Echinacoside Stimulates Cell Proliferation And Prevents Cell Apoptosis in Intestinal Epithelial MODE-K Cells By Up-Regulation Of Transforming Growth Factor- 1 Expression

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

یامین جیا، کیونونگ گوان، یوهای گوو، و کیگان دو

خلاصه

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) به طور گسترده ای به عنوان یک ملین گیاهی در طب گیاهی برای درمان سندرم روده تحریک پذیر یا یبوست استفاده شده است.اکیناکوزید از سیستانچ(ECH) یکی از مواد فعال زیستی اصلی در این گیاه است. هدف ما بررسی اثر ECH بر رشد و مرگ سلول های اپیتلیال روده بود. MODE-K، یک رده سلولی اپیتلیال روده، به عنوان یک مدل آزمایشگاهی روده استفاده شد. تکثیر سلولی با استفاده از روش متیل تیازول تترازولیوم (MTT) اندازه گیری شد. آپوپتوز سلولی با رنگ آمیزی Annexin-V تعیین شد. در اینجا نشان دادیم که در سلول‌های MODE-K کشت‌شده، ECH با کاهش آپوپتوز سلولی در حضور H2O2 یا مخلوطی از سایتوکین‌های پیش‌التهابی، ضمن تبدیل فاکتور رشد (TGF) به طور قابل‌توجهی تکثیر سلولی را تحریک کرد و بقای سلولی را افزایش داد.{6} بیان به صورت وابسته به دوز تنظیم شد. از بین رفتن بیان TGF- 1 هم فعالیت های تکثیری و هم فعالیت های محافظت سلولی ECH را مختل کرد، که با خنثی کردن فعالیت TGF{10}} با استفاده از آنتی بادی ضد TGF{11}} بیشتر تأیید شد. این داده ها نشان می دهد که ECH به عنوان یکی از مواد فعال زیست فعال در گیاه C. deserticola و سایرین ممکن است با تحریک تکثیر سلول های اپیتلیال روده و جلوگیری از مرگ سلولی از طریق افزایش تنظیم TGF-، ترمیم بافت مخاطی را بهبود بخشد.

کلمات کلیدی: سیستانش کویر، اپیتلیوم روده، تکثیر سلولی، آپوپتوز سلولی، فاکتور رشد تبدیل کننده (TGF)-

مقدمه

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) در طب گیاهی چین معمولاً به نام Rou Cong Rong شناخته می شود و در چین به دلیل استفاده پزشکی آن به محصول جدیدی تبدیل شده است (1). فواید بالینی آن در درمان بسیاری از مشکلات سلامتی از جمله یبوست مزمن گزارش شده است (2، 3) و اثرات مفید آن با فعالیت ملین آن در روده مرتبط است. مرطوب کردن مدفوع را افزایش می دهد، حرکت روده را در بیماران (4، 5)، و همچنین در مدل های حیوانی (6، 7) تقویت می کند. مطالعه اخیر ما نشان می دهد که تجویز خوراکی عصاره آبی C. deserticola به طور قابل توجهی تعداد هیپرپلازی التهابی در روده موش های مستعد سرطان کولورکتال را کاهش می دهد (8).

اکیناکوزید از سیستانچ (ECH) is a major component of phenylethanoid glycosides (PhG) (>50 درصد کل PhG جدا شده از C. deserticola (9) و به عنوان یک نشانگر زیستی برای کنترل کیفیت داروی ملین حاوی C. deserticola کپسول Ronggui Tongbian (10) یا برای کنترل کیفیت تولید C. deserticola کشت شده استفاده شده است. (11). ثابت شده است که ECH هم در یک مدل حیوانی بیماری پارکینسون (12، 13) و یک مدل آسیب ریه (14) و هم در سلول های فئوکروموسیتومای کشت شده (PC12) (15، 16) محافظ سلولی است. و نشان داده شده است که تقسیم سلولی سلول های فیبروبلاستیک انسانی (MRC{10}}) را افزایش می دهد (17). در این مطالعه، اثر ECH به عنوان یک ماده فعال زیستی اصلی C. deserticola بر تکثیر و بقای سلولی در سلول های اپیتلیال روده کشت شده به منظور درک عملکرد دارویی گیاه دارویی C. deserticola در درمان اختلالات روده مورد بررسی قرار گرفت. .

مواد و روش ها

کشت سلولی

MODE-K یک رده سلولی اپیتلیال روده ای است که از موش های C3H/HeJ (18) مشتق شده است که با مهربانی توسط دکتر تئودور اشتاینر (موسسه تحقیقات بهداشت ساحلی ونکوور، ونکوور، کانادا) ارائه شده است. سلول‌های MODE-K در محیط Eagle اصلاح‌شده Dulbecco (DMEM)، تکمیل‌شده با 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) در دمای 37 درجه تحت 5 درصد CO2 در اتمسفر هوا کشت داده شدند.

اکیناکوزید از سیستانچ (ECH) آماده سازی

ECH (اکیناکوزید از سیستانچ) بیشتر از عصاره تجاری C. tubulosa (حاوی بیشتر یا برابر 70 درصد ECH، Tianlife TLCT-E70؛ Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou، چین) با استخراج مکرر اتانول و به دنبال آن هوا- خالص شد. خشک کردن در هود بخار شیمیایی ماده باقی مانده بیشتر با لیوفیلیزاسیون خشک شد. ECH در محصول نهایی توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا تایید شد (شکل 1).

