایزوژنیک تصحیح شده تشکیل کیست کاهش یافته و مسیرهای ژنی را در مقایسه با ارگانوئیدهای بیمار بازیابی کردند، بنابراین سودمندی ارگانوئیدهای کلیه را در مطالعه اثرات عملکردی پایین دست جهش‌های خاص در سیستم‌های ارگان‌مانند ایزووژن نشان دادند.

محققان همچنین از ارگانوئیدهای مشتق شده از بیمار برای به دست آوردن بینش در مورد بیماری های ژنتیکی که بر گلومرول تأثیر می گذارد استفاده کرده اند. برای مثال، هیل و همکاران. (2018) بر روی ژن NPHS1 (نفرین) متمرکز شد که در صورت جهش، تشکیل فرآیند پادوسیت معیوب و فیلتراسیون ادرار نشت‌کننده را القا می‌کند و منجر به بیماری کلیوی می‌شود [34]. هیل و همکاران (2018) از NPHS1 hiPSCهای جهش یافته مشتق شده از بیمار برای استخراج ارگانوئیدهای کلیوی استفاده کرد که این فرآیندهای پادوسیت معیوب را مدلسازی کردند، از جمله کاهش سطوح پروتئین های خاص پودوسیت، نفرین و پودوسین [34]. به همین ترتیب، فریدمن و همکاران. (2015) ژن گلومرولی PODXL را در hiPSCها از بین برد و دریافت که ارگانوئیدها ساختار پودوسیت-پودوسیت معیوب را نشان می دهند [14].

یکی از پتانسیل های تا حد زیادی استفاده نشده ارگانوئیدهای کلیه، توانایی آنها در مدل سازی نقایص جنینی و جنینی است. در حال حاضر، محققان در تلاش هستند تا کلیه انسان بالغ را با ارگانوئید کلیه مدل کنند. با این حال، در سه ماهه اول و دوم فعلی، ارگانوئید کلیه ممکن است برای مطالعه نقایص رشدی کلیه استفاده شود [41]. نقص‌های تکاملی سیستم ادراری، مانند دیسپلازی کلیه، از شایع‌ترین و شدیدترین اختلالات رشدی است [42]. از آنجایی که بسیاری از این بیماری ها ممکن است در اوایل هفته 11 شناسایی شوند، ارگانوئیدهای کلیه به خوبی برای مطالعه ناتوانی های مادرزادی کلیه مناسب هستند. ما نه تنها ارگانوئیدهای کلیه مانند سه ماهه اول و دوم متانفریک را در اختیار داریم، بلکه رده های سلولی کلیه مزونفریک اولیه را نیز داریم (به عنوان مثال، تسوجیموتو و همکاران، 2020) برای مطالعه نقایص جنینی و جنینی [24]. از آنجایی که سیستم های کمی اجازه مطالعه و دستکاری کلیه انسان در حال رشد را می دهند، ارگانوئید کلیه امکان پتانسیل فوق العاده ای را برای مطالعات ژنتیکی، سم شناسی و رشد جنین فراهم می کند.

