سیستم های ضد ویروسی مخمری متنوع از پاتوژنز کشنده ناشی از LA Mycovirus جلوگیری می کند

مطالعات اخیر نشان می‌دهد که سیستم‌های ضد ویروسی به طور قابل‌توجهی از باکتری‌ها تا پستانداران حفظ می‌شوند، و نشان می‌دهد که می‌توان با مطالعه موجودات میکروبی به بینش منحصربه‌فردی در مورد این سیستم‌ها دست یافت. با این حال، برخلاف باکتری‌ها که عفونت فاژ می‌تواند کشنده باشد، هیچ پیامد ویروسی سیتوتوکسیک در مخمر ساکارومایسس سرویزیه در حال جوانه زدن شناخته نشده است، حتی اگر به طور مزمن با یک مایکویروس RNA دو رشته‌ای به نام LA آلوده شده باشد. علیرغم شناسایی قبلی سیستم های ضد ویروسی حفاظت شده که تکثیر LA را محدود می کند، این مورد باقی می ماند. در اینجا، ما نشان می‌دهیم که این سیستم‌ها برای جلوگیری از تکثیر افراطی LA، که باعث مرگ و میر در سلول‌های رشد شده در دمای بالا می‌شود، همکاری می‌کنند. با بهره‌برداری از این کشف، ما از یک صفحه نمایش بیش از حد برای شناسایی عملکردهای ضد ویروسی برای همولوگ‌های مخمر پروتئین متصل شونده به polyA (PABPC1) و پروتئین Larp1 حاوی دامنه La استفاده می‌کنیم که هر دو در ایمنی ذاتی ویروسی در انسان نقش دارند. با استفاده از رویکرد از دست دادن عملکرد مکمل، ما توابع ضد ویروسی جدید را برای اگزونوکلئازهای RNA حفظ شده REX2 و MYG1 شناسایی کردیم. مجتمع های تنظیمی کروماتین SAGA و PAF1. و HSF1، تنظیم کننده اصلی رونویسی پاسخ استرس پروتئوستاتیک. از طریق بررسی این سیستم‌های ضد ویروسی، ما نشان می‌دهیم که پاتوژنز LA با پاسخ استرس پروتئوستاتیک فعال و تجمع توده‌های پروتئین سیتوتوکسیک همراه است. این یافته‌ها استرس پروتئوتوکسیک را به‌عنوان یک علت زمینه‌ای پاتوژنز LA شناسایی می‌کنند و مخمر را به عنوان یک سیستم مدل قدرتمند برای کشف و شناسایی سیستم‌های ضد ویروسی حفاظت‌شده پیش می‌برند.

تمام سویه های آزمایشگاهی و بیشتر جدایه های محیطی مخمر جوانه زنی S. cerevisiae با ویروس RNA دو رشته ای (dsRNA) به نام LA (1، 2) آلوده شده اند. LA متعلق به خانواده Totiviridae پراکنده گسترده از ویروس های dsRNA درون زا است. مانند همه ویروس‌های این خانواده، ژنوم LA dsRNA درون یک ویریون بسته‌بندی می‌شود که از هضم با واسطه میزبان محافظت می‌کند. سوراخ‌های ویریون اجازه اکستروژن رونوشت‌های RNA را به داخل سیتوزول می‌دهد که پروتئین کپسید، Gag را کد می‌کند، که بیشتر ذره را تشکیل می‌دهد. رونوشت LA همچنین یک پروتئین همجوشی Gag-pol را کد می‌کند که در سطوح بسیار پایین‌تری نسبت به پروتئین Gag تولید می‌شود که دارای فعالیت RNA پلیمراز وابسته به RNA است. هر ویریون حاوی یک پروتئین Gag-pol است که تکثیر LA و رونویسی درون ذره را به عهده دارد. محصور کردن رونوشت های ویروسی در ذرات نوپا و سنتز رشته RNA منفی توسط Gag-pol برای تشکیل ژنوم dsRNA چرخه تکثیر LA را کامل می کند (2). برای تولید این پروتئین‌ها، LA از ویژگی‌های معمول ویروس‌های RNA که در انسان یافت می‌شود، استفاده می‌کند، از جمله مکانیسم «کلاه ربایی» که رونوشت‌های LA را با یک کلاهک 5'-متیل و مکانیزم تغییر چارچوب ریبوزومی برای تولید پروتئین‌های همجوشی Gag و Gag-pol ارائه می‌کند. یک رونوشت واحد (3، 4).

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

مطالعات اخیر سیستم های ضد ویروسی باکتریایی نشان داده است که آنها حفاظت تکاملی قابل توجهی را با انسان به اشتراک می گذارند و پتانسیل موجودات میکروبی را برای ارائه بینش های جدید در مورد ایمنی ذاتی ویروسی نشان می دهد (5-11). در واقع، مطالعات اولیه مربوط به LA منجر به کشف دو سیستم ضد ویروسی شد که متعاقباً نشان داده شد که به ایمنی ذاتی در برابر ویروس‌های RNA متنوع در پستانداران کمک می‌کنند (12-17). اولین مورد از این سیستم‌های ضد ویروسی شامل ژن‌های SKI2، 3 و 8 است که زیرواحدهای یک کمپلکس مرتبط با ریبوزوم حفاظت‌شده را رمزگذاری می‌کنند که با ترجمه رونوشت‌هایی که فاقد دم پلی(A) هستند، مانند آنهایی که توسط LA کدگذاری شده‌اند، مخالفت می‌کنند (18-23). یک مسیر مجزا از تضعیف LA از طریق Xrn1 (همچنین به عنوان SKI1 شناخته می شود)، یک اگزوریبونوکلئاز 5'-3' که mRNA های بدون پوشش را تجزیه می کند، رخ می دهد (24-26).

اخیراً دریافتیم که DNA/RNA اندونوکلئاز میتوکندری Nuc1 تجمع LA را در سلول‌های هاگ‌زا سرکوب می‌کند، که نشان‌دهنده یک مسیر ضد ویروسی جدید مخمر است (27). Nuc1 یک همولوگ از اندونوکلئاز G (EndoG) است که در همه یوکاریوت‌ها و بسیاری از پروکاریوت‌ها یافت می‌شود و بیشتر به دلیل نقشش در ترویج تکه تکه شدن ژنوم در طول مرگ سلولی برنامه‌ریزی‌شده پستانداران، یک مکانیسم برجسته آخرین راه‌حل دفاع ویروسی شناخته شده است (28، 29). به طور شگفت انگیزی، مرگ برنامه ریزی شده سلولی ذاتی اسپورزایی مخمر است و Nuc1 در طول این فرآیند، DNA را از محصولات میوز در حال مرگ قطعه قطعه می کند، علاوه بر نقش آن در تضعیف سطوح ویروسی LA که توسط هاگ ​​های باقی مانده به ارث می رسد (27، 30، 31).

علیرغم وجود فراگیر LA در سویه های آزمایشگاهی، هیچ پیامد تناسب اندام به آن نسبت داده نشده است و بنابراین LA تا حد زیادی به عنوان یک ترکیب بی ضرر در نظر گرفته می شود. در اینجا، ما نشان می‌دهیم که عفونت LA در واقع برای مخمر کشنده است و باید به طور فعال از طریق ایمنی ذاتی ویروسی برای حفظ زنده ماندن تضعیف شود. به طور خاص، در سویه‌هایی که فاقد مسیرهای ضد ویروسی NUC1 و SKI با اثر موازی هستند، تعداد کپی LA به شدت افزایش می‌یابد که منجر به کشندگی در دماهای بالا می‌شود.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

ما استدلال کردیم که توصیف بیشتر LA و عواملی که تکثیر آن را در سطح پایین حفظ می‌کنند می‌تواند سیستم‌های ضد ویروسی جدیدی را نشان دهد. شناسایی شرایطی که منجر به پاتوژنز LA می شود به ما امکان استفاده از روش های غربالگری ژنتیکی بیوانفورماتیک و پیشرو برای کشف ژن های ضد ویروسی جدید را داد. با استفاده از غربالگری برای ژن‌های با بیان بیش از حد که کشندگی شرطی nuc1∆ ski3∆ را سرکوب می‌کنند، ما عملکردهای ضد ویروسی را برای همولوگ‌های مخمر پروتئین متصل شونده پلی (PABPC1) و دامنه La حاوی پروتئین Larp1 شناسایی کردیم که هر دو در ذاتی ویروسی نقش دارند. ایمنی در انسان (32، 33). علاوه بر این، مطالعات ژنتیکی از دست دادن عملکرد دوازده ژن ضد ویروسی جدید را شناسایی کرد. در این میان، کمپلکس کواکتیواتور رونویسی SAGA بسیار حفاظت شده و چندین اگزونوکلئاز RNA از جمله REX2 و MYG1 هستند که هر دو دارای همولوگ های انسانی و باکتریایی متمایز اما ضعیف هستند (34-37).