کاهش بیان فاکتور رشد تبدیل کننده (TGF){1}}

بیان TGF- 1 در سلول‌های MODE-K با بیان پایدار shRNA به طور خاص در برابر رونوشت TGF{3}} از بین رفت (19). به طور خلاصه، توالی های اولیگونوکلئوتیدی برای تولید mRNA ژن TGF- 1 موش هدف قرار دادن shRNA (5'-AAC CAA GGA GAC GGA ATA CAG-3') و کنترل غیر اختصاصی (درهم) (5'-AAT CGC) ATA GCG TAT GCC GTT-3» قبلاً توضیح داده شد (19، 20)، و آنها توسط Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA, USA) سنتز شدند. هر توالی به یک وکتور pHEX-siRNA متصل شد (21). وکتورها با استفاده از Lipofectamine2000 (Invitrogen-Gibco، Carlsbad، CA، USA) به دنبال پروتکل سازنده به سلول های MODE-K ترانسفکت شدند. هر دو سلول ضد TGF ترانسفکت شده با shRNA (MODE-Ktgfb) و ترانسفکت شده با shRNA درهم (MODE-Kscr) در حضور زئوسین (تا 500 میکروگرم در میلی لیتر) (Invitrogen-Gibco) رشد کردند و انتخاب شدند. با مرتب‌سازی سلولی با استفاده از فلوسیتومتری برای پروتئین فلورسانس سبز (GFP). بیش از 95 درصد از سلول های ترانسفکت شده فلورسانس سبز قوی را در فلوسیتومتری یا میکروسکوپ نشان دادند.

سنجش متیل تیازول تترازولیوم (MTT).

از روش MTT برای اندازه گیری تکثیر سلولی یا زنده ماندن در فرهنگ استفاده شد. سلول‌ها در 25{3}}0 در هر چاهک در 96- میکروپلیت‌های چاهک کاشته شدند و هر شرایط حداقل چهار بار آزمایش شد. به طور خلاصه، 10 میکرولیتر از 0.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر از 3-(4،{7}}دی متیل تیازول{8}}یل){9}}،{10}}دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT؛ Sigma- Aldrich Canada، Oakville، ON، Canada) به هر چاهک اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 4 ساعت انکوبه شد. سپس کریستال های فورمازان در سلول های زنده در 100 میکرولیتر در چاه دی متیل سولفوکسید (DMSO، سیگما آلدریچ کانادا) حل شدند. میزان جذب رنگ در هر چاه به عنوان واحد جذب (AU) در طول موج 560 نانومتر با استفاده از دستگاه ELx808 Ultra Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT, USA) تعیین شد. درصد تغییر تکثیر سلولی در کشت‌های تیمار شده با دارو در برابر کنترل بدون دارو به صورت زیر محاسبه شد: درصد=(درمان با دارو - کنترل) / کنترل × 100 درصد. نرخ رشد به شرح زیر محاسبه شد: نرخ رشد (AU/day)=(AUend - AUbegin) / زمان (روز)، که زمان نشان دهنده دوره معاینه بود، AUend نشان دهنده واحدهای جذب در پایان معاینه بود. و شروع AU نشان دهنده واحدهای جذب در ابتدای معاینه است.

تجزیه و تحلیل آپوپتوز مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس (FACS).

آنالیز FACS با رنگ آمیزی Annexin-V-phycoerythrin (Annexin-V-PE) و رنگ آمیزی {3}آمینو-اکتینومایسین D (7-AAD) برای تعیین آپوپتوز سلولی (Annexin-V مثبت: آپوپتوز اولیه) استفاده شد. ؛ 7-AAD: آپوپتوز دیررس/نکروتیک) به دنبال پروتکل سازنده (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). بنابراین، در نمودار FACS، سلول‌های زنده در ربع پایین سمت چپ، سلول‌های آپوپتوز دیررس در ربع بالا سمت چپ ({8}}فقط AAD مثبت)، سلول‌های آپوپتوز در ربع بالا سمت راست (هر دو Annexin-V و {{ 10}}AAD مثبت)، و سلول های آپوپتوز اولیه در ربع پایین سمت راست (فقط Annexin-V مثبت). به طور خلاصه، پس از درمان، سلول ها با انکوباسیون مختصر با محلول تریپسین-EDTA (Sigma Aldrich Canada) آزاد شدند و سپس با Annexin-V-PE در بافر اتصال 1 × به مدت 15 دقیقه انکوبه شدند. پس از شستشو با PBS، سلول ها با 7-AAD رنگ آمیزی شدند. شدت فلورسانس سلول‌های آپوپتوز با استفاده از فلوسیتومتری اندازه‌گیری شد و با استفاده از نرم‌افزار CELLQUEST (BD Biosciences) یا FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) با کنترل‌های پس‌زمینه مقایسه شد.

واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس نیمه کمی (RT-PCR)

سطوح mRNA TGF{0}} به صورت نیمه کمی در مقایسه با گلیسرآلدئید فسفات دهیدروژناز (GAPDH) به عنوان یک کنترل داخلی با استفاده از کیت‌های RT-PCR (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) تعیین شد. ) همانطور که قبلا توضیح داده شد (19). هر دو رونوشت TGF- 1 و GAPDH در یک آماده سازی cDNA توسط PCR با 35 سیکل 94 درجه برای 1 دقیقه، 57 درجه برای 1 دقیقه و 15 ثانیه، و 72 درجه برای 1 دقیقه و 30 ثانیه پس از شروع اولیه تکثیر شدند. مرحله دناتوراسیون در 94 درجه به مدت 1 دقیقه. مرحله نهایی گسترش در 72 درجه به مدت 10 دقیقه اضافه شد. جفت آغازگرهای خاص برای TGF- 1 و GAPDH از گزارش قبلی (19) (mTGF{20}}: حس، 5'-TAC TAT GCT AAA GAG GTC ACC CGC، و ضد حس، 5 مشتق شده‌اند. «- CTG TAT TCC GTC TCC TTG GTT CAG؛ mGAPDH: حس، 5'-ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT G، و ضد حس، 5'-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT C). محصول PCR حاصل (25 میکرولیتر) تحت الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1 درصد در بافر Tris-acetate-EDTA (TAE) حاوی 0.5 میکروگرم بر میلی لیتر اتیدیوم بروماید قرار گرفت و در زیر نور UV مشاهده شد. سطح بیان TGF{37}} به طور نیمه کمی با سطوح GAPDH مقایسه شد.

