اثر سیستانچ فنیل اتانول گلیکوزید سد روده و میکروبیوت روده در بیماری کبد الکلی موش

خلاصه:

هدف، واقعگرایانه:مدل موس ازبیماری کبد الکلی(ALD) توسط خوراک مایع الکل لیبر-دکارلی و اثرات آن ایجاد شدگلیکوزیدهای فنیل اتانوئید سیستانچ(CPhGs) بر روی سد روده و ترکیب میکروبیوتای روده موش‌های ALD مورد بحث قرار گرفته است.

روش: 36 موش ماده C57BL/6N به طور تصادفی به دو گروه نرمال، CPhGs نرمال، گروه مدل و CPhGs با دوز کم، متوسط ​​و بالا (175 mg·kg{4}}، 350 mg·kg{{6} تقسیم شدند. }}و 700 mg·kg-1)، با 6 موش. ایجاد مدل ماوس ALD با استفاده از خوراک مایع الکل لیبر-دکارلی. به گروه دوز CPhGs و گروه نرمال CPhGs روزانه با دوزهای مناسب گاواژ CPhGs داده شد. یک آنالایزر بیوشیمیایی خودکار سطوح سرمی ALT، AST، TG و TC را شناسایی کرد. سرم TNF-، IL{12}}، LPS، LBP، D-LA، DAO و LBP کبد با روش الایزا شناسایی شد. سطوح TG و TC در نمونه های هموژنه کبد با رنگ سنجی تشخیص داده شد. بافت کبد با رنگ‌آمیزی قرمز روغنی O و HE رنگ‌آمیزی شد. بافت‌های روده با رنگ‌آمیزی HE و AB-PAS و ایمونوهیستوشیمی Muc2 رنگ‌آمیزی شدند. محتویات روده گروه نرمال، گروه نرمال CPhGs، گروه مدل، و گروه با دوز بالا CphGs جمع آوری شد و میکروبیوتای روده توالی یابی شد.

نتایج: مدل ALD با موفقیت ایجاد شد. در مقایسه با گروه نرمال، سطح سرمی ALT، AST و TG و سطوح TG و TC کبدی در گروه مدل به طور معنی‌داری افزایش یافت (P<0.05). Histopathology showed that compared with the normal group, the liver cells in the model group showed obvious steatosis. Compared with the model group, the levels of serum TG liver TG, and TC in the CPhGs dose group decreased significantly (P<0.05). The serum ALT, AST, TNF-α, IL-1β, LPS, and LBP in the CPhGs high dose group were also significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the number of fatty liver cells in the CPhGs high dose group was significantly reduced, the microvilli structure of jejunum epithelial cells was intact, and the expression of Muc2 was reduced in the colon.Compared with the model group, the flora of the CPhGs high dose group changed significantly (P<0.05). Compared with the normal group, the Allobaculum was significantly up-regulated in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the abundance of Akkermansia in the CPhGs high dose group was significantly increased (P<0.01). Akkermansia was negatively correlated with Allobaculum (r = -0.701, P<0.01). 

نتیجه: CPhG ها می توانند آسیب سد روده ای ناشی از ALD را کاهش دهند، که ممکن استبا تنظیم فراوانی و ساختار آکرمانسیا و آلوباکولوم نقش محافظتی ایفا می کنندو بر هموستاز لایه مخاطی سد مخاطی روده تأثیر می گذارد.