در نهایت، ما پاتوژنز LA را با استفاده از روش‌های بیولوژیکی سلولی مشخص می‌کنیم و دریافتیم که بار ویروسی بالا باعث استرس پروتئوستاتیک می‌شود. از آنجایی که درجه حرارت بالا به خوبی شناخته شده است که استرس پروتئوستاتیک را تشدید می کند، این مشاهدات نشان می دهد که استرس پروتئوستاتیک فاجعه بار علت مرگ و میر ناشی از LA است. مطابق با این فرضیه، ما نشان می‌دهیم که جهش‌های nuc1∆ ski3∆ حساسیت وابسته به LA به آزتیدین{6}}کربوکسیلیک اسید (AZC)، یک آنالوگ پرولین که باعث استرس ارتواستاتیک می‌شود، نشان می‌دهند (38). علاوه بر این، ما یک عملکرد ضد ویروسی برای HSF1 نشان می‌دهیم، یک فاکتور رونویسی حفاظت‌شده که پاسخ به استرس ارتواستاتیک را حس کرده و هدایت می‌کند. جالب توجه است که Hsf1 انسانی همچنین نقش مهمی در تکثیر و/یا بیماری‌زایی ویروس‌های مختلف از جمله HIV، SARS-Cov{11}} و ویروس دنگی ایفا می‌کند، اگرچه مکانیسم‌ها نامشخص هستند (39). این یافته‌ها نمونه‌های جدیدی از حفظ ایمنی ذاتی از میکروب‌ها به انسان و مخمر با نور بالا را به عنوان یک سیستم مدل قدرتمند برای کشف سیستم‌های ضد ویروسی جدید ارائه می‌کند.

نتایج

سیستم های ضد ویروسی مخمر NUC1، SKI و XRN1 برای جلوگیری از پاتوژنز LA همکاری می کنند.

مطالعات قبلی ما در مورد NUC1 روی سلول های میوز متمرکز بود (27). برای بررسی عملکرد ضد ویروسی NUC1 در مخمر در حال رشد رویشی، تعداد کپی LA را در سلول‌های هاپلوئید میتوزی در پس‌زمینه سویه BY4742 مورد بررسی قرار دادیم. ما سطوح LA dsRNA را با استفاده از رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید RNA الکتروفورز شده مشاهده کردیم و دریافتیم که یک جهش دوگانه nuc1∆ ski3∆ افزایش زیادی در LA dsRNA نشان داد (شکل 1A). ما این یافته ها را با استفاده از میکروسکوپ ایمونوفلورسانس با آنتی بادی dsRNA که برای شناسایی ویروس های RNA در حال تکثیر استفاده می شود، تأیید کردیم (40، 41). این تصاویر نشان داد که LA dsRNA در کانون‌ها انباشته شده است، که یادآور مکان‌های "کارخانه ویروسی" تکثیر ویروسی مشاهده شده در سلول‌های انسانی است (شکل 1B و پیوست SI، شکل S1) (42). مطابق با یافته‌های قبلی در زمینه‌های سویه دیگر (24، 27، 43)، وسترن بلات نشان داد که سطوح پروتئین Gag در جهش‌یافته‌های nuc1∆ و ski3∆ افزایش یافته است (شکل 1C). علاوه بر این، ما نشان دادیم که یک جهش دوگانه nuc1∆ ski3∆ سطوح Gag را به شدت افزایش می‌دهد (شکل 1C). این داده ها نشان می دهد که NUC1 و SKI3 در مسیرهای ضد ویروسی جداگانه شرکت می کنند و از دست دادن هر دو مسیر منجر به افزایش شدید بار ویروسی LA می شود.

برای تعیین اینکه آیا بار بالای ویروسی LA بر تناسب سلولی تأثیر می‌گذارد، رشد مخمر را با استفاده از سنجش رشد آزمایش نقطه‌ای بررسی کردیم. نقایص رشد ظریف جهش‌یافته‌های منفرد nuc1∆ و ski3∆ در 37 درجه مشاهده شد که سلول‌ها با گلیسرول به جای گلوکز به عنوان منبع کربن رشد کردند، شرایطی که در آن مخمر به تنفس میتوکندریایی متکی است (شکل 1D). قابل توجه است، اگرچه جهش دوگانه nuc1∆ ski3∆ به طور معمول در 3{19}} درجه رشد می‌کردند، بدون توجه به منبع کربن، کشندگی مشروط را در 37 درجه نشان دادند (شکل 1D). همانطور که انتظار می رفت، زنده ماندن در دمای بالا توسط یک پلاسمید بیان کننده NUC به یک موتانت دوگانه nuc1∆ ski3∆ بازگردانده شد که باعث کاهش متناظر در سطوح Gag شد (شکل 1 C و D). برای تأیید اینکه نقص رشد جهش دوگانه nuc1∆ ski3∆ توسط LA ایجاد شده است، یک سویه ایزوژنیک درمان شده از LA (LA{27}}) ساختیم و رشد آن را در دماهای بالا مورد سنجش قرار دادیم. ما دریافتیم که نقص رشد به طور کامل کاهش یافته است، به این معنی که کشندگی شرطی نتیجه تکرار نامحدود LA است (شکل 1D). برای ارزیابی اثرات تعداد بالای کپی LA بر تناسب سلولی در شرایط رشد بهینه، نرخ تکثیر را در کشت مایع اندازه‌گیری کردیم. این مطالعات کاهش نرخ رشد را در جهش‌های دوگانه nuc1∆ ski3∆ در مقایسه با نوع وحشی در 30 درجه نشان دادند که در سویه‌های L-A0 معکوس شد، و نشان داد که بار بالای LA برای تناسب اندام حتی در سلول‌های بدون تنش مضر است (ضمیمه SI، شکل 1). S2).

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

برای توصیف بیشتر نحوه تعامل NUC1 با مسیرهای ضد ویروسی شناخته شده، ما رابطه آن را با XRN1 آزمایش کردیم. ما دریافتیم که یک جهش دوگانه nuc1∆ xrn1∆ سطوح بسیار بالایی از Gag را در مقایسه با جهش‌های منفرد انباشته می‌کند و کشندگی شرطی وابسته به LA را در دمای بالا نشان می‌دهد (ضمیمه SI، شکل S3 A ​​و B)، که نشان می‌دهد NUC1 و XRN1 در مسیرهای موازی برای کاهش LA. با انعکاس نقش های کلیدی غیر زائد آنها در تنظیم mRNA حجیم، یک جهش دوگانه xrn1∆ ski3∆ حتی در سویه های فاقد LA غیرقابل تحمل است (44). برای تعیین اینکه آیا XRN1 یک سیستم ضد ویروسی مستقل از NUC1 و SKI3 را نشان می‌دهد، ما از یک پلاسمید با کپی بالا برای بیان بیش از حد XRN1 در یک جهش دوگانه nuc1∆ ski3∆ استفاده کردیم. در واقع، ما کاهش قابل توجهی در سطوح Gag و سرکوب کشندگی شرطی nuc1∆ ski3∆ با استفاده از بیان بیش از حد XRN1 مبتنی بر پلاسمید مشاهده کردیم (شکل 1 C و D). نتیجه می‌گیریم که Nuc1، Ski3، و Xrn1 به طور همگرا با تکثیر LA مخالفت می‌کنند و افزایش شدید بار ویروسی LA در جهش‌های nuc1∆ ski3∆ یا nuc1∆ xrn1∆ باعث ایجاد پاتوژنز کشنده در دماهای بالا می‌شود (شکل 1E).