وسترن بلات

سطوح سلولی TGF{0}} همانطور که قبلاً توضیح داده شد با وسترن بلات بررسی شد (19). باندهای پروتئینی TGF{2}} در بلات با آنتی-TGF{3}} (A{4}}) مونوکلونال (BD Biosciences) شناسایی شدند. همان بلات دوباره با استفاده از آنتی اکتین IgG (سیگما-آلدریچ کانادا) برای تایید پروتئین بارگذاری شده در هر نمونه بررسی شد.

سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) سطوح TGF ترشح شده در سوپرناتانت های کشت با روش الایزا تعیین شد. سلول‌های MODE-K (1.8 × 105 سلول در چاهک در 0.5 میلی‌لیتر محیط DMEM) در 24-صفحه‌های چاهی در سه تکرار یک شبه رشد کردند و به دنبال آن در غیاب یا حضور ECH انکوباسیون شدند.(اکیناکوزید از سیستانچ). سوپرناتانت های کشت پس از 24 ساعت درمان جمع آوری شدند و مقدار آزادسازی TGF با استفاده از سیستم ایمونواسی TGF 1 Emax® طبق پروتکل سازنده (Promega, Madison, WI, USA) تعیین شد.

تجزیه و تحلیل های آماری

برای مقایسه بین گروه ها از آنالیز واریانس یک طرفه یا دو طرفه (ANOVA) استفاده شد. داده ها از 3 تا 4 آزمایش فردی در هر مطالعه برای تجزیه و تحلیل آماری جمع آوری شد. مقدار P کمتر یا مساوی با 0.05 معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج

تحریک تکثیر سلولی در کشت های سلولی MODE-K

تکثیر سلولی برای ترمیم بافت ضروری است. اثر ECH(اکیناکوزید از سیستانچ)در تکثیر سلولی در سلول های MODE-K کشت مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 2A نشان داده شده است، افزودن ECH تکثیر سلولی را تحریک می کند، که با افزایش زنده ماندن سلول با استفاده از روش MTT، به روشی وابسته به دوز اندازه گیری می شود. در مقایسه با تعداد سلول‌ها در کشت‌های بدون دارو، تعداد سلول‌ها در کشت‌های تیمار شده با ECH در کشت‌های با 6.26 میکروگرم در میلی‌لیتر ECH، 25.6 ± 14.82 درصد، 14 ± 33.6 درصد افزایش یافت. ug/mL ECH، 9 ± 64.4 درصد.{19}} درصد با 50 ug/mL ECH، و 99.4 درصد ± 11.7 درصد با 100 ug/ میلی لیتر ECH پس از {26}} ساعت جوجه کشی (P < 0.0{{5{52}}}}01).="" برای="" تأیید="" بیشتر="" این="" مشاهدات،="" تأثیر="" ech="" بر="" روی="" منحنی="" رشد="" سلولی="" mode-k="" در="" یک="" دوره="" زمانی="" {{{{{{0}}}="" روزه="" مورد="" بررسی="" قرار="" گرفت.="" همانطور="" که="" در="" شکل="" 2b="" نشان="" داده="" شده="" است،="" افزودن="" 10="" میکروگرم="" در="" میلی="" لیتر="" ech="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" تعداد="" سلول="" های="" زنده="" را="" پس="" از="" زمان="" انکوباسیون="" در="" مقایسه="" با="" کشت="" های="" بدون="" درمان="" با="" دارو="" (یک="" کنترل="" پایه)="" افزایش="" داد.="" افزایش="" au="" برای="" کشت="" های="" دارای="" ech="" از="" 0.3{{7{74}}}}="" ±="" 0.02="" در="" شروع="" درمان="" ech="" (0-نقطه="" زمانی)="" تا="" 0.08="" ±="" 1.49="" پس="" از="" 2="" روز="" انکوباسیون="" و="" 2.20="" ±="" 0.11="" پس="" از="" 4="" روز="" انکوباسیون،="" در="" حالی="" که="" برای="" کشت="" های="" بدون="" دارو="" (فقط="" محیط="" کشت)="" این="" افزایش="" از="" 0.01="" ±="" 0.24="" در="" ابتدا="" به="" 0.1="" ±="" 1.22="" و="" 0.12="" ±="" 0.12="" روز="" بود.="" پس="" از="" 4="" روز="" (متوسط="" ​​در="" مقابل="" ech،="" p=""><0.0001). نرخ="" رشد="" در="" این="" دو="" فرهنگ،="" محاسبه="" شده="" بر="" اساس="" منحنی="" رشد="" (شکل="" 2b)،="" نشان="" داد="" که="" ech="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" نرخ="" رشد="" را="" در="" فرهنگ="" ها="" در="" هر="" دو="" روز="" 2="" افزایش="" داد="" (0.56="" در="" کشت="" های="" تیمار="" شده="" با="" ech="" در="" مقابل="" 0.35="" در="" کنترل="" های="" بدون="" دارو)="" و="" روز="" 3="" (0.43="" در="" کشت="" های="" تحت="" درمان="" با="" ech="" در="" مقابل="" 0.22="" در="" گروه="" شاهد="" بدون="" دارو)="" (شکل="" 2c).="" روی="" هم="" رفته،="" این="" داده="" ها="" نشان="" می="" دهد="" که="" ech="" تکثیر="" سلولی="" را="" در="" سلول="" های="" اپیتلیال="" روده="" ای="" کشت="" شده="" تحریک="" می="">

