استفاده از ترکیبات فنولی از آب گیاهی زیتون در جوجه های گوشتی: اثرات بر میکروبیوتای روده و عمر مفید فیله سینه قسمت 3

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

2.7. اکسیداسیون لیپید

اکسیداسیون لیپید از طریق اندازه گیری ثانویه (TBARs) و اولیه (D232 و D270) مورد مطالعه قرار گرفت.اکسیداسیونترکیبات (جدول 7). تفاوت معنی داری بین سه گروه آزمایشی مشاهده نشد، اگرچه شایان ذکر است که مقدار TBARs برای جوجه ها در گروه L2 نسبت به جوجه های گروه L1 و L{3}} کمی افزایش داشت، در حالی که D232 روند مخالف را نشان داد. این دو شاخص تحلیلی به طور معناداری همبستگی داشتند (TBARs در مقابل D232 r=-0.5,p<0.001 and="" tbars="" vs.="" d270r=""><0.05). the="" cooking="" treatment="" caused="" decreases="" in="" the="" primary="" oxidation="" products=""><0.01), which="" were="" followed="" by="" increases="" in="" the="" secondary="" ones="" (p=""><0.001). no="" interactions="" between="" diet="" and="" cooking="" were="" observed.="" on="" the="" contrary,="" [31]and="" [45]="" observed="" a="" significant="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" breasts="" from="" chickens="" whose="" diets="" were="" supplemented="" with="" either="" olive="" cake="" or="" omww.="" similarly,="" [46]="" observed="" a="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" quadriceps="" femoris="" of="" chickens="" whose="" diets="" were="" enriched="" with="" omww="" permeate="" and="" the="">

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا کلیک کنید

اوکه و همکاران [16] حجم های مختلفی از عصاره برگ زیتون (5، 10 و 15 میلی لیتر در لیتر) را به آب آشامیدنی عرضه شده به جوجه های گوشتی سویه Abor acre اضافه کرد که تأثیر قابل توجهی بر کاهش سطح مالون دی آلدئید خون (MDA) داشت. ابراهیم و همکاران [42]، کاهش قابل توجهی در غلظت MDA در سینه مرغ مشاهده کردند که با افزودن جیره با افزایش سطوح تفاله زیتون خشک تخمیر شده یا تخمیر شده آنزیمی به دست آمد. برخلاف سایر مطالعات، اثر محافظتی در برابر اکسیداسیون چربی عضلانی در بافت عضلانی در مطالعه حاضر مشاهده نشد. عوامل زیادی وجود دارد که باعث ایجاد تنوع و تفاوت بین مطالعات می شود. به غیر از نژاد حیوان و طول دوره پرواربندی، عوامل دیگری مانند ترکیب مواد مغذی جیره، خوراک مصرفی، دمای محیط به همراه سایر شرایط استرس زا می تواند منجر به نتایج بسیار متفاوتی شود که اغلب مقایسه آنها دشوار است. آخرین نوع ماتریکسی که رژیم غذایی با آن با فنل ها غنی شده است (کیک زیتون، تفاله زیتون، عصاره برگ زیتون، عصاره آب گیاهی، فقط چند مورد) به دلیل غلظت ترکیبات فعال و وجود مواد اضافی با یک عمل هم افزایی یا محافظتی موجود در همان ماتریکس، می تواند به طور قابل توجهی بر عملکرد آنتی اکسیدانی هم در داخل بدن و هم در بافت گوشت پس از کشتار تأثیر بگذارد [47]. مزایای سلامتی بالقوه از ادغام افزودنی های آنتی اکسیدانی در گوشت تازه و محصولات گوشتی همیشه ثابت نشده است [48]. در مقابل، بسیاری از ترکیبات اکسیداسیون لیپیدی و پروتئینی اولیه و ثانویه مانندهیدروپراکسیدهااپوکسیدها4-هیدروکسی‌نوننال، مالون آلدئیدبه عنوان مواد سرطان زا بالقوه شناخته می شوند یا می توانند بر انتقال سیگنال سلولی تأثیر بگذارند، همانطور که در مورد ترکیبات کربونیل وجود دارد [49]. در مورد گوشت تازه، امکان افزایش پتانسیل آنتی اکسیدانی از طریق جیره بندی حیوانات، به ویژه در استفاده از مواد طبیعی و نه مصنوعی، چشم انداز بسیار پیشنهادی است. در واقع، بر خلاف محصولات مبتنی بر گوشت که فناوری امکانات مختلفی را برای مداخله برای افزایش پتانسیل آنتی اکسیدانی ارائه می دهد، در گوشت تازه تنها جایگزین مداخله از طریق رژیم غذایی حیوانات، درمان با هدف سطح محصول است که با این حال باید انجام شود. مطابق با قوانین جاری مقدار باقیمانده فنل اندازه گیری شده در گوشت سینه مطالعه حاضر بعید است که فواید مستقیمی برای سلامتی داشته باشد، اما به طور غیرمستقیم می تواند مفید باشد. به عنوان مثال، پختن گوشت باعث از بین رفتن خالص دفاع آنتی اکسیدانی بافت می شود، بنابراین بافت گوشت با ترکیباتی که حتی پس از عملیات حرارتی هنوز فعال هستند غنی می شود.فنل ها، با توجه به افزایش ماندگاری و ایمنی خود محصول، کاربرد زیادی دارد. دلیل اینکه نه در ویدئو و نه جلوه های ویدئویی سابق به عنوان یک نتیجه از آزمایش تغذیه با CPC مشاهده نشد، مستحق بررسی های تجربی بیشتر است، به ویژه در مورد تعامل بینپلی فنول های غذاییو میکروبیوتای روده مرغ که بخش قابل توجهی از اثرات بالقوه بیوشیمیایی فنل ها را بر روی آن اعمال می کند [9،10].