یک صفحه نمایش ژنتیکی مبتنی بر بیوانفورماتیک عوامل جدید ضد ویروسی را شناسایی می کند.

کشندگی مشروط وابسته به LA جهش‌های دوگانه nuc1∆ ski3∆ این احتمال را افزایش داد که سایر عوامل ضد ویروسی را بتوان از طریق مطالعات جهش‌یافته ترکیبی شناسایی کرد. برای شناسایی فاکتورهای ضد ویروسی کاندید جدید، ما یک پایگاه داده تعامل ژنتیکی انتخاب شده را برای حذف ژن‌هایی که در ترکیب با nuc1∆ در حداقل دو مطالعه غربالگری با توان عملیاتی بالا باعث نقص رشد مصنوعی می‌شوند، جستجو کردیم (45). علاوه بر حضور مورد انتظار حذف های XRN1 و SKI در این مجموعه داده، ما شانزده ژن اضافی پیدا کردیم. ما از تلاقی ژنتیکی برای ساخت موتانت های سه گانه با ترکیب حذف هر یک از این شانزده ژن با nuc1∆ ski3∆ استفاده کردیم و شش مورد را تأیید کردیم که باعث نقص شدید رشد شدند (جدول 1). ما تشخیص دادیم که فنوتیپ‌های رشد مصنوعی ناشی از هر یک از این ژن‌ها در سویه‌های LA معکوس شدند، که نشان می‌دهد آنها پروتئین‌های ضد ویروسی را کد می‌کنند (جدول 1). ما تایید چندین مورد از این بازدیدها را به عنوان عوامل ضد ویروسی جدید در زیر شرح می دهیم.

یک ژن شناسایی شده در صفحه نمایش ما، REX2، یک اگزونوکلئاز RNA 3'-5' را رمزگذاری می‌کند که از باکتری‌ها به انسان حفظ شده است (35). هم Rex2 و هم REXO2 همولوگ انسانی آن در میتوکندری ها قرار دارند و حاوی یک دامنه EXOIII هستند که به طور گسترده در پروتئین های پروکاریوتی و یوکاریوتی یافت می شود، از جمله پروتئین ضد ویروسی تحریک شده با اینترفرون ISG2{40}} (36، 37، 46-48). ما دریافتیم که یک سویه جهش دوگانه rex2∆ nuc1∆ سطوح Gag را در مقایسه با تک جهش‌یافته و نقایص رشد وابسته به LA، از جمله کشندگی در دمای بالا، به شدت افزایش داد (شکل 2 A و B، و ضمیمه SI، شکل. S2). یک سویه تک جهش یافته rex2∆ افزایش جزئی در سطوح Gag نشان داد، اگرچه این اثر حاشیه ای بود (شکل 2B). برای بررسی دقیق عواقب rex2∆ برای تعداد کپی LA، ما RNA LA را با استفاده از RT-qPCR اندازه‌گیری کردیم. این اندازه‌گیری‌ها تایید کرد که سویه‌های rex2∆ nuc1∆ سطوح بسیار افزایش‌یافته LA را انباشته می‌کنند، اگرچه آنها همچنین نشان دادند که یک جهش‌یافته rex2∆ افزایش LA RNA را انباشته نکرده است (شکل 2C). این یافته ها نشان می دهد که نقش ضد ویروسی Rex2 تنها در غیاب عملکرد NUC1 آشکار است. به طور قابل توجهی، جهش سه گانه nuc1∆ ski3∆ rex2∆ و nuc1∆ xrn1∆ rex2∆ تحت تمام شرایط رشد غیرقابل تحمل بودند، و این نقایص در سویه‌های L-A0 معکوس شدند (شکل 2D). این یافته‌ها پتانسیل بیماری‌زایی شدید مایکوویروس LA را نشان می‌دهد و نقش ضد ویروسی جدیدی را برای یک اگزونوکلئاز RNA موضعی میتوکندری بسیار حفاظت‌شده مشخص می‌کند.

شکل 1. تضعیف LA مخمر را از پاتوژنز کشنده محافظت می کند. (الف) یک ژل رنگ آمیزی شده با اتیدیوم بروماید از RNA کل تهیه شده از سویه های نشان داده شده نشان داده شده است، با نوار 4.6 kb LA dsRNA که با یک فلش نشان داده شده است. (B) ایمونوفلورسانس برای تجسم LA dsRNA (نارنجی) در سلول‌های ژنوتیپ‌های مشخص شده استفاده شد. این سویه‌ها برای از بین بردن رنگ‌آمیزی پس‌زمینه از ویروس L-BC dsRNA با فراوانی ضعیف درمان شدند (جزئیات روش). رنگ آمیزی DAPI DNA به رنگ آبی است. (نوار مقیاس، 1 میکرومتر) (C) وسترن بلات سطح پروتئین LA Gag و 3-فسفوگلیسرات کیناز (Pgk1) در سویه‌های مشخص شده نشان داده شده است. نشانگرهای وزن مولکولی در سمت راست نشان داده شده اند. (D) سنجش رشد آزمایش نقطه ای سویه ها از 1C نشان داده شده است. سویه ها بر روی محیط کشت -Leu حاوی گلوکز یا گلیسرول مشاهده شدند و در دماهای مشخص شده رشد کردند. (E) پروتئین میتوکندری Nuc1 با پروتئین های سیتوزولی Xrn1 و SkiC برای تنظیم سطح پروتئین LA و اطمینان از تناسب سلولی همکاری می کند.

ژن دیگری که در صفحه ما شناسایی شد، MYG1 بود، همولوگ مخمر ژن 1 تکثیر ملانوسیت انسانی، یک اگزونوکلئاز RNA 3'-5' که دارای همولوگ در همه گونه‌ها است (34). سویه های جهش یافته ترکیبی از myg1∆ و nuc1∆ افزایش زیادی در پروتئین Gag و LA RNA در مقایسه با جهش‌یافته‌های منفرد نشان دادند و نقص‌های رشد وابسته به LA شدید را در دمای بالا و در کشت مایع نشان دادند (شکل 2C و پیوست SI، شکل‌های S2، S4). الف و ج). مانند rex2∆، یک سویه جهش یافته منفرد myg1∆ افزایش کمی در سطح Gag نشان داد و هیچ تغییری در LA RNA نشان داد (شکل 2C و ضمیمه SI، شکل S4C). ما توانستیم جهش‌یافته‌های سه‌گانه nuc1∆ ski3∆ myg1∆ را بازیابی کنیم، اگرچه رشد بسیار کندی در 30 درجه داشتند و حتی سطوح بالاتری از Gag را انباشته کردند (ضمیمه SI، شکل S4 A و C). این نقایص رشد نیز در سویه های L-A0 معکوس شد (ضمیمه SI، شکل S4A). بنابراین MYG1 یک عامل ضد ویروسی جدید را نشان می دهد که به موازات NUC1 و کمپلکس SKI عمل می کند.

جدول 1. شناسایی فاکتورهای ضد ویروسی کاندید جدید با استفاده از رویکرد بیوانفورماتیک

جهش هایی که منجر به بیان بیش از حد MYG1 انسان می شود با اختلال خود ایمنی ویتیلیگو مرتبط است، که نشان می دهد که MYG1 ممکن است نقشی در ایمنی ذاتی انسان ایفا کند (49، 50). ما این امکان را با استفاده از یک پلاسمید بیان کننده MYG1 انسانی تحت کنترل یک پروموتر مخمری سازنده بررسی کردیم (34) و دریافتیم که MYG1 انسانی نقص رشد شرطی یک جهش یافته nuc1∆ myg1∆ را نجات داد (ضمیمه SI، شکل S4D). این یافته ها نشان می دهد که عملکرد ضد ویروسی مخمر MYG1 می تواند توسط MYG1 انسانی انجام شود، که نشان دهنده یک عملکرد ضد ویروسی بالقوه برای MYG1 در انسان است.