شکل 2. تحریک رشد سلولی در سلول های اپیتلیال روده کشت شده توسط ECH. سلول‌های MODE-K (۲،۵00 سلول/چاه) یک شبه در 96-صفحه‌های چاهک کاشته شدند و سپس در حضور یا عدم حضور ECH انکوباسیون شدند. تعداد سلول های زنده در کشت ها با استفاده از روش MTT اندازه گیری شد. الف) کشت ها با غلظت های مختلف ECH به مدت 48 ساعت تیمار شدند. افزایش (درصد) در تعداد سلول در کشت‌های تیمار شده با ECH بر اساس کشت‌های تیمار نشده با دارو به عنوان مرجع پایه محاسبه شد. P <0.0001 (anova="" یک="" طرفه).="" ب)="" کشت="" ها="" با="" 10="" میکروگرم="" در="" میلی="" لیتر="" ech="" به="" مدت="" 4="" روز="" تیمار="" شدند.="" منحنی‌های="" رشد="" کشت‌های="" تحت="" درمان="" با="" ech="" در="" مقابل="" کشت‌های="" بدون="" دارو="" (فقط="" محیط)="" توسط="" واحدهای="" جذب="" (au)="" در="" طول="" موج="" 560="" نانومتر="" در="" روش="" mtt="" تعیین="" شد.="" p=""><0.0001 (متوسط="" ​​در="" مقابل="" ech،="" anova="" دو="" طرفه).="" داده="" ها="" به="" عنوان="" میانگین="" ±="" مشتق="" استاندارد="" (sd)="" آزمایش="" های="" مستقل="" ارائه="" شده="" است.="" ج)="" نرخ="" رشد="" (تغییر="" au/روز)="" بر="" اساس="" مس="" رشد="" محاسبه="">e، عدد میانگین در هر روز.

محافظت از سلول های MODE-K در برابر آپوپتوز

محافظت از سلول ها در برابر آپوپتوز مکانیسمی برای جلوگیری از آسیب بیشتر بافتی است. فعالیت محافظ سلولی ECH(اکیناکوزید از سیستانچ)در سلول های کشت شده MODE-K تحریک شده با پراکسید هیدروژن (H2O2) یا مخلوط سیتوکین های پیش التهابی (TNF- و IFN-) مورد بررسی قرار گرفت. H2O2 یک گونه اکسیژن فعال است که توسط متابولیسم اکسیداتیو تولید می شود و سناریوی استرس اکسیداتیو را نشان می دهد، در حالی که TNF- و IFN- سیتوکین های برجسته ای هستند که توسط سلول های ایمنی فعال شده تولید می شوند که وضعیت را تحت التهاب ناشی از سیستم ایمنی منعکس می کنند. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، افزودن ECH (5{34}} میکروگرم در میلی لیتر) به طور قابل توجهی باعث کاهش آپوپتوز از جمله سطح پایه آن در کشت های تیمار شده با H2O2 شد، که نشان دهنده کاهش آپوپتوز از سطوح پایه 5.3 است{47 }} درصد ± 1.24 درصد در کشت‌های بدون دارو تا 3.76 درصد 1.{51}}1 درصد در کشت‌های تیمار شده با ECH، از 1±26.93 درصد.{27}} درصد در کشت‌های بدون دارو به 14.08 درصد ± 1.30 درصد در کشت های تیمار شده با ECH در حضور 0.3 میکرومولار H2O2 و از 38.90 ± 1.76 درصد در کشت های بدون دارو به 19.88 ± 1.02 درصد در کشت های تیمار شده با ECH در حضور 0.6 میکرومولار H2O2000 (P<1. ،="" متوسط="" ​​/="" بدون="" دارو="" در="" مقابل="" تیمار="" ech).="" یک="" اثر="" محافظت="" سلولی="" مشابه="" ech="" در="" کشت="" های="" تحریک="" شده="" با="" مخلوط="" سیتوکین="" مشاهده="" شد="" (شکل="" 4).="" آپوپتوز="" (6.30="" ±="" 51.5="" درصد)="" در="" کشت="" های="" بدون="" افزودن="" ech="" (کنترل="" متوسط/غیردارویی)="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" بالاتر="" از="" آن="" (5.60="" ±="" 38.50="" درصد)="" در="" کشت="" های="" تیمار="" شده="" با="" ech="" بود="" (p="" {66}}.0204،="" درمان="" شده="" با="" متوسط/غیر="" دارو="" در="" مقابل="" تیمار="" شده="" با="" ech)،="" نشان="" می="" دهد="" که="" ech="" سلول="" های="" mode-k="" را="" از="" آپوپتوز="" ناشی="" از="" سیتوکین="" های="" پیش="" التهابی="" محافظت="" می="" کند.="" روی="" هم="" رفته،="" ech="" دارای="" فعالیت="" محافظ="" سلولی="" در="" برابر="" آپوپتوز="" سلولی="" ناشی="" از="" اکسیداسیون="" h2o2="" و="" همچنین="" سمیت="" سلولی="" سایتوکاین‌های="" پیش‌التهابی="">

افزایش بیان TGF- در سلول های MODE-K کشت شده

شواهد موجود در ادبیات نشان می دهد که TGF{0}} نقش مهمی در آسیب و ترمیم بافت (22، 23) و در بهبود دستگاه گوارش از کولیت یا بیماری التهابی روده ایفا می کند (24). برای بررسی اینکه آیا TGF{4}} نقشی در تکثیر سلولی ناشی از ECH و محافظت سلولی در سلول های اپیتلیال روده ای کشت شده ایفا می کند، اثر ECH(اکیناکوزید از سیستانچ)بیان TGF{{0}} در سلول‌های MODE-K کشت‌شده مورد بررسی قرار گرفت. سطوح رونوشت TGF{2}} با روش نیمه کمی RT-PCR مورد بررسی قرار گرفت، در حالی که سطح پروتئین آن توسط وسترن بلات (سطوح سلولی کل) یا ELISA (سطح پروتئین ترشح شده) تعیین شد. همانطور که در شکل 5A نشان داده شده است، تنظیم افزایش وابسته به دوز سطوح mRNA TGF- 1 در کشت های تیمار شده با ECH در 24 و 48 ساعت پس از افزودن ECH مشاهده شد. روند مشابهی از افزایش سطح پروتئین TGF{{10}} در داخل سلول ها با تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان داده شد (شکل 5B). پس از 24-ساعت انکوباسیون در 0.5 میلی‌لیتر محیط کشت حاوی غلظت‌های مختلف ECH، سطوح ترشحی TGF{15}} نیز به‌صورت مستقل از دوز افزایش یافت. از 186.4 ± 18.39 pg/mL در کشت های بدون دارو (سطوح پایه) به 186.4 ± 18.39 pg/mL در کشت های دارای 25 ug/mL ECH، 263.4 ± 14.14 pg/mL با 50 میکروگرم ECH، و 50 میکروگرم در میلی لیتر ECH 4.14 ± 263.4. 15.56 pg/mL با 100 ug/mL ECH (P <0.0001). همه="" این="" داده‌ها="" به="" وضوح="" نشان="" می‌دهند="" که="" ech="" تولید="" tgf{39}}="" را="" در="" سلول‌های="" اپیتلیال="" روده="" در="" کشت‌ها="" افزایش="">