3. مواد و روشها 3.1. امکانات آزمایشی

آزمایش در مرغداری مزرعه آزمایشی دانشگاه پادووا (لگنارو، پادووا، ایتالیا) پس از 6 ماه توقف انجام شد. مرغداری مجهز به سیستم خنک کننده، تهویه اجباری، گرمایش تابشی و سیستم های نور کنترل شده بود. در مجموع از 12 قلم شبکه سیمی (2.5×2.4 متر؛ 6 متر مربع) استفاده شد که هر کدام مجهز به پنج آبخوری نوک سینه (فاصله: 20 سانتی متر) و یک فیدر دایره ای (قطر: 30 سانتی متر) برای توزیع دستی خوراک بود. هر قلم دارای یک کف بتنی بود که با بستر چوب اصلاح شده بود (عمق 5 سانتی متر، 2.5 کیلوگرم بر متر).

نور 24 ساعت در روز برای 2 روز اول پس از رسیدن جوجه ها به مرغداری تامین می شد. سپس، تعداد ساعات نور به تدریج کاهش یافت تا زمانی که دوره نوری 18L:6D به دست آمد، که سپس از سن 12 روزگی به بعد حفظ شد.

سیستانچ می تواند ایمنی را بهبود بخشد

3.2. حیوانات، گروه‌های آزمایشی و ضبط‌های In Vivo

این مطالعه توسط کمیته اخلاقی آزمایش روی حیوانات (Organismo per la Protezione del Benessere Animale; OPBA) دانشگاه پادووا (پروژه 17/2016؛ شماره 154392 از 10 مه 2016) تأیید شد. همه حیوانات طبق اصول رفتار شدند. دستورالعمل 2010/63/EU[50] در مورد حمایت از حیواناتی که برای اهداف آزمایشی و سایر اهداف علمی استفاده می شوند. محققانی که در حمل و نقل حیوانات دخیل بودند یا متخصصان حیوانات (دکتری یا کارشناسی ارشد در علوم دامی) و/یا دامپزشک بودند.