کلید واژه ها:CPhG ها; بیماری کبد الکلی; سد روده؛ میکروبیوتای روده

عصاره طبیعی آلی سیستانچ با 40% اکیناکوزید و 16% آکتئوزید برای

خدمات حمایتی Wecistanche - بزرگترین صادرکننده سیستانچ در چین:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

واتساپ/تلفن:+86 15292862950

خرید برای جزئیات بیشتر مشخصات:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

الکل به یکی از عوامل خطر مهم تبدیل شده استبیماری های مزمن در سراسر جهان"گزارش جهانی در مورد الکل و سلامت 2018" منتشر شده توسط سازمان بهداشت جهانی نشان می دهد که تقریباً 3 میلیون نفر به دلیل مصرف بیش از حد الکل در سراسر جهان در سال 2016 جان خود را از دست دادند که 5.3٪ از کل را تشکیل می دهد [1]. در کشور ما سال به سال بیماری های کبدی ناشی از الکل در حال افزایش است و دومین عامل سیروز کبدی است [2] که به یک مشکل جدی بهداشت عمومی تبدیل شده است. مکانیسم‌های شروع و پیشرفت بیماری کبدی الکلی (ALD) پیچیده و متعدد هستند، عمدتاً مکانیسم آسیب کبدی متابولیت اتانول استالدئید و گونه‌های فعال اکسیژن [3]. در این میان نقش «محور روده-کبد» در پیشرفت ALD توجه قابل توجهی را به خود جلب کرده است [4-5]. کبد محل اصلی متابولیسم اکسیداتیو الکل است. نوشیدن طولانی مدت زیاد می تواند مستقیماً به کبد آسیب برساند و منجر به بروز ALD شود [6]. استئاتوز کبدی یک واکنش اولیه پس از نوشیدن الکل است. میکروبیوتای روده انسان (GM) به 10 تریلیون تخمین زده می شود [7]. تعادل میکرواکولوژیکی متشکل از فلور روده، ویروس ها، قارچ ها و متابولیت ها.

تعادل، یعنی میکرواکولوژی روده، ارتباط نزدیکی با پیشرفت ALD از طریق "محور روده-کبد" دارد، اما مکانیسم های مربوطه هنوز مشخص نیست [8-9]. سد روده و فلور بر «محور روده-کبد» غالب است و اختلال در تنظیم ژنتیک و بیان بیش از حد عوامل التهابی نقش مهمی در بروز و توسعه ALD دارد [10-11].

مطالعات نشان داده اند که اختلال شدید GM و بیان بیش از حد عوامل التهابی در طول بروز و توسعه ALD رخ می دهد [12]. مصرف طولانی مدت مزمن یا مصرف کوتاه مدت مقادیر زیاد الکل باعث تغییر نفوذپذیری روده می شود و باعث می شود LPS روده وارد گردش خون پورتال شود و پاسخ التهابی ایجاد کند و آسیب کبدی را تشدید کند [12-13].

سیستانچ به عنوان یک ماده دارویی مشخص چینی در سین کیانگ، در ماتریا مدیکا وو پو از سلسله های وی و جین، "مجموعه ماتریا مدیکا" از سلسله سونگ، و "مجموعه ماتریا مدیکا" از سلسله مینگ ثبت شده است [14]. ]. تحقیقات فارماکولوژیک مدرن نشان داده است که گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید سیستانش (CPhGs) نقش مهمی در ضد التهاب و فیبروز کبدی دارند [15-16]. با این حال، در حال حاضر تحقیقاتی در مورد اینکه آیا CPhG ها می توانند عملکرد سد روده یا فلور روده را در ALD تنظیم کنند و اثر محافظتی کبدی اعمال کنند، وجود ندارد.

این مطالعه از خوراک مایع الکل لیبر-دکارلی برای ایجاد مؤسسه ملی سوء مصرف الکل و الکلیسم (NIAAA) [17] مدل موش آسیب کبدی الکلی کوتاه مدت برای بررسی تأثیر CPhGs بر میکرواکولوژی روده ALD استفاده کرد. نفوذ. توجه ویژه ای به اثرات CPhGs بر عملکرد سد روده و هموستاز میکروبیوتای روده در موش های مدل ALD شد. این کمک می کند تا مکانیسم محافظت کبدی CPhGs از دیدگاه میکرواکولوژی روده آشکار شود و یک مرجع تجربی برای توسعه دارو فراهم می کند.