شکل 2. عوامل ضد ویروسی جدید با استفاده از پاتوژنز LA شناسایی می شوند. (الف) تجزیه و تحلیل نقطه ای سویه های معیوب در NUC1 و REX2 نشان داده شده است. سویه‌ها روی محیط‌های SC حاوی گلوکز یا گلیسرول مشاهده شدند و در دمای مشخص‌شده رشد کردند. (B) وسترن بلات سطح LA Gag و پروتئین Pgk1 سویه ها در شکل 2A. نشانگرهای وزن مولکولی در سمت راست نشان داده شده اند. (C) LA RNA با qPCR اندازه گیری شد و به RNA ACT1 درون زا نرمال شد. میانگین سطح RNA و SD نشان داده شده است. n=5. *P < {{10}}.05، **P < 0.01، ***P <0.001 (آزمون t دانشجوی جفت نشده). (D) تجزیه و تحلیل نقطه ای سویه های معیوب در سه مسیر موازی ضد ویروسی حاوی پلاسمید بیان کننده NUC1 نشان داده شده است. سویه‌ها بر روی محیط -URA یا محیط مصنوعی کامل (SC) همراه با 0.1٪ 5-فلوروئوروتیک اسید (5-FOA) مشاهده می‌شوند.

دسته ژن دیگری که با استفاده از صفحه بیوانفورماتیک ما شناسایی شد، بیان ژن بود. CDC73 و SPT3 به ​​ترتیب زیرواحدهای مجتمع‌های مرتبط با کروماتین حفاظت‌شده PAF1 و SAGA را رمزگذاری می‌کنند. هر دو cdc73∆ و spt3∆ هنگام ترکیب با nuc1∆ ski3∆ باعث کشندگی وابسته به LA شدند (جدول 1). از آنجایی که نشان داده شده است که SAGA (SptAda-Gcn{12}}استیل ترانسفراز) بیان ژن ضد ویروسی را در قارچ سوختگی شاه بلوط Cryphonectria parasitica تنظیم مثبت می کند، ما این مجموعه را بیشتر مورد بررسی قرار دادیم (51). یک سویه جهش دوگانه spt3∆ nuc1∆ سطوح افزایش یافته Gag را انباشته کرد و کشندگی وابسته به LA را در دماهای بالا نشان داد (ضمیمه SI، شکل S4 B و C). SAGA یک کمپلکس پروتئینی بزرگ است و ما تأیید کردیم که حذف در چندین ژن دیگر کدکننده زیرواحد SAGA پیامدهای فنوتیپی مشابه spt3∆ را دارد (ضمیمه SI، جدول S1 و S4C). همراه با یافته های C. parasitica، این نتایج نشان می دهد که مجموعه SAGA بیان ژن ضد ویروسی را در گونه های مختلف قارچی کنترل می کند.

غربالگری با سرکوب کپی بالا، عوامل ضد ویروسی مخمری را که در انسان نیز ضد ویروسی هستند، شناسایی می کند.

از آنجایی که بیان بیش از حد XRN1 نقایص رشد سویه nuc1∆ ski3∆ را سرکوب می‌کند، ما فرض کردیم که بیان بیش از حد سایر عوامل ضد ویروسی اثر مشابهی ایجاد می‌کند، که می‌تواند به عنوان یک صفحه نمایش برای شناسایی سیستم‌های ضد ویروسی جدید استفاده شود. ما از یک صفحه سرکوب پلاسمید با کپی بالا برای شناسایی ژن‌هایی استفاده کردیم که بیان بیش از حد آنها کشندگی شرطی سویه nuc1Δ ski3Δ را کاهش داد (جزئیات روش). با استفاده از این صفحه، ما SRO9، SLF1 و PAB1 را به عنوان سرکوبگرهای با کپی بالای nuc1∆ ski3∆ شناسایی کردیم، که همگی پروتئین‌های اتصال RNA مرتبط با ریبوزوم را کد می‌کنند (شکل 3A) (52، 53). Sro9 و Slf1 پروتئين‌هاي حاوي دامنه لوپوس اتوآنتي‌ژن پارالوگ (La) هستند كه به طور گسترده در يوكاريوت‌ها يافت مي‌شوند. قابل توجه است که همولوگ انسانی آنها، Larp1، اخیراً در غربالگری‌ها برای پروتئین‌های متصل به SARS-Cov{22}} به علاوه رشته ssRNA یا نوکلئوکپسید شناسایی شده است (32، 54). Larp1 تمرکز اصلی در یکی از این مطالعات بود و نشان داده شد که تکثیر SARS-Cov{27}} را در سلول‌های انسانی کاهش می‌دهد، اگرچه مکانیسم آن شناخته شده نیست (32). PAB1 پروتئین بسیار حفاظت شده PolyA-Binding را رمزگذاری می کند که هدف مشترک مهار ویروسی در انسان از طریق مکانیسم های مختلف است (33). ما دریافتیم که بیان بیش از حد PAB1 یا SRO9 به طور قابل توجهی سطوح Gag را در یک جهش یافته nuc1∆ ski3∆ کاهش می دهد و فنوتیپ های نجات دهنده آنها را توضیح می دهد (شکل 3B). عجیب است، حتی اگر بیان بیش از حد SLF1 نقص رشد nuc1∆ ski3∆ را به خوبی SRO9 نجات داد، به هیچ کاهشی در سطوح Gag منجر نشد (شکل 3 A و B). این یافته‌ها نشان می‌دهد که PAB1 و SRO9 با سرکوب تکثیر LA سلول‌ها را نجات می‌دهند و SLF1 سلول‌ها را از پیامدهای بیماری‌زای افزایش تکثیر ویروسی محافظت می‌کند.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

تعداد بالای کپی LA منجر به استرس پروتئوستاتیک سیتوتوکسیک می شود.

برای به دست آوردن بینش در مورد مکانیسم‌های متفاوت فعالیت‌های ضد ویروسی Sro9 و Slf1، ما در نظر گرفتیم که پیامدهای فیزیولوژیکی پاتوژنز LA چیست و چگونه SRO9/SLF1 ممکن است بر آنها تأثیر متفاوتی بگذارد. ما به مطالعه قبلی اشاره کردیم که در آن حذف ژن‌های NUC1 یا SKI-complex منجر به القای ضعیف یک ژن گزارشگر GFP کنترل‌شده توسط Hsf1 شد (55)، یک فاکتور رونویسی حفاظت‌شده که استرس پروتئوستاتیک را حس می‌کند و پاسخ بیان ژن را فعال می‌کند (56-58). ). با استفاده از فلوسایتومتری با این گزارشگر (HSE-GFP)، ما این نتایج را تأیید کردیم و تعیین کردیم که یک جهش دوگانه nuc1∆ ski3∆ باعث فعال‌سازی هم‌افزایی و وابسته به LA HSE-GFP می‌شود (شکل 3C و پیوست SI، شکل S5). ما فرض کردیم که تولید انبوه Gag مشاهده شده در جهش‌های nuc1∆ ski3∆ این پاسخ استرس پروتئوستاتیک را نشان می‌دهد. با حمایت از این، فعال‌سازی HSE-GFP یک جهش‌یافته دوگانه nuc1∆ ski3∆ با بیان بیش‌ازحد PAB1 یا SRO9 بازگردانده شد و پیامدهای این ژن‌ها را برای تجمع Gag منعکس کرد (شکل 3 B و C). قابل ذکر است، بیان بیش از حد SLF1 پارالوگ SRO9 از فعال سازی HSE-GFP جلوگیری نکرد. بنابراین، واگرایی تکاملی ژن‌های مشابه SRO9 و SLF1 منجر به مکانیسم‌های ضد ویروسی متفاوتی شده است، با SRO9 تجمع پروتئین ویروسی و استرس پروتئوستاتیک مرتبط را سرکوب می‌کند و SLF1 ظاهراً سلول‌ها را از پیامدهای سمی استرس پروتئوستاتیک ناشی از ویروس محافظت می‌کند.