از دست دادن تحریک رشد و محافظت سلولی اکیناکوزید به دلیل نابودی ژنتیکی بیان TGF- 1

برای روشن شدن اینکه آیا TGF{0}} به تحریک رشد و کاهش آپوپتوز در ECH کمک می‌کند یا خیر(اکیناکوزید از سیستانچ)سلول‌های درمان‌شده، بیان TGF- 1 در سلول‌های MODE-K با بیان پایدار anti-TGF{3}} shRNA، که توسط آن یک رده سلولی جدید MODE-Ktgfb تولید شد، از بین رفت. بیان پروتئین TGF{5}} تا حد زیادی در سلول‌های MODE-Ktgfb در مقایسه با سلول‌های MODE-Kscr که به طور پایدار shRNA درهم را بیان می‌کردند کاهش یافت (شکل 6A). همانطور که در شکل 6B نشان داده شده است، تحریک پرولیفراتیو ECH به طور قابل توجهی در سلول های MODE-Ktgfb مختل شد. مشابه پاسخ پرولیفراتیو به ECH در سلول‌های MODE-K والدینی (شکل 2)، تعداد سلول‌های زنده در سلول‌های MODE-Kscr به دنبال تحریک ECH افزایش یافت، 28.3 ± 12.4 درصد در کشت‌ها با 25 میکروگرم بر میلی‌لیتر ECH، افزایش یافت. 54.2 ± 6.8 درصد با 5{{3{32}}}} ug/mL ECH و 122.7 ± 20.8 درصد افزایش در کشت با 100 ug/mL ECH. در مقابل، تعداد سلول‌ها در حضور ECH در کشت‌های سلولی MODE Ktgfb، کاهش 12.0 ± 5.0 درصدی در کشت‌های با 25 میکروگرم در میلی‌لیتر ECH، کاهش 18.3 ± 4.1 درصد با 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر ECH کاهش یافت. 3.3 ± 30.4 درصد با 100 میکروگرم در میلی لیتر ECH کاهش یافت. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آنالیز واریانس دو طرفه نشان داد که تفاوت معنی‌دار پاسخ تکثیری به ECH بین این دو گروه وجود دارد (0001/0 > P). این داده ها نشان می دهد که از دست دادن بیان TGF{47}} در سلول های اپیتلیال روده، تحریک رشد ECH را مختل می کند.

برای بررسی بیشتر اینکه آیا عبارت TGF{1}} در ECH تنظیم شده است یا خیر(اکیناکوزید از سیستانچ)سلول های درمان شده منجر به کاهش آپوپتوز شدند، فعالیت ضد آپوپتوز ECH در سلول های MODE-Ktgfb در مقابل سلول های MODE-Kscr مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 6C نشان داده شده است، در مقایسه با کشت های سلولی MODE-Kscr، سطوح آپوپتوز در کشت های سلولی MODE-Ktgfb در غیاب سیتوکین ها بالاتر بود (11.2 ± 0.42 درصد در MODE-Ktgfb در مقابل MODE-Ktgfb در مقابل 9.6 درصد ± 0.99 درصد در MODE-Kscr) و در حضور سیتوکین ها (20.95 درصد ± 0).07 درصد در MODE- Ktgfb در مقابل 15.4 درصد ± 1.56 درصد در MODE-Kscr) (P=0.0{{60}}}13)، نشان می‌دهد که TGF- 1 یک ضد است عامل آپوپتوز در سلول های MODE K. افزودن ECH (50 ug/mL) به کشت‌های سلولی MODE-Kscr به طور قابل‌توجهی سطوح پایه آپوپتوز را کاهش داد (9.6 ± 0.99 درصد) در مقابل 0.43 ± 8.3 درصد. در تیمار شده با ECH) و 30.2 درصد کاهش آپوپتوز در کشت های تحریک شده با سیتوکین ها مشاهده شد (15.4 ± 1.56 درصد در تیمار نشده با دارو در مقابل 10.75 ± 1.05 درصد در تیمار شده با ECH). با این حال، در کشت سلولی MODE-Ktgfb، ECH سطوح پایه آپوپتوز را کاهش نداد (11.2 ± 0.42 درصد در تیمار بدون دارو در مقابل 12.0 ± 0.43 درصد در تیمار با ECH)، و تنها 16.71 درصد کاهش آپوپتوز را در مقایسه با 30.2 درصد در کشت های سلولی MODE-Kscr، در کشت های تحریک شده با سیتوکین ها مشاهده شد (0.07 ± 20.95 درصد در تیمارهای غیردارویی در مقابل 17.45 ± 0.35 درصد در تیمار شده با ECH). این داده‌ها نشان می‌دهند که کاهش بیان TGF- 1 در سلول‌های اپیتلیال روده، آپوپتوز را بدتر می‌کند و فعالیت محافظ سلولی ECH را کاهش می‌دهد.