1. مواد

1.1 حیوانات

موش ماده با درجه SPF C57BL/6N، 17 تا 20 گرم، از Beijing Vitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.، شماره گواهی SCXK (Beijing) 2021-0006 خریداری شد. حیوانات بزرگ شدند و آزمایش‌ها در محیط SPF مرکز آزمایش حیوانات دانشگاه پزشکی سین‌کیانگ (SYXK (جدید) 2022-0003) انجام شد. سخت گیرانه

با رفاه حیوانات و الزامات اخلاقی کمیته اخلاق حیوانات تجربی دانشگاه پزشکی سین کیانگ (IACUC-20220127-4) مطابقت داشته باشید.

1.2 معرف ها

اتانول مطلق، ایزوپروپیل الکل (کارخانه معرف شیمیایی تیانجین دامائو، شماره دسته 20230201 و 20190103)؛ خوراک مایع کنترلی Lieber-Decarli، خوراک مایع الکلی Lieber-Decarli (شرکت Daitz Biotechnology (Wuxi) Ltd.، به ترتیب برای 710027 و 710260).

تثبیت کننده پارافورمالدئید، فیکساتور کارنو و تثبیت کننده میکروسکوپ الکترونی (شرکت بیوتکنولوژی Wuhan Sevier، آموزشی ویبولیتین، به ترتیب CR2208028، CR2305094 و CR2210001). کیت سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم LBP (ELISA)، کیت TNF- ELISA، IL{5}}

Elisa Kit ، D-La Elisa Kit ، Dao Elisa Kit ، TG کیت تست رنگ سنجی و کیت تست رنگ سنج TC (شرکت Wuhan Yilerite Biotechnology ، Ltd. ، شماره های دسته ای CV072V649815 ، CV112VX05028 ، CV1106T8F3303030303030

GY010XN08244، GY03P04Z5104 و GY02DHB82603)؛ کیت LPS ELISA (شرکت بیوتکنولوژی ووهان فین، با مسئولیت محدود، شماره دسته U3126I069T)؛ کیت سنجش ALT، کیت سنجش AST، کیت سنجش TG و کیت سنجش TC (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd., Ltd.، شماره های دسته ای 140122014، 140223002، 14172121401 و 2002) محلول رنگ‌آمیزی HE، محلول رنگ‌آمیزی Oil Red O، محلول رنگ‌آمیزی AB-PAS. آنتی بادی اولیه Muc2، آنتی بادی ثانویه ضد موش بز (شرکت بیوتکنولوژی Wuhan Sevier، آموزشی ویبولیتین، شماره های دسته به ترتیب G1005، G1015، G1049، GB11344 و GB23301 هستند).

1.3 مواد مخدر

عصاره سیستانچ خریداری شدشرکت داروسازی و بیولوژیکی سین کیانگ هوتان دیچن، با مسئولیت محدود. (اکیناسید بزرگتر یا مساوی 40 درصد، ورباسکوزید بزرگتر یا مساوی 16 درصد، فنیل اتانوئید گلیکوزید بزرگتر یا مساوی 85 درصد، شماره دسته 20230103).

1.4 ابزار

BS-240آنالایزر بیوشیمیایی خودکار VET (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.); میکروسکوپ الکترونی عبوری HT7800 (Hitachi Manufacturing Co., Ltd., Japan).

2. روش

2.1 گروه بندی و استقرار مدل حیوانی

36 موش به طور تصادفی به دو گروه نرمال، گروه تجویز نرمال، گروه مدل و CPhGs با دوز کم، متوسط ​​و بالا (175 mg·kg{2}}، 350 mg·kg{4}} و mg·kg 700 تقسیم شدند. 6}})، هر گروه 6 تایی. به همه موش‌ها ابتدا غذای مایع کنترل لیبر-دکارلی داده شد و به مدت 3 روز با تغذیه سازگار شدند. طبیعی