در مجموع 144 1-جوجه یکروزه (راس 308) با یک کامیون تجاری، مطابق با مقررات شورای (EC) شماره 1/2005 [51]، به مراکز آزمایشی دانشگاه تحویل داده شد. همه جوجه ها در برابر بیماری مارک، برونشیت عفونی و بیماری نیوکاسل در هچری واکسینه شده بودند. جوجه ها در روز ورود به صورت جداگانه وزن شدند، با علامت پا مشخص شدند و به طور تصادفی بین 12 قلم (12 پرنده در هر قلم و 10 پرنده در متر مربع) تقسیم شدند.）,و سپس هر هفته یک بار برای اندازه گیری وزن زنده آنها تا زمان کشتار تجاری وزن می شود. مصرف خوراک قلم روزانه در طول آزمایش اندازه گیری شد. سه رژیم غذایی تجاری به شکل کرامبل در طول آزمایش اجرا شد (Martini SpA Longiano، Forli-Cesena، ایتالیا): رژیم غذایی P1 از 0 تا 23 روز، رژیم P2 از 24 تا 37 روز، و رژیم P3 از 38 روز تا کشتار در 48 روز (به مواد تکمیلی برای داده های تحلیلی، جدول S1 مراجعه کنید). کنسانتره فنلی خام (CPC) همانطور که توسط [12] توضیح داده شد، به دست آمد، به طور خلاصه، OVW ها با استفاده از آنزیم هایی با فعالیت پکتیناز و همی سلولزی تیمار شدند و سپس تحت میکروفیلتراسیون، اولترافیلتراسیون و اسمز معکوس قرار گرفتند. CPC به صورت زیر به جیره ها اضافه شد: i) L0 رژیم غذایی کنترل (P3)، (ii) L1 رژیم غذایی کنترل به اضافه CPC (220 میلی گرم بر کیلوگرم خوراک به عنوان فنل کل نظری)، (i) جیره کنترل L2 به همراه CPC (440 میلی گرم بر کیلوگرم خوراک به صورت نظری فنل کل). محتوای واقعی ترکیبات فنلی منفرد CPC و جیره ها در جدول S2 گزارش شده است. هر جیره در چهار قلم (همگن برای وزن زنده اولیه و تنوع) تکرار شد. CPC از سن 24 روزگی (d) تا زمان کشتار تجاری در 48 روزگی عرضه شد (به مواد تکمیلی برای ترکیب فنلی CPC مراجعه کنید). همه حیوانات در طول آزمایش به طور آزاد تغذیه شدند و جیره های مکمل به صورت هفتگی تهیه شد.

برای تعیین ترکیب جامعه میکروبی روده، سواب های کلواکال (4 حیوان/قلم) در 23،34 و 44 روزگی برای مجموع 12 حیوان (4 حیوان در هر رژیم غذایی) که سه بار مورد آزمایش قرار گرفتند (36 سواب) جمع آوری شد. نمونه های جمع آوری شده در کل).

3.3. کشتار تجاری، و ثبت کیفیت لاشه و گوشت

در سن 48 روزگی، پس از برداشت غذا و آب (به ترتیب 7 و 2 ساعت)، تمام جوجه ها در یک کشتارگاه تجاری کشتار شدند. جوجه ها قبل از بسته بندی به صورت جداگانه وزن شدند. تمام جوجه ها از یک قلم در یک قفس حمل و نقل بارگیری شدند (ارتفاع 62.5 سانتی متر × 16{7}} سانتی متر × 25.0 سانتی متر؛ سطح کف, 1 m²）. بارگیری و حمل و نقل از تأسیسات آزمایشی به کشتارگاه تجاری و انبار قبل از کشتار تقریباً 3 ساعت طول کشید. جوجه ها طبق رویه های استاندارد کشتارگاه تجاری کشتار شدند. لاشه ها پس از 2 ساعت نگهداری در یخچال در 2 درجه بازیابی شدند و برای اندازه گیری درصد پانسمان کشتار به صورت جداگانه توزین شدند [52].

24 ساعت پس از ذبح، لاشه ها تشریح شد تا ماهیچه های سینه ای جدا شده از سینه ها به دست آید [53].

در طول آزمایش، تلفات 17.4 درصد (25 جوجه) به دلیل مرگ و میر ثبت شد. از 119 لاشه، 72 مورد در طول دوره ماندگاری به آنالیزهای میکروبیولوژیکی اختصاص داده شدند (بخش 2.4 تشریح می‌کند که ترکیب میکروبیوتای پستان با روش‌های وابسته به فرهنگ و مستقل ایجاد می‌شود)، در حالی که 47 مورد یخ زده بودند ({11}} درجه ) و متعاقباً برای ارزیابی ترکیبات تقریبی و نرخ اکسیداسیون لیپید گوشت خام و پخته استفاده می شود (بند 3.5).