شکل 3. بیان بیش از حد عوامل کنترل ترجمه، پاتوژنز LA را کاهش می دهد. (الف) سنجش رشد تست نقطه ای سرکوبگرهای کپی بالا SRO9، SLF1، و PAB1 نشان داده شده است. سویه ها بر روی محیط کشت -LEU حاوی گلوکز یا گلیسرول مشاهده شدند و در دماهای مشخص شده رشد کردند. (B) وسترن بلات برای سطوح پروتئین LA Gag، Pgk1، Sro9، و Slf1 در سویه های 3A. نشانگرهای وزن مولکولی در سمت راست نشان داده شده اند. (C) از فلوسیتومتری برای اندازه گیری بیان HSE GFP در سویه های نشان داده شده (n {{0}}) استفاده شد. ربع اول و سوم با جعبه های خاکستری مشخص شده اند. شدت متوسط ​​GFP با نوارهای سیاه رنگ داخل مشخص می شود. *P < 0.05، **P <0.01، ***P <0.001 (آزمون t دانشجوی جفت نشده). (د) میکروسکوپ فلورسانس Hsp104-GFP در سویه‌های مشخص شده. سلول ها با DAPI رنگ آمیزی شدند تا هسته ها را تجسم کنند. (نوار مقیاس، 1 میکرومتر.) درصد سلول‌های دارای 3+ کانون GFP در سمت راست نشان داده شده است. n=3. برای هر تکرار 75 تا 140 سلول شمارش شد.

استرس پروتئوستاتیک اغلب با تجمع توده‌های پروتئینی سیتوتوکسیک همراه است که می‌توان با استفاده از GFP ترکیب شده با پروتئین Hsp104، هدف مستقیم فعال‌سازی رونویسی Hsf1 که با توده‌های پروتئینی همراه است، تجسم کرد (59، 60). برای بررسی بیشتر نقایص پروتئوستاتیک مرتبط با پاتوژنز LA، ما از میکروسکوپ فلورسانس برای تجسم کانون‌های Hsp104-GFP در گونه‌های مختلف استفاده کردیم. همانطور که انتظار می‌رفت، سلول‌های نوع وحشی که در دمای 30 درجه رشد کرده‌اند، به ندرت کانون‌های Hsp{9}}GFP قابل مشاهده را انباشته می‌کنند. در حالی که جهش‌های منفرد nuc1∆ و ski3∆ شبیه نوع وحشی بودند، به‌طور شگفت‌انگیزی، یک جهش دوگانه nuc1∆ ski3∆ بیش از 25 درصد سلول‌ها را با سه یا بیشتر کانون Hsp{15}}GFP نشان داد (شکل 3D). مانند سایر فنوتیپ‌هایی که برای nuc1∆ ski3∆ مشاهده کردیم، تجمع کانون‌های Hsp{19}}GFP وابسته به حضور LA بود (شکل 3D). این یافته‌ها نشان می‌دهند که بار ویروسی بالا ناشی از حذف NUC1 و SKI3 منجر به تجمع کانون‌های Hsp104-GFP می‌شود که نشان‌دهنده تجمع پروتئین سیتوتوکسیک است.

از آنجایی که پاتوژنز LA با نقص پروتئوستاتیک مرتبط بود، ما فرض کردیم که Hsf1 به عنوان یک عامل ضد ویروسی عمل می کند. حذف HSF1 کشنده است، بنابراین ما از آلل حساس به دما hsf1-848 استفاده کردیم که از مجموعه‌ای از سویه‌ها (61) منتشر شده بود. آلل hsf1-848 عدم رشد را در 39 درجه، یک فنوتیپ رشد متوسط ​​در 37 درجه، و بدون نقص رشد ظاهری در 35 درجه نشان داد (شکل 4A). سنجش‌های آزمایش نقطه‌ای نشان داد که فنوتیپ‌های رشد hsf1-848 در 35 درجه و 37 درجه در ترکیب با nuc1∆ یا ski3∆ بسیار افزایش یافته‌اند و این نقص‌های رشد در سویه‌های فاقد ویروس LA معکوس شده‌اند (شکل 4A) . همانطور که انتظار می رفت، زنده ماندن همه سویه های جهش یافته hsf{18}} در سلول هایی که در 39 درجه رشد کرده بودند بدون توجه به وجود LA ادامه داشت. علاوه بر این، با استفاده از کالبد شکافی تتراد، نشان دادیم که جهش‌یافته‌های سه‌گانه hsf1-848 nuc1∆ ski3∆ در صورت آلوده شدن به LA در دمای مجاز غیرقابل تحمل هستند، اما اگر از سویه LA{26}} مشتق شده باشند، سالم هستند (SI) پیوست، شکل S6). با استفاده از وسترن بلات، متوجه شدیم که hsf1-848 nuc1∆ و hsf1-848 ski3∆ مقادیر بیشتری از LA Gag را در مقایسه با تک جهش‌یافته‌ها انباشته کردند (شکل 4B). همراه با مطالعات بیولوژیکی سلولی ما، این یافته‌ها نشان می‌دهد که پاسخ استرس پروتئوستاتیک تنظیم‌شده Hsf به‌عنوان یک سیستم ضد ویروسی در مخمر عمل می‌کند و با پیامدهای بیماری‌زای تکثیر افسارگسیخته LA مخالفت می‌کند.

از آنجایی که نقص‌های پروتئوستاتیک تشدید می‌شوند و منجر به سمیت سلولی در دماهای بالا می‌شوند (59)، یک مدل ساده پیامدهای کشنده پاتوژنز LA در دماهای بالا را به استرس فاجعه‌بار پروتئوستاتیک نسبت می‌دهد. برای آزمایش بیشتر این مدل، ما سویه‌ها را با آزتیدین{2}}کربوکسیلیک اسید (AZC)، یک آنالوگ پرولین که در پروتئین‌هایی که منجر به استرس ارتوستاتیک می‌شود، ترکیب می‌کنیم (38). این آزمایشات نشان داد که nuc1∆ ski3∆ حساسیت شدیدی به AZC به روشی وابسته به ویروس LA نشان داد (شکل 4C و پیوست SI، شکل S6). علاوه بر این، ما دریافتیم که nuc1∆ ski3∆ حساسیتی به اتانول 5 درصد نشان می‌دهد، وضعیتی که باعث نقص پروتئوستاتیک نیز می‌شود، اما نه به 0.5 مولار NaCl، که باعث استرس اسمزی می‌شود (ضمیمه SI، شکل S6). این یافته ها نشان می دهد که پیامدهای کشنده پاتوژنز LA به طور خاص به دلیل استرس شدید پروتئوستاتیک است.

شکل 4. پاسخ شوک حرارتی پاتوژنز LA را سرکوب می کند. (الف) تجزیه و تحلیل نقطه ای سویه های معیوب در HSF1، NUC1، و SKI3 با یا بدون LA نشان داده شده است. سویه ها بر روی محیط کشت حاوی گلوکز مشاهده شدند و در دمای مشخص شده رشد کردند. (B) وسترن بلات برای سطوح پروتئین LA Gag و Pgk1 سویه های نشان داده شده. نشانگرهای وزن مولکولی در سمت راست نشان داده شده اند. (C) تجزیه و تحلیل نقطه ای سویه های تیمار شده با آنالوگ پرولین پروتئوتوکسیک، آزتیدین{8}}کربوکسیلیک اسید (AZC)، نشان داده شده است. سویه‌ها روی محیط‌های SC حاوی گلوکز همراه با یا بدون 0.1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر AZC مشاهده شدند و در دمای 30 درجه رشد کردند.