گروه کنترل و گروه دوز معمولی با خوراک مایع کنترل لیبر-دکارلی تغذیه شدند. گروه مدل و گروه‌های CPhGs با دوز کم، متوسط ​​و بالا با خوراک مایع الکل LieberDecarli تغذیه شدند. با شروع از روز چهارم آزمایش، گروه مدل و گروه‌های با دوز کم، متوسط ​​و زیاد CPhGs به تدریج غلظت الکل خوراک الکل را از 0% به 5% افزایش دادند و خوراک الکل 5% را تا زمانی که پایان آزمایش، و 9 ساعت قبل از جمع آوری مواد فشار داده شد. 0.2 میلی‌لیتر· 10 گرم-1 با اتانول 30 درصد به معده تزریق شد.

همه فید اکنون آماده و استفاده می‌شود و فید تازه هر روز از ساعت 17:00 تا 19:00 جایگزین می‌شود. هر روز به غذا خوردن، فعالیت و وضعیت ذهنی موش ها توجه کنید. هنگامی که موش های گروه مدل در حالت مستی مانند بی حالی، کاهش فعالیت و کاهش مصرف غذا ظاهر می شوند، نشان دهنده موفقیت آمیز بودن مدل سازی است [17]. هنگامی که گروه‌های با دوز کم، متوسط ​​و زیاد CPhGs و گروه تجویز معمولی شروع به تغذیه با خوراک الکلی کردند، محلول CPhGs با غلظت متناظر هر روز در مجموع به مدت 14 روز و نرمال سالین برای بقیه گاواژ شد.

2.2 مشاهده عمومی

غذا خوردن، فعالیت، وضعیت روانی و دفع موش ها هر روز مشاهده می شد. در طول مدل‌سازی و تجویز دارو، وضعیت مرگ و وزن موش‌ها ثبت شد. ضریب اندام=توده اندام/(جرم بدن/100)×100%.

2.3 انتخاب حیوانات آزمایشی

پس از 12 ساعت محرومیت از غذا و آب، موش ها بیهوش شدند، کره چشم آنها برداشته شد و قبل از قربانی شدن، خون جمع آوری شد. بافت کبد از بزرگترین لوب در محلول پارافورمالدئید ثابت شد. بافت ژژنوم به سرعت روی یخ جدا شد و در فیکساتور میکروسکوپ الکترونی ثابت شد. 3 سانتی متر از بافت ژژنوم و روده بزرگ (بدون شستشوی محتویات) جدا و در فیکساتور کارنوی ثابت شد. 3 سانتی‌متر دیگر از بافت ژژنوم و کولون (محتویات شسته شده با سالین فیزیولوژیکی) در محلول پارافورمالدئید تثبیت شد. محتویات تمام بخش‌های روده در کریوویال‌های استریل بدون آنزیم جمع‌آوری شد، به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شد و سپس برای نگهداری به یخچال درجه -80 منتقل شد.

2.4 الایزا و تشخیص رنگ سنجی سرم و شاخص های هموژن بافت کبد

ابزار بیوشیمیایی خودکار برای تشخیص سطوح سرمی ALT، AST، TG و TC استفاده شد. روش الایزا برای تشخیص سطوح سرمی TNF-، IL{1}}، LPS، LBP، DAO و D-LA و سطوح LBP کبدی استفاده شد. طبق دستورالعمل عمل کنید. برای همگن کردن بافت کبد، 0. 0.05~1.00 گرم از بافت کبد تازه مصرف کنید، ایزوپروپیل الکل را در دمای 2 تا 8 درجه با توجه به نسبت وزن (g): حجم (mL) اضافه کنید. {9}}:9، آسیاب کنید تا همگن شود، و با 20000 گرم در دقیقه{12}} دقیقه سانتریفیوژ کنید، مایع رویی را بردارید و برای آزمایش روی یخ قرار دهید و طبق دستورالعمل عمل کنید. تشخیص رنگ سنجی سطوح TG و TC در نمونه های هموژن بافت کبد.