3.4. ارزیابی ماندگاری

3.4.1. تهیه سینه مرغ بسته بندی شده

ماهیچه های اصلی P به صورت جداگانه در سینی های پلی اتیلن کم چگالی بسته بندی شدند که در یک فیلم PVC با ضخامت 12 میکرومتر پیچیده شده بودند.（وایگل,KOEX412,Gruppo Fabbri,ویگنولا,مودنا,ایتالیا)و در دمای 1±4 درجه نگهداری می شود. در یک کابینت یخچال دار (Majolo" Plus 100 Seasoning Control, Majolo, Cadoneghe, Padova, Italy). قرار گرفتن در معرض نور از 8 ثابت شد:00 تا ساعت 20:00 با استفاده از یک لامپ فلورسنت 36 وات [54]. تنظیمات ذخیره سازی با هدف تقلید از شرایط تبرید در حین فروش طراحی شده است. بسته ها به طور تصادفی در 24،72،120، 180، 216 و 264 ساعت نمونه برداری شدند. تاریخ کشتار

3.4.2. تحلیل حسی

ارزیابی حسی سینه‌های تازه بر اساس [37] با استفاده از یک سیستم امتیازدهی ضعیف 3-(1=قابل قبول نیست،2=قابل قبول، 3=کیفیت خوب) انجام شد. شاخص حسی مصنوعی (SI) به عنوان [(2× امتیاز بو به اضافه 2× امتیاز رنگ به اضافه 1× امتیاز بافت)/5]، با امتیاز 1.8 به عنوان آستانه برای تعریف نمونه های خراب محاسبه شد. تجزیه و تحلیل حسی توسط هشت نفر از اعضای آموزش دیده انجام شد.

3.4.3. تجزیه و تحلیل میکروبیولوژیکی گوشت پستان در طول دوره ماندگاری

آنالیزهای میکروبیولوژیکی طبق روش‌هایی که توسط [38] توضیح داده شد انجام شد. ماهیچه های سینه ای ماژور (حدود 2 سانتی متر طول × 1 سانتی متر عمق × 2 سانتی متر عرض) در امتداد هر سینه به صورت آسپتیک برداشته شدند تا نمونه نماینده 25 در هر پستان به دست آید. نمونه ها در یک کیسه معده با 225 میلی لیتر آب پپتون بافر مخلوط شده و پس از رقت های مناسب مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. برای استخراج DNA، 1 میلی لیتر از هر هموژن در لوله های اپندورف 2 میلی لیتری جمع آوری شد و در 13500 × گرم به مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ شد (سانتریفیوژ اپندورف 5425، هامبورگ، آلمان). سپس مایع رویی دور انداخته شد و گلوله در درجه -80 منجمد شد. چندین هدف میکروبی برای توصیف پویایی جمعیت میکروبی در طول دوره ماندگاری به شرح زیر مورد بررسی قرار گرفت: تعداد کل زنده (TVC) و تعداد کل روان‌گردان (TPC) در Plate Count Agar (Biokar Diagnostics، Beauvais، فرانسه) ارزیابی شد. و پلیت ها در دمای 30 درجه به مدت 72 ساعت یا در دمای 4 درجه به مدت 10 روز انکوبه شدند. انتروباکتریاسه ها با گلوکز آگار صفرا بنفش قرمز (Biokar Diagnostics، Beauvais، فرانسه) در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت شمارش شدند. باکتری های اسید لاکتیک (LAB) بر روی De Man، Rogosa و Sharpe Agar (Biokar Diagnostics، Beauvais، فرانسه) تحت شرایط بی هوازی در دمای 30 درجه به مدت 48 ساعت مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. گونه های سودوموناس. شمارش روی پایه سودوموناس آگار حاوی ستریمید، فوسیدین و سفالوریدین در دمای 25 درجه به مدت 48 ساعت ارزیابی شد (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK). شمارش باکتری مولد H2S (شوانلا spp.) روی آگار آهن (Lyngby، Laboratorios Conda، Torrejon de Ardoz، اسپانیا) در دمای 25 درجه به مدت 48 ساعت انجام شد. نتایج به صورت log10 CFU/g گوشت گزارش شده است.