بحث

علیرغم حضور همه جانبه آن در سویه های آزمایشگاهی، مطالعات روی ویروس LA dsRNA به دلیل ماهیت ظاهراً خوش خیم آن محدود شده است. در اینجا، ما نشان می‌دهیم که LA پیامدهای عمیقی برای مخمر دارد که تکثیر آن کنترل نشده باشد و سیستم‌های ایمنی ذاتی متنوع، تکثیر LA را در سطح قابل تحملی حفظ می‌کنند. به طور خاص، ما نشان می‌دهیم که در سویه‌های فاقد ژن‌های ضد ویروسی NUC1 و SKI3 با اثر موازی، تکثیر LA به شدت تنظیم می‌شود که منجر به استرس ارتوستاتیک و کشندگی شرطی در دماهای بالا می‌شود. با بهره گیری از این کشف جدید، ما از صفحه نمایش های بیوانفورماتیک و ژنتیکی برای شناسایی ژن های مخمر جدیدی استفاده کردیم که برای محدود کردن تکثیر LA یا محافظت از سلول ها در برابر پیامدهای بیماریزای تکثیر نامحدود LA عمل می کنند. از آنجایی که این صفحه‌ها اشباع نشده بودند، ژنوم مخمر احتمالاً فاکتورهای ضد ویروسی متعدد دیگری را رمزگذاری می‌کند. مطالعات روشنگرانه زیادی در مخمرها انجام شده است که تکثیر RNA های ویروسی معرفی شده به صورت برون زا از سایر ارگانیسم ها را مطالعه می کنند و مشخص کردن اینکه آیا فاکتورهای ضد ویروسی LA به طور مشابه روی این RNA های ویروسی عمل می کنند جالب خواهد بود (62، 63).

با توجه به خطر آشکار عفونت LA، نحوه تداوم آن در مواجهه با فعالیت ضد ویروسی همیشه گیج کننده است. توضیحی برای این پارادوکس ممکن است این باشد که LA یک مزیت متعادل کننده ارائه می دهد. یکی از مزایای احتمالی LA این است که برخی از سویه‌ها را قادر می‌سازد تا ویروس‌های ماهواره‌ای را که سموم ترشح شده را رمزگذاری می‌کنند که سلول‌های غیر آلوده همسایه را می‌کشند، حفظ کنند. با این حال، LA در بسیاری از سویه هایی که فاقد ماهواره های "قاتل" هستند وجود دارد، بنابراین این توضیح برای توضیح تداوم عفونت LA کافی نیست. بنابراین ما حدس می زنیم که LA ممکن است برخی از مزایای رمزآلود داشته باشد که پتانسیل مضر آن را متعادل می کند.

کشف ما از Rex2 به عنوان یک عامل تضعیف ویروسی، زرادخانه عوامل ضد ویروسی شناخته شده میتوکندری را فراتر از Nuc1 گسترش می دهد و نشان می دهد که میتوکندری ها یک مرکز ضد ویروسی کلیدی در مخمر هستند. در واقع، میتوکندری ها نقش اصلی را در دفاع ویروسی به عنوان تنظیم کننده مرگ سلولی برنامه ریزی شده و به عنوان یک پلت فرم برای سیگنال دهی ضد ویروسی در انسان ایفا می کنند. چگونه نوکلئازهای میتوکندری ویروسی را که در سیتوزول مخمر قرار دارد ضعیف می کنند؟ یک احتمال این است که این آنزیم ها، در حالی که برای میتوکندری ها هدف قرار می گیرند، ممکن است به سطوح پایین اما کافی در سیتوزول برای انجام مستقیم تضعیف LA تجمع کنند. مطابق با این فرضیه، ما قبلاً نشان دادیم که Nuc1 در سیتوزول سلول‌های میوز تجمع می‌یابد، اگرچه روش‌های ما نتوانستند آن را در سیتوزول سلول‌های میتوز شناسایی کنند (27). فرضیه دیگر این است که برخی از جنبه های چرخه تکثیر LA در ارتباط نزدیک با میتوکندری رخ می دهد. به عنوان مثال، رونوشت‌های LA ممکن است با میتوکندری‌ها ارتباط داشته باشند و احتمالاً از آن عبور کنند و آنها را در معرض Nuc1 و/یا Rex2 قرار دهند. نتایج ما اهمیت کلی بالقوه میتوکندری را برای ایمنی ذاتی ویروسی در یوکاریوت‌ها برجسته می‌کند و سیستم مخمر-LA را به عنوان یک مدل قدرتمند برای مطالعات بیشتر در مورد این موضوع قرار می‌دهد.

مجموعه SKI ضد ویروسی مرتبط با ترجمه ریبوزوم ها و شناسایی ما از Pab1، Sro9، و Slf1 به عنوان سرکوبگرهای کپی بالای پاتوژنز LA، ریبوزوم ترجمه کننده را به عنوان یک مرکز کلیدی فعالیت ضد ویروسی مخمر نشان می دهد. این یافته که PAB1 (پروتئین اتصال به polyA) LA را سرکوب می‌کند، با توجه به عدم وجود دم‌های polyA در رونوشت‌های LA، شگفت‌انگیز است، که نشان می‌دهد Pab1 مستقیماً روی LA عمل نمی‌کند. یافته‌های قبلی نشان داد که رونوشت‌های LA برای جذب زیرواحدهای ریبوزومی 60S برای تشکیل کمپلکس‌های ترجمه‌کننده 80S با mRNA‌های مخمر polyA+ رقابت می‌کنند (64). یکی از مدل‌هایی که یافته‌های ما را توضیح می‌دهد این است که Pab1 ترجمه mRNA‌های حاوی دم polyA را افزایش می‌دهد، که سپس در دسترس بودن زیر واحدهای 60S برای رونوشت‌های LA برای ترجمه را کاهش می‌دهد. نقش Sro9 و Slf1 در ترجمه کمتر به خوبی درک شده است، اما عملکرد آنها ممکن است به طور مشابه به رقابت رونوشت‌های LA برای زیر واحدهای 60S مرتبط باشد. نکته مهم این است که همولوگ های Pab1 و Sro9/Slf1 در دفاع ویروسی انسان نقش دارند و مطالعات بیشتر در مورد این ژن ها در مخمر، مکانیسم های ضد ویروسی حفظ شده از مخمر به انسان را روشن می کند.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

ما نقش ضد ویروسی را برای فاکتور رونویسی حفاظت‌شده HSF1 به همراه یک پاسخ استرس پروتئوستاتیک ناشی از LA که شامل تجمع کانون‌های Hsp104-GFP، یک نشانگر فعال HSF1- از توده‌های پروتئین سیتوتوکسیک است، شناسایی کردیم. این نتایج از مدلی حمایت می کند که در آن پاتوژنز LA توسط استرس پروتئوتوکسیک ایجاد می شود. ما همچنین عملکرد ضد ویروسی را برای مجموعه SAGA کشف کردیم که نشان داده شده است به عنوان یک فعال کننده القای ژن هدف Hsf1 به دنبال شوک حرارتی عمل می کند (65، 66). این مشاهدات نشان می‌دهد که سطوح بالای LA منجر به فعال‌سازی وابسته به SAGA ژن‌های هدف Hsf1 می‌شود که سپس عملکرد ضد ویروسی را انجام می‌دهند و یک برنامه بالقوه بیان ژن ضد ویروسی را در مخمر جوانه‌زن روشن می‌کنند. این مدل بسیاری از پیش‌بینی‌های قابل آزمایش را انجام می‌دهد که ممکن است مربوط به پاتوژنز ویروسی در سایر ارگانیسم‌ها باشد. در واقع، HSF1 انسانی بیان عوامل تنظیم کننده پروتئولیتیک را نیز کنترل می کند. در حالی که عملکردهای ضد ویروسی HSF1 انسانی شرح داده شده است، مشخص نیست که پاسخ استرس ارتواستاتیک چه نقشی در این دارد (39). یافته‌های ما یک سیستم قدرتمند را برای تشخیص عملکرد ضد ویروسی Hsf1 با توجه به نقش آن در فعال‌سازی پاسخ استرس پروتئوستاتیک روشن می‌کند.

منابع

1. T. Nakayashiki، CP Kurtzman، HK Edskes، RB Wickner، Preions مخمر [URE3] و [PSI+] بیماری هستند. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 102, 10575–10580 (2005).