2.5 رنگ آمیزی HE و Oil Red O برای تشخیص آسیب شناسی بافت کبد

برای رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (HE)، بافت کبد ثابت برداشته شد، پارافین برش داده شد، HE رنگ‌آمیزی شد و آب‌گیری شد و نصب شد. بافت کبد ثابت خارج شد، منجمد شد، با ایزوپروپیل الکل شسته شد، با Oil Red O رنگ آمیزی شد، مهر و موم شد و زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شد.

2.6 رنگ آمیزی HE و AB-PSA برای تشخیص مشاهدات پاتولوژیک بافت روده

بافت ژژنوم برداشته شد و در محلول پارافورمالدئید برای رنگ آمیزی HE ثابت شد. بافت کولون برداشته شد و در فیکساتور Carnoy برای رنگ آمیزی AB-PAS ثابت شد. مراحل ایمونوهیستوشیمی: بخش‌های پارافین را آب‌گیری کنید، بازیابی آنتی‌ژن، مسدود کردن پراکسیداز درون‌زا، مسدود کردن سرم، اضافه کردن آنتی‌بادی اولیه، افزودن آنتی‌بادی ثانویه، ضد رنگ‌آمیزی هسته‌های سلولی پس از رنگ‌آمیزی، آبگیری و سوار کردن، و مشاهده در زیر میکروسکوپ نوری. بافت ژژنوم برداشته شد، به قطعات کوچک 1 میلی متر × 1 میلی متر × 1 میلی متر برش داده شد، قبل از قاعدگی ثابت شد، بعد از آن ثابت شد، آبگیری شد، جاسازی شد، پلیمریزه شد و بسیار نازک برش داده شد. تغییرات میکروویلی سلول های اپیتلیال ژژنوم در هر گروه در زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری مشاهده شد.

2.7 تعیین توالی و آنالیز فلور روده با استفاده از روش 16S

محتویات روده گروه نرمال، گروه دوز نرمال، گروه مدل و گروه با دوز بالا CPhGs، بر اساس V3-V4 ناحیه 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') و 806R (5'-GGACTACNNNGGGTATCTAAT) -3')، با استفاده از فناوری توالی یابی با توان بالای 16S rDNA برای توالی یابی جامعه باکتریایی. آزمایش توالی یابی در این مطالعه توسط Shenzhen Microtech Technology Group Co., Ltd. تکمیل شد. داده های توالی یابی میکروبیوتای روده در این مطالعه در مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی تحت شماره پروژه PRJNA1006676 بارگذاری شده است.

بر اساس نتایج تجزیه و تحلیل انواع توالی آمپلیکون (ASVs)، تنوع آلفا، تجزیه و تحلیل تنوع بتا، حاشیه نویسی طبقه بندی گونه ها و تجزیه و تحلیل تفاوت انجام می شود. در میان آنها، شاخص تنوع آلفا عمدتاً شامل شاخص شانون و شاخص Chao1 است و آزمون آماری از آزمون Wilcoxon استفاده می کند. PCoA

تجزیه و تحلیل مختصات اصلی (PCoA) با استفاده از Anosim برای تجزیه و تحلیل تفاوت بین گروه ها انجام شد. از LEfSe برای تجزیه و تحلیل LEfSe) برای به دست آوردن گونه هایی با تفاوت معنی دار بین گروه ها استفاده شد. تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک با استفاده از ابزار Bioincloud Platform (https://www.bioincloud.tech) Microtech Alliance انجام شد.

2.8 تجزیه و تحلیل آماری

تمام داده های اندازه گیری به صورت igh̅± 𝑠 توصیف می شوند. برای داده هایی که از توزیع نرمال تبعیت می کنند و آزمون همگنی واریانس را برآورده می کنند، از تحلیل واریانس تک عاملی استفاده می شود. در غیر این صورت از آزمون ناپارامتریک استفاده می شود. داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS 24 مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند.{3}}. پ<0.05 means the difference is statistically significant.