3.4.4.pH و از دست دادن قطره

یک pH متر (Portamess 910، Knick، برلین، آلمان)، مجهز به یک الکترود خاص (Mettler Toledo، Milano، ایتالیا)، برای اندازه گیری مقادیر pH با قرار دادن در عضلات سینه ای بزرگ در سه نسخه در سمت شکمی آنها استفاده شد. افت قطره ای مطابق با روش ارائه شده توسط [55] با استفاده از روش کیسه ای ارزیابی شد. برش‌های تقریباً 2.5 سانتی‌متری بریده شده از سطح سینه‌های پشتی داخل کیسه‌های پلی اتیلن قرار داده شد و در یک شب در دمای 1±2 درجه سانتی‌گراد به حالت تعلیق در آمدند. درصد کاهش قطره (درصد) با رابطه زیر محاسبه شد: ].

3.4.5. غلظت فنل در رژیم غذایی و در ماهیچه سینه

استخراج فنل ها بر روی 5 گرم نمونه جیره چرخ شده مخلوط با 5{24}} میلی لیتر متانول/آب (محلول 80/20 (o/o) حاوی 20 میلی گرم در لیتر هیدروکسی تولوئن بوتیله (BHT) انجام شد. با استفاده از دیسپرسر میله ای (IKA، T50 Ultra-Turrax، Werke، Staufen، آلمان) به مدت 1 دقیقه در 7000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ در 9327×g به مدت 10 دقیقه و بازیابی شد.این روش دو بار تکرار شد و عصاره جمع آوری شد. سپس توسط یک اواپراتور چرخشی (Buchi Rotavapor، R{12}}، سوئیس) تا رسیدن به حجم نهایی 20 میلی لیتر متمرکز شد. قبلاً با 10 میلی‌لیتر متانول و 10 میلی‌لیتر آب فعال شده بود، با 1 میلی‌لیتر عصاره آبی پر شد و شستشو با 50 میلی‌لیتر متانول انجام شد و پس از حذف حلال در خلا، عصاره فنلی در 1 میلی‌لیتر از محلول حل شد. از متانول/آب (50:50 v/v) تشکیل شده و از طریق فیلتر سرنگ پلی وینیلیدین فلوراید (PVDF) (0.2 میلی متر) فیلتر شده است. تجزیه و تحلیل کمی و کیفی ترکیبات فنلی عصاره بر اساس [31] توسط

HPLC (Mod. 1100 Agilent Technologies، سانتا کلارا، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا)، مجهز به یک ستون C18 (Spherisorb ODS{2}}(250 میلی‌متر × 4.6 میلی‌متر) اندازه ذرات 5 um، عرضه‌شده توسط Waters SpA (میلان، ایتالیا) ترکیبات فنلی با استفاده از دستگاه DAD در طول موج 280 نانومتر شناسایی شدند.کمیت‌سازی پلی‌فنل‌ها با استفاده از منحنی‌های کالیبراسیون منفرد برای هر ترکیب تعیین شد و نتایج به صورت میلی‌گرم بر کیلوگرم بیان شد. هیدروکسی تیروزول (3،{{{ 10}}DHPEA) از Cabru SpA (میلان، ایتالیا)، تیروزول p-HPEA از Merck Life Science Srl (میلان، ایتالیا) خریداری شد، و ورباسکوزید از Extrasynthese (Genay، فرانسه) گرفته شد. فرم دی آلدهیدی د کربوکسی متیل اولئوروپئین آگلیکون (3،{14}}DHPEA-EDA) طبق روشی که از [56] گزارش شده از روغن زیتون بکر استخراج شد.

در مجموع 10 گرم گوشت با 50 میلی لیتر متانول و آب مخلوط شد（80/20,o/ø）حاوی اسید فرمیک {{0}}.2 درصد و 20 میلی گرم در لیتر BHT. محلول با استفاده از دیسپرسر میله ای (IKA، T50 Ultra-Turrax، Werke، Staufen، آلمان) به مدت 1 دقیقه در 7000 دور در دقیقه همگن شد، در 4146 × گرم به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و مایع رویی بازیابی شد. عمل دو بار تکرار شد و دو مقدار عصاره جمع آوری و متانول توسط اواپراتور چرخشی (Buchi Rotavapor, R{9}}, Switzerland) خارج شد. بیست میلی لیتر از عصاره آبی در کارتریج های SPE Bond Elut HF Mega BE-C18,5g (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) بارگذاری شد که قبلاً با 20 میلی لیتر متانول و 20 میلی لیتر آب فعال شده بود. شستشو با 50 میلی لیتر متانول انجام شد. پس از حذف حلال در خلاء، عصاره فنلی با 0.5 میلی لیتر از محلولی متشکل از متانول / آب بازیابی شد.（50∶50 o/ø）و از طریق پلی وینیلیدین فلوراید فیلتر شد（PVDF）فیلتر سرنگ ({0}}.2 میلی متر). آنالیزهای HPLC عصاره های فنلی طبق [56] با همان تجهیزاتی که در بالا گزارش شد انجام شد. هیدروکسی تیروزول با استفاده از آشکارساز فلورسانس (FLD) با طول موج تحریک 280 نانومتر و انتشار 313 نانومتر شناسایی شد. کمی سازی هیدروکسی تیروزول با استفاده از منحنی کالیبراسیون انجام شد و نتایج به صورت ug/kg بیان شد.