2. RB Wickner، T. Fujimura، R. Esteban، ویروس ها و پریون های Saccharomyces cerevisiae. Adv. ویروس Res. 86، 1–36 (2013).

3. T. Fujimura، R. Esteban، مکانیسم کلاهک در مخمر ویروس RNA دو رشته ای LA. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 108, 17667–17671 (2011).

4. JD Dinman، T. Icho، RB Wickner، تغییر چارچوب ریبوزومی -1 در یک ویروس RNA دو رشته‌ای مخمر، پروتئین همجوشی gag-pol را تشکیل می‌دهد. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 88, 174-178 (1991).

5. A. Bernheim و همکاران، افعی های پروکاریوتی مولکول های ضد ویروسی متنوعی تولید می کنند. Nature 589, 120-124 (2021).

6. A. Bernheim، R. Sorek، سیستم پان-ایمنی باکتری ها: دفاع ضد ویروسی به عنوان یک منبع جامعه. نات. Rev. Microbiol. 18، 113–119 (2020).

7. AG Johnson و همکاران، مغز متفکران باکتری، مکانیسم قدیمی مرگ سلولی را نشان می دهند. Science 375, 221-225 (2022).

8. BR Morehouse و همکاران، حسگر داینوکلئوتیدی حلقوی STING از باکتری ها منشا گرفته است. Nature 586, 429-433 (2020).

9. G. Ofir و همکاران، فعالیت ضد ویروسی دامنه های TIR باکتریایی از طریق مولکول های سیگنالینگ ایمنی. Nature 600, 116-120 (2021).

10. KM Slavik و همکاران، گیرنده های شبه cGAS RNA را حس می کنند و سیگنال دهی 3'2'-cGAMP را در مگس سرکه کنترل می کنند. Nature 597, 109-113 (2021).

11. AT Whiteley و همکاران، آنزیم های cGAS مانند باکتری سیگنال های نوکلئوتیدی متنوعی را سنتز می کنند. Nature 567, 194–199 (2019).

12. HM Burgess, I. Mohr, Cellular 5'-3' mRNA exonuclease Xrn1 تجمع RNA دو رشته ای و پاسخ های ضد ویروسی را کنترل می کند. میکروب میزبان سلولی 17, 332-344 (2015).

13. SC Eckard و همکاران، اگزوزوم RNA SKIV2L فعال شدن گیرنده های RIG-I مانند را محدود می کند. نات. ایمونول. 15, 839-845 (2014).

14. M. Miyashita، H. Oshiumi، M. Matsumoto، T. Seya، DDX60، یک جعبه هلیکاز DEXD/H، یک عامل ضد ویروسی جدید است که سیگنال‌دهی با واسطه گیرنده RIG-I را ترویج می‌کند. مول. سلول بیول. 31, 3802-3819 (2011).

15. CS Ng، DM Kasumba، T. Fujita، H. Luo، خصوصیات مکانی-زمانی فعالیت ضد ویروسی تجمع XRN1-DCP1/2 در برابر ویروس‌های RNA سیتوپلاسمی برای جلوگیری از مرگ سلولی. Cell Death Differ 27, 2363-2382 (2020).

16. RE Rigby، J. Rehwinkel، تخریب RNA در ایمنی ضد ویروسی و خودایمنی. Trends Immunol. 36، 179-188 (2015).

17. F. Shiromoto و همکاران، القای بیان Ski2 با واسطه IL-1بتا/ATF3- تخریب mRNA ویروس هپاتیت B را افزایش می‌دهد. بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 503، 1854–1860 (2018).

18. JT Brown، X. Bai، AW Johnson، پروتئین های ضد ویروسی مخمری Ski2p، Ski3p، و Ski8p به عنوان یک مجموعه در داخل بدن وجود دارند. RNA 6، 449-457 (2000).

19. DC Masison و همکاران، فریب دادن سیستم تخریب cap- mRNA توسط یک ویروس RNA دو رشته ای و نظارت بر mRNA poly(A)- توسط یک سیستم ضد ویروسی مخمر. مول. سلول بیول. 15, 2763-2771 (1995).

20. سی. اشمیت و همکاران، ساختار cryo-EM یک مجموعه ریبوزوم-اسکی2-اسکی3-Ski8 helicase. Science 354, 1431-1433 (2016).

21. AM Searfoss، RB Wickner، 3' poly(A) برای ترجمه ضروری است. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 97, 9133–9137 (2000).

22. EA Toh، P. Guerry، RB Wickner، جهش یافته های کروموزومی فوق کشنده ساکارومایسس سرویزیه. J. باکتریول. 136، 1002-1007 (1978).

23. A. Zinoviev، RK Ayupov، IS Abaeva، CUT Hellen، TV Pestova، استخراج mRNA از ریبوزوم های متوقف شده توسط مجتمع اسکی. مول. Cell 77, 1340-1349 e1346 (2020).

24. SG Ball، C. Tirtiaux، RB Wickner، کنترل ژنتیکی شماره کپی La و L-(Bc) Dsrna در سیستم های کشنده SACCHAROMYCES CEREVISIAE. ژنتیک 107، 199-217 (1984).

25. R. Esteban، L. Vega، T. Fujimura، 20S RNA نارناویروس از فعالیت ضد ویروسی SKI1/XRN1 در ساکارومایسس سرویزیه سرپیچی می کند. جی بیول. شیمی. 283، 25812–25820 (2008).

26. PA Rowley, B. Ho, S. Bushong, A. Johnson, SL Sawyer, XRN1 یک عامل محدودکننده ویروس خاص گونه در مخمرها است. PLoS Pathog. 12, e1005890 (2016).

27. J. Gao و همکاران، تضعیف ویروسی میوز از طریق یک مسیر آپوپتوز اجدادی. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 116, 16454–16462 (2019).

28. LY Li, X. Luo, X. Wang, Endonuclease G هنگامی که از میتوکندری آزاد می شود یک DNase آپوپتوز است. Nature 412, 95-99 (2001).

29. بی جی تامسون، ویروس ها و آپوپتوز. بین المللی J. Exp. پاتول. 82، 65-76 (2001).

30. MD Eastwood، SW Cheung، KY Lee، J. Moffat، MD Meneghini، تخریب هسته‌ای برنامه‌ریزی‌شده توسعه‌ای در طول گامتوژنز مخمر. توسعه دهنده سلول 23، 35-44 (2012).

31. MD Eastwood، MD Meneghini، هماهنگی تکوینی تمایز گامت با مرگ برنامه ریزی شده سلولی در مخمر هاگدار. سلول یوکاریوت 14، 858-867 (2015).

32. N. Schmidt و همکاران، SARS-CoV{2}} RNA-protein interactome در سلول های انسانی آلوده. نات. میکروبیول. 6، 339-353 (2021).

33. RW Smith, NK Gray, Poly(A)-binding protein (PABP): یک هدف ویروسی رایج. بیوشیمی. J. 426, 1-12 (2010).

34. R. Grover et al., Myg1 exonuclease برنامه های ترجمه هسته ای و میتوکندری را از طریق پردازش RNA جفت می کند. Nucleic Acids Res. 47، 5852–5866 (2019).

35. EV Koonin، یک دامنه باستانی حفاظت شده به ابرخانواده در حال رشد 3'-5' اگزونوکلئازها می پیوندد. Curr. Biol. 7، R604-606 (1997).

36. M. Szewczyk و همکاران، Human REXO2 RNA های میتوکندری کوتاه تولید شده توسط پردازش mtRNA و ماشین آلات فروپاشی را کنترل می کند تا از تجمع RNA دو رشته ای جلوگیری کند. Nucleic Acids Res. 48، 5572–5590 (2020).

37. Y. Zuo، MP Deutscher، ابرخانواده Exoribonuclease: تجزیه و تحلیل ساختاری و توزیع فیلوژنتیک. Nucleic Acids Res. 29، 1017-1026 (2001).