3.2.2. ارگانوئیدهای کلیه به عنوان مدلی برای سایر بیماری ها

علاوه بر بیماری ژنتیکی، ارگانوئیدهای کلیه برای مطالعه پاسخ سیستم های انسانی به عفونت ویروسی، سرطان و آسیب استفاده شده است. برای مثال، یانسن و همکاران. (2021) از یک پلت فرم ارگانوئید کلیه برای ارزیابی اثرات ویروسی SARS-CoV{2}} بر کلیه های انسان استفاده کرد [43]. این گروه دریافتند که عفونت SARS-CoV{5}} منجر به افزایش بیان کلاژن-I در ارگانوئیدهای کلیه انسان می‌شود، بنابراین توضیحی مکانیکی از آسیب کلیه و فیبروز ارائه می‌دهد که اغلب با موارد شدید کووید طولانی همراه است. 43]. با توجه به تحقیقات سرطان، هرناندز و همکاران. (2021) ارگانوئیدهای کلیه را به موش های دارای نقص ایمنی پیوند زد تا تومورهای کلیوی تحت تأثیر ژنتیکی نادر را مدل کند. در اینجا، ارگانوئیدهای مشتق از بیمار ضایعات تومور مانند ایجاد کردند، بنابراین تومورهای کلیه انسان را خلاصه می کنند [40]. علاوه بر این، آن‌ها از مدل‌های تومور مبتنی بر ارگانوئید کلیه به‌عنوان ساختارهای نیمه عملکردی مشتق از انسان استفاده کردند و داروها و درمان‌های مبتنی بر نانوذرات را آزمایش کردند. در نهایت، مطالعات اخیر نشان داده است که ارگانوئیدهای کلیه ممکن است برای آزمایش پاسخ آسیب کلیه استفاده شوند. برای مثال، پرزپیورسکی و همکاران. (2022) نشان داد که ارگانوئیدهای کلیه نشانگرهای آسیب اکسیداتیو و افزایش بیان نشانگر آسیب را با تجویز مولکول آسیب هیمن به ارگانوئیدهای کلیه، همراه با یک حسگر زیستی تولید می کنند [44].

3.2.3. ارگانوئیدهای کلیه در ارزیابی دارویی

علاوه بر ارائه بینش در مورد بیماری ها، ارگانوئیدهای کلیه برای غربالگری داروها استفاده شده است. به طور خاص، ارگانوئیدهای کلیه برای مطالعه آسیب کلیوی ناشی از دارو (DIKI)، که یکی از علل اصلی آسیب حاد کلیه است، استفاده شده است [45]. در ارزیابی عوارض جانبی سیس پلاتین، Czerniecki و همکاران. (2018) نشان داد که ارگانوئیدهای کلیه به عنوان مدل های با توان بالا برای بررسی داروهای جدید در مجموعه متنوعی از ژنتیک انسانی مفید هستند [46].

دیگران، مانند وو و همکاران. (2018) جداسازی هسته و توالی یابی snRNA را علاوه بر توالی یابی scRNA DropSeg در ارگانوئیدهای کلیه انجام داده اند. علاوه بر سطوح RNA، سطوح مختلف پروتئین از لیزات ارگانوئید کلیه از طریق ایمونوبلات کمیت و مقایسه شده است (به عنوان مثال، کروز و همکاران، 2017؛ مورایس و همکاران، 2022) [26،27]. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل ایمونوسیتوشیمی به طور معمول در ارگانوئیدهای کلیه برای بررسی ساختارهای نفرون خاص انجام شده است. این اغلب به عنوان رنگ آمیزی کل ارگانوئید انجام می شود. متناوبا، مقاطع بافتی نیز برای کاوش استفاده شده است (مثلا تاکاساتو و همکاران، 2015؛ کروز و همکاران، 2017) (20،26). این مطالعات نشان داده اند که ارگانوئیدهای کلیه گلومرول، لوله پروگزیمال، توبول دیستال، غشای پایه، و ترتیب مجرای جمع‌آوری (20،27). شکل 3 زیر نمونه‌ای از ارگانوئیدهای کلیوی انسانی تعبیه‌شده و برش داده شده با پارافین تولید شده با استفاده از پروتکل تاکاساتو و همکاران (2016) را نشان می‌دهد (12) این بخش برای توبول‌های گلومرولی، پروگزیمال و دیستال رنگ‌آمیزی شده است. پروتئین‌های نشانگر توبول و ساختارهای نفرونیک گلومرولی تا توبول دیستال را نشان می‌دهند. علاوه بر ساختارها، ارگانوئیدهای کلیه نیز عروقی را نشان می‌دهند. با این حال، محدود است، به سرعت در حال پسرفت است و مانند یک کلیه معمولی سازمان‌دهی نمی‌شود (28).

شکل 4. خلاصه راه هایی که ممکن است ارگانوئیدهای کلیه برای مدل سازی بیماری استفاده شوند. خلاصه ای از روش هایی که ممکن است از ارگانوئیدهای کلیه برای مدل سازی استفاده شود