3.5. ترکیب تقریبی، از دست دادن پخت، و تجزیه و تحلیل اسیدهای چرب

ترکیب تقریبی، پروفایل اسیدهای چرب، و پایداری اکسیداتیو در هر دو نمونه خام (سمت راست ص ماژور) و پخته شده (سمت چپ P. maijor) مورد بررسی قرار گرفت. پس از ذوب، افت پخت طبق [53] با تغییرات زیر ارزیابی شد: نیمه سمت چپ هر سینه وزن شده، بسته بندی شده و در حمام آب در دمای 8{35}} درجه به مدت 45 دقیقه پخته شد. پس از آن، سینه ها تا 4 درجه سرد شدند و به مدت 72 ساعت در یخچال (4 درجه) نگهداری شدند و سپس دوباره وزن شدند تا افت پخت به صورت [(وزن گوشت خام گوشت پخته شده با وزن گوشت)/وزن گوشت خام محاسبه شود. ]×100). ماهیچه، چه خام و چه پخته، به خوبی آسیاب شد (دوبار 2500 دور در دقیقه 10 ثانیه، رچ، دوسلدورف، آلمان) و به تجزیه و تحلیل رطوبت، پروتئین خام و خاکستر [57] فرستاده شد، در حالی که محتوای چربی خام با استفاده از روش ارائه شده تعیین شد. توسط [58]. به طور خلاصه، 200 میلی لیتر مخلوط دی کلرومتان/متانول 1:1 به 5 گرم از نمونه اضافه شد، در 11،{17}}/دقیقه به مدت 1 دقیقه همگن شد (Ultraturrax T25 Basic، Ika Werke. Staufen، آلمان) و در انکوبه شد. 60 درجه سانتیگراد در اجاق (سیستم PID، M{21}}VF، ابزار MPN، Bernaggio، MB، ایتالیا) به مدت 20 دقیقه. سپس 100 میلی‌لیتر دی‌کلرومتان دیگر اضافه شد و پس از همگن‌سازی (11،{25}} در دقیقه به مدت 1 دقیقه) نمونه صاف شد (کاغذ صافی سریع) و 100 میلی‌لیتر KCl 1 M به تراوش اضافه شد. پس از سانتریفیوژ (AvantiJ-E, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) در 1000×g به مدت 30 متر در دمای 4 درجه، مایع رویی تخلیه و عصاره آلی از طریق سولفات سدیم بی آب فیلتر شد. مقدار کمی (حدود 10 گرم) برای تعیین وزن سنجی درصد چربی استفاده شد، باقیمانده تقطیر شد (Rotavapor"R{34}}، Büchi، Essen، آلمان) و چربی بی آب برای تجزیه و تحلیل بیشتر استفاده شد. اسید چرب. متیل استرها (FAMEs) با وزن کردن 0.015 گرم چربی بی آب در یک لوله شیشه ای با درپوش پیچی [39] که با 1 میلی لیتر هیدروکلراید متانولی 3 مولار حل شد (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) تهیه شدند. و به مدت 2 ساعت در دمای 60 درجه انکوبه شد و سپس 1 میلی لیتر آب دیونیزه به آن اضافه شد.,پس از مخلوط کردن,FAME ها در 1 میلی لیتر n-هگزان بازیابی شدند. شهرت ها（1 μL）توسط یک کروماتوگرافی گازی (Shimadzu Italia Srl، مدل 2014، Milano، Italy) مجهز به آشکارساز یونیزاسیون شعله (تنظیم شده در 250 درجه) و یک انژکتور بدون شکاف (تنظیم شده در) تجزیه و تحلیل شدند. 280 درجه). محفظه حرارتی که ستون مویین را نگه می داشت (Supelco SP{4}}؛ 100 m×0.25 mm×0.2 um) به مدت 8 دقیقه در دمای 60 درجه نگه داشته شد. سپس دما به مدت 1 دقیقه با سرعت 10 درجه در دقیقه به 120 درجه و سپس با سرعت 2.5 درجه سانتیگراد در دقیقه از 120 به 240 درجه افزایش یافت. ایزوترم نهایی به مدت 20 دقیقه در 240 درجه نگهداری شد. اسیدهای چرب با استفاده از یک مخلوط استاندارد خارجی (37 Component FAME Mix، Supelco، آلمان) شناسایی شدند. آنالیزها در دو نسخه انجام شد.