از دست دادن تحریک رشد و محافظت سلولی ECH(اکیناکوزید از سیستانچ)با خنثی سازی فعالیت TGF{0}} با استفاده از آنتی بادی

برای تأیید بیشتر اینکه ممکن است TGF- 1 برای تحریک رشد و محافظت سلولی ECH مورد نیاز باشد(اکیناکوزید از سیستانچ)در سلول های اپیتلیال روده همانطور که در بالا توضیح داده شد (شکل 6)، اثر خنثی کننده آنتی بادی ضد TGF- 1 (Clone 9016; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, USA) بر واسطه ECH تکثیر سلولی و بقا در کشت سلولی MODE-K مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 7 A نشان داده شده است، افزودن ECH (25 میکروگرم در میلی لیتر) باعث افزایش 44.3 ± 8.2 درصدی تعداد سلول در گروه های کنترل نشده با آنتی بادی شد، اما در حضور آنتی بادی ضد TGF{13}} 11.3 ± 9.1{39}} درصد از دست دادن تعداد سلول در همان کشت‌های تحت درمان با ECH مشاهده شد که نشان می‌دهد خنثی‌سازی فعالیت TGF{18}} باعث کاهش تحریک رشد ECH در سلول‌های اپیتلیال روده می‌شود. آزمایش‌های بیشتر نشان داد که آنتی‌بادی ضد TGF{19}} نیز فعالیت محافظ سلولی ECH را در کشت‌های سلولی MODE-K خنثی می‌کند. افزودن ECH باعث کاهش آپوپتوز از 4.37 ± 1.19 درصد در کشت های بدون دارو به 1.72 ± 1.72 درصد در کشت های تیمار شده با ECH پس از 24 ساعت انکوباسیون و از 1.13 ± 11.1 درصد شد. 1.12 درصد در کشت‌های بدون دارو تا 9.13 ± 0.02 درصد در کشت‌های تیمار شده با ECH پس از 48 ساعت انکوباسیون (غیر دارو/متوسط ​​در مقابل ECH، ANOVA دوطرفه، P {44}}.0001). با این حال، در حضور آنتی‌بادی ضد TGF، آپوپتوز در کشت‌های تیمار شده با ECH (0.01 ± 2.88 درصد پس از 24- ساعت انکوباسیون؛ 12.58 درصد ± 0.02 درصد پس از 48- ساعت انکوباسیون تفاوت معنی‌داری با کشت‌های شاهد (غیردرمان‌شده با دارو) نداشت (ANOVA دو طرفه، P=0.9427)، که به این معنی است که آنتی‌بادی ضد TGF- 1 با بقای ECH در روده تداخل دارد. سلول های اپیتلیال

بحث

ECH(اکیناکوزید از سیستانچ)نه تنها یک PhG اصلی در عصاره گیاهی Cistanche spp است. بلکه در بسیاری از گیاهان دارویی دیگر مانند اکیناسه نیز یافت می شود. (25، 26). گزارش شده است که این ترکیب طبیعی دارای فعالیت آنتی اکسیدانی in vitro و in vivo است (13، 27، 28). با این حال، مکانیسم (های) عمل آن ناشناخته باقی مانده است. نتایج ما از مطالعه حاضر برای اولین بار در یک مدل آزمایشگاهی نشان می دهد که ECH تکثیر و بقای سلول های اپیتلیال روده را تحریک می کند که وابسته به TGF- 1 است.

اضافه شدن ECH(اکیناکوزید از سیستانچ)آپوپتوز سلولی را در H2O2- یا مخلوط سیتوکین های پیش التهابی (TNF- و IFN-) تحت درمان با سلول های MODE-K (شکل های 3 و 4) و نیز در سایر انواع سلول ها کاهش می دهد (16، 29)، و از بین بردن بیان TGF یا مسدود کردن فعالیت آن منجر به از بین بردن فعالیت ضد آپوپتوز آن می شود (شکل 6 و 7)، که نشان می دهد محافظت سلولی ECH به تولید TGF{15}} بستگی دارد (شکل 5). مطالعه قبلی ما نشان داده است که TGF{17}} بیان ضد آپوپتوز Bcl-2 را القا می‌کند و از آپوپتوز ناشی از TNF در سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای کلیوی جلوگیری می‌کند (19). یافته های مشابهی در سایر انواع سلول گزارش شده است. افزودن TGF{22}} در سلول‌های اندوتلیال شریان ریوی کشت شده، سطح پایه Bcl{24}} را تنظیم می‌کند و از آپوپتوز ناشی از محرومیت سرم و مسدود کردن گیرنده فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF) جلوگیری می‌کند (30). و در سلول های پیش ساز عصبی (NPCs) کشت شده، بقای سلولی را در برابر درمان H2O2 (تقریباً 76 درصد) افزایش می دهد، که با تنظیم بالا بیان Bcl{31} در ارتباط است (31). اگرچه اثر ECH بر بیان Bcl-2 در سلول‌های MODE-K در این مطالعه مورد بررسی قرار نگرفته است، اما ارتباط افزایش تنظیم Bcl{35}} با فعالیت ضد آپوپتوزی ECH در TNF گزارش شده است. - سلول‌های عصبی SHSY5Y (29) یا سلول‌های PC12 تیمار شده با H2O{42}} (15). روی هم رفته، این داده‌ها نشان می‌دهند که فعالیت ضد آپوپتوز ECH ممکن است توسط TGF{46}} از طریق یک مسیر Bcl{47}} واسطه شود.

این امکان وجود دارد که محافظت سلولی ECH(اکیناکوزید از سیستانچ)می تواند با کاهش مرگ سلولی خود به خود در پایان انکوباسیون به افزایش جزئی در تعداد سلول های زنده کمک کند، اما افزودن ECH (100 میکروگرم در میلی لیتر) تقریباً سلول های زنده را پس از 48- ساعت درمان دو برابر می کند (شکل 2A) ، نشان می دهد که ECH در واقع تکثیر سلولی را تحریک می کند که توسط داده های شکل 2، B و C بیشتر تایید می شود. اثر مشابهی از ECH در سلول های فیبروبلاستیک انسانی گزارش شده است، MRC{4}} (17): در MRC{ {6}} کشت سلولی، ECH می تواند پیری سلولی را با القای چرخه سلولی از فاز G1 به فاز S و فاز G2 به تعویق بیندازد. مانند فعالیت ضد آپوپتوزی ECH، فعالیت تکثیری ECH وابسته به TGF{10}} است (شکل 6 و 7) که به خوبی ثابت شده است که یک سایتوکین چند عملکردی است (32، 33). TGF- بسته به نوع سلول یا ریزمحیط خارج سلولی می تواند تکثیر سلولی را تحریک کند یا باعث توقف رشد شود. این مسیرهای سیگنال دهی متعدد از جمله Smads و non-Smads را فعال می کند (به عنوان مثال، پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن) (34، 35)، اما کدام مسیر تکثیر سلولی تحریک شده با ECH/TGF در سلول های MODE-K نیاز به بررسی بیشتر دارد.