38. EW Trotter، L. Berenfeld، SA Krause، GA Petsko، JV Gray، تا کردن اشتباه پروتئین و تغییر دما باعث توقف G1 از طریق مکانیسم مشترک وابسته به فاکتور شوک حرارتی در ساکارومایسس سرویزیه می‌شود. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 98, 7313–7318 (2001).

39. A. Reyes، AJ Navarro، B. Diethelm-Varela، AM Kalergis، PA Gonzalez، آیا نقش HSF1 در عفونت های ویروسی وجود دارد؟ FEBS Open Bio 12، 1112–1124 (2022).

40. F. Weber, V. Wagner, SB Rasmussen, R. Hartmann, SR Paludan, RNA دو رشته ای توسط ویروس های RNA رشته مثبت و ویروس های DNA تولید می شود اما در مقادیر قابل تشخیص توسط ویروس های RNA رشته منفی تولید نمی شود. جی. ویرول. 80, 5059–5064 (2006).

41. S. Welsch و همکاران، ترکیب و معماری سه بعدی سایت های تکثیر و مونتاژ ویروس دنگی. میکروب میزبان سلولی 5، 365-375 (2009).

42. I. Fernandez de Castro، R. Tenorio، C. Risco، کارخانه های مونتاژ ویروس در یک دنیای لیپیدی. Curr. نظر. ویرول. 18، 20-26 (2016).

43. YX Liu، CL Dieckmann، تولید بیش از حد ذرات ویروسی مخمر توسط سویه های کمبود یک هسته میتوکندری. مول. سلول بیول. 9, 3323-3331 (1989).

44. AW جانسون، RD Kolodner، کشندگی مصنوعی جهش یافته های sep1 (xrn1) ski2 و sep1 (xrn1) ski3 ساکارومایسس سرویزیه مستقل از ویروس کشنده است و نقش کلی این ژن ها را در کنترل ترجمه پیشنهاد می کند. مول. سلول بیول. 15, 2719-2727 (1995).

45. سی استارک و همکاران، BioGRID: یک مخزن کلی برای مجموعه داده های تعامل. Nucleic Acids Res. 34، D535-539 (2006).

46. ​​L. Espert و همکاران، ISG20، یک RNase جدید القا شده با اینترفرون خاص برای RNA تک رشته ای، یک مسیر ضد ویروسی جایگزین علیه ویروس های ژنومی RNA تعریف می کند. جی بیول. شیمی. 278, 16151-16158 (2003).

47. T. Hanekamp، PE Thorsness، YNT20، یک سرکوب کننده بای پس yme1 yme2، یک اگزونوکلئاز 3'-5' موجود در میتوکندری ساکارومایسس سرویزیه را کد می کند. Curr. ژنت 34، 438-448 (1999).

48. A. van Hoof، P. Lennertz، R. Parker، سه عضو حفظ شده از خانواده RNase D عملکردهای منحصر به فرد و همپوشانی در پردازش RNA های 5S، 5.8S، U4، U5، RNase MRP و RNase P در مخمر دارند. . EMBO J. 19, 1357–1365 (2000).

49. M. Dwivedi, NC Laddha, R. Begum, ارتباط افزایش بیان MYG1 و پلی مورفیسم پروموتر آن با پیشرفت بیماری و حساسیت بالاتر در بیماران ویتیلیگو. جی درماتول. علمی 71، 195-202 (2013).

50. K. Kingo و همکاران، MYG1، یک ژن جدید مرتبط با ملانوسیت، بیان بالایی در ویتیلیگو دارد. جی درماتول. علمی 44، 119-122 (2006).

51. IB Andika، A. Jamal، H. Kondo، N. Suzuki، کمپلکس SAGA واسطه رونویسی رونویسی رونویسی خاموش کردن RNA ضد ویروسی است. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 114, E3499–E3506 (2017).

52. SG Sobel، SL Wolin، دو پروتئین حاوی موتیف La مخمر، پروتئین های متصل شونده به RNA هستند که با پلی ریبوزوم ها مرتبط هستند. مول. Biol. سلول 10، 3849-3862 (1999).

53. A. Proweller، JS Butler، ارتباط ریبوزومی پلی(A)-binding protein در poly(A)-deficient Saccharomyces cerevisiae. جی بیول. شیمی. 271، 10859-10865 (1996).

54. DE Gordon و همکاران، نقشه تعامل پروتئین SARS-CoV{2}} اهدافی را برای استفاده مجدد از دارو نشان می دهد. Nature 583, 459-468 (2020).

55. O. Brandman و همکاران، یک مجموعه کنترل کیفیت محدود به ریبوزوم باعث تخریب پپتیدهای نوپا می شود و استرس ترجمه را سیگنال می دهد. سلول 151، 1042-1054 (2012).

56. J. Anckar، L. Sistonen، تنظیم عملکرد HSF1 در پاسخ به استرس گرمایی: مفاهیم در پیری و بیماری. آنو. کشیش بیوشیم. 80، 1089-1115 (2011).

57. J. Li، J. Labbadia، RI Morimoto، بازنگری HSF1 در استرس، رشد و سلامت ارگانیسم. Trends Cell Biol. 27, 895–905 (2017).

58. PK Sorger، HR Pelham، خالص سازی و خصوصیات پروتئین اتصال دهنده عنصر شوک حرارتی از مخمر. EMBO J. 6, 3035-3041 (1987).

59. EJ Solis و همکاران، تعریف عملکرد اساسی مخمر Hsf1 یک برنامه رونویسی فشرده برای حفظ پروتئوستاز یوکاریوتی را نشان می دهد. مول. سلول 63، 60-71 (2016).

60. JR Glover، S. Lindquist، Hsp104، Hsp70، و Hsp40: یک سیستم همراه جدید که پروتئین های قبلاً تجمع یافته را نجات می دهد. سلول 94، 73-82 (1998).

61. Z. Li و همکاران، کاوش سیستماتیک عملکرد ژن مخمر ضروری با جهش‌یافته‌های حساس به دما. نات. بیوتکنول. 29، 361-367 (2011).

62. RY Zhao، مخمر برای تحقیقات ویروس. میکروب. سلول 4، 311-330 (2017).

63. T. Panavas، E. Serviene، J. Brasher، PD Nagy، صفحه نمایش گسترده ژنوم مخمر مجموعه های متفاوتی از ژن های میزبان را نشان می دهد که بر تکثیر ویروس های RNA تأثیر می گذارند. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 102, 7326–7331 (2005).

64. Y. Ohtake، RB Wickner، انتشار ویروس مخمر به شدت به غلظت زیر واحد ریبوزومی آزاد 60S بستگی دارد. مول. سلول بیول. 15, 2772-2781 (1995).

65. کمپلکس های اصلاح کروماتین SB Kremer، DS Gross، SAGA و Rpd3 به صورت پویا ساختار و بیان ژن شوک حرارتی را تنظیم می کنند. جی بیول. شیمی. 284, 32914–32931 (2009).

66. MD Leach و همکاران، Hsf1 و Hsp90 بازسازی رونویسی جهانی و معماری کروماتین وابسته به دما را در کاندیدا آلبیکنس هماهنگ می کنند. نات. اشتراک. 7, 11704 (2016).

67. CS Sitron، JH Park، JM Giafaglione، O. Brandman، تجمع دم‌های CAT، تخریب آنها را مسدود می‌کند و باعث سمیت پروتئوتوکسیک در S. cerevisiae می‌شود. PLoS One 15، e0227841 (2020).

68. L. Magtanong و همکاران، شبکه‌های تعامل ژنتیکی سرکوب دوز، نمودارهای سیم‌کشی عملکردی سلول را افزایش می‌دهند. نات. بیوتکنول. 29, 505-511 (2011).

69. V. Bilanchone و همکاران، رتروترانسپوزون Ty3 اجسام پردازش RNA مخمر را برای آلوده کردن ژنوم‌های جدید جفت‌گیری می‌کند. PLoS Genet. 11, e1005528 (2015).

70. L. Ruan و همکاران، پروتئوستاز سیتوزولی از طریق وارد کردن پروتئین های غلط تا شده به میتوکندری. Nature 543, 443-446 (2017).