3.6. اکسیداسیون لیپید

ترکیبات اکسیداسیون اولیه به‌عنوان دی‌ن‌های کونژوگه با آنالیز اسپکتروفتومتری در میدان فرابنفش با استفاده از نسخه اصلاح‌شده روش نشان‌داده‌شده در پیوست شورای Reg.EU/2015/1833 [59] تعیین شدند. به طور خلاصه،0.01±0.001 گرم فتوای بی آب در یک فلاسک مدرج 10 میلی لیتری توزین شده و توسط سیکلوهگزان درجه اسپکتروفتومتری تا نقطه حل شد. یک اسپکتروفتومتر UV/Vis (Mod. 7800 Jasco UV/VIS, Oklahoma City, OK, USA) برای تعیین مقادیر خاص انقراض در 232 (دین های مزدوج) و 270 نانومتر (تریین های مزدوج) با استفاده از حلال مشابه استفاده شد. مرجع. محصولات ثانویه اکسیداسیون لیپید بر اساس روش ارائه شده توسط [60] با تغییراتی به شرح زیر تعیین شد: در یک لوله سانتریفیوژ، 8 میلی لیتر از محلول آبی 5 درصد (m/v) تری کلرواستیک اسید و 5 میلی لیتر n-هگزان. به حدود 2 گرم از نمونه همگن اضافه شد. پس از همگن سازی با Ultraturrax برای دهه 30 با سرعت بالا. نمونه به مدت 3 دقیقه در 3000×g در دمای 4C (Eppendorf 5810R؛ Eppendorf، هامبورگ، آلمان) سانتریفیوژ شد و مایع رویی خارج شد. نمونه از طریق فیلتر کاغذی سریع فیلتر شد و 2.5 میلی لیتر از فیلتر به 2.5 میلی لیتر محلول آبی تیوباربیتوریک اسید 0.02 مولار اضافه شد و به مدت 35 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد در حمام ترموستات انکوبه شد. }؛ Seelbach، بادن-وورتمبرگ، آلمان). پس از سرد شدن، جذب با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 532 نانومتر گرفته شد. داده ها به صورت میلی گرم مالون دی آلدئید در هر کیلوگرم گوشت بیان می شود. اندازه گیری ها به صورت تکراری بر روی سینه مرغ پخته و خام انجام شد.

3.7. استخراج DNA و تهیه کتابخانه NGS

DNA با استفاده از کیت جداسازی DNA DNeasy PowerSoil (Qiagen، Hilden، آلمان) استخراج شد. گلوله های همگن گوشت سینه با 6{7}} 0 uL بافر Lysis ارائه شده توسط کیت یخ زدایی شدند. سواب‌های کلوآکال با قیچی استریل بریده شدند، داخل یک میکروتیوب حاوی 600 uL بافر Lysis و 6 UL 2- مرکاپتواتانول (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) قرار گرفتند. لوله ها با استفاده از ورتکس به مدت 5 دقیقه به خوبی مخلوط شدند و سواب ها خارج شدند. برای هر دو نمونه کلواکال و گلوله گوشت سینه، در مجموع 100 میلی گرم دانه های 0.1 میلی متری استریل (BioSpec, Bartlesville, OK, USA) اضافه شد و یک آسیاب مهره (TissueLyser, Qiagen, Hilden, Germany) برای ایجاد اختلال در مراحل تکان دادن با سرعت بالا (2×30 ثانیه در 30 هرتز). در مجموع 40 میکرولیتر پروتئیناز K (Qiagen، Hilden، آلمان) اضافه شد و در دمای 56 درجه به مدت 90 دقیقه انکوبه شد. پس از این مرحله، دستورالعمل های سازنده کیت ایزوله DNeasy PowerSoil9DNA دنبال شد. غلظت و خلوص DNA با استفاده از اسپکتروفتومتر (NanoDrop ND{17}}، Thermo Scientific، Waltham، MA، USA) آنالیز شد.