تا به امروز، اطلاعات کمی در مورد پروتئین (های) هدف ECH وجود دارد(اکیناکوزید از سیستانچ)یا مسیر(های) سیگنالی که تنظیم می کند. یک مطالعه نشان می‌دهد که درمان ECH سطوح سلولی گوانوزین مونوفسفات حلقوی (cGMP) را در سلول‌های اندوتلیال افزایش می‌دهد (36)، و افزودن 8-Bromo-cGMP بیان TGF{3}} را در فیبروبلاست‌های قلبی به طور متوسط ​​افزایش می‌دهد (37). ). با این حال، آیا درمان ECH باعث افزایش cGMP می‌شود و به وسیله آن ECH بیان TGF- 1 را در سلول‌های اپیتلیال روده‌ای کشت‌شده تحریک می‌کند تا نیاز به بررسی بیشتر باشد.

در نتیجه، مطالعه ما نشان می دهد که ECH(اکیناکوزید از سیستانچ)تولید TGF- 1 را القا می کند که تکثیر سلولی و بقای سلولی را در سلول های اپیتلیال روده ای کشت شده واسطه می کند. سیگنال دهی TGF در اپیتلیوم روده برای ترمیم آسیب مخاطی یا التیام در موش های مبتلا به کولیت ناشی از سدیم سولفات دکستران (38) مورد نیاز است، که نشان می دهد ECH، احتمالاً C. deserticola گیاهی حاوی ECH یا سایرین، ممکن است پتانسیل درمانی برای ایجاد آسیب مخاطی داشته باشد. ترمیم در بیماران

تصدیق

YJ توسط یک بورس تحصیلی دانشجوی فارغ التحصیل از شورای بورس تحصیلی چین، چین حمایت شد.

منابع

1 Xu R، Chen J، Chen SL، Liu TN، Zhu WC، Xu J. Cistanche deserticola Ma به عنوان یک محصول جدید در چین کشت شد. Genet Resource Crop Evol. 2009؛ 56:137-142.

2 جیانگ Y، Tu PF. تجزیه و تحلیل ترکیبات شیمیایی در گونه Cistanche. J Chromatogr A. 2009؛ 1216: 1970-1979.

3 Tu PF، Wang B، Deyama T، Zhang ZG، Lou ZC. تجزیه و تحلیل گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی هربا سیستانچیس توسط RP-HPLC. Yao Xue Xue Bao (Acta Pharm Sin). 1997؛ 32:294-300. (متن به زبان چینی با چکیده انگلیسی)

4 Huang X, Li Z. [اثربخشی بالینی محلول حاوی سیستانچ در درمان یبوست پس از سکته مغزی]. Zhongguo Zhang Xi Yi Jie He Za Zhi (Chin J Integrated Trad West Med). 2002؛ 22:622-623. (به زبان چینی)

5 Zhang B, Lu X, Zhang R, Li L, Li C. [مطالعه در مورد اثر ملین Cistanche deserticola]. ژونگ یائو کائی (جی چین مد ماتر). 1992؛ 15:33-35. (به زبان چینی)

6 Tu P, Li S, Li Z, Wang C, Lou Z. [مقایسه در مرطوب کردن روده ها و سکته کردن گیاه سیستانچ ها]. Nat Prod Res Dev. 1997؛ 11:48-51. (متن به زبان چینی با چکیده انگلیسی)

7 Zhang B، Zhao X، Chen S، Liu L، Cheng H. [عمل ملین قسمت های جدا شده از گیاه سیستانچ]. ژونگگوو ژونگیایو شینشی زاژی (چین جی اینفورم تراد چین مد). 2003؛ 10:31-32. (متن به زبان چینی با چکیده انگلیسی)

8 Jia Y, Guan Q, Guo Y, Du C. کاهش هیپرپلازی التهابی در روده در موش‌های مستعد سرطان روده بزرگ با عصاره آبی Cistanche deserticola. Phytother Res. در مطبوعات.

9 Cai RL، Yang MH، Shi Y، Chen J، Li YC، Qi Y. فعالیت ضد خستگی عصاره غنی از فنیل اتانوئید از Cistanche deserticola. Phytother Res. 2010؛ 24:313-315.

10 Jing M، Song S، Li J. [مطالعه در مورد استخراج و تصفیه کپسول Ronggui Tongbian]. مدرن چین مد. 2009؛ 11: 18-20. (متن به زبان چینی با چکیده انگلیسی)

11 Wu Y، Shi HM، Bao Z، Wang MY، Tu PF، Li XB. استفاده از نشانگرهای مولکولی در پیش‌بینی کیفیت تولید گیاه سیستانش کویر کشت شده. بیول فارم بول. 2010؛ 33:334-339.

12 Geng X، Tian X، Tu P، Pu X. اثرات محافظتی عصبی اکیناکوزید در مدل MPTP موش بیماری پارکینسون. Eur J Pharmacol. 2007؛ 564:66-74.

13 Zhao Q، Gao J، Li W، Cai D. اثرات نوروتروفیک و نجات عصبی Echinacoside در مدل موش MPTP تحت حاد بیماری پارکینسون. Brain Res. 2010؛ 1346: 224-236.

14 Zhang Y، Xing J، Ai T، Wen T، Guan L، Zhao J. محافظت از اکیناکوزید در برابر آسیب حاد ریه ناشی از اسید اولئیک در موش صحرایی. Free Radic Res. 2007؛ 41:798-805.