یک رویکرد تقویت دو مرحله ای برای ساخت کتابخانه DNA 16S استفاده شد. نمونه‌ها در واکنش‌های 20- میکرولیتری تکثیر شدند,هر کدام از 5 میکرولیتر DNA رقیق شده تشکیل شده است,{0}}.4 میکرومولار از هر آغازگر (جدول 1)، 0.25 میلی مولار دئوکسی نوکلئوتید (dNTP)، 1× بافر Phusion HF، و 1 U Phusion DNA پلیمراز با وفاداری بالا (New England BioLabs, Inc., Ipswich ، MA، ایالات متحده آمریکا). PCR در چرخه حرارتی 2720 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) با 25 سیکل 95 درجه برای 30 ثانیه، 60 درجه یا 49 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد برای 45 ثانیه انجام شد. 7 دقیقه در 72 درجه سه تکرار PCR در هر نمونه انجام شد.

محصولات با استفاده از کیت خالص سازی SPRIselect (Beckman Coulter Life Sciences، Indianapolis، IN، USA) خالص شدند و پس از خالص سازی مهره، نوار هدف با استفاده از ژل آگارز 1.8 درصد تایید شد. بارکدها با تجزیه و تحلیل PCR دوم با پرایمرهای دارای بارکد مخصوص پلت فرم معرفی شدند. هر 50- uL واکنش PCR حاوی محصول PCR، 0. 2 میکرومولار از هر پرایمر بود.（میز 1）,0.3 mMdNTP,1× Phusion HFbuffer,and1UPhusion DNA پلیمراز با وفاداری بالا. ده سیکل از پروفایل PCR که در بالا توضیح داده شد انجام شد.

محصولات PCR با استفاده از کیت تصفیه SPRIselect (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, USA) خالص شدند. پس از خالص‌سازی نهایی، هر نمونه با استفاده از فلورومتر Qubit 2 اندازه‌گیری شد.{1}} (Invitrogen، Life Technologies، Monza، ایتالیا). کیفیت کتابخانه آمپلیکون با استفاده از Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies، Palo Alto، CA، USA) آزمایش شد. کتابخانه ها با استفاده از پلتفرم Illumina MiSeq با یک چرخه 300-جفتی (Macrogen Inc.، سئول، کره) توالی یابی شدند.

4. نتیجه گیری

غنی‌سازی جیره جوجه‌ها با فنل‌های به‌دست‌آمده از فیلتراسیون و غلظت آب گیاهی آسیاب روغن به مدت 24 روز با تفاوت در رشد حیوانات، نرخ تبدیل خوراک، یا عملکرد لاشه مرتبط نبود. مطالعه میکروبیوتای روده تأثیر معنی داری زمان تغذیه اما نه رژیم غذایی فی نفسه بر تناوب گروه های میکروبی را نشان داد. از سوی دیگر، ترکیب میکروبی گوشت در طول دوره ماندگاری، رشد بیشتر سودوموناس را در نمونه‌های جوجه‌هایی که خوراک غنی‌شده با فنل مصرف کردند، نشان داد. در نهایت، هیچ تفاوتی بین جیره‌ها با توجه به نشانگرهای تحلیلی (TBARs و dienes مزدوج) فرآیند اکسیداسیون لیپید مشاهده نشد. در عوض، هیدروکسی تیروزول در بافت ماهیچه‌ای نمونه‌های جوجه‌هایی که خوراک با فنل‌های اضافه شده مصرف می‌کردند شناسایی شد که نشان‌دهنده جذب روده‌ای وابسته به دوز بود. از آنجایی که فرآیند اکسیداتیو عمدتاً در ساختار غشایی سلول‌های عضلانی رخ می‌دهد، مطالعات بیشتری برای درک بهتر توزیع HT در بخش‌های سلولی و خارج سلولی ضروری است.

این مقاله از Molecules 2021, 26, 4307 استخراج شده است. https://doi.org/10.3390/molecules26144307 https://www.mdpi.com/journal/molecules