15 Kuang R، Sun Y، Yuan W، Lei L، Zheng X. اثرات محافظتی اکیناکوزید، یکی از گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید، بر سمیت سلولی ناشی از H2O2- در سلول‌های PC12. Planta Med. 2009؛ 75: 1499-1504.

16 Kuang R، Sun Y، Zheng X. سرکوب اکسید نیتریک دخیل در اثر محافظتی اکیناکوزید بر آسیب سلول PC12 ناشی از H2O{2}. Nat Prod Commun. 2010؛ 5:571-574.

17 Xie H، Zhu H، Cheng C، Liang Y، Wang Z. Echinacoside پیری سلولی سلول‌های فیبروبلاست انسانی MRC را به تاخیر می‌اندازد-5. داروسازی. 2009؛ 64:752-754.

18 Vidal K، Grosjean I، Evillard JP، Gespach C، Kaiserlian D. جاودانه‌سازی سلول‌های اپیتلیال روده موش توسط ژن T بزرگ SV40-. خصوصیات فنوتیپی و ایمنی رده سلولی MODE-K. روش های J Immunol. 1993؛ 166:63-73.

19 Guan Q، Nguan CY، Du C. بیان فاکتور رشد تبدیل کننده-بتا1 آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد کلیه را محدود می کند. پیوند. 2010؛ 89:1320-1327.

20 هوانگ ام، کیم اچ جی، نو اچ جی، چانگ وای سی، چاه وای ام، کیم کی اچ، و همکاران. TGF-beta1 siRNA فیبروز توبولو بینابینی در کلیه انسداد حالب را سرکوب می کند. Exp Mol Pathol. 2006؛ 81: 48-54.

21 Du C، Wang S، Diao H، Guan Q، Zhong R، Jevnikar AM. افزایش مقاومت سلول های اپیتلیال لوله ای به آپوپتوز توسط درمان با shRNA، آسیب ایسکمی- خونرسانی مجدد کلیه را بهبود می بخشد. پیوند Am J. 2006؛ 6: 2256-2267.

22 داگلاس هی. TGF-ss در بهبود زخم: بررسی J مراقبت از زخم. 2010؛ 19:403-406.

23 گراند جی پی. نقش تبدیل فاکتور رشد بتا در آسیب و ترمیم بافت Proc Soc Exp Biol Med. 1997؛ 214:27-40.

24 Monteleone G، Boirivant M، Pallone F، MacDonald TT. TGF beta1 و Smad7 در تنظیم IBD. ایمونول مخاطی. 2008؛ 1 Suppl 1: S50–S53.

25 Bauer R, Foster S. تجزیه و تحلیل آلکامیدها و مشتقات اسید کافئیک از شبیه سازی Echinacea و ریشه E. paradoxa. Planta Med. 1991؛ 57:447-449.

26 Perry NB، Burgess EJ، Glennie VL. استانداردسازی اکیناسه: روش های تحلیلی برای ترکیبات فنلی و سطوح معمولی در گونه های دارویی J Agric Food Chem. 2001؛ 53:849-857.

27 Pellati F، Benvenuti S، Magro L، Melegari M، Soragni F. تجزیه و تحلیل ترکیبات فنلی و فعالیت مهار رادیکال گونه Echinacea. J Pharm Biomed Anal. 2004؛ 35:289-301.

28 Wu Y، Li L، Wen T، Li YQ. اثرات محافظتی اکیناکوزید بر سمیت کبدی ناشی از تتراکلرید کربن در موش صحرایی سم شناسی. 2007؛ 232:50-56.

29 دنگ ام، ژائو جی، تو پی‌اف، جیانگ یی، لی زد بی، وانگ ی. Echinacoside سلول های عصبی SHSY5Y را از آپوپتوز ناشی از TNFalpha نجات می دهد. Eur J Pharmacol. 2004؛ 505:11-18.

30 Lu Q. تبدیل فاکتور رشد بتا1 در برابر آپوپتوز سلول های اندوتلیال شریان ریوی از طریق ALK5 محافظت می کند. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2008؛ 295: L123–L133.

31 Park SM، Jung JS، Jang MS، Kang KS، Kang SK. تبدیل فاکتور رشد بتا1 سرنوشت سلول های پیش ساز عصبی مشتق از نخاع کشت شده را تنظیم می کند. سلول پرولیف. 2008؛ 41:248-264.

32 Massague J. چگونه سلول ها سیگنال های TGF-beta را می خوانند. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000؛ 1:169-178.

33 رحیمی ر.آ، لئوف ای بی. سیگنالینگ TGF-بتا: داستانی از دو پاسخ. جی سل بیوشیمی. 2007؛ 102:593-608.

34 Moustakas A, Heldin CH. سیگنال های غیر Smad TGF-بتا. J Cell Sci. 2005؛ 118: 3573-3584.

35 Schmierer B, Hill CS. انتقال سیگنال TGF بتا-SMAD: ویژگی مولکولی و انعطاف پذیری عملکردی. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007؛ 8:970-982.

36 He WJ، Fang TH، Ma X، Zhang K، Ma ZZ، Tu PF. Echinacoside باعث ایجاد آرامش وابسته به اندوتلیوم در حلقه های آئورت موش از طریق یک مسیر NO-cGMP می شود. Planta Med. 2009؛ 75: 1400-1404.

37 عبدالعزیز N، کلمبو F، Mercier I، Calderone A. اکسید نیتریک بیان mRNA ژن فاکتور رشد-بتا3 را در فیبروبلاست‌های قلب موش از طریق بی‌ثباتی کاهش می‌دهد. فشار خون. 2001؛ 38:261-266.

38 Beck PL، Rosenberg IM، Xavier RJ، Koh T، Wong JF، Podolsky DK. تبدیل فاکتور رشد بتا باعث بهبود روده و حساسیت به آسیب در شرایط in vitro و in vivo از طریق سلول های اپیتلیال می شود. جی پاتول هستم. 2003؛ 162:597-608.